Tartu Ülikool

Loodus- ja tehnoloogiateaduskond

Ökoloogia ja Maateaduste Instituut

Mükoloogia õppetool

Kristiina Mark

Lihheniseerunud seeneliikide Vulpicida juniperinus ja V. tubulosus

(Parmeliaceae, Ascomycota) eristamine DNA tunnuste alusel. Magistritöö

Juhendaja: Lauri Saag, PhD

Tartu 2011

2

Sisukord

1. Sissejuhatus........................................................................................................................... 3

1.1. Perekonna Vulpicida asend seente süsteemis ja üldine iseloomustus ............................. 3

1.2. Perekonna Vulpicida liikide ajaloost ............................................................................... 8

1.3. Liikide Vulpicida juniperinus ja V. tubulosus morfoloogiline eristamine....................... 9

1.4. Anatoomilistest tunnustest............................................................................................. 11

1.5. DNA tunnused ............................................................................................................... 12

1.6. Töö eesmärgid ............................................................................................................... 13

2. Materjal ja metoodika ....................................................................................................... 14

2.1. Taksonid ja eksemplarid................................................................................................ 14

2.2. Morfoloogiliste tunnuste määramine............................................................................. 14

2.3. DNA eraldus ja PCR...................................................................................................... 15

2.4. Sekventside joondamine ja fülogeneetilised analüüsid ................................................. 17

3. Tulemused ........................................................................................................................... 20

3.1. DNA järjestused, rekombinatsioon ja ühe lookuse puude ühilduvus............................ 20

3.2. Kombineeritud maatriksil põhineva analüüsi tulemused............................................... 20

3.3. ITS järjestustel põhineva analüüsi tulemused ............................................................... 21

3.4. Morfoloogilised tunnused ning nende vastavus kahe lookuse fülogeneesipuule .......... 25

4. Arutelu................................................................................................................................. 26

4.1. Töö peamised resultaadid .............................................................................................. 26

4.2. Metoodilised tähelepanekud .......................................................................................... 26

4.3. Morfoloogiliste tunnuste määramine ning tunnuste seisundite ja morfoliikide vastavus

fülogeneesipuudele ............................................................................................................... 27

4.4. Fülogeneesipuude võimalikud tõlgendused................................................................... 29

4.5. Suunad edasiseks uurimiseks......................................................................................... 32

Kokkuvõte ............................................................................................................................... 33

Summary ................................................................................................................................. 35

Tänuavaldused........................................................................................................................ 37

Kasutatud kirjandus .............................................................................................................. 38

LISAD...................................................................................................................................... 44

3

1. Sissejuhatus

Lihheniseerunud seeneliigid Vulpicida juniperinus (L.) J.-E. Mattsson & M. J. Lai (kadaka-

rebasesamblik, kadaka-rebasekõrv) ja V. tubulosus (Schaer.) J.-E. Mattsson & M. J. Lai (loo-

rebasesamblik, loo-rebasekõrv) on morfoloogiliselt väga sarnased, omades kattuvust sellistes

ajalooliselt perekonna liikide eristamiseks kasutatud tunnustes nagu substraat, kasvuvorm,

värvus, pükniidide asetus tallusel. Perekonna autor, Mattsson pakkus 1993. aastal liike

eristavaks tunnuseks hõlmade kuju (täpsemalt nende radiaalsus) ning hõlmaservade paksus.

Samas just Eestist pärit vahepealsete vormide määramisraskused on tõstatanud küsimuse, kas

vastavate morfoliikide näol on tegemist tegelike evolutsiooniliselt eristuvate liikidega.

Molekulaarsetel tunnustel põhinev fülogenees on tänapäeval muutumas järjest olulisemaks.

DNA tunnustel põhinevad analüüsid annavad suhteliselt lihtsa ja kiire mooduse uurida

taksonite evolutsioonilist sugulust. Seni avaldatud DNA tunnuseid käsitlevates töödes on

perekond Vulpicida monofüleetiline (Crespo et al. 2007; Mattsson & Wedin 1998; Thell et al.

2002, 2009; Wedin et al. 1999), samas pole siiani perekonna sisemist struktuuri

molekulaarsete tunnuste alusel uuritud. Töödes, kus on esindatud perekond Vulpicida, on

üldjuhul kaasatud vaid üks või mõni liik perekonnast Vulpicida ning ka sellisel juhul on

eksemplaride arv jäänud väikeseks (Crespo et al. 2001, 2007; Thell et al. 2002, 2004), mis ei

annagi võimalust täpsemaks sugulussuhete selgitamiseks.

Minu magistritöö eesmärgiks on näha, kas morfoloogiliselt raskesti eristatavad liigid V.

juniperinus ja V. tubulosus erinevad üksteisest DNA tunnuste poolest ning juhul kui erinevad,

siis kuidas moodustuvad klaadid seostuvad morfoloogiliste tunnustega.

1.1. Perekonna Vulpicida asend seente süsteemis ja üldine iseloomustus

Perekond Vulpicida (rebasesamblik) kuulub kottseente (Ascomycota) hõimkonda,

päriskottseente (Pezizomycotina) alamhõimkonda, Lecanoromycetes klassi, seltsi

Lecanorales, sugukonda Parmeliaceae. Sugukond Parmeliaceae on üks enim uuritud

suursamblike rühmi. Samuti on see suurim sugukond lihheniseerunud seente hulgas,

sisaldades ligikaudu 2300 liiki (Thell et al. 2009). Sugukonda Parmeliaceae iseloomustatab

4

väga suur morfoloogiline mitmekesisus, mida ühendab kindlat tüüpi askuse ontogenees ja

teatud askoomi struktuur, mida kutsutakse kausikujuliseks ekstsiipulumiks (cupulate exciple)

(Blanco et al. 2006).

Sugukonda Parmeliaceae saab jagada kolme kergesti äratuntavasse morfoloogilisse rühma –

alektoroidsed, parmelioidsed ja tsetrarioidsed samblikud (Crespo et al. 2001; Kärnefelt et al.

1998; Thell et al. 2002). Perekonda Vulpicida kuuluvad liigid on nn. tsetrarioidsed liigid.

Tsetrarioidse morfoloogiaga liigid on püstised, lamedate harudega, servmiste

apoteetsiumite ja pükniididega. Tsetrarioidsete samblike monofüleetilisse tuumikusse kuulub

14 perekonda: Ahtiana Goward, Allocetraria Kurok. & M. J. Lai, Arctocetraria Kärnefelt &

A. Thell, Cetraria Ach., Cetrariella Kärnefelt & A. Thell, Cetreliopsis M. J. Lai,

Flavocetraria Kärnefelt & A. Thell, Kaernefeltia A. Thell & Goward, Masonhalea Kärnefelt,

Nephromopsis Müll. Arg., Tuckermanella Essl., Tuckermannopsis Gyeln., Usnocetraria M. J.

Lai & C. J. Wei ja Vulpicida J.-E. Mattsson & M. J. Lai (Thell et al. 2009; JOONIS 1).

5

JOONIS 1. Tsetrarioidsete samblike fülogeneesi konsensuspuu Bayesi meetodi ja säästuprintsiibi kohaselt. Analüüs baseerus kombineeritud andmemaatriksil, kus oli kasutatud tuuma ITS, intronite, ß-tubuliini, GPDH ja mtSSU järjestusi. Tugeva toetusega klaadid (kingapaela meetodi tulemustel enam kui 70%-lise toetusega ning Bayesi analüüsil enam kui 95%-lise toetusega) on märgitud joonisel jämedalt. Puul on eri värvides näidatud püknokoniidide tüübid ning peamised moodustuvad klaadid (Thell et al. 2009).

6

Keemilisi (sekundaarainete ainevahetusproduktide e. samblikuainete) tunnuseid on kasutatud

eristamaks erinevaid liike, kuid koos teiste tunnustega ka perekondi (näiteks Brodo 1986).

Lihheniseerunud seente perekonnal Vulpicida on iseloomulik sekundaarainete keemia, nimelt

pulviin- ja vulpiinhapete olemasolu – ühendid, mis tekkinud šikiimhappe sünteesirajal. Need

ühendid on iseloomulikud kõigile kuuele perekonna Vulpicida liigile ning üheski teises

tsetrarioidses samblikus neid ei esine (Mattsson 1993). Pinaster- ja vulpiinhape sisalduvad

medullas ning usniinhape koorkihis. Vastavate ainete kristallid talluses muudavad sambliku

looduses küllaltki hästi märgatavaks, kuna tallus on nende ainete tõttu värvunud kollaseks.

Koorkiht on kollane, olenevalt liigist ja kasvukohast, kas rohekam või hallikam; medulla on

kõigil liikidel erekollane (Mattsson & Lai 1993; Mattsson 1993). Medullas paiknevate

pinaster- ja vulpiinhappe funktsioon ei ole täpselt teada. On leitud, et vulpiinhape on

loomadele mürgine ning võib omada herbivooria vastast funktsiooni (Slansky 1979; Pöykkö

et al. 2005). Samuti inhibeerib see kottseente eoste germinatsiooni (Whiton & Lawrey 1982)

ning ka brüofüütide spooride idanemist (Gardner & Mueller 1981). Usniinhapet leidub ka

teistes Parmeliaceae perekondades, nt Usnea. Usniinhappe funktsiooniks koorkihis võib olla

kaitse liigse päikesekiirguse eest ning sellel on ka antibakteriaalne toime (Hager et al. 2008;

Nash 2008).

Vulpicida kirjeldati 1993. aastal Mattssoni ja Lai poolt (Mattsson & Lai 1993). Perekonnas on

6 liiki, kaks neist, V. canadensis (Räsänen) J.-E. Mattsson & M. J. Lai ja V. viridis (Schwein.)

J.-E. Mattsson & M. J. Lai on endeemsed erinevatele Põhja-Ameerika piirkondadele ning

nende ühiseks iseloomulikuks tunnuseks on lühikesed sidrunikujulised püknokoniidid.

Euraasia levikuga V. juniperinus (L.) J.-E. Mattsson & M. J. Lai (JOONIS 2) ning disjunktse

areaaliga Euroopa liik V. tubulosus (Schaer.) J.-E. Mattsson & M. J. Lai (JOONIS 3) on

morfoloogiliselt üksteisega sarnased, samas kui laia levikuga V. pinastri (Scop.) J.-E.

Mattsson & M. J. Lai on perekonnas ainulaadne vegetatiivsete paljunemisvahendite,

servasoraalide poolest. Euraasias ja Põhja-Ameerikas leviv arkto-alpiinne V. tilesii (Ach.) J.-

E. Mattsson & M. J. Lai on ainuke liik perekonnas, mis kasvab eranditult maapinnal.

Morfoloogilised ja anatoomilised tunnused, eelkõige paljunemise struktuurides, on omavahel

sarnasemad liikidel V. juniperinus, V. pinastri, V. tilesii ja V. tubulosus, võrreldes liikidega V.

canadensis ja V. viridis (Mattsson 1993). Eestis on leitud kolm Vulpicida liiki: V. juniperinus,

V. tubulosus ning V. pinastri. Neist V. pinastri on siin väga laialt levinud, kuid V. juniperinus

ning V. tubulosus kasvavad peamiselt Lääne- ja Põhja-Eestis loopealsetel (JOONIS 4, 5).

7

Liiki Vulpicida tubulosus, algse nimega Cetraria alvarensis (Wahlenb.) Vain., peeti varem

Eesti ainukeseks endeemseks samblikuliigiks. Alles 15-20 aastat tagasi avastati selle

disjunktne areaal.

JOONIS 2. V. juniperinus levik maailmas (Randlane & Saag 1994).

JOONIS 3. V. tubulosus levik maailmas (Randlane & Saag 1994).

8

JOONIS 4. V. juniperinus levik Eestis (Eesti puudel kasvavate suursamblike levikukaardid,

http://www.eseis.ut.ee/levik_www/index.html).

JOONIS 5. V. tubulosus levik Eestis (Eesti puudel kasvavate suursamblike levikukaardid,

http://www.eseis.ut.ee/levik_www/index.html).

1.2. Perekonna Vulpicida liikide ajaloost

Enne rebasesambliku perekonna kirjeldamist asusid praegused Vulpicida liigid perekonnas

Cetraria (Mattsson & Lai 1993), mis samuti kuulub sugukonda Parmeliaceae. Perekonna

Cetraria kirjeldas Acharius 1803. aastal, nimetades sinna 8 liiki, nende hulgas ka Cetraria

juniperina (L.) Ach. See liik sisaldas tol ajal ka soreedidega varieteeti C. juniperina var.

pinastri (Scop.) Ach. Sellest ajast alates on perekonda Cetraria lisatud ning sealt eemaldatud

palju liike. Täna kuulub siia perekonda umbes 30 liiki (Crespo et al. 2007; Randlane et al.

9

1997; Thell et al. 2002; Revision of second updated world list of cetrarioid lichens,

http://www.eseis.ut.ee/synonyms/cetraria.html).

Perekonnas Cetraria eristati 6 liiki, mis sisaldasid medullas vulpiin- ja pinasterhapet: C.

canadensis (Räsänen) Räsänen [liigi tasemel aktsepteeriti 1933], C. juniperina (L.) Ach.

[1753], C. pinastri (Scop.) S. F. Gray [1933], C. tilesii Ach. [1814], C. tubulosa (Schaerer)

Zopf [1836, (1823)] ja C. viridis Schwein. [1824]. Üldiselt arvas enamus lihhenolooge need

liigid tervikliku perekonna Cetraria alla, kuid Zahlbruckner paigutas C. tilesii Cetraria sect.

Eucetraria Körb. alla ning ülejäänud liigid Cetraria sect. Platysma Körb. alla. Hale tõstis

kõik perekonnast Cetraria pärit vulpiinhapet sisaldavad liigid, välja arvatud C. tilesii,

perekonda Tuckermannopsis (Mattsson 1993 järgi). Selline lai perekonna Tuckermannopsis

käsitlus muutis perekonna polüfüleetiliseks ja polnud üldiselt aktsepteeritud. Aja jooksul on

perekonnast Cetraria eraldatud mitmeid uusi perekondi [nt. Cetrelia W.L. Culb. & C.F.

Culb., Platismatia W.L. Culb. & C.F. Culb. (Culberson & Culberson 1968), Masonhalea

Kärnef. (Kärnefelt 1977)], nende hulgas ka perekond Vulpicida. 1993. aastal ilmunud töös

paigutsid Mattsson ja Lai (Mattsson & Lai 1993) need eespool nimetatud kuus liiki eraldi

perekonda Vulpicida (rebasesamblik). Perekonna ja selle liikide eristamisel ja kirjeldamisel

kasutasid nad morfoloogilisi, anatoomilisi, keemilisi tunnuseid, levikut ja ökoloogiat.

1.3. Liikide Vulpicida juniperinus ja V. tubulosus morfoloogiline eristamine

Juba 1753. aastal ilmunud teoses Species Plantarum 2 (1753:1147 no. 40) kasutab Linnaeus

nime Lichen juniperinus taksoni kohta, mis tema järgi kasvab kadakal (Juniperinus)

(Mattsson 1993 järgi). Ta eristab seda taksonist Lichen parietinus heleda kollase värvuse,

tõsusvate üksteisest eraldi asetsevate hõlmade ja pruunide apoteetsiumide poolest. Reeglina

ongi Vulpicida juniperinus epifüüt ja küllaltki rangelt substraadispetsiifiline, kasvades oma

areaali läänepoolsetel aladel ainult harilikul kadakal (Juniperinus communis) ja idapoolsetel

aladel kääbus-seedermännil (Pinus pumila). Samas on ka maapinnal kasvavaid isendeid ning

neid on leitud peamiselt alpiinses piirkonnas lubjarikkal pinnasel, aga ka Balti mere äärsetel

saartel (Mattsson 1993).

Maapinnal ja puukoorel kasvavate isendite vahel võib esineda morfoloogilisi erinevusi.

Puukoorel kasvavatel isenditel on tallus rosetjas, küllaltki lühikeste, kitsaste tõusvate

dorsiventraalsete hõlmadega. Maapinnal kasvavad isendid on rohkem püstisemad ning

10

hõlmad moodustavad tutte. Maapinna isenditel esineb viljakehi harva, epifüütsetel on neid

tihti palju. Mattssoni (1993) järgi pole need erinevused piisavad taksonoomiliseks

eristamiseks. V. juniperinus armastab kasvada niisketes, kuid päikesepaistelistes kohtades.

Eestis levib V. juniperinus läänesaartel loopealsetel aladel (JOONIS 4). Seoses karjatamise

kadumisega ranna-aladelt toimub nende alade kinnikasvamine. Kasvukohtade kadumine

avaldab survet ka V. juniperinus kooslustele ning mitmetest piirkondadest on see liik ka

kadunud (nt. Lõuna-Rootsi; Mattsson 1993 järgi).

Vulpicida tubulosus on morfoloogiliselt väga sarnane liigile V. juniperinus ning tihti ongi neid

kaht keeruline eristada. Avaldatud liigikirjelduste kohaselt (Mattsson 1993) peaks V.

tubulosus tallus olema rohekam või hallikam V. juniperinus tallusest, samas võib V. tubulosus

värvus varieeruda hallikas-rohelisest kuni erekollaseni. Üldiselt ei saa talluse värvust pidada

väga heaks tunnuseks, kuna on küllaltki subjektiivne ning sõltub palju talluse kasvukohast.

Päikesepaistelisemates kohtades on liikide V. juniperinus ja V. tubulosus tallused üldiselt

kollasemad, kuna sisaldavad rohkem usniinhapet koorkihis.

Sarnaselt liigile V. juiperinus võib ka V. tubulosus kasvada nii maapinnal, kui

puukoorel, kuigi tüüpilise V. tubulosus morfoloogiaga isendid kasvavad üldiselt maapinnal.

Liigil V. tubulosus on disjunktne areaal, ta levib lubjarikkal pinnasel Balti mere saartel ja

Kesk-Euroopa Alpides (JOONIS 3, 5). Mõlemates piirkondades võib teda leida nii maapinnal,

kui harilikul kadakal. Nagu ka liigil V. juniperinus võib ka liigil V. tubulosus eristada kahte

morfotüüpi − lehtjas ja lame põõsasjas. Maapinnal kasvavad isendid moodustavad tihedaid

tutte või padjandeid ning sellisel juhul on talluse hõlmad dorsiventraalsed kuni

radiaalsümmetrilised. Puukoorel kasvavad isendid on küllaltki laiade dorsiventraalsete

hõlmadega ja moodustavad roseti-taolisi talluseid ehk on äraütlemata sarnased V. juniperinus

epifüütsete isenditega. Peale selle on paljud eksemplarid vahepealse morfoloogiaga ning

nende puhul on morfotüübi üle raske otsustada. Ka liigi V. tubulosus puhul pidas Mattsson

(1993) õigeks säilitada V. tubulosus lai morfoloogiline käsitlus ja mitte eristada morfotüüpe

taksonoomilisel tasandil.

Eespool mainitud morfoloogilised tunnused – värvus, kasvuvorm ja substraat – on liikidel V.

juniperinus ja V. tubulosus liiga varieeruvad ja suures osas ka kattuvad, et neid pidada

headeks eristavateks tunnusteks. Samas ajalooliselt on nad ühed olulisemad uuritavate liikide

tunnused. Mattssoni (1993) välja pakutud perekonna määramistabeli järgi sobib samal alal

kasvavate isendite puhul uuritavate liikide eristamiseks hõlmade radiaalsus ning

11

dorsiventraalsete puhul ka hõlmaservade paksus (LISA 1). Liigi V. tubulosus hõlmad on

radiaalsümmeetrilised või dorsiventraalsed paksenevate hõlmaservadega. Liigil V. juniperinus

hõlmad on dorsiventraalsed õhukeste hõlmaservadega.

Mingil määral eristava tunnusena on kasutatud ka V. juniperinus ja V. tubulosus erinevat

pükniidide paigutust tallusel. Liigil V. juniperinus asuvad pükniidid pükniidikandjatel, kuid

liigil V. tubulosus võivad pükniidid olla nii pükniidikandjatel, kui tallusesse süübinult

(Mattsson 1993).

1.4. Anatoomilistest tunnustest

Morfoloogilisi tunnuseid võib analüüsides olla raske kasutada, kuna nad on tihti väga

plastilised. Anatoomilistest tunnustest on paljud mõjutatud tallusetüübi ja kasvukeskkonna

poolt, kuid nad võivad olla kasulikud liigi lõplikuks määramiseks. Ka liikidel V. juniperinus

ja V. tubulosus on mõningad osaliselt eristavad anatoomilised tunnused (Mattsson 1993 järgi):

- Liigil V. tubulosus on poorne pigmenteerunud epikoorkiht erinevalt teistest perekonna

Vulpicida liikidest, millel epikoorkiht on läbipaistev ja poorideta.

- Kuigi vetikal on mõningal määral võime talluses liikuda, on vetikarakkude ruumiline

paiknemine talluses ühe liigi piires siiski küllaltki sarnane. Liikidel V. tilesii ja V. tubulosus

levib fotobiondi kiht pükniidi alla, kuid teistel perekonna liikidel pükniidi all fotobionti ei ole.

- Liigil V. tubulosus on koorkiht mõnevõrra paksem [(25-) 41 ± 12 (-55) µm], kui liigil V.

juniperinus [(17-) 32 ± 11 (-45) µm]; mõõdetud tunnused on antud (ka edaspidi) järgmiselt

[(miinimum-) keskmine ± standardhälve (-maksimum)].

- Liigil V. juniperinus on pükniidid keskmiselt suuremad (100-) (125 ± 10 (-140) µm x (100-)

110 ± 4 (-120) µm), kui liigil V. tubulosus [(80-) 95 ± 10 (-115) µm x (70-) 90 ± 6 (-100)

µm].

- Liigil V. juniperinus on pükniidi sein keskmiselt paksem [(20-) 25 ± 3 (-30) µm], kui liigil

V. tubulosus [(10-) 15 ± 3 (-19) µm].

Esitatud anatoomilistes tunnustes on sarnaselt morfoloogiliste tunnustega teatud kattumine

ning kuna nad on määramisel aeganõudvad ja ebapraktilised välitöödel, siis keskendun oma

töös just eelkõige lihtsasti vaadeldavatele morfoloogilistele tunnustele.

12

1.5. DNA tunnused

Molekulaarsed tunnused on muutunud järjest olulisemaks lihheniseerunud seente

taksonoomias. Eriti laialt on kasutatud tuuma ribosomaalse DNA järjestusi, aga ka

mitokondriaalset rDNA-d, viimast eelkõige kõrgemate taksonoomiliste tasemete puhul

(Crespo et al. 2001). Fülogeneesi uurimiseks liigi ja perekonna tasemel on (lihheniseerunud)

seente puhul kasutatud eelkõige ITS piirkonna järjestusi, samuti ka SSU-s paiknevaid

introneid. Viimasel ajal kasutatakse lihheniseerunud seente fülogeneesi uuringutes üha

rohkem ka valke kodeerivate geenide järjestusi (β-tubuliin, RPB jm.; Crespo et al. 2007; Thell

et al. 2002, 2009).

Hiljuti töötati välja uus fülogeneetiline marker, osaline DNA järjestus tuuma geenist Mcm7,

tuntud ka kui MS456. See geen kodeerib DNA replikatsiooni algatamises osalevat valku

(Aguileta et al. 2008; Kearsey & Labib 1998). Markeril tuvastati suur fülogeneetiline

potentsiaal kõigis päriskottseente (Pezizomycotina) rühmades (Schmitt et al. 2009). Leitud

kahe lookuse (Mcm7 ja Tsr1) põhjal koostatud fülogeneesipuu andis sama topoloogia, hea

lahutusvõime ja kõrged harude toetused, kui selles uuringus kasutatud kõigi teiste ühe

koopiaga geenide (135 geeni) liitmaatriksi põhjal koostatud konsensuspuu. Isegi sellised

tuntud ja paljudes töödes kasutatud valku kodeerivad geenid nagu RPB1, RPB2, TEF1α, β-

tubuliin ja γ-aktiin näitasid nende uute markerite kõrval suhteliselt nõrku tulemusi (Aguileta

et al. 2008). Uus marker on väidetavalt kasutatav ka palju enamatel tasonoomilistel tasemetel.

Enamikus seni avaldatud DNA tunnuseid analüüsivates töödes on perekond Vulpicida

monofüleetiline (Crespo et al. 2007; Mattsson & Wedin 1998; Thell et al. 2002, 2009; Wedin

et al. 1999). Lähimad sugulased perekonnale Vulpicida on liigid perekondadest Cetraria ja

Allocetraria (Crespo et al. 2001, 2007; Mattsson & Wedin 1998; Thell et al. 2002, 2004,

2009; Wedin et al. 1999). Mõnedel fülogeneesipuudel on perekonna liikide suhted jäänud

lahenduseta ja sellisel juhul pole tekkinud eristust perekonnast Allocetraria (Thell et al. 2004,

2009; JOONIS 1).

Konkreetselt perekonnale Vulpicida keskendunud DNA tunnuste põhjal koostatud ja

publitseeritud uuringuid pole. Uuringutes, kus kaasatud ka perekond Vulpicida, on

analüüsitud vaid ühte või mõnda liiki sellest perekonnast ning ka eksemplaride arv on jäänud

13

väikeseks (nt. Crespo et al. 2001, 2007; Thell et al. 2002, 2004, 2009). Üheski töös pole

analüüsitud koos kõiki kuut liiki ning kuni praeguseni polnud saadaval V. tilesii ITS järjestusi.

Liigid Vulpicida juniperinus ja V. tubulosus on morfoloogiliselt väga sarnased ning just

Eestist pärit vahepealsete vormide määraramisraskused on tõstatanud küsimuse, kas vastavad

liigid eristuvad DNA tunnuste alusel või mitte.

1.6. Töö eesmärgid

Minu töö eesmärkideks on

1) näha, kas morfoloogiliselt raskesti eristatavad liigid V. juniperinus ja V. tubulosus erinevad

üksteisest DNA tunnuste poolest;

2) juhul, kui erinevad, siis kuidas moodustuvad klaadid seostuvad morfoloogiliste tunnustega.

14

2. Materjal ja metoodika

2.1. Taksonid ja eksemplarid

Analüüsiks oli mul kasutada 79 eksemplari viiest Vulpicida liigist, millest 59 olid V.

juniperinus või V. tubulosus morfoloogiaga eksemplarid. Eksemplarid olid värskelt korjatud

Eesti läänesaartelt, herbaareksemplarid või laenatud teistest teadusasutustest (LD, UPS,

GZU). Lisaks laadisin avalikust GenBank andmebaasist (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) alla

kõik 11 perekonna Vulpicida ITS järjestust ning 27 ITS järjestust lähedastest perekondadest.

(LISA 2). Välisrühmaks valisin Cetraria islandica L. (Ach.). Mitmetes töödes on näidatud, et

perekond Cetraria Ach. sensu stricto on lähedalt sugulane perekonnaga Vulpicida (Crespo et

al. 2001, 2007; Mattsson & Wedin 1998). Kõigisse analüüsidesse olid kaasatud ka

Allocetraria esindajad. On näidatud, et perekond Allocetraria on perekonnale Vulpicida väga

lähedane ning mõningates töödes need kaks perekonda ei eristu (Thell et al. 2002, 2004,

2009; JOONIS 1).

2.2. Morfoloogiliste tunnuste määramine

Kõigil kättesaadavatel eksemplaridel (67 tükki) vaatlesin järgmiseid tunnuseid: substraat,

talluse värvus, kasvuvorm, pükniidide asetus, hõlmade kuju ja hõlmaservade paksus ning

millised paljunemisvahendid olid tallusel esindatud. Kõigi tunnuste näol on tegemist

perekonnale ajalooliselt oluliseks kujunenud tunnustega (vt. määramistabel: LISA 1).

Morfoloogiliste tunnuste määramiseks vaatlesin eksemplare stereomikroskoobi all (Olympus

SZ51). Tunnused kodeerisin tunnuseseisunditeks järgmiselt:

*Substraat: puu koor (ka puu juur); maapind

*Talluse värvus: erekollane; rohekas-kollane; roheline

*Kasvuvorm: lehtjas liibuvate hõlmadega; lehtjas tõusvate hõlmadega; põõsasjas (üldjuhul

püstised radiaalsümmeetrilised hõlmad)

*Pükniidide asetus: tallusesse süübinult; talluse peal; pükniidikandjatel

*Hõlmade kuju: dorsiventraalsed; radiaalsümmeetrilised

*Hõlmaservade paksus: õhuke; paksenev (tunnus eksisteerib vaid dorsiventraalsete hõlmade

puhul)

15

*Paljunemisvahendid: pükniidid; apoteetsiumid; soraalid; eelnimetatud paljunemisvahendid

puuduvad

Tunnuseseisundid kodeerisin lihtsamaks graafiliseks vaatlemiseks sümboliteks.

Morfoloogiliste tunnuste seisundid visualiseerisin programmiga FigTree v1.3.1 (Rambaut

2009) ning lõplikud joonised kujundasin programmiga Adobe Illustrator CS2 12.0.1 (Adobe

Systems Inc. 2005). Kõigi kättesaadavate eksemplaride liigiline kuuluvus on määratud autori

enda vaatluste põhjal.

2.3. DNA eraldus ja PCR

Enne proovide lisamist 2 ml mikrotuubidesse inspekteerisin samblikutalluseid hoolikalt

stereomikroskoobi all, et vältida seenparasiitide sattumist proovi. Talluse proovid puhastasin

samblikuainetest neile atsetooni lisades, dekanteerides ning nad seejärel kuivatades, kuna

mõningad samblikuained võivad inhibeerida PCR reaktsiooni (Crespo et al. 1998). Lisasin

proovidele 3 roostevaba 3 mm läbimõõduga kuuli ning purustasin tallusetüki kuuliveskis

(Mixer Mill 400, Retsch) 3-4 minuti jooksul sagedusel 30 Hz. DNA eraldamiseks kasutasin

kemikaalide komplekti Roche High Pure PCR Template Prepartation Kit, jälgides tootja

juhiseid. Eraldatud genoomse DNA lahust kasutasin tuuma ribosomaalse DNA ITS piirkonna

ning tuuma geeni Mcm7 (MS456) osalise järjestuse ülespaljundamiseks PCR meetodil.

Kasutasin järgnevaid praimereid (TABEL 1): ITS1F ja ITS4, Mcm7-709for (Anna) ja Mcm7-

1348rev (Sam) ning LecMCM7f ja LecMCM7r.

Tabel 1. Uuringus kasutatud praimerid.

Praimeri nimi Järjestus 5′–3′ Viide

ITS1F CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A Gardes & Bruns 1993

ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC White et al. 1990

Mcm7-709for (Anna) ACI MGI GTI TCV GAY GTH AAR CC Schmitt et al. 2009

Mcm7-1348rev (Sam) GAY TTD GCI ACI CCI GGR TCW CCC AT Schmitt et al. 2009

LecMCM7f TAC CAN TGT GAT CGA TGY GG Leavitt et al. 2011

LecMCM7r GTC TCC RCG TAT TCG CAT NCC Leavitt et al. 2011

16

PCR segu koosnes 13µl PCR Master Mix 2x segust (Fermentas) (sisaldades 0,05 u/µl Taq

DNA polümeraasi, 4mM MgCl2, 0,4 mM igat dNTP ja reaktsioonipuhvrit), 12,5 pmol

mõlemat praimerit, olenevalt lahjendusest vastav kogus genoomse DNA lahust ning vett kuni

mahuni 25 µl. PCR reaktsioonid viidi läbi termotsükleris (Tpersonal 48, Biometra). ITS

järjestuste üles paljundamiseks kasutasin kahte erinevat programmi:

(1)

*denaturatsioon 95,0˚C 5 min

*denaturatsioon 95,0˚C 1 min

*praimerite seondumine 50,0˚C 1 min 35 tsüklit

*ekstensioon 72,0˚C 1 min

*lõplik ekstensioon 72,0˚C 5 min

(2)

*denaturatsioon 94,0˚C 10 min

*denaturatsioon 94,0°C 30 sek

*praimerite seondumine 55,0˚C 30 sek 5 tsüklit

*ekstensioon 72,0˚C 1 min

*denaturatsioon 94,0°C 30 sek

*praimerite seondumine 52,0˚C 30 sek 30 tsüklit

*ekstensioon 72,0˚C 1 min

*lõplik ekstensioon 72,0˚C 5 min

Mcm7 järjestuste amplifitseerimiseks kasutasin tingimusi, mis pärinevad Schmitt et al. 2009

tööst:

*denaturatsioon 94,0˚C 10 min

*denaturatsioon 94,0˚C 45 sek

*praimerite seondumine 56,0˚C 50 sek 38 tsüklit

*ekstensioon 72,0˚C 1 min

*lõplik ekstensioon 72,0˚C 5 min

PCR tulemusi kontrollisin etiidiumbromiidiga värvitud 0,5% agaroosgeelil ning vaatlesin UV-

laual, mille järel salvestasin pildi digifotona. PCR produktid puhastati SAP/EXO meetodil

(Shrimp Alkaline Phosphatase and Exonuclease I). Sekveneerimisel kasutati PCR jaoks

kasutatud praimereid ning nukleotiidne järjestus määrati mõlemal DNA ahelal.

17

Sekveneerimise tellisime ning see viidi läbi Eesti Biokeskuse ja TÜ Molekulaar- ja

Rakubioloogia Instituudi DNA genotüpiseerimise ja sekveneerimise tuumiklaboris.

2.4. Sekventside joondamine ja fülogeneetilised analüüsid

Sekventse vaatlesin programmiga 4Peaks (mekentosj.com), kontrollides, et ei esineks

konflikte kahe DNA ahela järjestustes. Sekventside joondamiseks kasutasin tarkvara MAFFT

(Katoh et al. 2009) ja MacClade 4.08 (Maddison & Maddison 2000). Kõigi sekventsidega

tegin enne joondamist GenBank BLAST otsingu, et leida neile lähimad kanded selles

andmebaasis oma maatriksisse lisamiseks ning avastada parasiitseente ja muud soovimatud

järjestused andmetöötluse varases faasis. ITS järjestuste maatriksisse lisasin GenBank

andmebaasist alla laetud kõik saadaolevad perekonda Vulpicida kuuluvate taksonite ITS

järjestused ning lähedastesse perekondadesse kuuluvate taksonite ITS järjestusi, kokku 38 ITS

sekventsi (LISA 2).

Erinevate lookuste sekventsid joondasin eraldi andmetabelites, kuid samuti koostasin ühise

andmemaatriksi kõigi saadud tunnuste analüüsiks. Koos geenipangast (GenBank) laetud 38

sekventsiga koosnes suur ITS maatriks 104-st taksonist ning 519-st tunnusest. Mcm7 maatriks

sisaldas 61 taksonit ja 489 nukleotiidi positsiooni. Kahe lookuse ühismaatriks sisaldas neid

samu 61 taksonit ning 1017 nukleotiidi positsiooni. Lisaks analüüsisin 61 taksoniga Mcm7

andmetabelile vastavat väikest ITS maatriksit. Osadel järjestustel oli ITS järjestuse alguses

SSU intron. Intronid ning ka järjestuste alguses ja lõpus segaselt joonduvad (sageli madalama

kvaliteediga) alad eemaldasin maatriksist.

Võimalike rekombinatsioonide leidmiseks kasutasin programmi RDP (Martin et al. 2005b),

kus rakendasin järgmiseid rekombinatsiooni detekteerimise meetodeid: RDP (Martin &

Rybicki 2000), GENECONV (Padidam et al. 1999), Chimaera (Posada & Crandall 2001),

Maxchi (Maynard Smith 1992), Bootscan (Maynard Smith 1992; Martin et al. 2005a), SiScan

(Gibbs et al. 2000), 3Seq (Boni et al. 2007) ja LARD (Holmes et al. 1999).

Molekulaarse fülogeneesi uurimiseks analüüsisin suurt ja väikest ITS maatriksit, Mcm7 ja

ühismaatriksit Bayesi meetodil (B/MCMC) programmiga MrBayes 3.1.2 (Ronquist &

18

Huelsenbeck 2003) ja ka säästuprintsiibi e. parsimoonia meetodil programmiga PAUP*

4.0b10 (Swofford 2002).

B/MCMC analüüsis määrasin erinevatele DNA piirkondadele eraldi üksteisest sõltumatud

nukleotiidi-evolutsiooni mudelid. ITS järjestused jagasin funktsiooni järgi ITS1, 5,8S ja ITS2

regioonideks. Parimad mudelid regioonide jaoks selgitasin välja, kasutades AIC kriteeriumi

(Akaike Information Criterion – Akaike informatsioonikriteerium) programmis MrModeltest

2.3 (Nylander 2004). Määratud mudelite nimed suures ITS maatriksis: ITS1 – GTR+G; 5,8S –

K80+I ja ITS2 – SYM+G. Mcm7 geeni osalist järjestust eri piirkondadeks ei jaotanud.

Lookuste ühises analüüsis kasutatud evolutsioonimudelid: ITS1 – SYM+I; 5,8S – K80; ITS2

– K80+I; Mcm7 - K80+G. Lüngad, mis esinesid ainult ITS regioonis, kodeerisin võrdse

kaaluga numbrilisteks tunnusteks programmiga SeqState (Müller 2005, 2006), kuna MrBayes

tõlgendab lünki puuduvate andmetena, ega võimalda ilma ümber kodeerimata

deletsioonide/insertsioonide efektiivset kaasamist puu konstrueerimisse. Nii lisandus

kombineeritud lookuste B/MCMC analüüsis nukleotiidi positsioonidele 24 tunnust ning kõigi

ITS järjestuste analüüsis 42 tunnust.

Kõik B/MCMC analüüsid jooksutati neljal ahelal (3 ahelat kuumutatud temperatuuril

vastavalt ITS – 0,08; Mcm7 – 0,12 ja kombineeritud maatriks – 0,08) ning tehti kahes

paralleelses korduses. Ühelookuselistel analüüsidel arvutati 10 miljonit generatsiooni, kahe

lookuse analüüsil 12 miljonit generatsiooni. Analüüs algas kõigil juhtudel suvalisest puust.

Iga kahesajas puu salvestati. Kahe iseseisva analüüsi peale kokku saadi kõigi ITS järjestuste

analüüsil 100002 puud, millest kasutati konsensuspuu (50%) koostamiseks 80002 puud;

kombineeritud maatriksi analüüsil kasutati 100002 puud (12002-st). Puudest moodustati

enamuse (50%) konsensuspuu harude järeltõenäosustega (posterior probability, PP)

programmis MrBayes, millele arvutati harude keskmised pikkused, kasutades sumt käsku.

Säästuprintsiibi analüüsil hindasin klaadide toetusi mitteparameetrilise kingapaela meetodi

abil (parsimony bootstrap, PBS). Programmis PAUP arvutati heuristilise otsinguga 800

kingapaela replikaati, millest igaüks sisaldas 10 juhuslikku sekventside puule lisamise

kordust. Geenipuud ning samuti käsitsi kodeeritud morfoloogiliste tunnuste seisundid

visualiseerisin programmiga FigTree v1.3.1 (Rambaut 2009).

19

Klaade, mille PP≥95% ja PBS≥70%, peetakse selles töös hästi toetatuks. Kontrollisin

geenipuid vaadates, kas esineb hästi toetatud konflikte Mcm7 ja sellele vastaval väikesel ITS

maatriksil põhinevate ühe lookuse puude vahel.

20

3. Tulemused

3.1. DNA järjestused, rekombinatsioon ja ühe lookuse puude ühilduvus

79-st eksemplarist õnnestus saada 66 uut ITS järjestust ja 61 uut Mcm7 järjestust.

Intron nuITS1 ala ees asuva SSU järjestuse lõpus esines morfoliikide V. pinastri, V.

juniperinus ja V. tubulosus kõigil esindajatel ning ühel V. tilesii eksemplaril (VSP 16;

korjatud Siberist). Intron esines ka geenipangast (GenBank) allalaetud V. viridis järjestusel.

Intron puudus mõlemal V. canadensis ja kahel V. tilesii morfoloogiliste tunnustega

eksemplaril (TIL 03, TIL 04; korjatud Põhja-Ameerikast).

Ükski rekombinatsiooni detekteeriv meetod ei tuvastanud üheski meie kasutatud

andmemaatriksis rekombinatsiooni. Mcm7 ja sellele vastaval väikesel ITS maatriksil

põhinevate ühe lookuse puude vahel hea toetusega konflikte ei esinenud.

Käesolevas magistritöös esitan kaks Bayesi meetodil saadud fülogeneesipuud – ITS ja Mcm7

kombineeritud andmetel põhinev (JOONIS 6) ning ainult ITS järjestustel põhinev

konsensuspuu (JOONIS 7). Mõlemal puul on näidatud nii harude järeltõenäosused (posterior

probability, PP; haru peal) kui vastavate harude toetused säästuprintsiibil tehtud kingapaela

analüüsist (parsimony bootstrap, PBS; haru all). Kombineeritud tunnuste fülogrammile on

lisatud eksemplaride järgmised morfoloogilised tunnused: substraat, kasvuvorm, hõlmade

kuju, hõlmaservad ja paljunemisvahendid (JOONIS 8).

3.2. Kombineeritud maatriksil põhineva analüüsi tulemused

Bayesi meetodil analüüsitud ITS ja Mcm7 tunnuste 50% konsensuspuu on esitatud joonisel 6.

Puu jalamilt alustades eristuvad kõigepealt väga hea toetusega 3 klaadi: Allocetraria haru

(PP=100%; PBS=100%), liigi Vulpicida canadensis haru (PP=100%; PBS=100%) ja selle töö

fookuses olev morfoliike V. juniperinus, V. pinastri, V. tubulosus ja V. tilesii sisaldav haru

(PP=100%; PBS=96%). Viimati nimetatud klaad jaguneb omakorda kolmeks: V. juniperinus-

tubulosus klaad A, mis sisaldab nii V. juniperinus kui V. tubulosus eksemplare ning neile

lisaks 3 V. tilesii eksemplari; V. pinastri haru ning V. juniperinus-tubulosus klaad B.

21

Seejuures V. juniperinus-tubulosus klaad A moodustab monofüleetilise rühma V. pinasti

klaadiga (PP=95%, kuid PBS ainult 56%).

Klaadis A eristuvad eraldi harul hea toetusega kaks Jaapanist pärit V. juniperinus eksemplari.

Alamklaadideks jagunemist näeme seal klaadis rohkemgi, kuid need on nõrgalt toetatud.

Klaadis B on samuti märgata osaliselt väiksemateks klaadideks harunemist. Analüüsitud V.

canadensis eksemplarid asuvad ülejäänud taksonitest kaugemal ning nende sugulus keskse

rühmaga vajab tulevikus täpsemat selgitamist. Analüüsitud Allocetraria eksemplarid

moodustavad basaalse asetusega klaadi (PP=100%; PBS=100%) ning ei paigutu mind

huvitavate V. juniperinus-tubulosus klaadide sõsarrühmaks.

3.3. ITS järjestustel põhineva analüüsi tulemused

Bayesi meetodil analüüsitud suur ITS järjestuste konsensuspuu on esitatud joonisel 7.

Uuritavad liigid on ITS puul asetatud laiemasse fülogeneetilisse konteksti, kaasates

Geenipangas saadaolevaid sekventse neile teadaolevalt lähedastest taksonitest (LISA 2). ITS

järjestuste alusel moodustavad perekonna Vulpicida 5 liiki monofüleetilise klaadi (PP=97%,

kuid PBS ainult 56%). Uuritud V. juniperinus ja V. tubulosus eksemplarid kuuluvad ühte

monofüleetilisse rühma ka rohkem sugulasekandidaate arvestades. Vulpicida sekventsid

moodustavad viis kõrge toetusega monofüleetilist klaadi: V. juniperinus-tubulosus

(mittetäielik) klaad A (PP=100%, PBS 74%); klaad, mis koosneb kahest Jaapanist pärit V.

juniperinus eksemplarist (PP=96%, PBS 78%); V. pinasti rühm (PP=100%, PBS 100%); V.

juniperinus-tubulosus klaad B (PP=100%, PBS 100%) ning V. canadensis rühm (PP=100%,

PBS 100%). Esindatud on ka Geenipangast pärit ainuke V. viridis järjestus. Klaadi A

kuuluvad ka mõned sekveneeritud V. tilesii eksemplarid. Erinevalt kombineeritud puust

eristuvad klaadist A kaks Jaapanist pärit V. juniperinus eksemplari ning ei ole tõestatud, et

need kaks klaadi koos monofüleetilise rühma moodustaksid. Sellele vaatamata saame öelda,

et klaad A on tõenäoliselt lähemalt suguluses V. pinastri klaadiga, kui ülejäänud V.

juniperinus-tubulosus eksemplaridega klaadist B. ITS järjestuste alusel moodustab V.

juniperinus-tubulosus klaad B monofüleetilise rühma V. canadensis ja V. viridis

eksemplaridega.

22

JOONIS 6. Bayesi meetodil rekontsrueeritud kombineeritud andmemaatriksil põhinev enamuse (50%) konsensuspuu. Kasutatud on tuuma ITS ja Mcm7 järjestusi. Klaade, mille PP≥95% ja PBS≥70%, peetakse selles töös hästi toetatuks. Joonisel on tähistatud liikide V. juniperinus ja V. tubulosus klaad A ja klaad B.

23

JOONIS 7. Bayesi meetodil rekonstrueeritud nuITS järjestustel põhinev enamuse (50%) konsensuspuu. Klaade, mille PP≥95% ja PBS≥70%, peetakse selles töös hästi toetatuks. Joonisel on näidatud perekonna moodustav monofüleetiline klaad ning V. juniperinus-tubulosus klaad A ja B.

24

JOONIS 8. Allkiri järgmisel lehel.

25

JOONIS 8 (eelmisel lehel). Tuuma ITS ja Mcm7 järjestustel põhinev fülogeneesipuu, kuhu on

tulpadena lisatud morfoloogilised tunnused ning sümbolitega tähistatud tunnuse seisundid.

Tunnus 1 – SUBSTRAAT: - maapind, - puu koor; Tunnus 2 – KASVUVORM: -

lehtjas liibuv, - lehtjas tõusvate hõlmadega, - põõsasjas; Tunnus 3 – HÕLMADE KUJU:

- dorsiventraalsed, - radiaalsümmeetrilised; Tunnus 4 – HÕLMASERVAD: - lapikud,

- paksenevad, - - tunnus puudub; Tunnus 5 – PALJUNEMISVAHENDID: P – pükniidid, A -

apoteetsiumid, S – soraalid, 0 – apoteetsiumid, pükniidid, soraalid puuduvad; ? – info puudub.

Eksemplari tunnus on joonisel esindatud rohkem kui ühe sümboliga juhul, kui tallusel

esinesid tunnuse vastavad seisundid rohkem või vähem võrdsel määral. Joonisel on tumedama

halliga märgitud V. tubulosus morfoloogiaga eksemplarid ning heledama halliga V.

juniperinus morfoloogiaga eksemplarid. Joonisel on eraldi välja toodud V. pinastri klaad.

3.4. Morfoloogilised tunnused ning nende vastavus kahe lookuse fülogeneesipuule

Uuritud eksemplaride olulisemate morfoloogiliste tunnuste seisundid on koos ITS+Mcm7

fülogeneesipuuga näidatud joonisel 8. Tunnuste vastavust geenipuu klaadidele käsitletakse

töö arutelu osas.

26

4. Arutelu

4.1. Töö peamised resultaadid

Käesolevas töös avaldatud ITS ja Mcm7 tunnustel baseeruv DNA lookuste fülogeneesi

rekonstruktsioon (JOONIS 6) näitab, et molekulaarsete tunnuste alusel jagunevad V.

juniperinus ja V. tubulosus eksemplarid kaheks hästi toetatud klaadiks, millest üks (klaad A)

on tõenäoliselt lähemalt suguluses liigiga V. pinastri, kui ülejäänud V. juniperinus ja V.

tubulosus taksonitega (klaad B). Ühegi tehtud analüüsi tulemuste kohaselt ei ole võimalik

eristada monofüleetilist klaadi üksnes V. juniperinus/tubulosus sekventsidega ilma V. pinastri

esindajateta, mis on vastuolus meie algse oletusega, et tegu võib olla pigem ühe

morfoloogiliselt varieeruva liigiga. Klaadid A ja B ei vasta morfoliikidele V. juniperinus ja V.

tubulosus, kuna mõlemas klaadis on mõlema morfoliigi täiesti selge ja täieliku

tunnustekomplektiga eksemplare ning seega ei saa väita, et klaadi A näol on tegu V.

juniperinus liigiga ning klaadi B näol V. tubulosus liigiga.

4.2. Metoodilised tähelepanekud

Sekventsi kvaliteedid ITS järjestustel olid väga head, eriti rakendades 2. PCR programmi.

Mcm7 järjestuste PCR õnnestumise protsent oli Anna ja Sam praimerite puhul väiksem ning

sekventside kvaliteedid olid sageli halvemad. LecMCM7f ja Lec MCM7r andisid kvaliteedi

osas paremaid tulemusi. 79-st eksemplarist õnnestus algsete Mcm7 praimeritega (Anna +

Sam) saada vaid 44 eksemplari Mcm7 järjestused (ITS puhul 66 eksemplari järjestused). Selle

praimeripaari kehvemaid tulemusi võib põhjendada kahe asjaoluga:

(1) Mcm7 lookus on genoomis vaid ühes korduses ning seetõttu tema füüsiline DNA kogus

on väiksem kui ITS järjestustel, mida on genoomis palju kordusi. Ühe koopiaga lookuse

puhul on eriti oluline genoomse DNA kvaliteet ning proovi puhtus (Crespo et al. 1998).

Juhtudel, kui selle töö käigus sekveneeritud ITS andis tulemuseks parasiidi sekventsi või

parasiidi ning peremehe DNA segu, ei õnnestunud neist eksemplaridest Mcm7 järjestuse üles

amplifitseerimine või tuli sekvents loetamatu.

(2) Käesolevas töös kasutatud Schmitt ja teiste (2009) poolt välja töötatud praimerid on

lagupraimerid, mis kujutavad endast erinevate järjestustega oligonukleotiidide segu ning

27

järjestuses esineb ka desoksüinosiini, mille seondumisspetsiifilisus ja -tugevus on väga madal

(Linhart & Sahmir 2002).

Töö käigus töötati välja uued tsetrarioidsete samblike spetsiifilised praimerid, mida praegu

testitakse. Sel kevadel avaldatud seltsi Lecanorales spetsiifilised praimerid LecMCM7f ja Lec

MCM7r (Leavitt et al. 2011) on samuti andnud üsna häid tulemusi.

Fülogeneesi rekontstrueerimiseks kasutasime erinevatesse paradigmadesse kuuluvaid

meetodeid. Esiteks kasutasime Bayesi meetodit, mis võimaldab rakendada keerukaid

nukleotiidide asenduse mudeleid parameetrilises statistilises raamistikus andmetabeli eri

osadele sõltumatult, hinnates ka tulemuste olulisustõenäosust. Tegime ka säästuprintsiibist

lähtuvad analüüsid, kaasaarvatud mitteparameetrilisel kingapaela meetodil klaadide toetuste

hindamiseks. Viiasel juhul nukleotiidide asenduse mudeleid ei kasutata ja andmeid osadeks ei

jagata. Toetused puu harudele erinesid meetodite puhul. Bootstrap meetodil ei ole erinevalt

Bayesi järeltõenäosustest toetatud perekonna Vulpicida analüüsitud eksemplaride

monofüleetilisus ega ka V. juniperinus-tubulosus klaadi A lähem sugulus V. pinastri klaadiga

võrreldes ülejäänud V. juniperinus-tubulosus eksemplaridega. Madalamad kingapaela meetodi

toetused olid eeldatud, kuna klaadide Bayesi järeltõenäosused võivad mõnikord olla üle

hinnatud, eriti juhtudel, kus puu harud on lühikesed. Kontrastina peetakse kingapaela

meetodil saadud toetusi enamasti väga konservatiivseks ja seega klaadi toetuse alampiiri

hinnanguks (Douady et al. 2003).

4.3. Morfoloogiliste tunnuste määramine ning tunnuste seisundite ja morfoliikide vastavus fülogeneesipuudele

Liikide V. juniperinus ja V. tubulosus morfoloogiline eristamine on keeruline, kuna tunnuste

seisundid on suures ulatuses kattuvad. Näiteks, liigil V. juniperinus peaksid pükniidid

asetsema tallusel pükniidikandjatel ja liigil V. tubulosus kas pükniidikandjatel või tallusesse

süübinult. Minu vaadeldud eksemplaride järgi võib öelda, et pükniidide paigutuse järgi

tallusel ei ole siiski võimalik morfoliike V. juniperinus ja V. tubulosus eristada. Enamusel

eksemplaridel esineb rohkem kui üks tunnuse seisund ning liikide vahel on tunnuse

seisundites tugev kattumine. Nii võib ühel eksemplaril olla osa pükniide pükniidikandjatel,

osa tallusesse süübinult ning veel vahepealsed, mis asuvad talluse peal ning seda nii ühe, kui

teise liigi puhul. Sarnane situatsioon valitseb ka mitmetes teistes eristamiseks kasutatavates

28

morfoloogilistes tunnustes. Näiteks Eestist pärit V. junierinus ja V. tubulosus eksemplare pole

värvuse järgi võimalik eristada, kõik on suhteliselt ühtlaselt rohekas-kollase värvusega.

Jaapanist pärit V. juniperinus eksemplarid eristuvad ülejäänutest tumedama rohelise talluse

poolest ning teised klaadi A kuuluvad väljastpoolt Eestit pärit eksemplarid, seal hulgas V.

tilesii esindajad, oma eredama kollase värvuse poolest. Klaadis B asuvad eksemplarid ei eristu

värvuse poolest. Liiga väikese informatiivsuse tõttu pole tunnuseid „värvus“ ega „pükniidide

asetus“ fülogeneesipuule kantud.

Uuritud eksemplaride olulisemate morfoloogiliste tunnuste seisundid on koos ITS+Mcm7

fülogeneesipuuga näidatud joonisel 8. Tulemustest näeme, et nii V. juniperinus kui V.

tubulosus morfoloogiaga eksemplarid kasvavad nii maapinnal kui puu koorel. V. juniperinus

eksemplarid on kasvutüübi poolest lehtjad või lehtjad tõusvate hõlmadega, V. tubulosus

eksemplarid põõsasjate või lehtjate tõusvate hõlmadega. Vaid vähestel eksemplaridel olid

kõik talluse hõlmad üksnes radiaalsümmeetrilised. Üldjuhul olid radiaalsümmeetrilised talluse

sisemised harud ning tipud, vahepealne talluse osa oli dorsiventraalne. Noored tallused ning

vanade talluste noored hõlmad on dorsiventraalse ehitusega, olenemata morfoliigist.

Hõlmaservade paksus osutub oluliseks tunnuseks määramisel, kui radiaalsümmeetrilisus ei

ole tallusel valdav. Mitmetel juhudel oli tallusel nii õhukeste (eriti noored hõlmad, aga ka

vanad) kui paksenevate hõlmaservadega hõlmi. Üldjuhul, kui tallusel valdasid paksenevad

hõlmaservad, määrasin eksemplari liigiks V. tubulosus, olenemata eelmistest tunnustest.

Kõigil vaadeldud V. juniperinus ja V. tubulosus morfoloogiaga eksemplaridel esinesid

pükniidid, mõningatel, olenemata liigist, ka apoteetsiumid. V. tilesii eksemplarid eristusid

paljunemisvahendite puudumise poolest.

Ühegi vaadeldud tunnuse järgi ei eristu klaadid A ja B (joonis 8); need ei vasta morfoliikidele

V. juniperinus ja V. tubulosus, küll aga võib märgata tunnustes teatud tendentsi, mille järgi V.

juniperinus-tubulosus klaadi A kuulub rohkem V. juniperinus morfoloogiaga eksemplare ning

klaadi B rohkem V. tubulosus morfoloogiaga eksemplare. Siiski on mõlemas klaadis nii

selgelt V. juniperinus kui V. tubulosus morfoloogiaga eksemplare ning lisaks ka mitmeid kahe

morfoliigi vahepealsete tunnustega talluste sekventse. Huvitavaks tähelepanekuks on see, et

klaadis A esinevad V. tubulosus morfoloogiaga eksemplarid on kõik pärit Eestist. Klaad B

sisaldab mõlema morfoliigi Eestist ja Rootsist pärit eksemplare (ITS puul on ka andmebaasist

pärit Soome V. juniperinus ja Austria V. tubulosus).

29

V. pinastri moodustab kõigil fülogeneesipuudel tugevalt toetatud monofüleetilise klaadi, mida

on võimalik eristada teistest eksemplaridest ka morfoloogiliselt, nimelt servasoraalide

esinemise poolest. V. pinastri eksemplarid on lehtja dorsiventraalsete hõlmadega talluse

poolest pigem sarnased tüüpiliste V. juniperinus esindajatega. V. pinastri klaadi lähedasem

sugulus klaadiga A DNA tunnste alusel (kuigi mitte toetatud PBS poolt), oleks seega

morfoloogiaga kooskõlas.

Kui me usume, et V. pinastri on iseseisev liik, siis oleks mõistlik pidada ka klaadi A

ning klaadi B iseseisvateks liikideks. Praegune liikide V. juniperinus ja V. tubulosus käsitlus

muudab need liigid saadud fülogeneesipuul polüfüleetiliseks. Käesolevas töös vaadeldud

morfoloogiliste tunnuste abil ei ole võimalik neid kahte klaadi morfoloogiliselt selgelt

eristada.

4.4. Fülogeneesipuude võimalikud tõlgendused

Käesolevas töös on esitatud kaks fülogeneesipuud, ITS järjestuste ning ITS ja Mcm7

kombineeritud järjestuste puu. Kombineeritud puu põhineb suuremal DNA andmete mahul

ühe eksemplari kohta ning on seega tõenäoliselt usaldusväärsem fülogeneesi rekonstruktsioon

uuritavas rühmas. ITS puul on töö fookuses olevad liigid asetatud laiemasse fülogeneetilisse

konteksti, et välistada mõne teise teadaolevalt lähedase rühma sõsarlust uuritavate

taksonitega. Saadud ITS puu on kooskõlas teiste uuringutega (Thell et al. 2002, 2004, 2009).

Evolutsiooniline liigikontseptsioon eeldab, et liigid on monofüleetilised (de Queiroz 1998,

2007), kuid analüüsitud sekventside järgi on morfoliigid V. juniperinus ja V. tubulosus

polüfüleetilised. Morfoloogiliselt raskesti eristatavate liikide puhul on alati risk eksemplaride

valesti määramiseks. Seetõttu keskendusin eksemplari morfoloogiliste tunnuste vaatlemisele,

et võrrelda geenipuudega suuremat andmehulka ning sealjuures vaadata, kas mõni tunnus

vastab geenipuul toetatud klaadidele. Näilist polüfüüliat võib põhjustada ebapiisav või

ebaadekvaatne andmehulk (Funk & Omland 2003). Fülogeneesi algoritmid koostavad

topoloogiad olenemata, kui palju ja missuguse kvaliteediga informatsioon ette on antud.

Seega, kui uuritav geen evolutsioneerub liiga aeglaselt võrreldes liigitekke kiirusega või kui

liiga väike osa geenist on uurimise all, siis need andmed ei pruugi sisaldada piisaval hulgal

sünapomorfe taksonite lahutamiseks. Andmete piisavuse ning kvaliteedi kontrolliks

kasutatakse erinevaid kvantitatiivseid puude harude toetuste hindamise meetodeid. Oluliste

30

klaadide toetused minu puudel olid enamjaolt väga head. See annab kindluse, et saadud

topoloogia näol pole pelgalt tegu ebapiisava informatsiooni artefaktiga. Funk ja Omland

(2003) leidsid, et 2/3 polüfüülia juhtumitest (avaldatud tunnustatud ajakirjades 1990-2002) oli

toetatud ≥70% kingapaela (bootstrap) toetusega. Seega pole andmete ebapiisavus peamine

kirjeldatud liikide ning avaldatud geenipuude ühildumatuse põhjus.

Domineerivaks kontseptsiooniks on ajalooliselt olnud morfoloogiline liigikontseptsioon ning

liikide määramiseks on kasutatud morfoloogilist liikide standardit. On näidatud, et tihti

sisaldab üks morfoloogiline liik rohkem kui üht bioloogilist või fülogeneetilist liiki ehk

teisisõnu morfoloogline liigi standard ei võimalda alati eristada evolutsiooniliselt mõttekaid

liike ning liigipiirid on valesti määratud (Agapow et al. 2004). Valesti määratud liigipiirid on

üheks polüfüülia põhjuseks. Sagedasemaks juhtumiks on liikide kokkuklasterdamine, kus

erinevate liikide varieeruvust peetakse liigisiseseks varieeruvuseks. Sellisel juhul kasutatud

taksonoomia hindab liigi piire laiemaks. Liikide kokkuklasterdamine on tavaline, kui eri liike

on üksteisest väga keeruline morfoloogiliselt eristada. Kokku klasterdatud nn. krüptilised

liigid saame geenipuu abil tuvastada, kui teine kirjeldatud selgelt eristatav liik on lähemalt

suguluses krüptilise liigiga, võrreldes krüptiliste liikide sugulusega omavahel. Sellisel juhul

näeme geenipuul polüfüüliat, kus nn tuntud liik lahutab krüptiliste liikide kompleksi, mida

algselt peeti üheks liigiks (Funk & Omland 2003; Crespo & Pérez-Ortega 2009). Kui

rakendada seda teooriat liikide V. juniperinus ja V. tubulosus kompleksis, siis võib öelda, et

liik V. pinastri lahutab morfoloogiliselt eristamatud krüptilised liigid, mis geenipuudel

vastavad V. juniperinus-tubulosus klaadile A ja klaadile B. Morfoloogiliste tunnuste

eristumatuse üheks põhjuseks võib olla ühise eellase säilinud morfoloogia (sünplesiomorf),

kuid sama polüfüleetiline muster võib tekkida ka siis, kui liikides on toimunud sarnase

morfoloogia konvergentne evolutsioon (homoplaasia). Tõenäoliselt võib klaadide A ja B näol

olla tegu krüptiliste liikidega ning nende eristamine on praegu võimalik vaid DNA tunnuste

alusel. Vaadates mutatsioonide arvu järjestustes ning vähest eristumist muude tunnuste alusel

võime arvata, et tegu on suhteliselt noore liigikompleksiga, kuhu kuuluvad ka V. tilesii ja V.

pinastri.

Oluliseks geenipuul ilmneva morfoliigi sisese polüfüülia põhjusteks peetakse noorte liikide

käimasoleva tekkega seotud mittetäielikku liinide sorteerumist (incomplete lineage sorting;

Funk & Omland 2003; Knowles & Carstens 2007; de Queiroz 2007). Morfoliigid V.

juniperinus ja V. tubulosus ei vasta geenipuu klaadidele, vaid paiknevad neis segiläbi.

31

Morfotüüpide sellist jaotust võime näha, kui parasjagu toimub tekkivate liikide ühiselt

eellaselt päritud polümorfsete alleelide sorteerumine ning kinnistumine. Kui geen on

polümorfne ning sisaldab kahte alleeli (A, B) ühe liigi isendite hulgas, siis fülogeneetilise

liigikontseptsiooni järgi võiks alleeli A sisaldavad organisme pidada eraldi liigiks ning

alleeliga B isendeid teiseks liigiks. Sellist pilti näeme, kui alleelide lahknemine on jõudnud

lõpule ning tütarliikides kinnistunud alleelid on monofüleetilised (JOONIS 9). Sellele võivad

aga eelneda polüfüüliat ja parafüüliat sisaldavad etapid, kus neutraalse valiku korral alleelile

võib algse alleeli polümorfsus populatsioonis säilida määramata aja ning muude tunnuste,

kaasa arvatud DNA lookuste alusel eristuvad liigid võivad antud geeni suhtes jäädagi

polümorfseteks (Funk & Omland 2003).

JOONIS 9. Eellase polümorfse geeni alleelide eristumine tütarliikide tekkel. Algselt on

fülogeneesipuu eeldatult polüfüleetiline. Aja jooksul toimub alleelide sorteerumine ning

fikseerumine osade alleelide kadumise ning mutatsioonide teel. Kui alleelide lahknemine on

jõudnud lõpule, siis tütarliikides kinnistunud alleelid on monofüleetilised (Taylor et al. 2000).

Ühe liigi alleelid võivad sattuda teise liigi geenifondi ka läbi liikidevahelise ristumise ning

hübriidsed alleelid võivad tagasiristumise kaudu sattuda ka tagasi vanempopulatsiooni. Seda

protsessi nimetatakse introgressiivseks hübridiseerumiseks või introgressiooniks.

Hübridiseerumise üheks võimalikuks detekteerimise viisiks on rekombinatsiooni otsimine

32

järjestustest erinevate meetodite abil (Posada & Crandall 2001). ITS kompleksis ning osalises

Mcm7 järjestuses (ega ka nende ühismaatriksis) ei leitud ühtegi rekombinatsiooni juhtu ning

seega me saame öelda, et neis lookustes uuritud erinevate alleelide vahel rekombinatsiooni ei

ole toimunud ning meie tulemused ei ole järjestuste vahelisest rekombinatsioonist mõjutatud.

4.5. Suunad edasiseks uurimiseks

Käesolev töö on tõstatanud mitmeid uusi probleeme uuritud taksonite rühmas. Analüüs

sisaldas ka mõnda V. tilesii eksemplari, mis fülogeneesipuul paigutusid V. juniperinus ja V.

tubulosus klaadi A. Kuna keegi kunagi varem polnud V. tilesii DNA järjestust analüüsinud,

siis me ei osanud taksoni sellist asetust eeldada. ITS järjestuste alusel erinesid kaks Põhja-

Ameerika V. tilesii isendit ülejäänud V. juniperinus-tubulosus eksemplaridest vaid ühe

nukleotiidi asenduse ning introni puudumise poolest. V. juniperinus-tubulosus klaadide A ja B

nimetamine liikideks on võimalik alles peale liigi V. tilesii staatuse lahendamist. Samuti on

nomenklatuurimutuste tegemiseks vajalik analüüsi lisada tüüpeksemplarid või uued

eksemplarid tüüpleiukohast. Nii vanade liikide puhul nagu uuritavad V. juniperinus ja V.

tubulosus on enamasti tüüpeksemplaride kasutamine molekulaarseteks analüüsideks

välistatud. Käesolevas töös on liik V. juniperinus esindatud tüüpleiukohaga (Flatruet, Rootsi;

laborikood JUN 16), V. tubulosus tüübi leiukohast korjatud eksemplar on plaanis lisada

tulevikus.

Mittetäielikust liinide sorteerumisest tingitud polüfüülia usaldusväärseks välistamiseks

on tarvis sekveneerida olemasolevatele lisaks 1–2 DNA lookust ning rakendada nimetatud

nähtust arvesse võtvat spetsiaalset tarkvara (Degnan & Rosenberg 2009, Kubatko et al. 2009).

ITS puul moodustas V. juniperinus-tubulosus klaad B hästi toetatud monofüleetilise klaadi V.

canadensis ja V. viridis järjestustega. Mcm7 järjestuste alusel ning ka kombineeritud tunnuste

puul sellist sugulust ei ilmnenud. Nende taksonite vaheliste fülogeneetiliste suhete

selgitamiseks oleks tarvilik lisada analüüsi rohkem V. canadensis ja V. viridis eksemplare.

Perekonna kõikide liikide piisava eksemplaride hulga olemasolul saab kindlamalt uurida ka

perekonna monofüleetilisust.

33

Kokkuvõte

Lihheniseerunud seeneperekonda Vulpicida kuulub 6 liiki, millest Eestis on esindatud kolm –

V. juniperinus, V. pinastri ja V. tubulosus. V. juniperinus ja V. tubulosus on omavahel

morfoloogiliselt väga sarnased. Samuti kasvavad nad mõlemad Eestis peamiselt läänesaartel

loopealsetel aladel. Ajalooliselt on kujunenud arvamus (mis väljendub ka liikide nimedes:

kadaka- ning loo-rebasesamblik), et V. juniperinus kasvab harilikul kadakal ja V. tubulosus

maapinnal. Tegelikkuses võivad mõlema morfoliigi tallused kasvada nii maapinnal kui puu

koorel. Sarnane kattumine on ka morfoloogilistes tunnustes, mida liikide autorid on kasutanud

nende eristamiseks liigikirjeldustes. Kattuvate tunnuste hulka kuuluvad samblike hulgas laialt

kasutatud kasvuvorm, värvus, paljunemisvahendid, aga ka spetsiifilisemalt uuritavate liikide

jaoks kasutatavad hõlmade kuju tunnused. Eriliselt probleemseks on osutunud just Eestist

pärit vahepealsete vormide määramine.

Kui liikide morfoloogiline eristamine on raskendatud, võivad olla küsitavad ka liikide

olemasolu ning evolutsiooniline erinevus. Vastuse võivad anda DNA tunnuste analüüsid.

Oma töös analüüsisin 61 eksemplari tuuma DNA ITS ja Mcm7 järjestusi ühises

maatriksis Bayesi ja parsimoonia meetodil. Lisaks tegin vaid ITS järjestustel põhineva Bayesi

meetodil konstrueeritud fülogeneesipuu, kuhu olid lisatud Geenipanga andmebaasist pärit

kõik perekonna Vulpicida ITS järjestused ning teadaolevalt lähedastest perekondadest pärit

järjestusi, et paigutada uuritavad taksonid laiemasse fülogeneetilisse konteksti. Töös esitatud

Bayesi järeltõenäosustega fülogrammidele on lisatud klaadide toetused parsimoonia

kingapaela meetodi järgi. Kogu ITS puu koosnes 104-st sekventsist, kahe lookuse puu 61-st

sekventsist. Vaadeldud eksemplaridest 59 esindas V. juniperinus või V. tubulosus

morfoloogiat. Lisaks vaatlesin kättesaadavate eksemplaride (67 tk) morfoloogilisi tunnuseid

ning määrasin tunnuse seisundid, et võrrelda saadud geenipuid määramiseks kasutatavate

tunnustega ning nende põhjal määratud morfoliikidega.

Uuringu käigus leidsin, et töös kasutatud V. juniperinus ja V. tubulosus eksemplarid

jagunevad DNA tunnuste alusel kahte selgelt eristuvasse klaadi, millest üks on tõenäoliselt

lähemalt suguluses liigiga V. pinastri kui ülejäänud uuritud V. juniperinus ja V. tubulosus

eksemplaridega. Olulised klaadid on puudel väga heade toetustega. Morfoloogiliste tunnuste

34

järgi paigutuvad töös käsitletavad morfoliigid klaadidesse segiläbi ehk uuritud eksemplaride

järgi on V. juniperinus ja V. tubulosus polüfüleetilised. Võib küll näha tendentsi, et liigiga V.

pinastri lähemas suguluses olevas klaadis (klaad A) esineb rohkem tüüpilise V. juniperinus

morfoloogiaga eksemplare ja liigist V. pinastri kaugemas klaadis (klaad B) rohkem tüüpilise

V. tubulosus morfoloogiaga eksemplare, kuid siiski mõlemas klaadis esineb mõlema

morfoliigi täiesti selge ja täieliku tunnustekomplektiga eksemplare ning seega ei saa väita, et

klaadi A näol on tegu V. juniperinus liigiga ning klaadi B näol V. tubulosus liigiga.

Olemaks kindel, et tulemused pole rekombinatsioonist mõjutatud, otsisin

olemasolevatest järjestustest ning ka nende ühismaatriksist rekombinatsiooni juhte spetsiaalse

tarkvara abil (RDP). Rekombinatsioone ei tuvastatud kummagi lookuse järjestustes ega ka

nende ühismaatriksis.

V. juniperinus/tubulosus klaadid A ja B võivad olla krüptilised liigid, mida praegu suudame

eristada vaid DNA tunnuste alusel. Fülogeneesipuude topoloogia ning morfoliikide vähene

eristumist muude tunnuste alusel viitab, et tegu võib olla suhteliselt noore liigikompleksiga,

kuhu kuuluvad ka V. pinastri ja V. tilesii. Morfotüüpide polüfüleetiline jaotumine klaadide

vahel võib olla seotud ka noorte liikide käimasoleva tekkega seotud mittetäieliku liinide

sorteerumisega (incomplete lineage sorting), kus eellase polümorfsete alleelide jagunemine

ning kinnistumine pole veel lõpuni kujunenud.

35

Separation of two species of lichenized fungi – Vulpicida juniperinus and

V. tubulosus – using DNA characters Kristiina Mark

Summary

Genus Vulpicida consists of 6 species of lichenized fungi, from which three are found in

Estonia – V. juniperinus, V. pinastri and V. tubulosus. Species V. juniperinus and V. tubulosus

are morphologically very similar. In Estonia, they both are found growing mostly on Western-

Estonian islands on alvars. Historically V. juniperinus is thought to grow on Juniperinus

communis and V. tubulosus on calciferous ground. Both of them can actually grow on ground

as well as on bark. Similar over-lapping is observed in morphological characteristics that the

authors of the species have used in the species descriptions to distinguish these taxa. Among

these are the characters widely used with lichens – growth form, colour, different

reproductive structures – but also the ones describing the shape of lobes that are more specific

to the focal taxa of this study. Intermediate forms of these two taxa in Estonia have appeared

to be especially problematic.

When morphological distinction of the species is complicated, species’ reality and their

evolutionary difference can be questioned. Analyzing DNA sequences can help to answer this

question.

In my work I analyzed concatenated ITS and Mcm7 sequences of nuclear DNA from 61

specimens with Bayesian and parsimony methods. In addition, phylogenetic trees with

Bayesian approach were constructed using only ITS sequences. For this, all available genus

Vulpicida ITS sequences from GenBank were added to the matrix together with selected

sequences from genera known to be close to Vulpicida. The significance of this analysis was

to put the studied taxa in a broader evolutionary context. In the Bayesian phylograms

presented in this paper the posterior probabilities and parsimony bootstrap values are given

for the branches. The full ITS matrix consisted of 104 sequences and the combined matrix of

61 sequences. 59 samples represented morphology of V. juniperinus or V. tubulosus. In

addition, I observed morphological characteristics of all available specimens (67) and

determined all character states to compare the gene trees with the morphological traits and the

morphospecies determined by these traits.

36

My research shows that V. juniperinus and V. tubulosus specimens used in this study are

divided into two clearly distinguished groups by the DNA characters. One of the groups is

possibly more closely related to V. pinastri than to the other clade of V. juniperinus and V.

tubulosus sequences. The important groups on the trees are well supported. The

morphospecies are mixed between the clades in the gene trees so that V. juniperinus and V.

tubulosus are polyphyletic according to our samples. The tendency can be seen that more

specimens with the typical V. juniperinus morphology are located in clade that is possibly

more closely related to V. pinastri (“clade A” in the trees) and the clade further from V.

pinastri (clade B) includes more specimens with the characteristic V. tublosus morphology.

However, both clades include specimens belonging to both morphospecies, exhibiting full

sets of clearly expressed character states. Therefore we cannot say that clade A is equivalent

to the species V. juniperinus and clade B to the species V. tubulosus.

To exclude the possibility of our results being affected by recombination I searched the

recombination events with special program (RDP) from obtained sequences but also from the

combined matrix. No events of recombination were detected in either of the loci or their

combined matrix.

Clades A and B of V. juniperinus/tubulosus could represent cryptic species that we can only

distinguish by molecular methods at this moment. We could theorize looking at the topology

of the phylogenetic trees and the weak distinction in morphology that what we see is a

relatively young species complex that includes also V. pinastri and V. tilesii. Additionally, the

polyphyletic distribution of morphospecies between clades could theoretically be connected

with incomplete lineage sorting that is often connected with early stages of speciation. In this

case, the ancestor’s polymorphic alleles could still be in the process of sorting, so that the loci

have not yet become fixed.

37

Tänuavaldused

Soovin tänada oma juhendajat, Lauri Saagi, kes oli abiks töö igas etapis – laboritöös,

andmebaasistamisel, töös analüüsiprogrammidega ning andis soovitusi töö kirjutamisel.

Tänan Tiina Randlast magistritöö teema soovitamise ning muude näpunäidete ning Andres

Saagi arvutiabi eest. Ilma inimesteta, kes kogusid, korjasid ja saatsid sambikeeksemplare, ei

oleks töö sellises mahus valmimine olnud võimalik – aitäh Inga, Ede, Tiiu, Piret, Arne, Göran

ja teised.

38

Kasutatud kirjandus

Adobe Systems Inc. 2005. Adobe Illustrator CS2 version 12.0.1. San Jose, CA, USA.

Agapow, P.-M., Bininda-Emonds, O. R. P., Crandall, K. A., Glittleman, J. L., Mace,G. M.,

Marshall, J. C. & Purvis, A., 2004. The impact of species concept on biodiversity

studies. The Quarterly Review of Biology 79(2): 161-179.

Aguileta, G., Marthey, S., Chiapello, H., Lebrun, M. H., Rodolphe, F., Fournier, E.,

Gendrault-Jacquemard, A., Giraud, T., 2008. Assessing the performance of single-copy

genes for recovering robust phylogenies. Systematic Biology 57: 613–627.

Blanco, O., Crespo, A., Ree, R. H. & Lumbsch, H. T., 2006. Major clades of parmelioid

lichens (Parmeliaceae, Ascomycota) and the evolution of their morphological and

chemical diversity. Molecular Phylogenetics and Evolution 39: 52–69.

Boni, M. F., Posada, D. & Feldman, M. W., 2007. An exact nonparametric method for

inferring mosaic structure in sequence triplets. Genetics 176: 1035-1047.

Brodo, I. M., 1986. Interpreting chemical variation in lichens for systematic purposes.

Bryologist 89: 132-138.

Crespo, A. & Pérez-Ortega, S., 2009. Cryptic species and species pairs in lichens: A

discussion on the relationship between molecular phylogenies and morphological

characters. Anales del Jardín Botánico de Madrid 66(1): 71-81.

Crespo, A., Blanco, O., Hawksworth, D. L., 2001. The potential of mitochondrial DNA for

establishing phylogeny and stabilising generic concepts in the parmelioid lichens.

Taxon 50: 807-819.

Crespo, A., Cubero, O. & Grube, M., 1998. PCR application in studies of lichen-forming

fungi. In: P.D. Bridge, D.K. Arora, C.A. Reddy and R.P. Elander, Editors, Applications

of PCR in Mycology, CABI, Wallingford pp 85–105.

Crespo, A., Lumbsch, H. T., Mattsson, J.-E., Blanco, O., Divakar, P. K., Articus, K.,

Wiklund, E., Bawingan, P. A. & Wedin, M., 2007. Testing morphology-based

hypotheses of phylogenetic relationships in Parmeliaceae (Ascomycota) using three

39

ribosomal markers and the nuclear RPB1 gene. Molecular Phylogenetics and Evolution

44: 812–824.

Culberson W. L. & Culberson C. F., 1968. The lichen genera Cetrelia and Platismatia

(Parmeliaceae). Contr. U.S. Nat. Herb. 34:449-558.

de Queiroz, K., 1998. The General Lineage Concept of Species, Species Criteria, and the

Process of Speciation. In: Endless Forms: Species and Speciation. Oxford University

Press. pp 57-75.

de Queiroz, K., 2007. Species concepts and species delimitation. Syst. Biol. 56(6): 879-886.

Degnan, J. H., Rosenberg, N. A., 2009. Gene tree discordance, phylogenetic inference and the

multispecies coalescent. Trends in Ecology & Evolution 24: 332-340.

Douady, C. J., Delsuc, F., Boucher, Y., Doolittle, W. F. & Douzery, E. J. P., 2003.

Comparison of Bayesian and maximum likelihood bootstrap measures of phylogenetic

reliability. Molecular Biology and Evolution 20: 248–254.

Funk, D. J. & Omland, K. E., 2003. Species-level paraphyly and polyphyly: Frequences,

causes, and consequences, with insights from animal mitokondrial DNA. Annu. Rev.

Ecol. Evol. Syst. 34: 397-423.

Gardens, M. & Bruns, T. D., 1993. ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes

– application to the identification of mycorrhizae and rusts. Molecular ecology 2(2):

113-118.

Gardner, C. R. & Mueller, D. M. J. 1981. Factors affecting the toxicity of several lichen acids:

effect of pH and lichen acid concentration. Am. J. Bot. 68: 87-95.

Gibbs, M. J., Armstrong, J. S. & Gibbs, A. J., 2000. Sister-scanning: a Monte-Carlo procedure

for assessing signals in recombinant sequences. Bioinformatics 16: 573-582.

Hager A, Brunauer G, Türk R, Stocker-Wörgötter E., 2008. Production and Bioactivity of

Common Lichen Metabolites as Exemplified by Heterodea muelleri (Hampe) Nyl.

Journal of Chemical Ecology 34: 113-120.

Holmes, E. C., Worobey, M. & Rambaut, A., 1999. Phylogenetic evidence for recombination

in dengue virus. Molecular Biology and Evolution 16: 405-409.

40

Katoh, K., Asimenos, G.& Toh, H., 2009. Multiple Alignment of DNA Sequences with

MAFFT. In: Posada D, ed. Bioinformatics for DNA Sequence Analysis, Humana Press.

pp. 39-64.

Kearsey, S. E., Labib, K., 1998. MCM proteins: evolution, properties, and role in DNA

replication. Biochimica et Biophysica Acta 1398: 113–136.

Knowles, L. L. & Carstens, B. C., 2007. Delimiting species without monophyletic gene trees.

Syst. Biol. 56(6): 887-895.

Kubatko, L. S., Carstens, B. C. & Knowles, L. L., 2009. STEM: species tree estimation using

maximum likelihood for gene trees under coalescence. Bioinformatics 25: 971-973.

Känefelt, I., 1977. Masonhalea, a new genus in the Parmeliaceae. Bot. Notiser 130: 125-

129.

Kärnefelt, I., Emanuelsson, K. & Thell, A., 1998. Anatomy and systematics of usneoid genera

in the Parmeliaceae. Nova Hedwigia 67: 71-92.

Leavitt, S. D., Fankhauser, J. D., Leavitt, D. H., Porter, L. D., Johnson, L. A. & St. Clair, L.

L., 2011. Complex patterns of speciation in cosmopolitan “rock posy” lichens –

Discovering and delimiting cryptic fungal species in the lichen-forming Rhizoplaca

melanophthalma species-complex (Lecanoraceae, Ascomycota). Molecular

Phylogenetics and Evolution 59(3): 587-602.

Linhart, C. & Shamir, R., 2002. The degenerate primer design problem. Bioinformatics 18(1):

172-186.

Maddison, D. R. & Maddison, W.P., 2000. MacClade 4: analysis of phylogeny and character

evolution. Version 4.0: Sinauer Associates, Sunderland, MA.

Martin, D. & Rybicki, E., 2000. RDP: detection of recombination amongst aligned sequnces.

Bioinformatics 16: 562-563.

Martin, D. P., Posada, D., Crandall, K. A. & Williamson, C., 2005a. A modified bootscan

algorithm for automated identification of recombinant sequences and recombination

breakpoints. AIDS Res. Hum. Retroviruses 21: 98-102.

Martin, D. P., Williamson, C. & Posada, D., 2005b. RDP2: recombination detection and

analysis from sequence alignments. Bioinformatics 21: 260-262.

41

Mattsson, J.-E. & Lai, M. J., 1993. Vulpicida, a new genus in the Parmeliaceae (Lichenized

Ascomycetes). Mycotaxon 49: 425-428.

Mattsson, J.-E. & Wedin, M., 1998. Phylogeny of the Parmeliaceae - DNA data versus

morphological data. Lichenologist 30: 463-472.

Mattsson, J.-E., 1993. A monograph of the genus Vulpicida (Parmeliaceae, Ascomycetes).

Opera Bot. 119: 1-61. Copenhagen

Maynard Smith, J., 1992. Analysing the mosaic structure of genes. J. Mol. Evol. 34: 126-129.

Müller, K., 2005. SeqState: Primer Design and Sequence Statistics for Phylogenetic DNA

Datasets. Appl. Bioinformatics 4: 65-69.

Müller, K., 2006. Incorporating information from length-mutational events into phylogenetic

analysis. Molecular Phylogenetics and Evolution 38: 667-676.

Nash T. H. (ed.), 2008. Lichen biology. Second edition. Cambridge University Press.

Nylander, J. A. A., 2004. MrModeltest v2. Program distributed by the author: Evolutionary

Biology Centre, Uppsala University.

Padidam, M., Sawyer, S. & Fauquet, C. M., 1999. Possible emergence of new geminiviruses

by frequent recombination. Virology 265: 218-225.

Posada, D. & Crandall, K. A., 2001. Evaluation of methods for detecting recombination from

DNA sequences: Computer simulations. Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 13757-13762.

Pöykkö, H., Hyvärinen, M. & Bačkor, M., 2005. Romoval of lichen secondary metabolites

affects food choice and survival of lichenovorous moth larvae. Ecology 86(10): 2623-

2632.

Rambaut, A., 2009. FigTree v1.3.1. Program distributed by the author: Institute of

Evolutionary Biology, University of Edinburgh, Edinburgh, United Kingdom.

Randlane, T. & Saag, A., 1994. Distribution patterns of some primary and seconday cetrarioid

species. Acta Universitatis Upsaliensis Symbolae Botanicae Upsaliensis 34: 359-376.

Randlane, T., Saag, A. & Thell, A., 1997. A second updated world list of cetrarioid lichens.

Bryologist 100: 109-122.

Ronquist, F. & Huelsenbeck, J. P., 2003. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under

mixed models. Bioinformatics 19: 1572-1574.

42

Schmitt, I., Crespo, A., Divakar. P. K., Fankhauser, J. D., Herman-Sackett, E., Kalb, K.,

Nelsen, M. P., Nelson, N. A., Rivas-Plata, E., Shimp, A. D., Widhelm, T. & Lumbsch,

H. T., 2009. New primers for promising single-copy genes in fungal phylogenetics and

systematics. Persoonia 23: 35-40.

Slansky, F., 1979. Effect of the Lichen Chemicals Atranorin and Vulpinic Acid upon Feeding

and Growth of Larvae of the Yellow-striped Armyworm, Spodoptera ornithogalli.

Environmental Entomology 8(5): 865-868.

Swofford, D. L., 2002. PAUP*: phylogenetic analysis using prasimony (* and other methods),

version 4.0 b10: Sunderland, M. A.: Sinauer Associates.

Taylor, J. W., Jacobson, D. J., Kroken, S., Kasuga, T., Geiser, D. M., Hibbett, D. S. & Fisher,

M. C., 2000. Phylogenetic species regognition and species concepts in fungi. Fungal

Genetics and Biology 31: 21-32.

Thell, A., Feuerer, T., Kärnefelt, I., Myllys, L. & Stenroos, S., 2004. Monophyletic groups

within the Parmeliaceae identified by ITS rDNA, ß-tubulin and GAPDH sequences.

Mycological Progress 3(4): 297-314.

Thell, A., Högnabba, F., Elix, J. A., Feuerer, T., Kärneflet, I., Myllys, L., Randlane, T., Saag,

A., Stenroos, S., Ahti, A. & Seaward, M. R. D., 2009. Phylogeny of the cetrarioid core

(Parmeliaceae) based on five genetic markers. The Lichenologist 41(5): 489–511.

Thell, A., Stenroos, S., Feuerer, T., Kärnefelt, I., Myllys, L. & Hyvönen, J., 2002. Phylogeny

of cetrarioid lichens (Parmeliaceae) inferred from ITS and β-tubulin sequences,

morphology, anatomy and secondary chemistry. Mycological Progress 1: 335–354.

Wedin, M., Döring, H. & Mattsson, J.-E., 1999. A multi-gene study of the phylogenetic

relationships of the Parmeliaceae. Mycological Research 103: 1185-1192.

White, T. J., Bruns, T. D., Lee, S. & Taylor,J. W., 1990. Amplification and direct sequencing

of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis, M. A., Gelfand, D. H.,

Sninsky, J. J., White, T. J., eds. PCR Protocols: a guide to methods and applications.

New York, NY: Academic Press Inc. pp 315-322.

Whiton, J. C. & Lawrey, J. D., 1982. Inhibition on Cladonia christatella and Sordaria

fimicola ascopore germination by lichen acids. Bryologist 85: 222-226.

43

Internetiallikad:

Eesti puudel kasvavate suursamblike levikukaardid (2011).

[http://www.eseis.ut.ee/levik_www/index.html]. 16.05.2011.

National Center for Biotechnology Information (NCBI). [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/].

17.01.2011.

Revision of second updated world list of cetrarioid lichens,

(http://www.eseis.ut.ee/synonyms/cetraria.html) 16.05.2011.

44

LISAD LISA 1. Mattssoni (1993) perekonna Vulpicida määramistabel eesti keelde panduna ja graafilisel kujul esitatuna (Mattsson 1993).

45

LISA 2. Analüüsides kasutatud eksemplarid.

Liik Laborikood GenBank ITS Leiukoht; koguja ning eksemplari andmed Allocetraria ambigua AF404128 Hiina, Tiibet, Sichuan; Obermayer 3.08.2000, 08141 (GZU, LD) A. globulans AF404126 Hiina, Tiibet, Sichuan; Obermayer 3.08.2000, 08137 (GZU, LD) A. madreporiformis MAD 01 Venemaa, Lõuna-Siber, Buryatia; Urbanavidius 11.08.2007 (TU) A. madreporiformis AF416460 Austria, Tirol, Osttirol; Obermayer 4.11. 1998, 7746 (M, HBG, LD) A. sinensis AF315458 Chen,L., Zhou,Q. & Wei,J., avaldamata A. sinensis AF404125 Hiina, Tiibet, Sichuan; Obermayer 3.08.2000, 08148 (GZU, LD) A. stracheyi AF404124 Hiina, Tiibet, Sichuan; Obermayer 4.08.2000, 8147 (GZU) A. stracheyi AST 02 AF404130 Hiina, Tiibet, Sichuan; Obermayer 3.08.2000, 08143 (GZU, LD) Cetraria aculeata EU401758 Hispaania, Castilla y Leon, Cienfuego Pass; Feuerer s. n. 1196893 (LD) C. arenaria AF115758 Kanada; Miao 22.02.1996, TDI 220 C. australiensis EU401760 Austraalia, New South Wales; Feuerer 20.03.2004 DNA1696 (HBG, LD) C. ericetorum FJ008682 CH-Ce21; Hametner,C., avaldamata C. ericetorum subsp. ericetorum

AF228290 Rootsi, Scania, Ahus; Thell & Marth 22.07.1999 SK-9928 (TUR)

C. islandica ISL 01 Rootsi, Öland, Suur Alvar; Pihu & Reier 08.06.2006 (TU) C. islandica subsp. antarctica AF254627 Argentiina, Tierra del Fuego; Stenroos, 5326 C. islandica subsp. crispiformis

AF228294 Soome, Nylandia, Helsinki; Thell 15.11.1999, FIN-9930 (TUR)

C. islandica subsp. islandica AF228296 Eesti, Põlvamaa, Taevaskoja; Thell 06.09.1999, EST-9901 (TUR) C. kamtczatica EU401763 USA, Alaska, Noatak National Preserve; Ahti 25.06.2004, 63296 (H, LD) C. muricata AF228302 Island, S Pingeyar sysla, Myvatn; Thell 11.08.1997, ISL-9722 (LD) C. muricata EU410409 Hispaania, Castilla Y Leon; Feuerer 1197733 (LD) C. nigricans AF254629 Kanada, Baffin island; Westberg 2377 (LD) C. odontella AF228304 Soome, Regio Aboensis; Thell, Stenroos & Puolasma 13.10.1999, FIN-9932 (TUR) C. sepincola FR799153 Suur-Britannia; 01580 (RBGE)

46

Cetrariella delisei EU401767 USA, Alaska, Noatak; Holt 23063 (LD) C. fastigiata AF226660 Venemaa, Yamal; Kärnefelt 9466 (LD) C. fastigiata EU401768 Soome, KiL, Muonio; Haikonen 24443 (H, LD) Flavocetraria minuscula EU401772 Venemaa, Sakha; Ahti 61573 (H, LD) F. minuscula EU401773 Venemaa, Sakha; Ahti 61793 (H, LD) Melanelia sorediella EU401769 Andorra, Ordino; 10592 (MAF, LD) M. sorediella GU994558 Hispaania; 15556 (MAF) Vulpicida canadensis CAN 01a USA, California, Del Norte; Suija 10.07.2008 (TU) V. canadensis CAN 01b USA, California, Del Norte; Suija 10.07.2008 (TU) V. canadensis AF072238 Kanada, British Columbia; Thell & Veer 96250 (LD) V. canadensis AF228306 Kanada, British Columbia, Jackson Flats; Miao 1996, TDI 146 V. cf. juniperinus VSP 02a Eesti, Saaremaa, Karide; Leppik 21.08.2009 (TU) V. cf. juniperinus VSP 02b Eesti, Saaremaa, Karide; Leppik 21.08.2009 (TU) V. cf. juniperinus VSP 03 Eesti, Saaremaa, Ulje; Leppik 13.07.2009 (TU) V. cf. juniperinus VSP 15 Eesti, Hiiumaa, Aruküla; Jüriado & Leppik 13.06.2010 (TU) V. cf. juniperinus JUN 22 Jaapan, Hokkaido, Kitami; Thor 13.06.2010 (UPS) V. cf. tubulosus JUN 14 Eesti, Saaremaa, Tammese; Leppik 27.08.2009 (TU) V. cf. tubulosus TUB 14 Rootsi, Gotland, Stenkyrka; Sandler 11.03.2009 (LD) V. cf. tubulosus VSP 05 Eesti, Saaremaa, Lõo; Leppik & Jüriado 14.07.2009 (TU) V. cf. tubulosus VSP 10 Eesti, Hiiumaa, Saare ps.; Jüriado & Leppik 13.06.2010 (TU) V. cf. tubulosus TUB 03 Eesti, Saaremaa, Lõo; Marmor 18.09.2008 (TU) V. juniperina AF058038 Rootsi, Uppland; Mattsson 4013 (UPS) V. juniperinus JUN 05 Eesti, Saaremaa, Lõo; Leppik & Tõrra 18.09.2008 (TU) V. juniperinus TUB 15 Rootsi, Gotland, Stenkyrka; Sandler 11.03.2009 (LD) V. juniperinus TUB 17 Rootsi, Gotland, Stenkyrka; Sandler 11.03.2009 (LD) V. juniperinus VSP 07 Eesti, Saare mk., Muhu; Jüriado 10.09.2009 (TU) V. juniperinus VSP 08 Eesti, Saaremaa, Lõo; (TU) V. juniperinus VSP 09 Eesti, Saaremaa, Lõo; Jüriado & Leppik 12.07.2010 (TU)

47

V. juniperinus VSP 12 Eesti, Hiiumaa; Jüriado & Leppik 13.06.2010 (TU) V. juniperinus VSP 14 Eesti, Hiiumaa, Soonlepa; Jüriado & Leppik (TU) V. juniperinus JUN 02a Eesti, Saaremaa, Lõo; Leppik & Tõrra 18.09.2008 (TU) V. juniperinus JUN 02b Eesti, Saaremaa, Lõo; Leppik & Tõrra 18.09.2008 (TU) V. juniperinus JUN 04 Eesti, Saaremaa, Atla; Thell 18.09.2008 (LD) V. juniperinus JUN 06 Eesti, Saaremaa, Atla; Randlane 14.09.2007 (TU) V. juniperinus JUN 07 Eesti, Hiiu mk., Vohilaid; Suija 02.07.2008 (TU) V. juniperinus JUN 08 Rootsi, Lule Lappmark; Westberg 29.07.2004 (LD) V. juniperinus JUN 10 Rootsi, Lule Lappmark; Westberg 29.07.2004 (UPS) V. juniperinus JUN 12 Norra, Storfjord; Nordin 09.08.2003 (UPS) V. juniperinus JUN 13 Eesti, Saaremaa, Mõnnuste; Leppik 24.08.2009 (TU) V. juniperinus JUN 15 Rootsi, Härjedalen, Helagsfjället; Patrik (LD) V. juniperinus JUN 16 Rootsi, Härjedalen, Flatruet; Patrik (LD) V. juniperinus JUN 20 Jaapan, Hokkaido, Kitami; Thor 13.06.2010 (UPS) V. juniperinus JUN 21 Jaapan, Hokkaido, Kushiro; Thor 23.06.2010 (UPS) V. juniperinus TUB 02 Eesti, Saaremaa, Atla; Randlane 14.09.2007 (TU) V. juniperinus VSP 06 Eesti, Saare mk., Muhu; Jüriado 10.09.2009 (TU) V. juniperinus EU401775 Soome, Varsinais-Suomi, Lohja; Pykälä 21426 (H) V. pinastri PIN 03 Jaapan, Hokkaido, Kushiro; Thor 23.06.2010 (UPS) V. pinastri PIN 04 Jaapan, Hokkaido, Kitami; Thor 13.06.2010 (UPS) V. pinastri PIN 05 Jaapan, Hokkaido, Kitami; Thor 13.06.2010 (UPS) V. pinastri PIN 06 Jaapan, Hokkaido, Kitami; Thor 13.06.2010 (UPS) V. pinastri PIN 07 Eesti, Võrumaa; Mark 15.01.2011 (TU) V. pinastri AY332522 Kanada, Alberta, Rock Lake; Miao 30.07.1995 TDI-180 (LD) V. pinastri AY611113 Hispaania; Blanco; 6783 (MAF) V. pinastri AF058039 Rootsi, Uppland; Mattsson 4004 (UPS) V. pinastri AF139031 Rootsi, Scania; Thell 9604 1056353 (LD) V. pinastri AF072239 Kanada, British Columbia; Thell TDI 180

48

V. tilesii TIL 03 USA, Colorado; Westberg 07.07.1998 (LD) V. tilesii TIL 04 Kanada, Nunavut; Wong 14.06.1999 (CANL) V. tilesii VSP 16 Venemaa, Lõuna-Siber, Buryatia; Urbanavidius 11.08.2007 (TU) V. tubulosus TUB 01 Eesti, Saaremaa, Atla; Randlane 14.09.2007 (TU) V. tubulosus TUB 04 Eesti, Saaremaa, Atla; Thell 18.09.2008 (TU) V. tubulosus TUB 05 Eesti, Saaremaa, Lõo; Leppik & Tõrra 18.09.2008 (TU) V. tubulosus TUB 06 Eesti, Saaremaa, Atla; Randlane 14.09.2007 (TU) V. tubulosus TUB 08a Rootsi, Gotland, Sundre; Sandler 12.03.2009 (LD) V. tubulosus TUB 08b Rootsi, Gotland, Sundre; Sandler 12.03.2009 (LD) V. tubulosus TUB 09a Rootsi, Gotland, Sundre; Sandler 12.03.2009 (LD) V. tubulosus TUB 09b Rootsi, Gotland, Sundre; Sandler 12.03.2009 (LD) V. tubulosus TUB 10 Rootsi, Gotland, Sundre; Sandler 12.03.2009 (LD) V. tubulosus TUB 11 Rootsi, Gotland, Sundre; Sandler 12.03.2009 (LD) V. tubulosus TUB 12 Rootsi, Gotland, Ardre; Sandler 12.03.2009 (LD) V. tubulosus TUB 13 Rootsi, Gotland, Östergarn; Sandler 12.03.2009 (LD) V. tubulosus TUB 16 Rootsi, Gotland, Sundre; Sandler 12.03.2009 (LD) V. tubulosus TUB 19 Eesti, Saaremaa, Atla; Leppik 19.08.2009 (TU) V. tubulosus TUB 20 Eesti, Saaremaa, Atla; Thell 18.09.2008 (TU) V. tubulosus TUB 21a Eesti, Saaremaa, Tammese; Leppik 27.08.2009 (TU) V. tubulosus TUB 21b Eesti, Saaremaa, Tammese; Leppik 27.08.2009 (TU) V. tubulosus VSP 01 Eesti, Saaremaa, Atla; Leppik & Jüriado 07.08.2009 (TU) V. tubulosus VSP 04a Eesti, Saaremaa, Lõo; Leppik & Jüriado 14.07.2009 (TU) V. tubulosus VSP 04b Eesti, Saaremaa, Lõo; Leppik & Jüriado 14.07.2009 (TU) V. tubulosus AF404132 Austria, Tyrol, Innsbruck; Feuerer & Thell s.n. 64184 (HBG) V. viridis DQ004573 USA, Connecticut, Tolland; Feuerer s.n. (HBG)