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Lipide
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Grundlagen• Was sind Lipide?
• Arten und Funktionen von Lipiden• Glycerophospholipide• Mono-, Di- und Triglycerine• Ergosteriol und Ergosterylester• Freie Fettsäuren• Sphingolipide
• Isolierung• Auftrennung• Wieso 2D DC?• Nachweis
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Arbeiten mit radioaktiven Substanzen• Eigener Bereich für radioaktives Arbeiten• Art der Strahler • Umgang mit radioaktiven Substanzen• Substanzen gesondert entsorgen• Nach abgeschloßener Arbeit: Dekontamination des
Arbeitsplatzes
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Durchführung
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Vorbereitung der Hefekultur
Zellkonzentration mittels OD bestimmen
Zellen in Minimalmedium
vorinkubieren
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Zugabe von 1-14C-Palmitinsäure
Lösung inkubieren
BSA-Lösungzugeben
Zellpellet waschen
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Zellen
aufschließen
Lipide extrahieren
Mittels DC auftrennen
Aktivität der Fraktionen bestimmen
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Durchführung des Aktivitätsassays
Vorbereitung des Reaktionsansatzes
Zuagen von Stopplösung nach 0, 10, 20 Minuten
Bestimmen der Aktivität
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ZählausbeuteProbe Cocktail cpmLE cpmBW dpmLE dpmBW cpm*/dpm* %Zählausbeute
6 Safety Cocktail MW Probe 6 MW Probe 9 MW Probe 6 MW Probe 9 (Probe6-Probe9)/(Probe6-Probe9) cpm*/dpm*100
7 Safety Cocktail + H2O MW Probe 7 MW Probe 10 MW Probe 6 MW Probe 9 (Probe7-Probe10)/(Probe6-Probe9) cpm*/dpm*100
8 Safety Cocktail + H2O + Kieselgel MW Probe 8 MW Probe 11 MW Probe 6 MW Probe 9 (Probe8-Probe11)/(Probe6-Probe9) cpm*/dpm*100
Berechnungen
Spezifische Aktivität der Palmitinsäure
GBq/mmol dpm/mmol cpm/mmol
2,1 2,1*60 *10^9 dpm*Zählausbeute
Theoretische Totalaktivität
MBq/100ml fV dpm/10ml
37 10 37*60/fV*10^6
Bilanz
Probe Messvolumen µl cpm/Messung cpm*/Messung Gesamtvolumen ml Gesamtaktivität dpm
Totalaktivität 100 MWProbe 1 Probe1-Probe6 10,1 cpm*/Zählausbeute*Messvolumen/Gesamtvolumen
Medium 100 MWProbe2 Probe2-Probe6 11 cpm*/Zählausbeute*Messvolumen/Gesamtvolumen
Waschwasser1 100 MWProbe 3 Probe3-Probe6 5 cpm*/Zählausbeute*Messvolumen/Gesamtvolumen
Waschwasser2 100 MWProbe 4 Probe4-Probe6 10 cpm*/Zählausbeute*Messvolumen/Gesamtvolumen
Zellen 100 MWProbe 5 Probe5-Probe6 10 cpm*/Zählausbeute*Messvolumen/Gesamtvolumen
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Aufnahmerate
theorethische Konzentration 37000*60*1000/10,1/132000000 µmol/l
tatsächliche Konzentration cpm*Totalaktivität/Zählausbeute*10000/132000000 µmol/l
Zellkonzentration 1 mg/ml
Inkubationszeit 10 min
Einbau GesamtaktivitätZellen/GesamtaktivitätTotalaktivität*100 %
Aufnahmerate GesamtaktivitätZellen/100*Zählausbeute cpm*/(mg*min)
GesamtaktivitätZellen/100 dpm*/(mg*min)
GesamtaktivitätZellen/100/1,32*10^8 nmol/(mg*min)
Gesamtlipide
cpm cpm* % AktivitätLSC % Gesamtaktivität
Phospholipide MW MW-BW MW-BW/Summe MW-BW MW-BW/MW-BW
Diacylglycerine MW MW-BW MW-BW/Summe MW-BW MW-BW/MW-BW
freie Fettsäuren MW MW-BW MW-BW/Summe MW-BW MW-BW/MW-BW
Triacylglycerine MW MW-BW MW-BW/Summe MW-BW MW-BW/MW-BW
Sterolester MW MW-BW MW-BW/Summe MW-BW MW-BW/MW-BW
Summe Summe MW Summe MW-BW Summe=100% Summe MW-BW/MW-BW
Gemessene Gesamtaktivität MW MW-BW
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Phospholipide
cpm cpm* % Aktivität 1.Dim % Aktivität 2.Dim % Gesamtaktivität
PC 2421 2345 42,6 30,8 28,8
PS 481 405 7,4 5,3 5,0
PI 1958 1882 34,2 24,8 23,1
PE 826 750 13,6 9,9 9,2
DMPE 57 0 0,0 0,0 0,0
PA 439 363 6,6 4,8 4,5
LP 152 76 1,4 1,0 0,9
CL 25 0 0,0 0,0 0,0
FS 536 460 8,3 6,1 5,6
JVL 1398 1322 24,0 17,4 16,2
Summe 8293 7603 138,0 100,0 93,4
Gemessene Gesamtaktivität 8219 8143
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0 10 200
0.5
1
1.5
2
2.5
f(x) = 0.100118243243243 x − 0.0562049549549546R² = 0.986391545948243
Aktivitätsassay
Zeit [min]
Men
ge [n
mol
*f]
Anfangsgeschwindigkeitzeit dpm mmol nmol nmol*f zeit dpm mmol nmol nmol*f
0 173 2,64E-11 2,64E-05 0,01 0 MW MW/6,55E+12 mmol *E+6 nmol*442,2510 11976 1,83E-09 0,00183 0,81 10 MW MW/6,55E+13 mmol *E+6 nmol*442,2520 29808 4,55E-09 0,00455 2,01 20 MW MW/6,55E+14 mmol *E+6 nmol*442,25
Serin konz.Ci/ml Ci/mmol Bq/mmol dpm/mmol
0,001 29,5 1,0915E+11 6,549E+12 1Ci 3,7E+10Bq
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Diskussion
Phospholipide Diacylglycerine freie Fettsäuren Triacylglycerine Sterolester Sterole0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Gesamtlipide
Wildtyp Mutante psd1psd2 Vergleich WildtypVergleich Mutante
% d
er G
esam
takti
vitä
t des
Coc
ktai
ls
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PC PS PI PE DMPE PA LP0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
Phospholipide
Wildtyp Mutante psd1psd2 Vergleich Wildtyp
% d
er G
esam
takti
vitä
t des
Coc
ktai
ls
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0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
PS : PE
Wildtyp
Mutante psd1psd2
Vergleich Wildtyp
Vergleich Mutante
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Aktivitätsassay
0 5 10 15 20 250
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
f(x) = 0.197280405405405 x + 0.194695945945947R² = 0.981465973602446
f(x) = 0.100118243243243 x − 0.0562049549549546R² = 0.986391545948243
Wildtyp
Zeit [min]
Konz
entr
ation
[nm
ol]