lipidi u zdravlju i bolesti - mykolife.bamykolife.ba/assets/files/reishi-naucni-rad.pdf · svojstva...
TRANSCRIPT
-
Page 1 of12
(page number not for citation purposes)
Lipidi u zdravlju i bolesti ^Me
Otvoreni pristup
Istraivanje
Svojstva za sniavanje holesterola Ganoderma lucidum in vitro, ex vivo i kod hraka i minijaturnih svinja
ABerger*1,2, D Rein1,3, E Kratky1, I Monnard1, H Hajjaj1'4, I Meirim1, C
Piguet-Welsch1, J Hauser1,5, K Mace1 and P Niederberger1
Adresa: 1Nestl Research Center, Lausanne 26, 1000, Switzerland, 2Paradigm Genetics, Research Triangle Park, NC 27709-4528, USA, 3BASF Plant Science Holding GmbH,
Agricultural Center, BPH-Li 555, Limburgerhof, 67114, Germany, 4Univerity des Sciences et de Technologie de Lille, B.P. 179, Villeneuve d'Ascq Cedex, 59653, France and 5University of Lausanne, Institut de Biologie Cellulaire et de Morphologie, 1015, Lausanne, Switzerland
Email: A Berger* - [email protected]; D Rein - [email protected]; E Kratky - [email protected]; I Monnard -
[email protected]; H Hajjaj - [email protected]; I Meirim - [email protected]; C Piguet-Welsch -
[email protected]; J Hauser - [email protected]; K Mace - [email protected]; P Niederberger -
[email protected] * Corresponding author
Objavljeno: 18. februara 2004.godine Zaprimljeno: 22. januara 2004.godine . Primljeno: 18. februara 2004.godine
Lipidi u zdravlju i bolesti 2004,3 :2
lanak je dostupan na stranici: http://www.lipidworld.eom/content/3/l/2
2004 Berger et al; po licenci BioMed Central Ltd. lanak otvorenog tipa: Verbatim kopiranje i redistribucija lanka je dozvoljena u svim medijima za bilo koju svrhu, uz uslov da je ovo obavjetenje
naglaeno zajedno sa originalnom URL adresom lanka.
Abstrakt
Uvod: Postoji obnovljeni interes za medicinska svojstva gljiva. Prouavali smo svojstva za smanjenje holesterola
Ganoderma lucidum (Gl), poznate medicinske vrste.
Rezultati: Organske frakcije koje sadre oksidirane dervirate lanosterola su inhibirale sintezu holesterola u hepatocitima
T9A4. Kod hraka, 5% Gl nije utjecao na LDL ; ali je smanjio ukupni nivo holesterola (TC) 9.8%, i HDL 11.2%. Gl (2.5 i 5%) su
imali uinka na nekoliko fekalno neutralnih sterola i unih kiselina. Obje doze Gla su smanjile hepatiku mokrosomalnu
ex-vivo HMG-CoA reduktaznu aktivnost. Kod minijaturnih svinja, 2.5 Gl je smanjilo TC, LDL- i HDL holesterol 20,27, odnosno
18% ((P < 0.05) ; poveali fekalni holesterol i hoprostanol i smanjili holate.
Zakljuci: OSveukupno, Gl ima potencijal da smanji LDL holesterol in vivo kroz razne mehanizme. Slijedei koraci su:
potpuna karakterizacija bioaktivnih komponenti u lipidskim rastvorljivim/nerastvorljivim frakcijama; procjena bioaktivnosti
izoliranih frakcija; i ispitivanje svojstava sniavanja ljudskog holesterola. Zamiljene su inovativne nove vrste hrane i lijekova
koje sadre Gl i sniavanju holesterol.
Pozadina
U narodnoj kineskoj medicini Kampo, medicinska svojstva
gljiva su poznata od 1200 p.n.e. [1]. U skorijim godima, javio
se interes za svojstva gljiva koja smanjuju holesterol, to je
ukljuivalo i gljive Ganoderma ludicum (Reishi-, Longevity-,
ili Fantom gljiva, Biladi Top, Young-zhi, Kralj trava, Ling Zhi
na Kineskom, Saru-no-koshikake i Mannendake na
Japanskom jeziku) [2,3], Pleurotus ostreatus (bukovaa) [4-8],
Volvariella volvacea [9], Agaricus bis-porus (ampinjon) [10],
Agaricus campestris [11], Auricu-laria auricula (Judino uho),
Tremella fuciformis [12,13], Grifola frondosa (Maitake gljiva)
[14,15], Lentinus erodes (itake) i izolirane frakcije [14,16], i
Polyporus confluens (Ningyotake) [17].
http://www.biomedcentral.com/http://www.biomedcentral.com/info/about/charter/mailto:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]://www.lipidworld.com/content/3/1/2
-
http://www.lipidworld.com/content/3/1/2
Page 2 of 12
(page number not for citation purposes)
Lipids in Health and Disease 2004, 3
U ranijim djelima Kaneda i Tokuda su prouavali svojstva
smanjenja holesterola ekstrakta etera, vode i etanola iz
klobuka i struka Lentinus edodes, Auricularia polytrichia,
Flammulina velutipes, i Agaricus bis-porus. Veina ovih studija
se izvodila na pacovima. Svojstva za smanjenje holesterola
gljive Cordyceps sinensis su prouavana na ljudima [19].
Mi emo se fokusirati na Gl , bitnu medicinsku gljivu koja pripada porodici Ganodermataceae i koja je prouavana
zbog mnogih zanimljivih zdravih svojstava, koja ukljuuju
svojstva za borbu protiv tumora, protiv upala i protiv
agregacije trombocita [20-27]
http://kyotan.com/lectures/lectures. Zapravo, kompletne knjige, simpoziji i organizacije (npr. Gonoderma Institut za
meunarodna istraivanja, New York) i mnoge terapije su
posveene Gl gljivi. Jo jedan primjer njene vanosti dolazi iz
vremena stare Kine gdje je oboava boginja Reishi (Reishi
senshi) koja je podarivala zdravlje, ivot i vjenu mladost.
Kao to je opisano, Gl je povremeno prouavana zbog njenih svojstava za borbu protiv holesterola i hipotenzinih
svojstava izraen kod pacova [2] i zeeva [28],, ali nije
istraena u vie fiziolokim modelima [29] holesterola kakve
su minijaturne svinje. Pretpostavlja se da Gl moe sniziti
holesterol kod ljudi, ali istraivanja nisu nadgledana niti
prikladno opisana [24] http://www.gano therapyusa.com/DXN/docs/whatis.htm.
Minijaturne svinje su svejedi, kao i ljudi i njihovi
metabolizmi lipida i stroida, digestivna i kardiovaskularna
fiziologija su jako sline onima kod ljudi [30-32]; dok
nasuprot ljudi, glodari mogu nositi veinu holesterola u
HDL frakcijama sve dok nisu nahranjeni hranom visokozasienom mastima i holesterolom koji mogu ugasiti
LDL receptore [29].
Tabela 1: Priblina analiza Nafag 924 test ishrana za hrke1
Komponente Gl koje mogu sniziti holesterol nisu poznate, ali
mogu ukljuiti glukane ganoderanog tipa [22,33,34],
hetero--gikane, komplekse glukan-proteina (ksiloglukani,
uronske kiselinski--glukani), druga vlakna, lektine [25], terpenoid triterpene [35-38], ergostanske sterole [39], i visoko
oksidirane ganoderonske kiselinske tipove, lanostanoidne
triterpene [38-42]. Komponente vlakana Gl gljive mogu imati
uinka na absorpciju holesterola i recikliranje une kiseline,
dok lipofilini komponenti mogu utjecati na sintezu
holesterola.
Gl moe utjecati na sintetu holesterola na izvreni
3-hidroksi-3-metilglutaril koenzim A reduktaza (HMG-CoA
reduktaza) korak limitiranja mjere; ili na potonju lanosterol
14-metil demetilazu: cikokrom P-450 demitalzni
(P-45014DM) korak [43,44], katalizirajui korak limitiranja
mjere u konverziji lanosterol-holesterola. U vrstama koje
nisu Gl gljive, inhibicija skvalenske sintetaze zaragoznskim
kiselinskim metabolitima gljiva je zabiljeena kod primata
[45]. Ovdje smo testirali uinke Gl na metabolizam
holesteroma kod elija ljudske jetre T9A4, na modelu manjih
ivotinja, tj. hrka, i na modelu veih ivotinja, minijaturne
svinje koja imaju razliitu distribuciju lipoproteinskog
holesterola od hrka. ivotinjski modeli su hranjeni
ishranom koja je sadravala holesterol to je opisano u
Tabelama 1 i 2.
Rezultati
Aktivni sastojci u Gl i in vitro aktivnostima
Organske i vodene faze Gl nisu sadravale HPLC-primjetne
razine lovastatina. Organski ekstrakovana faza je snano
1Nafag 924 potpuna ishrana za hrke je iz Eberle Nafag AG, Gossau, vicarska. Detaljni sastojci ishrane nisu prikazani. Metabolizirana energija je procijenjena na 3111 kcal/kg ishrane. Ishrana lovastatinom je bila identina kontrolnoj ishrani, ali je sadravala 2 mg/100 g ishrani lovastatina. Gl, G. lucidum.
Komponente Kontrola Teina %
Karbihodrati (razliitosti) 31.8 31.0 30.
3
krob 23.6 23.0 22.
5
Grubi protein 15.6 15.2 14.
8
Voda 8.0 7.8 7.6
Grube masti 4.4 4.3 4.2
Pepeo 4.7 4.6 4.5
Gruba vlakna 3.5 3.4 3.3
Esencijalne aminokiseline 3.4 3.3 3.2
Ekstrakt Gl 0.0 2.5 5.0
Vitaminski mix (ukljuuje kolin) 2.4 2.3 2.3
Minerali (Ca, P, Mg, K, Na) 2.3 2.2 2.2
Elementi u tragovima 0.3 0.3 0.3
http://www.lipidworld.com/content/3/1/2http://kyotan.com/lectures/lectureshttp://www.ganotherapyusa.com/DXN/docs/whatis.htmhttp://www.ganotherapyusa.com/DXN/docs/whatis.htm
-
http://www.lipidworld.com/content/3/1/2
Page 3 of 12
(page number not for citation purposes)
Lipids in Health and Disease 2004, 3
Tabela 2: Sastojci za ishranu minijaturnih svinja prilikom testiranja1
KOmponente (g/100 g hrane, kao osnova za hranjenje) Teina % Kontrola ili 2.5% Gl
ito (do 100%) 26.6
Penica 29.8
Svinska masnoa2 9.0
Obrok od soje (44%; sadri proteine soje) 8.5
Dodatni proizvodi za peenje 8.5
Neslani, topljeni puter3 4.5
Mjeavina aminokiselina4 3.4
Mjeavina minerala5 2.8
Celuloza6 (kontrola) ili Gl7 2.5
Obrok od kanole (uljana repica) 2.5
Obrok od peradi 1.7
Holesterol8 0.1
Mjeavina vitamina (ukljuuje kolin)9 0.1
Mjeavina elemenata u tragovima10 0.02
ispoljava biosintezu holesterola (ID50 = 1.3 g/mL, relativnu
za 0.4 lovastatina), dok je vodena faza bila neaktivna (ID50 >
330). Razni visoko oksidirani lanostanoidni tritepeni, i
32-metil- i 26-okso steroli su pronaeni u organskim fazama,
i vjerovano su doprinijeli inhibiciji sinteze holesterola. 20%
EtOAc/heksanske frakcije je sadravalo ganoderal A; i 50%
EtOAc/heksan je sadravalo ganoderole-A i B, i
ganoderonsku kiselinu Y.
Teina tijela i organa i unos hrane kod hraka
Teina tijela je varirala od 68.7-70.8 do 83.2-86.4 g za
eksperimentalne grupe D1, odnosno D18, bez znaajnih
razlika u odnosu na kontrolne grupe, na D1, D18 ili D18
minus D1. Relativna teina jetre i slijepog crijeva (g
organ/100 g teine tijela) su bile 2.77-2.84, odnosno 0.52-0.56
za razliite grupe, bez znaajnih razlika u odnosu na
kontrole grupe. Dnevni unos hrane je bio 7.1-7.8 g
hrane/prosjek kroz D1-16; nije bilo znaajnih razlika u
odnosu na kontrolne grupe.
Holesterol i triaciglicerol kod hraka
Poetni nivoi D1 TC nisu bili razliiti meu grupama, dok su
bili razliiti u D2 TAG (Tabela 3). Gl na 2.5 i 5.0% je smanjio
D18 TAG (vjerovatno zbog D1TAG razliitih poetnih
vrijednosti). Gl na 2.5% nije smanjio D18 TC, LDL ili HDL. Sa
5.0% Gl, postojao je statistiki trend (P < 0.10) da se smanji TC
i HDL; LDL nije bio promjenjen. Slino veim dozama Gla,
lovastatin je smanjio D18 TC i HDL, ali nije LDL. LDL/HDL
odnos nije bio statistiki razliit za tretmane ishrane u
odnosu na kontrolnu grupu.
Fekalne une kiseline i neutralni sretoli kod hraka
Gl (2.5%) je poveao fekalne une kiseline i
ksenodeoksiholate (Tabela 4). Obje doze Gla su poveale
koprostalnol 3-jedan, dok je, 5% Gla smanjilo kolestanol.
Lovastatin nije imao znaajan uinak na une kiseline ili
ispitane neutralne sterole.
Ex vivo hepatina HMG-CoA reductazna aktivnost kod
hraka
Lovastatin nije imao uinka na de-fosforilatnu aktivnost, i
fosforilatna aktivnost nije ispitana (Tabela 5). U nedostatku
NaF (inhibitora fosfataze) i u prisustvu 2.5 i 5% Gl ,
3-hidroksi-metilgluratil-CoA reduktazna aktivnost u
hepatinim mikrosomima hraka (pmol/min/g/ jetra) je bila
smanjena 2.1, odnosno 1.5 puta, u odnosu na kontrolu. U
prisustvu NaF, 2.5% i 5% Gl je smanjio HMG-CoA reduktaze
3.5, odnosno 1.9 puta, u odnosu na kontrolu.
'Hranu je posebno pripremila Kliba (Kaiseraugst, vicarska) kao ishranu bogatu mastima i holesterolom 2604. Ukoliko nije posebno naglaeno, zalihe su dole iz kompanije Kliba.
Priblina analiza ishrane minijaturnih svinja (bez %): karbohidrati kao slobodni ekstrakti azota 46.6, grubi protein 15.9, voda 11.1, grube masti 16.8, pepeo (sa vitaminima) 5.1, gruba
vlakna 4.6. Ukupna i probavljiva energija ishrane je procijenjena na 3985 i 3776 kcal/kg.2Centravo Schweinefett B 90, Centravo AG, Cirih, vicarska. Sastojala se od 98% masnoe, 5%
slobodnih masnih kiselina, 9% polinezasienih masnih kiselina, zatienih antioksidansima. 3Migros Genossenschafts-Bund SA, Cirih, vicarska. 82% masnoa, 0.5% protein, 0.5%
karbohidrate. 4Po 100 g ishrane, sastojalo se od 1.06% arginina, 0.75% lisina, 0.26% metionina, 0.56% metionina + cistin, 0.20% triptofana, i 0.57% treonine [78]. 5Po 100 g ishrane,
sastojalo se od 0.80% kalcija, 0.70% fosfora, 0.19% natrija, 0.63% kalija, 0.20% magnezija, and 0.26% hlorida. 6Vitacel LC 200 Cellulose, J. Rettenmaier & Sohne (JRS), GMBH + Co,
Rosenberg, Holzmuhle 1, Njemaka. 0.3% sulfatnog pepela, pH 5.0-7.5, 300 M duine vlakana. 7Champitec, Payerne, vicarska. Pripremljeno kao to je opisano u tekstu. Svinje koje
nisu dobile ekstrakt Gl, dobile su kontrolnu ishranu i 80 mg lovastatin/svinja/dan u pola jabuke. 8Fluka 26740, Fluka Holding AG, Buchs, vicarska. 97% ista. 9Roche Vitamins Ltd, Basel,
vicarska. U mg/100 g ishrana se sastojala od 0.4 vitamina A (800 IU), 2.0 vitamina D3 (80 IU), 10.5 vitamina E, 0.3 vitamina K3, 1.2 vitamina Bh 0.8 vitamina B2, 3.0 nikotinske kiseline,
2.0 pantotenonske kiseline, 0.' Folne kiseline, 0.7 vitamina B6, 0.0034 vitamina B'2, 0.02 biotina, 65.' koline, and 2.0 vitamian C. '0U mg/'00 g ishrana se sastojala od 1.1 bakra (mg/kg), 7.6
cinka, 11.0 eljeza, 0.05 joda, 5.0 mangana, and 0.03 seleniuma. Gl, G. lucidum.
http://www.lipidworld.com/content/3/1/2
-
http://www.lipidworld.com/content/3/1/2
Lipids in Health and Disease 2004, 3
Tabela 3: Holesterol u plazmi i triacigliceriol kod hraka tretiranih sa G. lucidum i lovastatinom (mmol/L)
Grupa TC TC TAG TAG VLDL LDL HDL LDL/HDL DI DI8 DI DI8 DI8 DI8 DI8 DI8
Kontrola 3.57 3.48 I.I0 I.08 0.22 0.5I 2.75 0.I9 Lovastatin 3.39 3.I6a I.07 0.98 0.I8a* 0.48 2.50a 0.I9 Gl (2.5%) 3.46 3.40 0.64a 0.90a 0.I8 0.53 2.69 0.20 Gl (5%) 3.34 3.I4a* 0 . 8 9 a * 0 . 9 2 a 0.20 0.49 2.44a* 0.20
TC, ukupni holesterol; TAG, triacilglicerol; VLDL, LDL, HDL, veoma nisko-, nisko-, i visoka gustina lipoproteina; D, dan; LOVA, 20 mg/kg ishrana. Vrijednosti predstavljaju 6 ivotina. aZnaajna
razlika od kontrole (P < 0.05 or *P < 0.10), students, nespareni, jednostruko vezani,t-test, jednake promjene.
Tabela 4: Fekalne une kiseline in neutralni steroli kod hraka tretiranih sa G. lucidum i lovastatin (nmol/g suhe fekalije/d)
une kiseline Neutralni steroli
Grupa C LC DC CDC UDC Ukupni BA COP-ol COP-3-one CHOL erol CHOL anol Ukupni NS
Kontrola I5.0 I4.3 I0.7 5.I I.7 46.7 II.5 ND 7.2 I8.4 37.I
Lovastatin I5.0 I2.8 II.6 6.2 I.6 47.I I2.0 ND 6.7 I8.9 37.6
Gl (2.5%) I6.9 I6.2 I4.3 8.5a I.9 57.8a II.7 4.2a 7.7 I6.9 40.6
Gl (5%) I2.2 I3.9 I2.0 6.4 I.4 45.8 I2.0 7.8a 7.0 I4.Ia 4I.0
Fekalije su se kvantitativno skupljanje zavretkom eksperimenta (D18). C, kolat;LC, likoholat; DC, deoksiholat; CDC, kenodeoksiholat, UDC, Ursodeoksiholat; COP, koprostan; CHOL,
koloest; BA, une kiseline; NS, neutralni steroli. ND, nije zapaeno. Vrijednosti predstavljaju 6 determinatoria. aZnaajna razlika od kontrole (P < 0.05), student nespareni, dvostruk ovezani
t-test, jednake promjene. Statistiki trendovi (P < 0.10) su postojali u setu podataka.
Tabela 5: Aktivnost HMG-CoA reductaze na hepatike mikrosome hraka (pmol [14C]mevalonolakton/min/mg microsomalni protein)
Grupa Aktivnost-NaF Ukupna aktivnost+NaF
Kontrola I2.36 9.30
Lovastatin I3.34 ND
Gl (2.5%) 5.86a 2.66a
Gl (5%) 8.08a 4.86a
Konsultirati tekst za metodoloke detalje. [l4C]mevalonate je promijenjen u [l4C]mevalonolakton uz 10 M HCl prije koraka TLC. Gore navedene vrijednosti su ispravljenje za oporavak (15-63%)
uz [3H]mevalonat. G. lucidum, a ne lovastatin je inhibirao ex vivo sintezu bez obzira da je li je oporavak bio zagrantovan, rezultati su izraeni u gramima po teini jetre; [l4C]mevalonolacton
se prvo izdvojio u organski rastvor i onda primjenio na TLC ploe [79] radije nego da se koriste vodeni ekstrakti direktno na TLC determinacije.a Znaajno odudara od kontrole, student
nespareni, dvostruko vezani test, jednake promjene (P < 0.05). ND, nije utvreno.
Odnos frakcionalne sinteze holesterola kod hraka
Kod hraka, vrijednosti FSR u odnosu na 24 sata (atom % poveanje D17-18) su bili 1.68 0.20, 1.91 0.16,
1.75 0.36, i 2.29 0.05 (znaenje n = 6, 1 SEM) za kontrolu, lovastatin, 2.5%, odnosno 5% Gl. Vrijednosti
se nisu statistiki razlikovale od kontrole.
Tjelesna teina minijaturnih svinja
Tjelesna teina minijaturnih svinja se poveala ekvivalentno sa Gl i lovastinom 19.0-26.9 kg u trajanju od
D1-28. Sline teine u odnosu na godine su zamijeene kod eksperimentalno hranjenih Gttingen
minijaturnih svinja[46].
Holesterol i tiacilglicerol kod minijaturnih svinja
Eskeprimentalna ishrana je poveala TC 27-30% od D1 do D14 (Tabela 6). U Gl hranjenoj grupi, TC je
znaajno opao na 12.5% od D14 do D21, ali ne dalje od D21 do D29; opadanje TC iz D14-29 je bilo 20%(P <
0.01). Lovastatin nije znaajno smanjio TC u D14-21 (P > 0.13),D 21-29 niti D14-29; ali se TC smanjio >10%
kod dvije svinje od D14-21.
http://www.lipidworld.com/content/3/1/2
-
http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2
Page 5 of 12
(page number not for citation purposes)
Lipids in Health and Disease 2004, 3
Tabela 7: Fekalne une kiseline i neutralni steroli kod minijaturnih svinja tretiranih sa G. lucidum ilovastatinom (nmol/g dry feces)
une kiseline Neutralni steroli
Nije bilo znaajne razlike u TAG i VLDL sa Gl ili
lovastatinom (Tabela 6). Meutim, VLDL je manji
lipoproteinski dio. Lovastatin nije ima znaajnog uinka na
LDL ili HDL; Gl je smanjio LDL 26% i HDL 16% (P < 0.01;
D14 vs 29). Gl nije statistii utjecala na LDL/HDL budui da
su se oba pojedinana parametra smanjila od D14-29.
Fekalne une kiseline i neutralni steroli kod minijaturnih
svinja
Ishtrana bogata visokm holesterolom je smanjila
ksenodeoksiolate; poveala koprostanol, koprostan 3-jedan, i
holesterol od D1-14 (P < 0.05 ili < 0.10; Tabela 7). Gl je
poveao kolestanol (D14 vs 29; P < 0.10).
Diskusija
Aktivni sastojci u Gl i in vitro aktivnost
Kao to je opisano, lovastatin nije detektovan u naim
preparatima Gl gljive. Suprotno tome, statinske mjeavinke
su naene u bukovaama [47] i Chrysosporium pannorum [48].
Meutim, otkrili smo oksidirani molekule lanosterola kao
to su 32-metil- i 62-okso steroli, ganoderoli-A i B, ganoderonska kiselina , i ganoderali A i B u organskom
sloju. Organski sloj je snano inhibirao biosintetzu
holesterolu iz acetata. Slini ili identini okisidirani
lanosteroidi su prethodno zapaeni u Gl [38-42], i
ustanovljeno je da su inhibirali konverziju
24,25-dihidrolano-terola na holesterola na lanosterolu 14 -dimetilaz koraka [49-51], i takoer da indirektno inhibiraju
HMG-CoA aktivnost reduktaze [51]. injenica da je vodena
faza Gl bila neuinkovita za inhibiranje sinteze holesteola
(ID50 > 330) sugerie da su hidrofilne molekule kao to su
glukani i vlakna Gl nisu utjecali na konverziju acetata u
holesterol. Meutim, takve molekule mogu utjecati na upijanje holesterola i recikliranje ucane kiseline.
Ex vivo hepatina HMG-CoA reduktaza i postotak sinteze
holesterola kod hraka
Posmatrana inhibicija ex-vivo HMG-CoA aktivnosti
reduktaze kod hraka tretiranih sa Gl gljivama kod hraka je
posmatrana i kod pacova sa Gl tretmanom[51], i sa istim
lanosterolnim analogima [44,52]. Na manjak uinka sa
lovostatinom (4.3 mol/kg tjelesne teine) kontrastira
rezultatima sa vezanim statinom, simvastatinom, gdje su
10,30, i 60 mol/kg tjelesne teine /dan poveali ex-vivo
hepatinu HMG-CoA aktivnost reduktaze 2,7, odnosno 50
puta [53]. Lovastatin moe imati drugaije uinke na
HMG-CoA reduktazu i druge enzime od simvastatina, ali to
nije ispitano u datoj studiji.
Poznato je da analogi lanosterola kao oni pronaeni u Gl
inhibiraju prevod HMG-CoA reduktaze mRNK, i takoer
mogu ubrzati degradaciju proteina [44,52]. Gl takoer moe
utjecati na biosintetzu holesterola u kasnijim biosintetikim
koracima kao to je konverzija lanosterola [51], to e indirektno inhibirati HMG-CoA aktivnost reduktaze, kao to
je uvieno za statine kod minijaturnih svinja [53].
Zabiljeeno je da je represija lanosterol 14 -dimetilaznog
koraka moe rezultirati u akumulaciji
3-hidroksi-lanost-8-en-32-al, poznatog prevoditeljskog
regulatora nanie HMG-CoA reduktaze [54].
Kad bi Gl imao direktan fiziki utjecaj na aktivnost
HMG-CoA reduktaze, to implicira da bi ak i nakon posta od
16 sati Gl komponente kod hraka jo uvijek bile vezane za
enzime tokom procedure analize [55]. Nakon posta od 16
sati, lovastatin se moe ukloniti iz enzima to e odgovarati manjku primjeen ujecaja lovastina na ex-vivo aktivnost
HMG-CoA reduktaze. Zbog uklanjana ovog lijeka,
primjeeno je da drugi statini poveavaju ex-vivo aktivnost
HMG-CoA reduktaze [56]. Hepatina ex-vivo aktivnost
HMG-CoA reduktaze i kompletnog tjelesnog holesterola
FSR su potpuno razliiti tipovi mjera. Nije jasno zato Gl i lovastatin ne utjeu na FSR holesterol kod hraka. U
principu, stanje nisko zasienog visokog holesterola koje se
postiglo posebnom ishranom je trebalo dovesti do visokih
enogenih procenata sinteze holesterola, to bi moglo biti
inhibirano Gl gljivama i lovastatinom. Mogue je da su se Gl
i lovastatin raspali u mjeavini prehrane. Da bi se testirala ova hipoteza, izdvojili smo Gl i lovastatin iz pohranjene
ishrane nakon zavretka eksperimenta i nismo nali razlike u
analiziranim bioaktivnim sastojcima kada smo ih poredili sa
originalnim poetnim materijama (prije dodatka u ishranu;
podaci nisu pokazani).
Holesterol i triacilglicerol kod hraka i minijaturnih svinja
Hrci su hranjeni ishranom baziranom na niskom
holesterolu bez dodatnih egzogenih holesterola ili zasienih
masti. Pod ovim uvjerima, nije bilo dovoljno holesterola da
se redistribuira holesterol iz HDL u LDL dio [29]. Zbog
ovoga je hrcima 5% Gl i lovastatina smanjeno na D18 TC i
HDL, ali nije smanjne LDL [57,58].
Koritenjem iste vrste hrane, oktriveno je da lovastatin
smanjuje HDL kod hraka; samo kada je dodana zasiena
mast u hranu, i LDL i HDL su smanjeni [57]. Jo jedan od
faktora koji su doprinijeli manjku jaih uinaka na hrke je
totalnog manjka uinka na minijaturne svinje moe biti taj da
Grupa TC TC TC TC TAG TAG TAG TAG VLDL VLDL LDL LDL HDL HDL LDL/HDL LDL/HDL
DI DI4 D2I D29 DI DI4 D2I D29 DI4 D29 DI4 D29 DI4 D29 DI4 D29
Gl (2.5%) 2.47a 3.2Ibc 2.8I 2.58 0.53 0.57 0.80 0.69 0.07 0.09 I.45c I.08 I.69c I.42 0.88 0.79
Lovastatin 2.36a 3.00 2.44 2.8I 0.50 0.60 0.59 0.7I 0.I0 0.09 I.40 I.29 I.50 I.43 0.95 0.9I
Tabela 6: Holesterol plazme i triacilglicerol kod minijaturnih svinja tretiranih G. lucidum ilovastatinom (mmol/L)
Lovastatin se davao u koliinama od 80 mg/da. Izmeu D1-14, sve svinje su hranjene ishranom bogatom visokim holesterolom i mastima; od D15-29, svinje su dobile ili ekstrakt G.
lucidum (Gl) ili lovostatin. Isti statistiki rezultati su dobiveni za svih 10 svinja u poreenju izmeu D1-14. Svinje su se nasumice odrabrale da prime ili Gl ili lovastatin prije poetka
studije. Student's, spareni, jednostruko vezani, i t-test, su se koristili za statistika poreenja. Statistik znaajne promjene (P < 0.05, jednostruko vezanog testa) parametara holesterola
su prikazani: aDI vs. I4; bD 14 vs. 2I; cDI4 vs. 29. Skraenice: pogledati Tabelu 3. Postojao je znaajan trend za 2.5% Gl da smanji odnos LDL/HDL u DI4-29 (P < 0.II, jednostruko vezano
testiranje).
Sve svinje (DI) I.98 0.86 0.66a 2.4Ia 0.I0a I.73a* 0.96
Sve svinje (DI4) I.98 I.33 0.I6 3.75 0.I7 2.96 0.9I
Gl (DI4) I.98 I.6I 0.I4 3.6I 0.I8 3.37 0.87b*
Gl (D29) I.98 0.8I 0.I6 4.44 0.I5 3.I5 I.22
Lovastatin (DI4) I.98 0.99 0.I9 3.92 0.I5 2.44 0.96
Lovastatin (D29) I.98 I.23 0.I8 3.28 0.I6 2.34 I.I4
Grupa NCT C CDC COP-ol COP-3-one CHOL eroi CHOL anol
Fekalije su skupljene Dl, 14 i 29. Kvantitativno skupljanje fekalija nije bilo mogue, sto su rezultati izraeni po gramu fekalija. Skraenice: pogledati Tabelu 4, osim NCT, 23- nor
kolanat 5,7,12 triol. Spareni, dvostruko vezani student t-test, jednake promjene su procijenile uinke ishrane sa visokim holesterolom i mastima, izmeu D1-14 (10 minijaturnih
svinja); uinci Gl ili lovastatina izmeu D15-29 (5 minijaturnih svidnja/grupa) su sljeei: aDl vs 14, za sve minijaturne svinje zajedno (P < 0.00l).bDl4 vs 29 (P < 0.05). *0.05 < P < 0.1,
za ukazivanje statistikih trendova.
http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2
-
http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2
Page 6 of 12
(page number not for citation purposes)
Lipids in Health and Disease 2004, 3
je doza lovastatina bila nedovoljna. Hrcima je data doza od
2 mg lovastatina/100 g prehrane to je priblino 4.3mol
lovastatina/ kg tjelesne teine. Himber et al. [57] su tretirali
hrke sa 25 mol lovastatina/kg tjelesne teine, to je
smanjilo HDL; ili 50 mol to je smanjilo LDL i HDL[57].
Morand et al.[53] su otkrili da 20-200mol simvastatina/kg
tjelesne teine je bio dovoljan da smanji LDL. Ma et al. [59] su
smanjili lipoproteine kod hraka sa 100 mg lovastatina/ 100 g
prehrane/dan, to je takoer moda bilo pogreno. Doza od
24-42 mg je dovoljna da smanji lipoproteine kod Hyde Park
minijaturnih svinja [60]. Bez obzira na to, vrsta svinja koje
smo mi koristili su moda manje agresivno odgovorile na
lovastatin (M. Huff, Lina komunikacija, decembar 2000.
godine). Kod Gottingen minijaturnih svinja, doza od 80 mg
simvastatina je smanjila LDL, dok je 240 mg smanjilo LDL i
HDL [53]; simvastatin je vie uinkovit kod svinja neko
lovastatin u slinim reimina ishrane [61,62].
Redukcija TAG sa Gl gljivama je mogua zbog niih D1 TAG
vrijednosti kod Gl grupa u odnosu na kontrolnu. TAG redukcije kod hraka se obino deavaju pod uvjetima veeg
unosa zasienih masti [6,63]. U jedinoj drugoj revidiranoj
studiji koja ispituje smanjenje osobina holesterola Glom kod
manjih ivotinja, prah 5 dijetskih teinskih% osuenih Reishi
gljiva je smanjio TC kod SHR pacova; uinci na VLDL, LDL i
HDL nisu prouavani [2]. Kada su se koristili uvjeti hranjenjem holesterolom visokih masnoa kod minijaturnih
svinja, Gl inducirana inhibicija sinteze holesterola bi trebala
rezultirati u manjem prisustvu hepatilnog holesterola za
sintezu lipoproteina. Zauzvrat, to ima potencijalni uinak
redukcije plazma VLDL sekreta holesterola, redukciju LDL
direktnog luenja; i mogue smanjenje VLDL-LDL konverzije [64,65]. U datoj studiji, nismo posmatrali razlike u
nivoima TAG ili VLDL kod svinja hranjenih ili Gl gljivama ili
lovastatinm, meutim ovaj uinak je moda predvien jer je
VLDL grupa predstavljala samo mali dio lipoproteina i/ili se
desila efikasna VLDL-LDL konverzija. Redukcije LDL i HDL
uz pomo Gl su postojane uz vie doze statina [53].
Fekalne eluane kiseline i neutralni steroli kod hraka i
minijaturnih svinja
Kod hraka, Gl je povisio fekalne eluane kiseline i
kenodeoksikolate, dok su obje doze povisile koprostanol
3-jedan; 5% doze je smanjilo kolestanol zbog nejasnih
razloga. Poveanje fekalnih kenodeoksikolata vjerovatno
ukazuje da je produkcija ili recikliranje kenodeoksikolata
bila poveana.
Plazmeni nivoi kolestanola su pozivitno povezani sa
absorpcijom holesterola [66]; dok smanjenje fekalnog
kolestanola moe indicirati da je plazmeni kolestanol bio
povien i da je bila poviena absorpcija holesterola. Kod
minijaturnih svinja, Gl je poveavao fekalni kolestanol,
suprotno od onoga to se desilo kod hraka hranjenih sa 5%
Gl. Koprostanol i koprostanol 3-jedan su bakterijski
proizvodi holesterola, koji su povieni kada je fekalni
holesterol
povien, ili kada je prominjena flora probavnog sistema [67].
Budui da se nivoi fekalnog holesterola ili koprostanola nisu
promijenili nijednom dozom Gl, nije jasno zato se koprostanol 3-jedan akumulirao.
une soli mogu imati razne funkcije i mogu djelovati kao
sredstva za pranje, aktivatori proteina kinaze C i
fosfatidilinositol-3 kinaze; i mogu biti vani regulatori gena
[68,69]. Kenodeoksikolat, deoksi-lat i njihovi glicini i taurini
konjugiraju i mogu dovesti do faresoid X receptor/retinoid X receptora (FXR/RXR)-inducirane aktivacije probavne
eluane kiseline koja vee transkripciju proteina (I-BABP), i
supresiju CYP7RNK i proteinskih nivoa (FXR sprijeava
jetrene X receptore (LXR)-inducirane transaktivacijom
CYP7). CYP7 regulie izvrni korak klasine sinteze une
kiseline. Sveukupno, poveani fekalni nivoi kenodeoksikolata mogu znaiti da je manje
kenodeoksikodala prisutno za aktivaciju FXRa. Manje
aktivacije FXRa bi vodilo do manjeg recikliranja une
kiseline i manje inhibicije sinteze une kiseline, vie
hepatinog holesterola bi se konvertovalo u unu kiselinu i
smanjio bi se holesterol plazme.
Sveukupno, mogue je da fibrozne i/ili lipofiline sterolinske
molekule u Gl mijenjaju absorpciju i recikliranje unih
kiselina i neutralnih sterola, to vodi do promijenjenje
fekalne akumulacije. Monitoring neutralnih steola i une
kiseline, i kvantificiranje konjugiranih i dekonjugiranih
unih kiselina bi trebalo da pomogne razjasniti moguu
vanost posmatranih radnji.
Poreenje in vitro, ex vivo i in vivo rezultata
U datoj studiji, in vitro eksperimenti su izvreni sa
podijeljenim Gl ekstraktima, dok su ex-vivo i in vivo
eksperimenti koristili nepromijenjeni Gl. Nepromijenjeni Gl
sadri fibrozne komponente, koju mogu djelovati na unu
kiselinu i absorpciju i reciklau neutralnih sterola. Fibrozni
sastojci takoer mogu natetiti unosu lipofilinih
komponenti, kao to su one koje inhibiraju in vitro sintezu
holesterola. Dodatna sloenost jeste da lipofiline
komponente kao to su ergostani steroli [39] mogu djelovati
na eluanu kiselinu i neutralni nivoe sterole. Stoga, teko je
direktno porediti nae in vitro i in vivo rezultate. Hranjenje
podijeljenim i nepromijenjenim gljivama moe doprinjeti
otkrivanju in vivo bioaktivnih komponenti kao to je to
uraeno za bukovae [70].
Zakljuak i glavni rezulati
U saetku, otkriveno je da Gl ima potencijal sniavanja
holesterla u in vitro, ex-vitro studijama, i to na dva ivotinjska
modela, uz neke razlike izmeu modela ivotinja. Mogue je da oksidirani lanosterolni derivati u Gl (djelomice
okarakterizani u datoj studiji) mogu doprinjeti smanjenju
holesterola tako to smanjuju sintezu holesterola (promjene
u in vitro i ex-vitro , ali ne na itavom tijelu, sinteza
holesterola je prisutna u datoj studiji). Fibrozni sastojci i
glukani u Gl su vjerovatno odgovorni za posmatrani alteracije fekalno neutralnih sterola i unih kiselina kod
obje vrste ivotinja, u konanici djelujui na absorbciju
holesterola i recikliranje unih kiselina i doprinosei
smanjenju holesterola. Sljedei koraci jestu ispitivanje
svojstava smanjenja holesterola raznih doza promijenjenih i
nepromijenjenih, hemijski okarakterisanih Gl komponenti u placebo-kontrolisanoj klinikoj studiji. Eksperimenti na
ivotinjama trebaju takoer koristiti podijeljenje materijale i
idealno, razjasniti mehanizme djelovanje svake bioaktivne
komponente. Pozitivni rezultati smanjenja holesterola u
takvim studijama e osvijetliti put za dodavanje Gl gljive
novim lijekovima i hranam za smanjenje holesterola, kao i u kombinaciji sa drugim sastojcima i lijekovima.
Materijali i metode
Materijali
Gl je iz Fermenta SA, Payerne, vicarska. Gljive su uzgajane
po odreenoj formuli piljevine, penine slame i zrnevlja prosoa. Substrakt je sterilisan na 90C u trajanju od 48 sati,
onda inkubiran sa materijalom Gl sijemena iz Mycotec Srl
(Cernier, Neuchtel).
Kultivacija se deava uz kontrolisanu temperaturu, svjetlo,
vlagu i koncentraciju karbon dioksida. Ljudske hepatozne elije T8A4 [71] su uzgajane u materijalu LCM seruma na
uslovima od 3.5% CO2 na 37C. Lovastatin je kupljen kao 20
mg Mevacor tableta (MSD Chibropharm GmbH, Haar,
Njemaka). HMG-CoA reduktaza,
DL-3-Glutaril-3-[14C]-HMG-CoA (2216 MBq/ mmol),
R-[5-3H] mevalonska kiselina amonijska so (1443 MBq/mmol), (2070 MBq/mmol) su iz Amersham (Upsala,
vedska). -3-HMG-CoA (hladni) i teni koktel za treprenje
su od Sigma (Buchs, vicarska). Materijal LCM elija je iz
Biofluids (Rockville, MD). 5-kolestan-3-ol, 5--kolestan i
2,3-nor-5-kolaniacid-3,7,12-triol su iz Steraloids, Inc.
(Newport, Rhode Island); drugi stereoidi su iz Sigma, i Calbiochem (La Jolla, Kalifornija). Metanolski HCL i Sylon
HTP su iz Supelco (Buchs, vicarska). Cobas Bio
autosampler je iz Hoffman-La Roche (Basel, vicarska) i
reagenti su iz Roche Diagnostics (Rotkreuz, vicarska).
Ukupna oprema za kolesterol 352 i oprema tricilglicerol 336
su iz Sigma kompanije. Deuterijum je iz Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA). Zn katalist je iz Biochemical
laboratories (Univerzitet u Bloomingtonu, IN).
Kromatografija tankog sloja silikonskog gela (TLC) je iz
Merck Eurolab (Dietkon, vicarska). Reagensi za analizu
Coomassie Plus-200 protein,a i frakcija V albumina goveeg
seruma su iz Pierce kompanije (Rockford, Illinois). Sve druge hemikalije su iz Sigma kompanije.
Priprema Gl za in vitro testiranje
http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2
-
http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2
Page 7 of 12
(page number not for citation purposes)
Lipids in Health and Disease 2004, 3
Plodna tijela iz gl (20 g) su osuena, samljevana i trapljena u
0.4 L MeOH/H2O (4:1,v/v) na sobnoj temperaturi u trajnaju
od 3 dana. Mjeavina se filtrirala, isparila, ponovno
rastvorila u H2O, ukiselila do pH3 vrijednosti sa 3M HCl,
ekstrahirala 3x sa 150 mL etil acetata, i organska faza je
isparila pod vakumom na 300C, ponovno rastvorila u 10 mL
MeOH, i suila sa Na2SO4, za analize HPLC i in vitro
testiranje.
Hemijska analiza Gl
Prisustvo lovostalina u Gl je odreeno koritenjem HPLC uz
Nucleosil 100-5 C18 kolonu (250 c 4 mm; Mach-erey-Nagel,
Oesingen, vicarska) i sa Lichrospher 100 RP-18 post
kolonom (Merck, Glattbrugg, vicarska). Sovent A je bio
H3PO4/H2O (1:2000, po volumenu); solvent B je bio
acetonitril. Dijeljenje je zapoeto linearnim gradijentom od
95% A, 5% B, dostiui 50% A, 50% B za 45 minuta, 30% A,
70% B za 46 minuta, 10% A, 90% B za 48 minuta i 0% A i
100% B za 50 minuta; nastavljeno je isokratino 4 minute.
Poetno stanje je odrano 6 minuta prije ponovnog
uravnoteenja; mlaz je bio 1 mL/min. Detektor je bio G1315
A, detektor serije 1100 (Hewlett Packard, Meyrin,vicarska);
upijanje se biljeilo na 254 nm. Nakon selektivne ekstrakcije i
purifikacije razliitim adsorbentima i solventima, ganoderoli
ganoderina kiselina su zapaeni od strane masenog
spektometra i NMR (detalji e biti posebno objavljeni).
In vitro aktivnost ekstrakta Gl
Ljudske hepatine elije T9A4 su uzgajanje u LCM
serumskom materijalu 3.5% CO2 na 37C. elije su prosiranje
na ploama 24-well i na spajanju, inkubirane sa
1mM14C-acetat (1mCi/nmol) u trajanju od 20 sati ekstrakti
gljiva. Lipidi su izvaeni iz elija inkubiranjem 2x sa 1.5 mL
hesana/isopropanola (3:2 po volumenu) u trajanju od 30
minuta na sobnoj temperaturi. Kombinirani organski
ekstrakti su sueni pod N2, ponovno rastvoreni u heksanu, i
odvojeni TLCom sa heksani/dietil eter/acetinom kiselinom
(75:25:1 po volumenu). Sinteza holesterola se utvrdila
mjerenjem inkorporacije 14C iz acetata u holesterol.
Radioaktivnost se mjerila instantnim slikanjem i izraena je
kao procenat kontrole.
Primjena Gla i lovastatina hrcima
Mujaci Golden Syrican hraka (Harlan, UK), 3-4 sedmice
stari, 4060 grama teki su drani pojedinani u kavezima
Macrolon tipa 3 u 12 smjenjujuih perioda svjetlosti i tame.
Tokom 3 sedmice
prije tretmana, hranjeni su Nafag 924 kompletnom ishranom za hrke (3132/20, Eberle Nafag AG, Gossau, vicarska;
Tabela 1). Slijedei randomiziranje tjelesne teine, grupe su se sastojale od 6 hraka/ grupe su primale ili : Nafag ishranu
(kontrola), Nafag mijeanu sa 2 mg lovostatina/100 g ishrane
(pretvorenu u prah uz teni N2); ili Nafag mijeanu sa 2.5 ili
5% suenih Gl. Hrci cu hranjeni eksperimentanom ishranom
17 dana. Lovostatin je inhibitor HMG-CoA reduktaze [72], i
koriten je za pozitivnu kontrolu. Unos hrane je biljeen svaki dan, a teina tijela se mjerila sedmino. Fekalije su se
skupljale za D15-18. Hrcima je podkono ubrizgano 250L
D2O na D17 i ubijeni pod anestezijom sa isofurlanom na D18.
Slijedei post od 16 sati, D1 (0.5 mL) i D18 krv (>3 mL) su
uzeti iz retroorbitalnih upljina, odnosno srane vene, i
prebaeni u EDTA tube. Plazma se pripremila centrifugom na 1500 g, 15 min, na 40C. Plazma, i hepatina i tkiva slijepog
crijeva su pohranjena na -800C. Zahvati na ivotinjama su
autorizovani od strane Service Vtrinaire du Canton de
Vaud, Switzerland, protokol 1247.
Primjena Gla i lovostatina na minijaturnim svinjama
Devet enki i jedan mujak Gottingen minijaturnih svinja
(Jrg Farm in Bern vicarska; Minipig-Primrzucht, Auswill,
vicarska) starih 6-12 mjeseci (18-20 kg) sa bijelim (7) i crnim
(3 minijaturne svinje) koloracijama, su drane u
spremnicima od 30 m2 uz normalni ciklus svjetlosti i mraka,
na sobnoj temperaturi. enke su odabrane jer imaju manje
modifikacija lipida koji su povezani sa godinama i manju
koncentraciju lipida od mujaka. Jedan mujak je grekom
dostavljen, meutim ukupan holesterol (TC), lipoproteini,
une kiseline i neutralni steroli su bili slini ostalim
svinjama. Minijaturne svinje su se nausmice rasporedice po
teini u dvije odvojene grupe i oznaile plastinom oznakom
na uhu, hranile dva puta dnevno 11 dana komercijalnom
hranom za svinje u prahu (Hrana 574, Minipig-Primrzucht).
Tokom etiri uzastopna dana prilagodbe, minijaturne
svidnje su hranje prilagoenom mjeavinom hrane i
poveanim koliinama prakastog hiperkolesteromine
kontrolne hrane (posebna ishrana 2604, Kliba, Kaiseraugst,
vicarska; Tabela 2) od 0% do 100% u koracima od 25 %,
osmiljenoj po planu Burnett et al. [64,74], to je bilo shodno
nutricionistikim potrebama Gottingen minijaturnih svinja
[75]. Tokom slijedee dvije sedmice (D15-D29), grupe su
hranjenje kontrolnom hiperholesteroleminom dijetom
prethodno smijeanom sa 2.5% ekstrakta Gl ; ili
hiperholestetominom ishranom plus 80 mg
lovastatina/svinja/dan (u etiri tablete od 20 mg) [53], svinje
su runo hranjene svako jutro, stavljenje u pola jabuke. Radi
prilagodbe, na D12-14, minijaturne svinje su dobile pola
jabuke bez lovastatina. Studija je bila slijepa jer su ishrane
kodirane, i oznaka za ekstrakt gljive je bila "Nestl Special
Fiber". Unos hrane je bio 3.5% tjelesne teine po danu
(bazirano na prosjenoj teini grupe), podeavao se
sedmino kako bi se pruio dovoljan, ali ne prekomjeran broj
kalorija [64,65,75]. Hrana se dijelila u 07:00 i 15:00 sati i
linerano irila na istu cementiranu povrinu kako bi se
omoguilo pojedinano hranjenje. Destilovana voda se
davala ad libitum. Igrake i ljudski kontakt je pruen kako bi
se izbjegla dosada. Uzorci krvi od posta od 16 sati (10 mL;20
mL na D29) su spremljeni u EDTA tube na D1,15,22,28, i 28 iz
prednje uplje vene. Plazma je pripremljena centrifugom kao
to je opisano za hrke, i pohranjena na -800C. Uzimanje krvi
je zapoeto u 08:00 slijedei injekciju intramiinog
relaksanta Dormicum (Hoffmann La Roche, Basel,
vicarska), onda sredstvo za umirenje Stresnil (Janssen Pharmaceuticals, Beerse, Belgija). Nakon skupljanja krvi na
D1, 15 i 29, minijaturne svinje su izolirane na maksimalno 2
sata radi prikupljanja individualnih fekalija. Neke
minijaturne svinje nisu vrile nudu u tom periodu, dok su
druge vrile nudu ponovo po povratku u grupe. Stoga,
jutarnje prikupljanje fekalija je bilo kvalitativno. Fekalije su
se skladitile na -400C uz N2. Tjelesna teina se mjerila
sedmino, a unos hrane svako jutro. Minijaturne svinje su
donirane Univerzitetu u enevi nakon zavretka studije.
Zahvati na ivotinja su autorizirani od strane Service
Vtrinaire du Canton de Geneve, vicarska, protokol 1315,
autorizacija 31.1.1014/1719/1.
Mjerenje holesterola i triacilglicerola kod hraka i
minijaturnih svinja
Ukupni holesterol plazme i triacilgliceroli su mjereni
koritenjem posebne opreme i Roche Cobas Bio
autosamplera. Lipoptoteini plazme su razdvojeni
koritenjem HPLC razdvanja na osnovu veliine kao to je
prethodno opisano [63].
Mjerenje odnosa sinteze frakcijskog holesterola kod hraka
i minijaturnih svinja
Mjerenja vodom i holesterom deutrij bogaena su vrena uz
pomo Finnigan Thermoquest Delta XL plus izotopskog
masnog spektometra (Bremen, Njemaka) kao to je
prethodno opisano [76,77]. Odnos frakcijske sinteze (FSR)
slobodnog holesterola je izraunat iz uzoraka plazme
skupljenih 24 sata nakon to je ubrizgana potkona injekcija
deutrium oksida : FSR (u % dio/dan) = 100 x (bogaenje
holesterola/ (bogaenje vodom) x 0.478)). Zbog tehnikih
razloga, nije bilo dovoljno vrijednosti u eksperimentima na
minijaturnim svinjama da bi se proizveli konkretni rezultati.
Mjerenje ekalne une kiseline i neutralnih sterola kod
hraka i minijaturnih svinja
Fekalni neutralni steroli i une kiseline su izvaene iz
lifoliziranih fekalija, dekonjugirane, derivatizirane uz Sylon
HTP i analizirane uz gasnu kronomatografiju prethodno
opisanu uz unutarnje standarde: 5--kolestan iz neutralnih
sterola; 2,3-nor 5 -kolanik kiselina-3,7,12-triol za une
kiseline [63].
http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2
-
http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2
Page 8 of 12
(page number not for citation purposes)
Lipids in Health and Disease 2004, 3
Hepatozna ex-vivo mjerenja reduktaze HMG-CoA kod
hraka
Svjea jetra (300 mg) je uzeta nakon posta od 16 sati iz
hraka, isjeckana makazama i homogenizirana sa 0.4 mL bufera (50 nM KH2PO4, 0.1 surkoze, 50 mM KCl, 50 mM
NaCl, 30 mM EDTA i 2 MM dithiotreitol, 50 mM NaF) uz
Potter-Elvehjem S homogenizator sa 400 opm/5 udara, na
ledu, po Conde et al. [55]. NaF inhibira defosforilaciju
HMG-CoA reuktaze inaktivirajui fosforoproteinsku
fosfatazu, to prouzrokuje ukupnu fosforilatiziranu aktivnost HMG-CoA reduktaze. Nakon pranja
homogenizatora sa 0.2 mL pufera, homogenat se
centrifugirao na 10000 g, 15 minuta, na 40C. Supernatant je
decantiran, 0.4 mL hladnog pufera dodano, i tuba je
ponovno stavljena i ponovo centrifugirana. Odvojeni
post-mitohondrijski supernatanti su se vrtili na 1.5 mL utracentrifugalnim tubama na 150000 opm, 10 minuta na 4C
u Sorvall Discoverz M 150 mikro ultracentrifugi ((Kendro
Laboratory Products SA, Carouge-Geneva, vicarska), i
mikrosomalne frakcije su spremljene na -800C. Mikrosomalni
proteini (200g, 10-18L) su prethodno inkubirani na 37C u
kupatilu za mijeanje, onda su inkubirani 15 minuta sa 50L rastvora substrata (pufer plus 90mM glukoza-6-fosfata, 72
mM EDTA, 9mM NADP, 6.2 nmol hladnog HMG-CoA (0.12
mM), 1.3 nmol [14C]HMG-CoA (0.0025 MBq), 0.3 IU
glukoza-6-fosfata, dehidrogenaza, i 0.024 MBq
[3H]meval-onske kiselne kao povratni standard). Nakon 15
minuta, reakcija je okonana uz 25L 10 M HCL, onda inkubirana 30 minuta na 37C za konverziju
mevalonat-mevaloolakton. Slijedei centrifugu na 1000 g, 1
minut, na 4C da se uklone denaturisani proteini, supernatant
se dodao na aktivirane (1 sat, 105C) TLC ploe, razvijene u
svjeem benzen-acetonu (1:1 po volumenu),mevalonolaktoni
region je sastrugan (na osnovu migracije hladnih standarda i rendgenskih zraka film vizualizacije; Rf 0.42-0.5), i
radioaktivnost se mjerila u koktelu treperenja od 10 mL.
Statistika
Razlike izmeu grupa su testirane parnim/neparnim,
jednostranim/dvostranim, student t-testovima, jednakim
promjenama, kao to je prikladno za razliita mjerenja.
Statistiki znaaj se izraavao u odnosu na kontrolu P < 0.05
osim ako nije naznaeno drugaije
Lista skraenica
D, dan; FPLC, tena kromatografija brzih proteina; GC gasna
kromatografija; Gl ili G. Ludidum, Ganoderma lucidum; HMG-CoA 3-hidroksi-3-metilglutaril koenzim A; HPLC,
tena kromatografija pod visokim pritiskom; TLC
kromatografija tankog sloja; TAG tiacilglicerol; TC, ukupni
holesterol.
Doprinosi autora
AB je napisao i sastavio veinu manuskripta, bio je
odgovoran za studije na minijaturnim svinjama, i sluio je
kao voa projekta za istraivanje holesterola na ivotinjama.
DR je razvio metode za mjerenje lipoproteina holesterola, i
bio je odgovoran za studije na hrcima. EK; I. Monnard i JH
su sudjelovali u studijama na ivotinjama, i razvili su
metode za neutralne sterole, une kiseline i ex vivo mjerenja.
HH je razvio metode za hemijsku analizu Gl.I. Meirim i CPW
su razvili metode za odnose sinteze holesterola. KM je dio
odgovaran za in vitro bioloka testiranja ekstrakta Gl.
P.Niederberger je vodio kompletan projekat.
Priznanja Autori se ele zahvaliti P. Weber iz Champiteca za dobavljanje Gl; D. Isler iz Klibae za
pripremanje posebne ishrane za minijaturne svinje; P. Bidaut i P. Bonfills iz Univerziteta u
enevi za brigu i hranjenje minijaturnih svinja, i pomo sa protokolom eksperimenta;J.-L.
Sanchez-Garcia ili asistiranje sa vaenjem krvi minijaturnih svinja;M. Gyger za predoenje
veterinarskih protokola; Jedinici za brigu o ivotinjama Nestle centra za istraivanje za
pomo sa eksperimentima na hrcima; M. Huff sa Univerziteta u Zapadnom Ontariju za
korisne diskusije u vezi ishrane minijaturnih svinja i doziranja lovastatina: Ellegaard
Gottingen Minipigs ApS, Dalmose, Danska, za pruanje informacija o Gorringen
minijaturnim svinjama; i na kraju D. Mutchu, B. Germanu, J.-R. Nesseru, i O. Ballervreu za
dinamine diskusije u vezi sa modelima istraivanja holesterola kod ivotinja.
Reference
1. Borchers AT, Stern JS, Hackman RM, Keen CL, Gershwin ME: Mushrooms, tumors,
and immunity. Proc Soc Exp Biol Med 1999, 221:281-293.
2. Kabir Y, Kimura S, Tamura T: Dietary effect of Ganoderma lucidum mushroom on
blood pressure and lipid levels in spontaneously hypertensive rats (SHR). J Nutr
Sci Vitaminol (Tokyo) 1988, 34:433-438.
3. Li Khva Ren, Vasil'ev AV, Orekhov AN, Tertov VV, Tutel'ian VA: [Anti-atherosclerotic
properties of higher mushrooms (a clinico-experimental investigation)]. Vopr Pitan
1989:16-19.
4. Opletal L, Jahodar L, Chobot V, Zdansky P, Lukes J, Bratova M, Soli-chova D,
Blunden G, Dacke CG, Patel AV: Evidence for the anti-hyperlipidaemic activity of the
edible fungus Pleurotus ostreatus. Br J Biomed Sci 1997, 54:240-243.
5. Bobek P, Ozdin L, Galbavy S: Dose- and time-dependent hypoc-holesterolemic
effect of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) in rats. Nutrit ion 1998,
14:282-286.
6. Bobek P, Galbavy S: Hypocholesterolemic and antiatherogenic effect of oyster
mushroom (Pleurotus ostreatus) in rabbits. Nahrung 1999, 43:339-342.
7. Cheung PC, Lee MY: Fractionation and characterization of mushroom dietary fiber
(nonstarch polysaccharides) as potential nutraceuticals from sclerotia of Pleurotus
tuber-regium (Fries) singer. J Agric Food Chem 2000, 48:3148-3151.
8. Gunde-Cimerman N, Plemenitas A: Hypocholesterolemic activity of the genus
Pleurotus (Fr.) Karst. (Agaricales s.l., Basidiomycetes). Int J Medicinal
Mushrooms 2001, 3:A9I.
9. Cheung PC: Plasma and hepatic cholesterol levels and fecal neutral sterol excretion
are altered in hamsters fed straw mushroom diets. J Nutr 1998, 128:1512-1516.
10. Fukushima M, Nakano M, Morii Y, Ohashi T, Fujiwara Y, Sonoyama K: Hepatic LDL
receptor mRNA in rats is increased by dietary mushroom (Agaricus bisporus) fiber
and sugar beet fiber. J Nutr 2000, 130:2151-2156.
11. Beynen AC, Fielmich AM, Lemmens AG, Terpstra AH: Farm-grown mushrooms
(Agaricus campestris) in the diet of rats do not affect plasma and liver cholesterol
concentrations. Nahrung
I996, 40:343-345.
12. Cheung PCK: The hypocholesterolemic effect of extracellular polysaccharide from the submerged fermentation of
mushroom. Nutr Res 1996, 16:1953-1957.
13. Cheung PCK: The hypocholesterolemic effect of two edible mushroom: Auricularia
auricula (Tree-ear) and Tremella fuci-formis (White-jelly leaf) in
hypercholesterolemia rats. Nutr Res 1996, 16:1721-1725.
14. Kabir Y, Yamaguchi M, Kimura S: Effect of shiitake (Lentinus edo-des) and maitake
(Grifola frondosa) mushrooms on blood pressure and plasma lipids of
spontaneously hypertensive rats. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo) 1987,
33:341-346.
15. Kubo K, Nanba H: The effect of maitake mushrooms on liver and serum lipids.
Altern Ther Health Med 1996, 2:62-66.
16. Sugiyama K, Yamakawa A, Saeki S: Correlation of suppressed linoleic acid
metabolism with the hypocholesterolemic action of eritadenine in rats. Lipids 1997,
32:859-866.
17. Sugiyama K, Kawagishi H, Tanaka A, Saeki S, Yoshida S, Sakamoto H, Ishiguro Y:
Isolation of plasma cholesterol-lowering components from ningyotake (Polyporus
confluens) mushroom. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo) 1992, 38:335-342.
18. Kaneda T, Tokuda S: Effect of various mushroom preparations on cholesterol levels
in rats. J Nutr 1966, 90:371-376.
19. Shao G: [Treatment of hyperlipidemia with cultivated Cordyceps a double-blind,
randomized placebo control trial]. Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi (Chin J Integ
Med) 1985, 5:642-665.
20. Tao J, Feng KY: Experimental and clinical studies on inhibitory effect of Ganoderma
lucidum on platelet aggregation. J Tongji Med Univ 1990, 10:240-243.
21. Chang ST: Ganoderma - the leader in production and technology of mushroom
neutraceuticals. In: Recent advances in Gano-derma lucidum research
Edited by: Kim B-K, Kim YS. Seoul, Korea: The Pharmaceutical Society of
Korea; 1995:43-52.
22. Chen AW, Miles PG: Biomedical research and the application of the mushroom
nutriceuticals from Ganoderma lucidum. In: Mushroom Biology and Mushroom
Products Edited by: Royse DJ. University Park, PA: The Pennsylvania
State University; 1996:161-175.
23. Mizuno T: Oriental medicinal tradition of Ganoderma lucidum (Reishi) in China. In:
Ganoderma lucidum Edited by: Mizuno T, Kim BK. Seoul, Korea: II-Yang
Pharm. Co. Ltd; 1996:101-106.
24. Sun-Soo T: Effective dosage of the extract of Ganoderma lucidum in the treatment
of various ailments. In: Mushroom Biology and Mushroom Products Edited by:
Royse DJ. University Park, PA: The Pennsylvania State University;
1996:177-185.
25. Wasser SP, Weis AL: Therapeutic effects of substances occur-ring in higher
Basidiomycetes mushrooms: a modern perspective. Crit Rev Immunol 1999,
19:65-96.
26. Chang ST, Buswell JA: Medicinal Mushrooms - A Prominent Source of Nutriceuticals
for the 21st century. Current Topics in Nutraceutical Research 2003,
1:257-280.
27. Shiao MS: Natural products of the medicinal fungus Gano-derma lucidum:
occurrence, biological activities, and phar-macological functions. Chem Rec 2003,
3:172-180.
28. Lee SY, Rhee HM: Cardiovascular effects of mycelium extract of Ganoderma
lucidum: inhibition of sympathetic outflow as a mechanism of its hypotensive action.
Chem Pharm Bull (Tokyo) 1990, 38:1359-1364.
29. Rein D, Monnard I, German JB, Berger A: Screening of cholesterol absorption and
synthesis inhibiting food ingredients in hamster models. FASEB J 2000, I4:A250.
30. Cevallos WH, Holmes WL, Myers RN, Smink RD: Swine in atherosclerosis research
- Development of an experimental animal model and study of the effect of dietary
fats on cholesterol metabolism. Atherosclerosis 1979, 34:303-317.
31. Clarkson T, Shively C, Weingand K: Animal Models of diet-Induced Atherosclerosis.
In: Use of Animal Models for Research in Human Nutrit ion Volume 6.
Edited by: Beynen A, West C. Basel: Karger; 1988:56-82.
32. Fadden K, Hill MJ, Latymer E, Low G, Owen RW: Steroid metabo-lism along the
gastrointestinal tract of the cannulated pig. Eur J Cancer Prev 1999, 8:35-40.
33. Hikino H, Ishiyama M, Suzuki Y, Konno C: Mechanisms of hypogly-cemic activity of
ganoderan B: a glycan of Ganoderma luci-dum fruit bodies. Planta Med 1989,
55:423-428.
34. Bao X, Duan J, Fang X, Fang J: Chemical modifications of the
(I-->3)-alpha-D-glucan from spores of Ganoderma lucidum and investigation of their
physicochemical properties and immu-nological activity. Carbohydr Res 2001,
336:127-140.
35. Zhu M, Chang Q, Wong LK, Chong FS, Li RC: Triterpene antioxidants from
Ganoderma lucidum. Phytother Res 1999, 13:529-53 1.
36. Wu TS, Shi LS, Kuo SC: Cytotoxicity of Ganoderma lucidum trit-erpenes. J Nat
Prod 2001, 64: II2I-II22.
37. Gao JJ, Min BS, Ahn EM, Nakamura N, Lee HK, Hattori M: New trit-erpene
aldehydes, lucialdehydes A-C, from Ganoderma luci-dum and their cytotoxicity
against murine and human tumor cells. Chem Pharm Bull (Tokyo) 2002,
50:837-840.
38. Luo J, Zhao YY, Li ZB: A new lanostane-type triterpene from the fruiting bodies of
Ganoderma lucidum. J Asian Nat Prod Res 2002, 4: I29-134.
39. Ma J, Ye Q, Hua Y, Zhang D, Cooper R, Chang MN, Chang JY, Sun HH: New
lanostanoids from the mushroom Ganoderma lucidum. J Nat Prod 2002, 65:72-75.
http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1046/j.1525-1373.1999.d01-86.xhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1046/j.1525-1373.1999.d01-86.xhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10460691http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3236086http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3236086http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9624732http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/S0899-9007(97)00471-1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/S0899-9007(97)00471-1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1002/(SICI)1521-3803(19991001)43:5%3c339::AID-FOOD339%3e3.3.CO;2-Xhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1002/(SICI)1521-3803(19991001)43:5%3c339::AID-FOOD339%3e3.3.CO;2-Xhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1021/jf000382shttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1021/jf000382shttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9732312http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9732312http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10958806http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10958806http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9008834http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9008834http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/S0271-5317(96)00218-7http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/S0271-5317(96)00218-7http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/S0271-5317(96)00218-7http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/0271-5317(96)00191-1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/0271-5317(96)00191-1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3443885http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3443885http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=8795938http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9270978http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9270978http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=1291638http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=6005929http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=6005929http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=2098581http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9987601http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9987601http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1002/tcr.10058http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1002/tcr.10058http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=12900937http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=2393962http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=518741http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=518741http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=518741http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10091041http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10091041http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=2682700http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/S0008-6215(01)00238-5http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/S0008-6215(01)00238-5http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=11689183http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10479768http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1021/np010115whttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1021/np010115whttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1248/cpb.50.837http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1248/cpb.50.837http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=12045343http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=12067158http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=11809071
-
http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2
Page 9 of 12
(page number not for citation purposes)
Lipids in Health and Disease 2004, 3
40. Komoda Y, Shimizu M, Sonoda Y, Sato Y: Ganoderic acid and its derivatives as
cholesterol synthesis inhibitors. Chem Pharm Bull I989, 37:53I -533.
41. Mizushina Y, Takahashi N, Hanashima L, Koshino H, Esumi Y, Uzawa J, Sugawara
F, Sakaguchi K: Lucidenic acid O and lactone, new terpene inhibitors of eukaryotic
DNA polymerases from a basidiomycete, Ganoderma lucidum. Bioorg Med Chem
I999,
7:2047-2052.
42. Ha TB, Gerhauser C, Zhang WD, Ho-Chong-Line N, Fouraste I: New lanostanoids
from Ganoderma lucidum that induce NAD(P)H:quinone oxidoreductase in cultured
murine hepatoma cells. Planta Med 2000, 66:68I-684.
43. Walker KA, Kertesz DJ, Rotstein DM, Swinney DC, Berry PW, So OY, Webb AS,
Watson DM, Mak AY, Burton PM et ab Selective inhibition of mammalian lanosterol
14 alpha-demethylase: a possible strategy for cholesterol lowering. J Med Chem
I993,
36:2235-2237.
44. Frye LL, Leonard DA: Lanosterol analogs: dual-action inhibitors of cholesterol biosynthesis. Crit Rev Biochem Mol Biol I999,
34:I23-I40.
45. Bergstrom JD, Dufresne C, Bills GF, Nallin-Omstead M, Byrne K: Discovery,
biosynthesis, and mechanism of action of the zarago-zic acids: potent inhibitors of
squalene synthase. Annu Rev Microbiol I995, 49:607-639.
46. Bollen P, Ellegaard L: The Gottingen minipig in pharmacology and toxicology.
Pharmacol Toxicol I997, 80(Suppl 2):3-4.
47. Gunde-Cimerman N, Cimerman A: Pleurotus fruiting bodies con-tain the inhibitor of
3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase-lovastatin. Exp Mycol I995, 19:
I-6.
48. Ogawa H, Hasumi K, Sakai K, Murakawa S, Endo A: Pannorin, a new
3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor produced by
Chrysosporium pannorum. J Antibiot (Tokyo) I99I,
44:762-767.
49. Morisaki M, Sonoda Y, Makino T, Ogihara N, Ikekawa N, Sato Y: Inhibitory effect of 15-oxygenated sterols on cholesterol syn-
thesis from 24,25-dihydrolanosterol. J Biochem (Tokyo) I986,
99:597-600.
50. Aoyama Y, Yoshida Y, Sonoda Y, Sato Y: 7-Oxo-24,25-dihydro- lanosterol: a novel lanosterol 14 alpha-demethylase (P-
M) inhibitor which blocks electron transfer to the oxy-
ferro intermediate. Biochim Biophys Acta 1987, 922:270-277.
51. Sonoda Y, Obi N, Onoda M, Sakakibara Y, Sato Y: Effects of 32-oxy-genated
lanosterol derivatives on 3-hydroxy-3-methylglu-taryl coenzyme A reductase activity
and cholesterol biosynthesis from 24,25-dihydrolanosterol. Chem Pharm Bull
(Tokyo) 1992, 40:2796-2799.
52. Trzaskos JM, Magolda RL, Favata MF, Fischer RT, Johnson PR, Chen HW, Ko SS,
Leonard DA, Gaylor JL: Modulation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase by
15 alpha-fluorolanost-7-en-3 beta-ol. A mechanism-based inhibitor of cholesterol
biosynthesis. J Biol Chem 1993, 268:22591-22599.
53. Morand OH, Aebi JD, Dehmlow H, Ji YH, Gains N, Lengsfeld H, Him-ber J: Ro
48-8.071, a new 2,3-oxidosqualene:lanosterol cyclase inhibitor lowering plasma
cholesterol in hamsters, squirrel monkeys, and minipigs: comparison to simvastatin.
J Lipid Res 1997, 38:373-390.
54. Ness GC, Gertz KR, Holland RC: Regulation of hepatic lanosterol 14
alpha-demethylase gene expression by dietary cholesterol and cholesterol-lowering
agents. Arch Biochem Biophys 2001, 395:233-238.
55. Conde K, Roy S, Freake HC, Newton RS, Fernandez ML: Atorvasta-tin and
simvastatin have distinct effects on hydroxy methyl-glutaryl-CoA reductase activity
and mRNA abundance in the guinea pig. Lipids 1999, 34:1327-1332.
56. Del Puppo M, Rauli S, Galli Kienle M: Inhibition of cholesterol synthesis and hepatic
3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase in rats by simvastatin and pravastatin.
Lipids 1995, 30:1057-1061.
57. Himber J, Missano B, Rudling M, Hennes U, Kempen HJ: Effects of
stigmastanyl-phosphocholine (Ro 16-6532) and lovastatin on lipid and lipoprotein
levels and lipoprotein metabolism in the hamster on different diets. J Lipid Res
I995, 36:1567-1585.
58. Krause BR, Princen HM: Lack of predictability of classical animal models for
hypolipidemic activity: a good time for mice? Atherosclerosis 1998, 140:15-24.
59. Ma PT, Gil G, Sudhof TC, Bilheimer DW, Goldstein JL, Brown MS:
Mevinolin, an inhibitor of cholesterol synthesis, induces mRNA for low density
lipoprotein receptor in livers of hamsters and rabbits. Proc Natl Acad Sci U S A
1986, 83:8370-8374.
60. Huff MW, Telford DE: Regulation of low density lipoprotein apoprotein B metabolism
by lovastatin and cholestyramine in miniature pigs: effects on LDL composition and
synthesis of LDL subfractions. Metabolism 1989, 38:256-264.
61. Tikkanen MJ: Statins: within-group comparisons, statin escape and combination
therapy. Curr Opin Lipidol 1996, 7:385-388.
62. Knopp RH: Drug treatment of lipid disorders. N Engl J Med 1999, 341:498-51 I.
63. Berger A, Gremaud G, Baumgartner M, Rein D, Monnard I, Kratky E, Geiger W, Burri
J, Dionisi F, Allan M, Lambelet P: Cholesterol-low-ering properties of amaranth grain
and oil in hamsters. Int J Vitam Nutr Res 2003, 73:39-47.
64. Burnett JR, Wilcox LJ, Telford DE, Kleinstiver SJ, Barrett PH, Newton RS, Huff MW,
Barrett P: Inhibition of HMG-CoA reductase by atorvastatin decreases both VLDL
and LDL apolipoprotein B production in miniature pigs. Arterioscler Thromb Vasc
Biol I997, 17:2589-2600.
65. Burnett JR, Wilcox LJ, Telford DE, Kleinstiver SJ, Barrett PH, Newton RS, Huff MW:
The magnitude of decrease in hepatic very low density lipoprotein apolipoprotein B
secretion is determined by the extent of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A
reductase inhibition in miniature pigs. Endocrinology I999, 140:5293-5302.
66. Miettinen TA, Strandberg TE, Gylling H: Noncholesterol sterols and cholesterol
lowering by long-term simvastatin treatment in coronary patients: relation to basal
serum cholestanol. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000, 20:I340-I346.
67. Collinder E, Cardona ME, Kozakova H, Norin E, Stern S, Midtvedt T: Biochemical
intestinal parameters in pigs reared outdoors and indoors, and in germ-free pigs. J
Vet Med A Physiol Pathol Clin
Med 2002, 49:203-209.
68. Edwards PA, Kast HR, Anisfeld AM: BAREing it all: the adoption of LXR and FXR and their roles in lipid homeostasis. J Lipid Res
2002, 43:2-I2.
69. Davis RA, Miyake JH, Hui TY, Spann NJ: Regulation of cholesterol- 7alpha-hydroxylase: BAREly missing a SHP. J Lipid Res 2002,
43:533-543.
70. Bobek P, Ozdin L, Kuniak L: The effect of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus), its ethanolic extract and extraction res-
idues on cholesterol levels in serum, lipoproteins and liver of
rat. Nahrung I995, 39:98-99.
71. Pfeifer AM, Cole KE, Smoot DT, Weston A, Groopman JD, Shields PG, Vignaud JM, Juillerat M, Lipsky MM, Trump BF et ab Simian virus 40 large
tumor antigen-immortalized normal human liver epithelial cells express hepatocyte
characteristics and metabolize chemical carcinogens. Proc Natl Acad Sci U S A
I993,
90:5I23-5I27.
72. Askenazi M, Driggers EM, Holtzman DA, Norman TC, Iverson S, Zimmer DP, Boers
ME, Blomquist PR, Martinez EJ, Monreal AW et al.: Integrating transcriptional and
metabolite profiles to direct the engineering of lovastatin-producing fungal strains.
Nat Biotechnol 2003, 21:150-156.
73. Berlin E, Khan MA, Henderson GR, Kliman PG: Influence of age and sex on
composition and lipid fluidity in miniature swine plasma lipoproteins.
Atherosclerosis I985, 54:I87-203.
74. Burnett JR, Wilcox LJ, Telford DE, Kleinstiver SJ, Barrett PH, Newton RS, Huff MW:
Inhibition of ACAT by avasimibe decreases both VLDL and LDL apolipoprotein B
production in miniature pigs. J Lipid Res 1999, 40: I3I7-I328.
75. Ritskes-Hoitinga J, Bollen PJA: Nutrition of (Gttingen) minipigs: facts, assumptions
and mysteries. Pharmacol Toxicol 1997, 80(Supl II):5-9.
76. Gremaud G, Piguet C, Baumgartner M, Pouteau E, Decarli B, Berger
A, Fay LB: Simultaneous assessment of cholesterol absorption and synthesis in humans using on-line gas chromatography/
combustion and gas chromatography/pyrolysis/isotope-ratio
mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 2001,
15:1207-1213.
77. Gremaud G, Dalan E, Piguet C, Baumgartner M, Ballabeni P, Decarli B, Leser ME, Berger A, Fay LB: Effects of non-esterified stanols in a liquid emulsion on cholesterol absorption and synthesis in
hypercholesterolemic men. Eur J Nutr 2002, 41:54-60.
78. Nutrient Requirements for Swine - 10th Revised Edition. Washington, D. C.:
National Research Counci l/National Academy of Science (NRC/NAS);
1998.
79. Shapiro JD, Nordstrom LJ, Mitschelen JJ, Rodwell VW, Schimke RT: Micro assay for
3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase in rat liver and in L-cell fibroblast.
Biochim Biophys Acta 1974, 370:369-377.
Publish with BioMed Central and every scientist
can read your work free of charge
"BioMed Central will be the most s ignif icant development for
disseminating the results of biomedical research in our l ifetime."
Sir Paul Nurse, Cancer Research UK
Your research papers will be:
available free of charge to the entire biomedical community
peer reviewed and published immediately upon acceptance
cited in PubMed and archived on PubMed Central
yours you keep the copyright
Submit your manuscript here:
http://www.biomedcentral.com/info/publishing_adv.asp
o
BioMedcentral
450,
http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=2743504http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=2743504http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10530954http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1055/s-2000-8647http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1055/s-2000-8647http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=11105584http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=8340925http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=8340925http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10333389http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10333389http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1146/annurev.mi.49.100195.003135http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1146/annurev.mi.49.100195.003135http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1146/annurev.mi.49.100195.003135http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1146/annurev.mi.49.100195.003135http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9249853http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1006/emyc.1995.1001http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1006/emyc.1995.1001http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7614366http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=1880066http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=1880066http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=1880066http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3700366http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3700366http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3318933http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3318933http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=1464112http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=1464112http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=1464112http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7693673http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7693673http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7693673http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9162756http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9162756http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9162756http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1006/abbi.2001.2590http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1006/abbi.2001.2590http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1006/abbi.2001.2590http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1006/abbi.2001.2590http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10652993http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10652993http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10652993http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=8569435http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=8569435http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7595080http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7595080http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7595080http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/S0021-9150(98)00141-5http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/S0021-9150(98)00141-5http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3464957http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3464957http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=2918845http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=2918845http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=2918845http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9117143http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9117143http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1056/NEJM199908123410707http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1056/NEJM199908123410707http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=12690910http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=12690910http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9409231http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9409231http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1210/en.140.11.5293http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1210/en.140.11.5293http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1210/en.140.11.5293http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1210/en.140.11.5293http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10807752http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10807752http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10807752http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1046/j.1439-0442.2002.00407.xhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1046/j.1439-0442.2002.00407.xhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=12069263http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=11792716http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=11792716http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=11907135http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=11907135http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7898579http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7898579http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7898579http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7898579http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=46667http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=46667http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=46667http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=46667http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1038/nbt781http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1038/nbt781http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=12536215http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3986017http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3986017http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10393217http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10393217http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9249854http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9249854http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1002/rcm.365http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1002/rcm.365http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1002/rcm.365http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1002/rcm.365http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1007/s003940200008http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1007/s003940200008http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1007/s003940200008http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1007/s003940200008http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/0005-2744(74)90098-9http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/0005-2744(74)90098-9http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=4441486http://www.biomedcentral.com/http://www.biomedcentral.com/info/publishing_adv.asphttp://www.biomedcentral.com/