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Dirección General de Epidemiología
Instituto de Diagnóstico y referencia Epidemiológicos“Dr. Manuel Martínez Báez”
lineamientos para la vigilancia epidemiológicade brucelosis por laboratorio
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LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE BRUCELOSIS POR LABORATORIO
DGE-InDRE–RNLSP 2015
Fotografía de la portada propiedad de HKS arquitectos
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PRIMERA EDICIÓN, 2015 BRUCELOSIS-RNLSP ESTE DOCUMENTO FUE AVALADO POR LOS REPRESENTANTES DE LAS INSTITUCIONES QUE
CONFORMAN EL GRUPO TÉCNICO INTERINSTITUCIONAL DEL COMITÉ NACIONAL DE
VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA (CONAVE). TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY © INDRE-DGE-SECRETARÍA DE SALUD SE PERMITE LA REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: “LINEAMIENTOS
PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE BRUCELOSIS POR LABORATORIO” VERSIÓN N°. 01. INDRE, 2015. COLECCIÓN DE PUBLICACIONES TÉCNICAS DEL INDRE: ISBN: INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS DR. MANUEL MARTÍNEZ
BÁEZ. FRANCISCO P MIRANDA 177, COL. LOMAS DE PLATEROS DEL. ÁLVARO OBREGÓN, C. P. 01480, MÉXICO, D. F. WWW.INDRE.SALUD.GOB.MX TEL. (55)53-42-75-50 LA EDICIÓN ESTUVO A CARGO DE: DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ EL DISEÑO ESTUVO A CARGO DE: LIC. BRENDA ESCOBEDO LÓPEZ IMPRESO EN MÉXICO. PRINTED IN MEXICO
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SECRETARÍA DE SALUD
DRA. MERCEDES JUAN LÓPEZ SECRETARIA DE SALUD
DR. EDUARDO GONZÁLEZ PIER
SUBSECRETARIO DE INTEGRACIÓN Y DESARROLLO DEL SECTOR SALUD
DR. PABLO ANTONIO KURI MORALES SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD
LIC. MARCELA GUILLERMINA VELASCO GONZÁLEZ
SUBSECRETARIA DE ADMINISTRACIÓN Y FINANZAS
DR. GABRIEL O´SHEA CUEVAS COMISIONADO NACIONAL DE PROTECCIÓN SOCIAL EN SALUD
LIC. MIKEL ARRIOLA PEÑALOZA
COMISIONADO FEDERAL DE PROTECCIÓN CONTRA RIESGOS SANITARIOS
DR. JOSÉ MELJEM MOCTEZUMA COMISIONADO NACIONAL DE ARBITRAJE MÉDICO
DR. GUILLERMO MIGUEL RUIZ-PALACIOS Y SANTOS
TITULAR DE LA COMISIÓN COORDINADORA DE INSTITUTOS NACIONALES DE SALUD Y
HOSPITALES DE ALTA ESPECIALIDAD
LIC. RODRIGO REINA LICEAGA TITULAR DE LA UNIDAD COORDINADORA DE VINCULACIÓN Y PARTICIPACIÓN SOCIAL
DR. NELLY AGUILERA ABURTO
TITULAR DE LA UNIDAD DE ANÁLISIS ECONÓMICO
LIC. CARLOS SANDOVAL LEYVA DIRECTOR GENERAL DE COMUNICACIÓN SOCIAL
DR. JESÚS FELIPE GONZÁLEZ ROLDAN
DIRECTOR GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE PROGRAMAS PREVENTIVOS Y CONTROL
DE ENFERMEDADES
DR. EDUARDO JARAMILLO NAVARRETE DIRECTOR GENERAL DE PROMOCIÓN DE LA SALUD
DR. CUITLÁHUAC RUIZ MATUS
DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA
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LIC. JUAN CARLOS REYES OROPEZA DIRECTOR GENERAL DE INFORMACIÓN EN SALUD
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INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS DR. MANUEL MARTÍNEZ BÁEZ
DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO
BIOL. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA
QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS
DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO
LIC. ADRIANA CASTRO CABRERA SUBDIRECTORA DE OPERACIÓN
M. EN C. BELÉN TORRES LONGORIA
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA
QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIAS
M. EN C. JUAN CARLOS CARPIO PEDROZA JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA
DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA
M. EN C. JUDITH ESTEVEZ RAMÍREZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS
DR. JOSÉ ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y VALIDACIÓN DE TÉCNICAS
BIÓL. NORMA ANGÉLICA MONTES COLIMA JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA
QBP. IRMA HERNÁNDEZ MONROY ASESORA TÉCNICA DE LA DIRECCIÓN
QBP. NORMA CECILIA CÁRDENAS NAVA
JEFA DEL LABORATORIO DE BRUCELOSIS COORDINADOR DE LA RED DE DIAGNÓSTICO DE BRUCELOSIS
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GRUPO DE TRABAJO
QBP. NORMA CECILIA CÁRDENAS NAVA JEFA DEL LABORATORIO DE BRUCELOSIS
COORDINADOR DE LA RED DE DIAGNÓSTICO DE BRUCELOSIS
QBP. IRMA HERNÁNDEZ MONROY ASESORA TÉCNICA DE LA DGA INDRE
BIOL. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ
DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA
DR. HUGO MARTÍNEZ ROJANO ASESOR TÉCNICO DE LA DIRECCIÓN GENERAL ADJUNTA DEL INDRE
COORDINADOR DE MEDICINA LABORAL
DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ DIRECTOR GENERAL ADJUNTO
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LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE BRUCELOSIS
POR LABORATORIO
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ÍNDICE INTRODUCCIÓN 9
Antecedentes de la RNLSP para el diagnóstico de brucelosis 11
MARCO LEGAL 12
DEFINICIONES OPERATIVAS 12
OBJETIVO GENERAL 13
Objetivos específicos 13
RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE LA ENFERMEDAD DE BRUCELOSIS 14
Organización de la red nacional de laboratorios de brucelosis 15
Funciones de los integrantes de la red nacional de laboratorios de brucelosis 15
Recepción, manejo y envío de muestras 17
Suero o LCR 17
Hemocultivo 18
Cepas 19
ALGORITMO DIAGNÓSTICO 20
ESTÁNDARES DE CALIDAD 25
CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS DE LAS MUESTRAS 28
PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO (PEED) 28
Diagnóstico de brucelosis en 28
BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO 30
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES 31
BIBLIOGRAFÍA 32
I.- TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS 34
II.- PREPARACIÓN DE REACTIVOS 39
III.- AISLAMIENTO DE CEPAS 41
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INTRODUCCIÓN
El descubrimiento de la Brucella fue realizado a finales del siglo XIX, por el Dr. David Bruce, en la Isla de Malta. La enfermedad se conoce también como fiebre ondulante, fiebre del mediterráneo, fiebre recurrente, brucelosis o fiebre del Río Grande. Se ha mantenido como una de las zoonosis de mayor distribución e importancia en el mundo. Desde 1905 se acepta su aparición en México, aun cuando el primer aislamiento de una cepa de Brucella melitensis lo realizó en Puebla el Dr. Pláceres en 1920.
La brucelosis es una enfermedad zoonótica que se transmite de un animal a otro de manera directa. En el caso del humano la infección ocurre de manera accidental, debido al consumo de productos lácteos no pasteurizados o bien, de dudosa procedencia.
La brucelosis ha sido y sigue siendo, la causa de grandes pérdidas económicas a la ganadería del país y constituye un importante problema de salud pública. Existe una marcada preferencia del microorganismo por el huésped animal, por lo que la cepa B. abortus infecta normalmente al ganado bovino, la cepa B. melitensis se ha relacionado más con la infección de cabras y borregos; la cepa, B. suis está asociada con la infección de cerdos, B. canis infecta a perros, B. ovis causa infección específicamente en borregos y B. neotomae en roedores. El hombre es susceptible a cualquiera de las cuatro primeras especies, y se considera que B. ovis y B. neotomae poseen una baja virulencia que las restringe solo a ciertos huéspedes. En años recientes el amplio espectro de huéspedes de Brucella se ha ampliado al incluir a los mamíferos marinos. Se ha realizado el aislamiento de Brucella a partir de una amplia variedad de focas, leones marinos, delfines y ballenas en las costas de diferentes continentes. Estas cepas, B. ovis y B. neotomae, claramente forman dos grupos separados a los que, de forma no oficial, se les ha denominado B. cetaceae y B. pinnipediae. De igual manera, otra especie recientemente aislada en ratón es B. microti.
El género Brucella, está formado por bacterias intracelulares facultativas, que producen el aborto epizoótico en muchas especies domésticas de animales y enfermedad febril septicémica o infecciones focalizadas, en el hombre.
En los animales las manifestaciones clínicas de la infección son aparentemente poco detectables en estadios tempranos y debido a que la bacteria se aloja en el tracto reproductor en las hembras, el aborto, los partos prematuros y la retención de placenta son los únicos signos visibles del padecimiento. Por otro lado, la enfermedad en el humano se manifiesta con un cuadro febril de curso prolongado, incapacitante, con severas complicaciones y que puede progresar hacia una enfermedad crónica sin embargo, se pueden presentar mialgias, artralgias, sudoraciones nocturnas, debilidad, pérdida de apetito, cefalea, pérdida de peso, etc.
Las vías más comunes por las cuales el ser humano puede adquirir brucelosis son por vía indirecta como la ingestión, debido a que la Brucella es eliminada en forma intermitente en la leche, convirtiéndose ésta en una fuente de infección para la población que la consume sin ningún tratamiento térmico preliminar (la leche se ingiere sin hervirse); por vía directa como la inoculación accidental es decir, cuando de forma casual el personal del laboratorio o de las campañas de
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vacunación de animales, por ejemplo, se pincha con agujas que estuvieron en contacto con la bacteria; o bien, por inhalación.
En los países con un adecuado nivel sanitario, la enfermedad se considera de carácter casi exclusivamente profesional, lo que significa que el contagio se reduce al personal que trabaja en laboratorios o clínicas veterinarias o personas que están en contacto con productos cárnicos; mientras que en los países con una sanidad deficiente, un número importante de los casos de brucelosis corresponde a la población general, que adquiere la infección a través de la ingesta de productos lácteos no controlados, principalmente leche y queso fresco. En relación a la infección por el consumo de productos lácteos como queso, mantequilla, crema o helados preparados con leche contaminada es importante hacer notar que las bacterias pueden sobrevivir en los productos, algunos meses. Por otro lado, el consumo de carne de ganado vacuno cruda o mal cocida, proveniente de animales infectados, representa un riesgo menor, ya que el músculo contiene baja cantidad de Brucella, pero órganos como las vísceras, la ubre y los testículos contienen cantidades importantes de bacterias. La sangre fresca del ganado es potencialmente peligrosa para aquellos individuos que acostumbra consumirla ya sea en forma natural o mezclada. Otra forma en la que los seres humanos pueden adquirir Brucelosis son: al inhalar polvo o pelo contaminado, por salpicaduras en la conjuntiva, por ingestión accidental, a través de abrasiones o cortaduras en la piel, por auto inoculación accidental de sangre del animal infectado o de vacunas vivas. La Brucella spp puede sobrevivir por períodos prolongados en el polvo, estiércol, agua, fetos, suelo, carne y productos lácteos.
La transmisión de persona a persona es muy rara, de mayor relevancia es la infección como resultado de una transfusión de sangre, o de un trasplante de tejido, siendo el de médula ósea el que mayor riesgo representa. Otra forma de transmisión es la de madre con brucelosis aguda, al hijo, a través de la leche materna en el recién nacido.
En México, desde hace varios años, la brucelosis ha estado presente en la población tanto rural como urbana, económicamente activa (20 a 45 años de edad) y de ambos sexos, con prevalencia en las mujeres.
El presente documento establece los lineamientos de operación para la vigilancia basada en el laboratorio de la brucelosis incluyendo las funciones de la RNLSP de Brucelosis por niveles; la toma, manejo y envío de muestras; la metodología para el análisis de muestras; la evaluación del desempeño así como, los estándares de calidad.
Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública
La Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP) es el conjunto de laboratorios para la vigilancia epidemiológica con objetivos específicos que le han permitido unificar métodos de diagnóstico, criterios de interpretación de resultados, transferencia tecnológica, generación de conocimiento y formación de recursos humanos. Es el soporte técnico-científico útil para la vigilancia
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epidemiológica y que genera información de calidad para la toma oportuna de decisiones a través de la confirmación de diagnósticos mediante estudios de laboratorio en muestras biológicas.
La RNLSP depende de la Secretaría de Salud y es el Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE) su órgano rector en el área de vigilancia epidemiológica. Tiene fundamento legal en la Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiológica y está conformada por 31 Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) de las 32 entidades federativas del país.
El Marco Analítico Básico de la RNLSP consta de 27 diagnósticos, distribuidos en 16 redes de vigilancia específica.
Antecedentes de la RNLSP para el diagnóstico de brucelosis El Laboratorio de Brucelosis, en colaboración con la Dirección General de Epidemiología (DGE), es responsable de la vigilancia epidemiológica de esta enfermedad en México. El estudio de la brucelosis en el Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológica (InDRE) inició en el año de 1939 en el Laboratorio de Bacteriología, aun cuando la creación de un laboratorio específicamente dedicado al estudio de este padecimiento se llevó a cabo hasta 1985. Después de analizar los resultados de la encuesta seroepidemiológica en que participó el Laboratorio de Brucelosis en 1989, se consideró la necesidad de crear la Red de Brucelosis para lo cual, como primer paso, se visitaron algunos laboratorios interesados en participar.
En el periodo de 1992 a 1997 el Laboratorio de Brucelosis formó parte del Departamento de Microbiología. Después del primer año de este periodo se escribió una monografía acerca de los avances y perspectivas del estudio de la Brucelosis; además se publicó un artículo en relación a la Organización de la Red de Laboratorios de Diagnóstico de la Brucelosis en la Revista de Higiene y también se elaboró el Manual de Procedimientos de Laboratorio INDRE/SAGAR “Brucelosis” en colaboración con la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural (SAGAR) y con el patrocinio de la Organización Panamericana de la Salud (OPS).
En 1997 el Laboratorio de Brucelosis es incorporado al Departamento de Zoonosis y en el 2000 se re-incorpora al Laboratorio de Bacteriología. De esta manera, la Red de Brucelosis se fortalece y se integran a ella 30 laboratorios. En el 2002 se da continuidad al trabajo establecido con la Red, agregándose en 2010, el último laboratorio que faltaba para cubrir el 100% de los LESP dentro de la misma. A partir de 2004 el Laboratorio de Brucelosis imparte anualmente un curso de actualización dirigido principalmente a personal de los LESP que realizan el diagnóstico de brucelosis, así como a particulares que lo soliciten y lleva a cabo la evaluación del desempeño a la Red de LESP a través de Paneles de Eficiencia de acuerdo al calendario establecido y de la misma forma, se evalúa la calidad a través del programa Caminando a la Excelencia.
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MARCO LEGAL
1. Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos. Artículo 4. DOF 05/02/1917, Última Reforma D.O.F. 15/02/2012.
2. Ley General de Salud. Artículo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139 y 141. DOF 7/02/1984, Última Reforma DOF 07/06/2012.
3. Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012. Para la Vigilancia Epidemiológica. (DOF: 19/02/2013).
4. Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Protección ambiental -Salud ambiental- Residuos peligrosos biológico-infecciosos -Clasificación y especificaciones de manejo (DOF: 17/02/2003).
5. Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005. Que establece las características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados de los residuos peligrosos. DOF: 23/06/2006.
6. Norma Oficial Mexicana NOM-022-SSA2-2012. Para la prevención y control de la brucelosis en el ser humano (DOF: 11/07/2012).
7. Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011. Para la organización y funcionamiento de los laboratorios clínicos (DOF: 27/03/2012).
8. Lineamientos para los programas de evaluación externa del desempeño de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública, InDRE-Secretaría de Salud, 2013
9. Criterios de Operación para la Red nacional de Laboratorios de Salud Pública, InDRE-Secretaría de Salud, 2013.
10. Secretaría de Salud. Programa Sectorial de Salud 2013-2018. Diario Oficial de la Federación DOF: 12/12/2013.
11. Presidencia de la República. Plan Nacional de Desarrollo 2013-2018. Diario Oficial de la Federación, DOF: 20/05/2013, www.dof.gob.mx
12. Secretaría de Salud. Programa de Acción Específico 2013-2018. Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica, primera edición 2014.
DEFINICIONES OPERATIVAS
Se conoce como Brucelosis a la enfermedad bacteriana, infecto-contagiosa, que afecta a diversas especies de mamíferos domésticos y silvestres, la cual accidentalmente puede transmitirse al hombre, por lo que se considera una zoonosis.
Caso confirmado de brucelosis: es toda persona cuyo diagnóstico es conocido por medio de las pruebas confirmatorias de laboratorio, aglutinación estándar y aglutinación en presencia de 2-mercaptoetanol y/o aquellos que, presenten resultado positivo a hemocultivo.
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Caso sospechoso de brucelosis: es toda persona en riesgo, que por razones epidemiológicas, es susceptible y presenta sintomatología sugestiva de brucelosis, y que epidemiológicamente está relacionada con factores de riesgo.
OBJETIVO GENERAL
Establecer las directrices para realizar el diagnóstico por laboratorio de la Brucelosis a través de la RNLSP de forma estandarizada, estableciendo los flujos de información adecuados de los datos generados por el laboratorio en apoyo a la vigilancia epidemiológica.
Objetivos específicos
Establecida la metodología de la NOM-022-SSA2-2012. Para la prevención y control de la brucelosis en el ser humano, y determinar la presencia de anticuerpos específicos en el humano, que se han producido al estado infectado de Brucella spp.
Determinar el envío al Laboratorio de Brucelosis del InDRE del 100% de las muestras serológicas que sean positivas a Brucella spp. provenientes de los diferentes niveles de salud y de todas las instituciones que forman parte del Sistema Nacional de Salud.
Determinar el envío al Laboratorio de Brucelosis del InDRE del 10% de las muestras serológicas que sean negativas a Brucella spp. originadas en los diferentes niveles de salud y de todas las instituciones que forman parte del Sistema Nacional de Salud.
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RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE LA ENFERMEDAD DE BRUCELOSIS Figura. 1. Conformación de la red para el diagnóstico de Brucelosis en
México
La Red para el diagnóstico de brucelosis está formada por 31 laboratorios (sin color): Aguascalientes, Baja California, Baja California Sur, Campeche, Chiapas, Chihuahua, Coahuila, Colima, Durango, Estado de México, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Jalisco, Michoacán, Morelos, Nayarit, Nuevo León, Oaxaca, Puebla, Querétaro, Quintana Roo, San Luis Potosí, Sinaloa, Sonora, Tabasco, Tamaulipas, Tlaxcala, Veracruz, Yucatán y Zacatecas, los cuales declaran en su marco analítico que realizan la prueba presuntiva Rosa de Bengala y las pruebas confirmatorias, Aglutinación estándar (SAT) y Aglutinación en 2-Mercaptoetanol (2-Me).
El Distrito Federal no cuenta con laboratorio estatal y está identificado en el mapa en color rojo.
N
INTEGRANTES DE LA RED DE BRUCELOSIS
NO FORMA PARTE DE LA RED
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Organización de la red nacional de laboratorios de brucelosis La red nacional de laboratorios de diagnóstico de Brucelosis está encabezada por el Laboratorio de Brucelosis, adscrito al Departamento de Bacteriología del InDRE. Esta Red está constituida por los Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) a través del componente Brucelosis y por los laboratorios de diagnóstico locales, además de todos los laboratorios públicos y privados que realicen el diagnóstico serológico del padecimiento considerados como red de apoyo estatal.
LABORATORIO DE BRUCELOSIS InDRE
[(Laboratorio Nacional de Referencia (LNR)]
Muestras resultados
Laboratorios de Diagnóstico de Brucelosis (LESP) (Redes Estatales de Diagnóstico)
Laboratorios Locales de Diagnóstico de Brucelosis
(Redes Locales de Diagnóstico)
Redes de Apoyo Jurisdiccionales
Laboratorios Locales de Diagnóstico públicos y privados que realicen el diagnóstico de Brucelosis
Figura 2. Flujo de trabajo de la Red Nacional de Laboratorios para el diagnóstico serológico de la brucelosis humana.
Funciones de los integrantes de la red nacional de laboratorios de brucelosis Funciones del laboratorio nacional de referencia El Laboratorio de Brucelosis del InDRE es el laboratorio nacional de referencia y es el rector normativo para el diagnóstico de brucelosis en México. Las funciones que le competen son:
Procesar las muestras de suero que llegan al InDRE para diagnóstico, así como aquellas que envían los Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) para confirmación de diagnóstico.
Aislar y tipificar las probables cepas de Brucella enviadas por los LESP y otras dependencias que así lo soliciten.
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Producir los antígenos Rosa de Bengala y Blanco, y los reactivos para llevar a cabo el diagnóstico de brucelosis tanto presuntivo como confirmativo.
Apoyar a la Red de Laboratorios de Brucelosis, enviando el antígeno Rosa de Bengala para referencia y el antígeno Blanco para el diagnóstico y también los sueros testigo positivo y negativo y los reactivos para el diagnóstico.
Impartir cursos para la capacitación en el diagnóstico de brucelosis al personal de los LESP y otras dependencias que así lo soliciten.
Realizar el control de calidad mediante el Programa de Evaluación Externa del Desempeño (PEED) a los LESP.
Supervisar de manera directa a los laboratorios estatales.
Dar apoyo técnico a los laboratorios y analistas que lo requieran y soliciten.
Generar información de orden nacional en materia de diagnóstico, control de calidad, formación de recursos humanos e investigación operativa en la vigilancia epidemiológica de la brucelosis, que coadyuven para la toma de decisiones en el control y prevención de la enfermedad al programa nacional de salud.
Identificar las cepas de Brucella spp hasta su biovariedad.
Funciones de los laboratorios estatales de salud pública Para el diagnóstico
Realizar los procesos analíticos para corroborar la presencia o no de anticuerpos específicos, en suero de pacientes.
Asegurar la calidad del diagnóstico de Brucelosis.
Emitir en tiempo y forma los resultados de los exámenes de laboratorio, de acuerdo a la prioridad del diagnóstico.
Referir muestras al InDRE para control de calidad, para la conformación del banco de muestras o en caso de duda diagnóstica.
Generar evidencia y notificar al órgano normativo estatal correspondiente los casos confirmados.
Participar como mecanismo de apoyo técnico y proporcionar la información relacionada y requerida por el programa sustantivo del área de su competencia.
Para capacitación
Organizar el curso anual de capacitación estatal a los laboratorios locales de acuerdo a las necesidades detectadas a través del Programa de Evaluación Externa del Desempeño (PEED) o del programa de control de calidad.
Mantener en niveles óptimos la capacidad diagnóstica de los integrantes de la red.
Dar apoyo técnico a los integrantes de la red con capacitación en servicio.
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Apoyo técnico
Participar en las urgencias epidemiológicas en el área de su competencia.
Colaborar y/o elaborar trabajos de investigación operativa que proporcione información prioritaria estatal, una vez que los protocolos sean aceptados por los comités de investigación.
Preparación y/o evaluación los reactivos que utilizan los integrantes de la red.
Apoyar en la selección para la adquisición y en el suministro de materiales y reactivos requeridos por los laboratorios de la red estatal de acuerdo a la evaluación proporcionada por el InDRE.
Funciones de los laboratorios a nivel local
Recibir e identificar las muestras recibidas.
Procesar las muestras de acuerdo a la metodología pre-establecida en las capacitaciones.
Capacitar a la red de apoyo jurisdiccional en caso que lo requieran.
Aplicar las recomendaciones del nivel estatal.
Cumplir con el programa de control de calidad que establece el nivel estatal. DIAGNÓSTICO DE BRUCELOSIS POR LABORATORIO Recepción, manejo y envío de muestras
Suero o LCR Toma de la muestra: La obtención de muestras serológicas para el diagnóstico de la Brucelosis humana en personas que por sintomatología se sospeche tengan la enfermedad o para descartar la presencia de anticuerpos, requiere que la muestra debe estar sin hemolisis, no ictérica, no lipémica, no contaminada, no debe estar derramada, debe estar refrigerada y, tener un volumen mínimo de 2.0 mL.
Envío de muestra: Debe enviarse en viales de polipropileno tipo Eppendorf o en tubos de plástico, no se aceptarán muestras serológicas en envases de vidrio y deberá venir acompañada de la historia clínica del paciente, el formato único del InDRE llenado completamente y también de la solicitud del estudio de brucelosis, la muestra debe estar debidamente identificada con el nombre del paciente o clave correspondiente y ser la misma que la indicada en la historia clínica. (Sistema Básico de Triple Embalaje, para envío de muestras1).
1 El Sistema Básico de Triple Embalaje consiste en la utilización de un recipiente primario,
en el cual está contenida la muestra biológica (exudado faríngeo, exudado nasofaríngeo, lavado
bronquio alveolar, biopsia, suero, etc.), el recipiente primario (p. ej. criotubos, tubos o frascos con
tapa de rosca) debe ser hermético para evitar que la muestra se derrame y tiene que estar
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Recepción de muestra: Cuando una muestra no cumple con las características mencionadas se debe llenar el formato de rechazo de muestra (REMU-F-11/0) [entregar al área de recepción de muestras] y la muestra se elimina de acuerdo al procedimiento GABI-P-05/2. Si la muestra no se va a procesar inmediatamente, se resguarda en refrigeración y se procesa al día hábil siguiente de acuerdo al método LBRU-M-01/1 y LBRU-M-02 /1. Para que la muestra sea considerada como control de calidad, deberá venir acompañada de los resultados obtenidos en el LESP en Rosa de Bengala, aglutinación estándar y 2-mercaptoetanol, de lo contrario se considerará como muestra de diagnóstico aunque en su oficio diga control de calidad.
Una vez procesadas las muestras y emitido el resultado final, las muestras son mantenidas en refrigeración. Las muestras de control de calidad que sean discordantes se registran en el formato LBRU-F-17/0 y se conservan durante 45 días naturales a partir de que el laboratorio emite el resultado. Transcurrido este tiempo se eliminan como Residuos Peligrosos Biológicos Infecciosos (RPBI) de acuerdo al procedimiento GABI-P-05/2. Todas las muestras que no se guardan, los envases originales así como los tubos rotos de muestras, se esterilizan y se desechan como RPBI de acuerdo al procedimiento GABI-P-05/2.
Hemocultivo
Toma de muestra: La tomar de sangre para cultivo se debe realizar antes del pico febril. Deberá desinfectar con solución de yodo el área donde se realizará la punción venosa de forma circular del centro hacia fuera, limpiar el exceso de solución de yodo con una torunda de algodón impregnada de alcohol de la misma manera. Realizar la punción y obtener una muestra sanguínea de por lo menos 10 a 15 mL, retirar y cambiar la aguja para depositarla en un frasco de medio bifásico (limpiar el tapón previamente con solución de yodo).
Recepción de muestra: Al recibir la muestra, verificar que ésta cumpla con las siguientes características: estar a temperatura ambiente (no refrigerada ni congelada), traer consigo la historia clínica del paciente, el formato único del InDRE correcta y completamente lleno, además de la solicitud de aislamiento de
perfectamente etiquetado con el nombre o número de muestra del paciente. El recipiente primario
deberá rodearse de material absorbente como gasa o papel absorbente y colocarse en un recipiente
secundario hermético a prueba de derrames y golpes. Si se colocan varios recipientes primarios
dentro de un recipiente secundario se deberá usar una gradilla y material absorbente para evitar
algún derrame. Es importante mencionar que dentro del recipiente secundario (hielera) tiene que
haber suficientes refrigerantes para mantener una temperatura de 4 a 8 °C, si el tipo de muestra y
ensayo lo requiere . Los recipientes secundarios deberán llevar las etiquetas de riesgo biológico y
señal de orientación del recipiente, a su vez el recipiente secundario deberá ir contenido en un
paquete externo de envío (caja de cartón o hielera) que proteja el contenido de elementos externos
del ambiente y debe estar etiquetado con los datos del remitente, destinatario y señal de
orientación. La documentación que se integre al triple embalaje deberá colocarse en la parte interior
del paquete.
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Brucella spp. La muestra debe estar identificada con el nombre o clave del paciente y corresponder los datos de la historia clínica.
Registrar la muestra en el formato LBRU-F-16/0 y asignarle un número de red correspondiente al laboratorio de Brucelosis del InDRE, este mismo número se asigna como diagnóstico en la historia clínica y se rotula en la muestra.
Cuando la muestra no cumple con las características mencionadas se llena el formato de rechazo de muestra (REMU-F-11/0) y se entrega al área de recepción de muestras. La muestra rechazada se elimina como RPBI de acuerdo al procedimiento GABI-P-05/2.
Incubar las muestras a 37 °C, una vez que éstas han sido procesadas y se ha emitido el resultado final, las muestras que resulten positivas al aislamiento de Brucella spp se esterilizan y desechan como RPBI. El cultivo puro obtenido de cada muestra se rotula y se guarda en refrigeración, las muestras que resultaron negativas al aislamiento de Brucella spp después de seis semanas de incubación, se esterilizan y se eliminan como RPBI de acuerdo al procedimiento GABI-P-05/2.
Cepas
Al recibir las muestras en el InDRE, el personal del laboratorio verifica que la muestra cumpla con las siguientes características:
La muestra debe estar a temperatura ambiente, no debe estar contaminada, debe traer por escrito las referencias del aislamiento y la solicitud de aislamiento de Brucella spp.
La muestra debe estar debidamente identificada con el nombre o clave correspondiente y ser la misma a la de la historia clínica.
El personal del laboratorio registra la muestra en el formato LBRU-F-16/0 y a esta se le asigna el número de red correspondiente al laboratorio, con dicho número se consignará el diagnóstico en la historia clínica. El número de red también se rotula en la muestra.
Cuando una muestra no cumple con las características mencionadas anteriormente, se llena el formato de rechazo de muestra (REMU-F-11/0) y éste último se entrega en el área de recepción de muestras. La muestra rechazada se elimina como RPBI de acuerdo al procedimiento GABI-P-05/2.
Procesar la muestra y si no se va a trabajar inmediatamente mantenerla en refrigeración y procesarla al siguiente día hábil. Una vez procesada la muestra y emitido el resultado final, el cultivo puro obtenido de la muestra se rotula y se guarda bajo llave en refrigeración. Las muestras que resultaron negativas al aislamiento de Brucella spp se desechan como RPBI de acuerdo al procedimiento GABI-P-05/2.
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ALGORITMO DIAGNÓSTICO
Figura. 3. Algoritmo para el diagnóstico serológico de Brucelosis
Positivo
Negativo
ESTÁNDAR DEL SERVICIO 3días
Negativo
Indeterminado
POSITIVO
SAT: Título mayor o igual a 1; 80
2-ME: Cualquier título
INDETERMINADO
SAT: Título menor a 1:80
NEGATIVO
Ausencia de anticuerpos
Positivo
Conservación de sueros positivos en congelación
Suero o LCR
Prueba Presuntiva (Rosa de bengala)
Pruebas Confirmatorias (SAT y 2-mercaptoetanol)
Revisión e impresión de
resultado
LBRU Perfil serológico de la brucelosis
CLAVE - 1B5563007
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Figura. 4. Prueba presuntiva (Rosa de Bengala)
Figura 5. Pruebas confirmatorias: (aglutinación estándar y 2-mercaptoetanol)
POSITIVO NEGATIVO
1 2 3 4 5 6 7
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Cuadro 1. Interpretación de resultados
Rosa de Bengala SAT M.E. Resultado NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO INDETERMINADO POSITIVO <1:80 NEGATIVO INDETERMINADO POSITIVO >1:80 NEGATIVO POSITIVO POSITIVO >1:80 1:20 POSITIVO POSITIVO 1:20 1:20 POSITIVO
Interpretación clínica:
En el primer caso se considera como un caso negativo
En el segundo caso nos indica que el paciente en algún momento de su vida estuvo en contacto con Brucella, hay que solicitar una segunda muestra para confirmar
En el tercer caso se solicita una segunda muestra para determinar si el paciente se encuentra en una fase inicial o de recuperación de la infección por Brucella.
En el cuarto, quinto y sexto caso se consideran como positivos.
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ALGORITMO DIAGNÓSTICO
Figura. 6. Algoritmo para el diagnóstico y referencia bacteriológica de
Brucelosis
ESTÁNDAR DEL SERVICIO
2 semanas
Cepas
Siembra semanal en cajas de Petri con medios de cultivo enriquecidos
Con desarrollo presuntivo
Identificación mediante pruebas bioquímicas,
colorantes, fagos y serología
Sin desarrollo bacteriano
Conservación de cepas de Brucella spp en ultra-congelación
Extracción de la muestra
PCR
Revisión e impresión de
resultado
LBRU Cultivo y tipificación de cepas CLAVE-1B5563001
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ALGORITMO DIAGNÓSTICO
Figura. 7. Algoritmo para el diagnóstico bacteriológico de Brucelosis
Estándar del servicio
6 semanas
Siembra semanal en cajas de Petri con medios de cultivo enriquecidos
Con desarrollo bacteriano
Identificación mediante pruebas bioquímicas,
colorantes, fagos y serología
Sin desarrollo bacteriano
Conservación de cepas de Brucella spp en ultra congelación
Extracción de la muestra
PCR
Revisión e impresión de
resultado
Hemocultivo, Mielocultivo, Líquido cefalorraquídeo
LBRU Aislamiento e Identificación de Brucella spp a partir de muestras clínicas. CLAVE-1B5563001
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ESTÁNDARES DE CALIDAD Marco analítico
Las pruebas para el diagnóstico de la Brucelosis humana que conforman el marco analítico para la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP), están conformados por:
● Rosa de Bengala
● Pruebas confirmatorias (SAT y 2-Me)
● Aislamientos de cepas de Brucella spp
Con la finalidad de verificar la concordancia de los resultados emitidos por la RNLSP para el diagnóstico de la brucelosis, se estableció un Programa de Control de Calidad en el que se solicita a sus integrantes que envíen el 100 % de sus muestras positivas y el 10% de las muestras negativas. Hasta el 2005 ésta fue la herramienta con la que se pretendía garantizar la calidad de los diagnósticos emitidos, sin embargo, la aparición en el mercado de diversas marcas de reactivos comerciales con diferencias en sensibilidad y especificidad generó la falta de concordancia entre los resultados obtenidos por algunos LESP y el laboratorio de Brucelosis del InDRE, fundamentalmente con el antígeno de Rosa de Bengala.
Ante la dificultad de controlar esta situación y debido a que no hay una normatividad nacional para la producción de éstos antígenos, se planteó la necesidad de contar con una herramienta confiable que permita evaluar la capacidad técnica de los miembros de la red y es por esto que a partir de 2006 se prepararon y enviaron a toda la red paneles de eficiencia; consistentes en un envío de 10 sueros tanto positivos como negativos (panel), previamente caracterizados y codificados en el laboratorio de Brucelosis del InDRE.
Para la evaluación de los resultados obtenidos en los paneles se consideraron los tres métodos utilizados para este diagnóstico; aglutinación con antígeno Rosa de Bengala, Aglutinación Estándar (SAT) y Aglutinación en presencia de 2-Mercaptoetanol ponderados al 40%, 30% y 30% respectivamente. Con la suma de porcentajes obtenida en cada rubro se obtiene la calificación final.
Se asignó un código confidencial a cada LESP, de tal manera que al enviar el informe final de los resultados obtenidos en cada panel, todos los miembros pueden conocer la situación de toda la red nacional para el diagnóstico de brucelosis, y también puedan ubicar la posición de su laboratorio identificándolo con el código de confidencialidad de cada uno de ellos.
Con base en el análisis de los indicadores del Boletín Caminando a la Excelencia, cumplimiento y concordancia, y la evaluación del desempeño obtenido por los LESP en los paneles de eficiencia de 2010 y 2011, se estratificaron los LESP en tres categorías: sobresaliente, satisfactorio y mínimo. Quedando clasificados 15 como sobresalientes, 11 como satisfactorios y 5 como mínimo.
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Los criterios utilizados para la clasificación fueron los siguientes:
a) Los LESP que hayan obtenido de manera constante en los dos años de evaluación entre 8.6 y 10.0 tanto en el Boletín como en el PEED, se clasificaron como sobresalientes.
b) Los LESP que hayan obtenido de manera constante en los dos años de evaluación entre 7.0 y 8.5 tanto en el Boletín como en el PEED, se clasificaron como satisfactorios.
c) Los LESP que hayan obtenido de manera constante en los dos años de evaluación menos de 6.9 tanto en el Boletín como en el PEED, se clasificaron como mínimos.
A partir de 2008 se programó el envío de dos paneles de evaluación por año con la intención de privilegiar el envío de paneles de eficiencia como una mejor herramienta para la evaluación del desempeño sin embargo, se planteó que esta transición se haría de manera gradual y se propuso modificar el porcentaje de sueros que en ese momento se enviaban para control de calidad de la manera siguiente:
Cuadro 2. Porcentajes de desempeño y envío de muestras
Clasificación del laboratorio
Porcentaje para control de calidad
Sobresaliente No enviarán sueros para control de calidad y se evaluarán solamente con dos paneles de eficiencia al año
Satisfactorio Enviarán el 50% de positivas y el 10% de negativas, además se les enviarán dos paneles de eficiencia al año
Mínimo Enviaran el 100% de positivas y el 10% de negativas, además se les enviarán dos paneles de eficiencia al año
Considerando los resultados de este análisis y los criterios de clasificación los LESP quedaron organizados como se muestra en el siguiente cuadro:
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Cuadro 3. Características para envío de muestras
Estándar de calidad
Prueba Muestras clínicas
Criterios de aceptación
Criterios de rechazo Estándar de
servicio
Rosa de Bengala Suero
Volumen mínimo de 2.0 mL NO hemolizada NO ictérica NO contaminada NO lipémica. Envase de polipropileno, identificación legible, formato único del InDRE llenado, historia clínica, solicitud de estudio. Muestra refrigerada
Volumen menor de 2.0 mL, previamente congelada, derramada, vial vacío o roto, hemolizada, ictérica, contaminada, lipémica. NO envase de polipropileno, SIN identificación legible, SIN formato único del InDRE lleno, SIN historia clínica, SIN solicitud de estudio
Diagnóstico 3 días, control de calidad 4
días
Aglutinación estándar y 2-
mercaptoetanol Suero
Volumen mínimo de 2.0 mL NO hemolizada NO ictérica NO contaminada NO lipémica. Envase de polipropileno, identificación legible, formato único del InDRE llenado, historia clínica, solicitud de estudio, muestra refrigerada.
Volumen menor de 2.0 mL, previamente congelada, derramada, vial vacío o roto, hemolizada, ictérica, contaminada, lipémica. NO envase de polipropileno, SIN identificación legible, SIN formato único del InDRE lleno, SIN historia clínica, SIN solicitud de estudio
Diagnóstico 3 días, control de calidad 4
días
Aislamiento Hemocultivo
Frasco con medio bifásico, identificación legible, formato único del InDRE lleno, historia clínica, solicitud de estudio
SIN identificación legible, SIN formato único del InDRE lleno, SIN historia clínica, SIN solicitud de estudio
Hasta 6 semanas
Aislamiento Cepa
Tubo o placa Petri, identificación legible, formato único del InDRE lleno, historia clínica, solicitud de estudio
Contaminada, SIN identificación legible, SIN formato único del InDRE lleno, SIN historia clínica, SIN solicitud de estudio
Hasta 15 días
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CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS DE LAS MUESTRAS La captura de datos de las muestras es realizada por personal del área de recepción de muestras del InDRE, donde la información del oficio e historia clínica y/o formato único del InDRE, es capturada en la base de datos INFOLAB. Una vez que las muestras son analizadas los resultados se capturan en esta misma base de datos, se imprimen los resultados y se entregara al encargado de firmarlos, junto con dos formatos REMU-F-05 debidamente completados y el oficio de solicitud del estudio. Después firmar la hoja impresa de resultados y los formatos, deberán ser entregados en el área de recepción de muestras. Uno de los formatos REMU-F-05 firmado en recepción de muestras es el acuse de recibido y deberá ser archivado inmediatamente, en la carpeta correspondiente en el laboratorio. El área de recepción de muestras es la responsable de entregar a los usuarios los resultados correspondientes. PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO (PEED)
Diagnóstico de brucelosis en humanos El Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE) genera información de orden nacional, integrando y siendo rector de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP), en materia de diagnóstico, investigación y desarrollo tecnológico para la vigilancia epidemiológica, para la toma de decisiones en el control de enfermedades y la formulación y orientación de los programas nacionales de salud. En este sentido, uno de los compromisos del InDRE y la RNLSP es generar información confiable y oportuna para la toma de decisiones en apoyo de la vigilancia epidemiológica y los Programas Nacionales de Salud, en apego a la normativa vigente. En julio de 2007, se inició el Programa de Evaluación Externa del Desempeño (PEED) del Diagnóstico Serológico de la Brucelosis Humana para los laboratorios de apoyo a la salud pública en México, con la participación de los Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) que incluyeron las pruebas en el marco analítico estatal registrado en el InDRE. Con esta base, el PEED para serología de Brucelosis se ha sumado al esfuerzo institucional de evaluar el desempeño de los laboratorios de la RNLSP y contribuir de esta manera al perfeccionamiento del serodiagnóstico de este padecimiento.
Envío de paneles de eficiencia El laboratorio de Brucelosis del InDRE coordina el Programa de Evaluación Externa del Desempeño (PEED) en el diagnóstico de la Brucelosis humana y se encarga de:
Elaborar el panel de sueros, con respaldo documentado de las características de reactividad de cada muestra.
Embalar el panel en condiciones óptimas para el envío a los laboratorios participantes, incluyendo instrucciones detalladas para el manejo del mismo (Sistema Básico de Triple Embalaje).
Elaborar los reportes de resultados y enviarlos a los participantes.
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Mantener la confidencialidad de los laboratorios participantes mediante una clave única.
Enviar dos veces al año a los Laboratorios de la Red Nacional de Brucelosis, un panel de evaluación integrado por diez muestras de suero que deben procesarse con la metodología establecida para los laboratorios de la red (aglutinación con antígeno Rosa de Bengala, aglutinación estándar y aglutinación en presencia 2-mercaptoetanol). Solicitar que los resultados obtenidos se envíen a más tardar en 10 días hábiles, vía fax, oficio o correo electrónico.
El primer panel se envía en el mes de marzo y el segundo en el mes de octubre del mismo año.
Además de los resultados de las muestras que conforman el panel se le solicita a los laboratorios de la Red que envíen los datos de las marcas de reactivos con los que están trabajando, con la finalidad de poder establecer si hay alguna relación entre la marca de reactivo utilizado y la no concordancia de resultados, si fuera el caso, obtenidos en el laboratorio de referencia (InDRE), así como para comparar la sensibilidad y especificidad de las marcas de reactivos que han sido evaluadas en el InDRE.
Ponderación
Se evalúan 3 métodos:
1. Aglutinación con antígeno Rosa de Bengala 2. Aglutinación estándar (SAT) y 3. Aglutinación en presencia de 2-Mercaptoetanol
La evaluación se lleva a cabo de manera independiente para cada método, asignando una ponderación a alcanzar expresada en porcentaje y distribuida de la siguiente manera:
1) Aglutinación con antígeno Rosa de Bengala Se le asigna una ponderación de 40%
2) Aglutinación estándar (SAT) Se considera como concordante el valor obtenido dentro del intervalo de + 1 título con respecto al referido por el InDRE, con una ponderación de 30%.
3) Aglutinación en presencia de 2-Mercaptoetanol (2ME) Se considera como concordante el valor obtenido dentro del intervalo de +1 título con respecto al referido por el InDRE, con una ponderación de 30%.
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Informe de resultados peed brucelosis a la RNLSP Los resultados serán expresados como resultados concordantes. La suma de las ponderaciones parciales para cada método da como resultado la ponderación final (calificación final) obtenida para cada LESP. El laboratorio que no cumpla con el envío de sus resultados en la fecha establecida, será penalizado con 20 puntos, en su calificación final obtenida. El informe final se deberá enviar cuatro semanas después de la fecha límite de la recepción de resultados por los LESP al InDRE.
Criterios para la liberación del diagnóstico Los Laboratorios de la Red Nacional de Brucelosis recibirán semestralmente dos panel de eficiencia y con base a los resultados obtenidos en los últimos 2 años se evaluará su desempeño. Se definirá si se continúa con el diagnóstico liberado si cumple con lo siguiente:
por lo menos deberá tener 86% en la calificación en cada uno de los 4 paneles de los últimos 2 años.
si en alguno de los paneles no obtiene la calificación mínima, será motivo para no alcanzar la liberación.
Paralelamente se evaluará la concordancia obtenida por cada uno de los LESP en los últimos 2 años.
al sumar la concordancia de las muestras positivas y negativas por año, deberá ser mínimo del 86%.
Si en alguno de los dos años no obtuviera la calificación mínima, no podrá obtener la liberación.
Para que un LESP pueda obtener la liberación en el diagnóstico de Brucelosis humana, debe mantener una calificación de 86% tanto en los 4 paneles así como, una concordancia de 86% en los 2 últimos años.
Aquellos LESP que no obtuvieron la liberación se les disminuirá el porcentaje de muestras que envíen al InDRE para control de calidad (50% de positivas y 10% de negativas).
Aquellos LESP cuya concordancia no sea aceptable (0-75.9%) en cada uno de los paneles, así como en la concordancia en control de calidad, deberán recibir capacitación.
BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO
Colección de cepas Una vez que las cepas aisladas han sido caracterizadas y enviadas al InDRE, después de la emisión del informe correspondiente estas cepas se conservarán a largo plazo (indefinidamente, mientras se mantengan viables). Todas las cepas son integradas a la colección de cepas del InDRE y de éstas, el 100% de las cepas de Brucella spp. El objetivo de conservar los aislamientos realizados es:
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Monitorear cambios fenotípicos o genotípicos de cepas circulantes a nivel nacional, en apoyo a la vigilancia epidemiológica de este padecimiento.
Y así desarrollar proyectos de investigación en colaboración con instituciones, que permitan un fortalecimiento de los participantes de la RNLSP.
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDAD ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DIC
Curso teórico-practico XX
Envío del primer panel a los Laboratorios Estatales de la Red de EFES
XX
Recepción de resultados del Panel en el InDRE
XX
Envío de resultados a la RNLSP
XX
Envío del segundo panel a los Laboratorios Estatales de la Red de EFES
XX
Recepción de resultados del Panel en el InDRE
XX
Envío de resultados a la RNLSP
XX
Nota: Si alguna de las fechas corresponde a un día no laborable, la actividad deberá realizarse el siguiente día hábil.
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BIBLIOGRAFÍA 1. Alton GG, Jones LM, Pietz DE. Las técnicas de laboratorios en la brucelosis,
2ª ed. OMS, Ginebra, Suiza, 1976. 2. Hernández MI, Peña FG y Betancourt MX. Brucelosis 19. en Manual de
procedimientos de laboratorio, Alejandro Escobar Gutiérrez, editor. INDRE/SAGAR. INDRE-SSA, México, 1996.
3. López MA, Contreras RA. Brucella, cap. III. en Agentes Patógenos Transmitidos por Alimentos, Ma. Refugio Torres Vitela y Alejandro Castillo
Ayala. Editores. Vol. II. 2ªed. México, Universidad de Guadalajara; 2009. p. 89-124. ISBN: 978-970-764-859-3.
4. Hernández MI, López MA. La red nacional de diagnóstico de Brucelosis humana. Higiene (México). 1994; Abril-Junio.
5. López SR, Antonio OD, Hernández MI, González DF. Brucelosis: avances y perspectivas. Secretaría de Salud, Publicación Técnica del InDRE, 6 (México). 1991.
6. Miller MJ, et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. MMWR Surveill Summ. 6; 61:1-102; 2012.
7. Delany JR, Pentella MA, Rodríguez JA, Shah KJ, Baaxley KP, Holmes DE; Centers for Disease Control and Prevention. Guidelines for biosafety laboratory competency: CDC and the association of Public Health Laboratories, MMWR. Supplement / Vol. 60; 2011.
8. World Health Organization. Guidance on regulations for the Transport of Infectious Substances 2013-2014; Geneva: WHO Press; 2012.
9. Chosewood C & Wilson DE. Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories–5th ed. CDC-NIH; 2009. 10. European Committee for Standardization. CWA 15793:2011 Laboratory
biorisk management standard. Brussels: CEN; 2011.
11. World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual–3rd ed. Geneva: WHO; 2004.
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ANEXOS
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I.- TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS
1.- Diagnóstico serológico presuntivo con el antígeno Rosa de Bengala (Tanto el antígeno como los sueros problema y control deberán estar de 18 a 25 °C).
1. Verificar que los sueros problema no estén hemolizados, lipémicos o contaminados, ya que estas condiciones pueden dar resultados, falsos positivos.
2. Tomar una placa de vidrio, con separaciones circulares o cuadriculadas y limpiarla perfectamente de toda impureza con una de gasa pequeña.
3. Colocar en una de las separaciones de la placa 30 L del suero problema, en
otra separación 30 L de suero testigo positivo y por último 30 L del suero
testigo negativo en otra separación, posteriormente agregar 30 L o una gota del antígeno Rosa de Bengala a cada suero y con la ayuda de un aplicador de madera mezclar perfectamente.
4. Continuar mezclando con movimientos giratorios, durante 4 minutos y con la ayuda de una lámpara con luz blanca observar la formación o no de aglutinación (aparición de grumos teñidos y clarificación del medio).
5. Observar inicialmente que la reacción esperada en los sueros testigos sea la que corresponde. Para el control positivo la formación de grumos de aglutinación y para el control negativo la ausencia de grumos, si esto no sucede, desechar la placa y cambiar el frasco del antígeno. Realizar la prueba una segunda vez y si no se observa lo esperado (grumos de aglutinación en el control positivo y ausencia de grumos en el control negativo), se cambia de sueros testigos.
6. La interpretación de los resultados se realiza de la siguiente manera:
a. Cualquier tipo de aglutinación se informa como positivo.
b. Ausencia de aglutinación se informa como negativo.
7. La prueba tiene validez si se lee antes de 4 minutos, después de este tiempo la prueba se invalida, particularmente si se llega a secar la muestra.
2.- Diagnóstico serológico confirmatorio con el antígeno blanco de Brucella abortus y Brucella melitensis (SAT y 2-Me) (Tanto el antígeno, como los sueros problema y control deberán estar de 18 a 25 °C).
1. Recibir la muestra y colocarla en refrigeración si no se va a analizar inmediatamente, por no más de 24 horas.
2. Utilizar dos placas de 96 pozos de fondo en “U” una para el SAT y otra para el 2-mercaptoetanol.
3. Colocar el número de identificación de la muestra en ambas placas, teniendo en total, dos columnas para la placa de Aglutinación estándar (SAT) y dos
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columnas para la placa de 2-mercaptoetanol, considerando que se tendrá que titular con antígeno de Brucella abortus y antígeno de Brucella melitensis en la Aglutinación estándar (SAT) y con los mismos antígenos en presencia de 2-mercaptoetanol. Colocar en los pozos número 1 de las
columnas A y B 180 L de Solución Salina Fenolada (SSF) al 0.5% y del pozo
2 al 10 de ambas columnas colocar 100 L de la misma solución en una placa; en la otra placa, realizar el mismo proceso pero con la solución de 2-mercaptoetanol al 0.85%.
4. Añadir en los pozos número 1 de las columnas A y B de ambas placas 20 L del suero problema, mezclar 6 veces con la micropipeta (aspirar y expulsar
con ayuda de la micropipeta) y transferir 100 L de éste pozo (número 1) al pozo número 2, realizar el mismo procedimiento y pasar al siguiente pozo (pozo número 3), continuar así sucesivamente hasta llegar al último pozo
(pozo 10) desechando de este 100 L.
5. Repetir todos los pasos del proceso anterior en la placa de 2-mercaptoetanol.
6. Realizar nuevamente el mismo proceso para el suero testigo positivo y para el suero testigo negativo, los cuales deberán ser colocados en ambas placas.
7. Adicionar a todos los pozos (1 al 10), 100 L de antígeno Blanco de Brucella abortus previamente diluido 1:10 en la columna A de ambas placas.
8. Añadir a todos los pozos (1 al 10), 100 L de antígeno Blanco de Brucella melitensis previamente diluido 1:10 en la columna B de ambas placas.
9. Tapar las placas e incubarlas a 37 °C durante 24 horas. Revisar todos los pozos con la ayuda de una fuente luminosa (lámpara con luz blanca) y un espejo.
10. Verificar que la reacción sea la esperada en los pozos de los controles positivo y negativo, una vez transcurrido el tiempo especificado. Buscar en el fondo del pozo la presencia de una malla de aglutinación o la ausencia de esta.
11. El título corresponderá a la dilución del último pozo donde existe la formación de la malla y clarificación del medio. La muestra se considera positiva cuando el título es mayor o igual a 1:80 para la placa de SAT y cualquier título para la 2-mercaptoetanol.
12. El mismo criterio de la prueba se considera tanto para el antígeno de Brucella abortus como para el de Brucella melitensis.
Identificación bacteriológica
1. Resembrar la cepa recibida por duplicado en placas de Agar Brucela (AB), Base de Agar Sangre o Agar Soya Tripticasa (TSA) con asa bacteriológica. Utilizar las medidas de bioseguridad indicadas (guantes, goggles, bata y respirador N95) para el manejo de cepas.
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2. Incubar las placas a 37 °C de 48 a 72 horas. Una en aerobiosis y la otra en
atmósfera que contenga del 5 al 10% de CO2 a 37 °C.
3. Todas las pruebas que se describen a continuación deben efectuarse con crecimiento de 48-72 horas.
Prueba de identidad
1. En una placa de vidrio limpia y sin grasa, colocar una gota de Solución Salina Fenolada (SSF) estéril al 1% y un poco de crecimiento bacteriano usando el asa bacteriológica para este fin. Mezclar perfectamente hasta tener una suspensión.
2. Agregar una gota o 15 µL de suero polivalente.
3. Mezclar con un aplicador y mover la placa con movimientos rotatorios durante 4 minutos como máximo. Transcurrido este tiempo, buscar la presencia de aglutinación en la placa, que indicaría que se trata de una cepa de Brucella spp.
4. Preparar otras dos suspensiones, como se indica en el inciso (1).
5. Agregar una gota o 15 µL de suero mono-específico (Monovalente A y M, respectivamente).
6. Mezclar con un aplicador y mover la placa con movimientos rotatorios durante 4 minutos máximo.
7. Determinar si se observa aglutinación en alguno de los sueros.
Pruebas de tipificación
Prueba de la Oxidasa y Catalasa
1. Oxidasa
Tomar una asada de cultivo puro y colocar un poco del crecimiento (lo tomado por el asa de siembra) en la superficie de la tira reactiva para determinar oxidasa.
Dejar que se desarrolle la reacción. Cualquier coloración con tonos violeta en la tira reactiva es indicativo de resultado positivo.
2. Catalasa
Colocar una gota de solución salina sobre un portaobjetos, tomar con un asa bacteriológica crecimiento bacteriano y depositarlo sobre la gota que está en el portaobjetos, homogenizar bien con la misma asa y colocar una gota de Peróxido de hidrógeno al 3%. La aparición/producción de burbujas indicará una reacción catalasa positiva.
Siempre se hará primero la oxidasa y después la catalasa.
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Pruebas fisiológicas
1. Preparar una suspensión del cultivo a identificar: colocar una asada del crecimiento en un tubo de ensaye estéril que contenga 1.0 mL de Caldo Soya Tripticasa o Solución Salina Estéril.
2. Ajustar esta suspensión al tubo número 4 del nefelómetro de Mc. Farland.
3. Sembrar superficialmente con una asada bacteriológica la suspensión, en un tubo de Citrato de Simmons.
4. Sembrar por picadura una asada de la suspensión en un tubo con medio Movilidad Indol Ornitina (MIO) (determinación de Indol, movilidad y ornitina).
5. Estriar una asada de la suspensión en un tubo de Urea de Christensen en la superficie del agar.
6. Inocular una asada de la suspensión por estría superficial un tubo con Agar Soya Tripticasa.
7. Colocar, en forma aséptica una tira de papel filtro impregnado con acetato de plomo en el tubo de Agar Soya Tripticasa, para la determinación de ácido sulfhídrico.
8. Sembrar por estría superficial y picadura un tubo de medio Kligler o Agar de Hierro y Triple azúcar (TSI).
9. Incubar los cinco tubos (puntos 4 a 8) a 37 °C en aerobiosis durante 24 horas.
10. Hacer una lectura preliminar a las 24 horas y otra a las 48 horas. Si se deja transcurrir más tiempo, las lecturas obtenidas pueden ser erróneas.
11. Las pruebas fisiológicas siempre deben inocularse siguiendo el orden indicado.
Prueba de crecimiento en colorantes
1. Usar placas con medio conteniendo Safranina, Fucsina y Tionina con las siguientes concentraciones: 1:500 para Safranina, 1:25000 y 1:50000 para Fucsina y Tionina respectivamente).
2. Tomar de la suspensión que se utilizó para las pruebas fisiológicas (1) inocular una asada de esta suspensión formando cinco líneas sobre la superficie de cada una de las placas de colorante.
3. Es importante no volver a cargar el asa después de haber formado cada una de las líneas, incubar en aerobiosis, durante 4-5 días a 37 °C.
4. Buscar en la placa, crecimiento o ausencia del mismo, si el crecimiento aparece solo en la primera estría, se deberá a que en ella el inoculo fue más denso y la prueba se considera como negativa, la prueba es positiva cuando aparece crecimiento en tres o más estrías.
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5. Sin crecimiento en colorantes o con crecimiento en una o dos líneas, es preferible repetir la prueba.
Prueba de fagotipia
1. Utilizar la suspensión que se utilizó para las pruebas fisiológicas (1). Solamente se aplicará a cepas que hayan dado positivo a aglutinación en suero polivalente.
2. Hacer resiembra masiva en una placa de Agar Brucella, Agar Tripticasa Soya o Base de Agar Sangre mediante estría gruesa con hisopo estéril en dos sentidos.
3. Dejar absorber el inóculo y colocar en puntos equidistantes 1.0 µL de los siguientes fagos Tb, Bk, Iz, Fi, y Wb. Identificar sobre la placa el lugar en que se colocó cada fago.
4. Dejar que se absorba la muestra e incubar en aerobiosis a 37 ºC durante 48 horas.
5. Leer en términos de la lisis observada en el cultivo, identificando como:
a. LT: Lisis total. No se observa crecimiento en el área que ocupa la gota de fago.
b. LP: Lisis parcial: Hay desarrollo escaso en el área ocupada por la gota de fago.
c. NL: No lisis: Hay crecimiento sobre el área en que se colocó la gota.
6. Anotar los resultados obtenidos en la libreta de resultados y con base en ello se realiza la identificación de la cepa.
7. Reportar también a la red de cómputo, para imprimir el resultado y entregarlo con la hoja de solicitud, en el área de recepción de muestras.
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II.- PREPARACIÓN DE REACTIVOS
1) Solución desinfectante de hipoclorito de sodio
Para descontaminar material de laboratorio, desinfectar mesas y superficies de trabajo, que se alterna mensualmente con la solución de fenol al 3.0% de acuerdo con el calendario establecido en el laboratorio.
Solución de hipoclorito de sodio al 5.0%
Hipoclorito de sodio concentrado al 13% 385 mL
Agua destilada 615 mL
2) Solución de fenol
Para descontaminar material de laboratorio, desinfectar mesas y superficies de trabajo, que se alterna mensualmente con la solución de hipoclorito de sodio al 5.0% de acuerdo con el calendario establecido en el laboratorio.
Solución de fenol al 3%
Fenol concentrado 3.0 g
Agua destilada 100 mL
3) Solución salina fisiológica (SS)
NaCl 0.85 g
Agua destilada 100 mL
4) Solución salina fenolada (SSF)
Fenol 0.5 g
Solución Salina 100 mL
Por cada 100 mL de SS adicionar 0.5 g de fenol
5) Solución 2-mercaptoetanol
2-mercaptoetanol 0.71 mL
Solución Salina 100 mL
Por cada 100 mL de SS adicionar 0.71 mL de 2-mercaptoetanol
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6) Solución de acetato de plomo
Para identificar la producción de ácido sulfhídrico
a. Pesar 10 g de acetato de plomo y disolver en agua destilada.
b. Cortar tiras de papel filtro de aproximadamente 5.0 cm de largo y 0.5 cm de ancho e impregnarlas con la solución anterior.
c. Colocar las tiras impregnadas a 37 °C hasta que sequen.
d. Guardar en tubos estériles hasta su uso.
7) Solución de acriflavina para determinar fase celular
a. Pesar 0.1 g de acriflavina neutra.
b. Añadir 100 mL de agua destilada y disolver.
c. Colocar en frasco ámbar y utilizar el mismo día.
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III.- AISLAMIENTO DE CEPAS
Medio de cultivo base
Las bacterias del género Brucella se cultivan en medios muy enriquecidos, para el aislamiento se emplean el Agar Soya Tripticasa, Agar Brucela, Agar Triptosa y Agar Infusión de Papa. Se puede añadir suero inactivado de caballo, bovino o conejo al 5.0%, sin anticuerpos contra Brucella. En cada lote de suero nuevo se verifica la ausencia de anticuerpos y se inactiva a 56 °C durante 30 minutos, añadir el suero estéril al medio de cultivo base, que deberá estar a 45 °C, mezclar y vaciar en cajas de Petri o tubos.
Medio de cultivo de Farell
Es un medio de cultivo base al cual se le adicionan diferentes tipos de antibióticos y suero negativo al 5.0% para anticuerpos contra Brucella. Se utiliza cuando se trata de muestras muy contaminadas como el queso y la leche.
1) Los antibióticos que se emplean y sus concentraciones son: Bacitracina a 25 U/mL; Polimixina B a 5.0 U/mL; Cicloeximida a 100 µg/mL; Vancomicina a 20 U/mL; Ácido Nalidíxico a 5.0 U/mL; Nistatina a 100 U/mL. Existe una mezcla comercial con estos antibióticos (suplemento selectivo para Brucella, marca OXOID).
2) El medio base puede ser Agar Brucela o Agar Soya Tripticaseína; pesar la cantidad necesaria para preparar 500 mL del medio de acuerdo al instructivo del fabricante y esterilizar. Los antibióticos se diluyen de acuerdo a su instructivo. Si no se dispone de la presentación comercial, hacer los cálculos correspondientes a partir de las sales puras.
3) Sacar el medio de la autoclave y permitir que baje su temperatura hasta 50 °C. Agregar los antibióticos y el suero esterilizados por filtración, homogeneizar y vaciar el medio en placas de Petri. Almacenar las placas en refrigeración dentro de una bolsa de plástico hasta su uso.
4) Otro medio sugerido por el Departamento de Agricultura de los EEUU, se prepara agregando al medio base 750 U/L de Bacitracina; Actidiona (Cicloheximida) a 30 mg/L; Polimixina a 1800 U/L; 50 mL/L suero negativo de caballo o conejo y 1.25 mL/L de violeta de etilo (solución acuosa al 0.1%). Se prepara como en el punto anterior.
Medio de cultivo modificado de Ruíz Castañeda
1) Utilizar como medio base Agar Soya Tripticaseína o Base de Agar Sangre. Preparar la cantidad de medio acorde al tamaño del frasco que se va a utilizar para ello, pesar la cantidad del medio siguiendo las instrucciones del fabricante de acuerdo al número de frascos que se van a preparar y, agregar el agar necesario para que la concentración final sea de 2.5% y lograr que la fase sólida permanezca adherida a las paredes del frasco.
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2) Hervir el agar para homogenizar y vaciar en los frascos la cantidad necesaria para formar una capa gruesa de agar. Esterilizar e inclinar los frascos para que solidifique el agar, dejar a prueba de esterilidad durante 24-48 horas.
3) Preparar por separado la fase líquida, que contiene el caldo base (Caldo de Brucella o Caldo Soya Tripticaseína) y agregar Polianetol Sulfonato de Sodio al 0.05%, Cisteína al 0.025% y Sacarosa al 10%. Esterilizar y dejar para prueba de esterilidad de 24 a 48 horas. Una vez que pasa la prueba anterior, añadir a la fase sólida. en forma estéril.
4) Los frascos con las dos fases, se mantienen durante 48 horas a 37 °C para comprobar la esterilidad, aquellos que presenten cualquier tipo de crecimiento o turbidez de la fase líquida, después de transcurrido este tiempo, se desechan. Tapar los frascos estériles con tapón de hule estéril y fijarlo con una gárgola de aluminio. Conservar a temperatura ambiente durante 2 a 3 días. Si en este tiempo se observa cualquier tipo de crecimiento, la botella se descarta. Si no se observa crecimiento los frascos se guardan en refrigeración hasta su uso.
Medios de cultivo con colorantes
Para la elaboración de estos medios se requiere preparar la solución madre de cada
colorante y almacenarla en un frasco ámbar (de preferencia Pyrex™).
Deberá realizar el cálculo y pesar la cantidad necesaria de colorante para obtener una solución al 0.2 % p/v.
Someter la solución de colorante al 0.2% a flujo de vapor durante 40 minutos en autoclave cerrado sin presión o en un baño de agua hirviendo durante una hora.
Guardar en refrigeración hasta su uso.
Se puede emplear como medio base, Agar Brucella o Agar Soya Tripticaseína, adicionado con extracto de levadura al 1.0%, esterilizar y permitir que la temperatura disminuya hasta 40 °C.
Los colorantes se añaden de acuerdo a la siguiente tabla, aunque algunos autores utilizan concentraciones diferentes 1:25,000, 1:50,000 y 1:100,000.
Cada lote de colorantes se prueba con las cepas de referencia:
Biovariedad ATCC. 544 (B. abortus 1) 23448, M16 (B. melitensis 1) 23456 y 1330 (B. suis 1) 23444.
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Cuadro 4. Preparación de medios con colorante
Colorante Solución madre (% p/v)
Volumen añadido por
litro de medio (mL)
Dilución final
Fucsina básica* 0.2 20 1:50,000 Fucsina básica* 0.2 40 1:25,000 Tionina* 0.2 20 1:50,000 Tionina* 0.2 40 1:25,000 Safranina O 0.5 20 1:10,000