lit anaman echinacea purpurea .(l.) untuk bahan baku ...repository.litbang.kemkes.go.id/579/1/154...
TRANSCRIPT
LIT
LAPORAN AKBIR PENELITIAN
Standarisasi T anaman Echinacea purpurea .(L.) Moencq� Untuk Bahan Baku Imunomodulator
Sub.Judul Kajian Karakteristik Aksesi dan Pengembangan Teknis
Pembibitan Secara In Vitro Echinacea purpurea L.
Dyah Subositi, M.Sc.
BALAI BESAR PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN TANAMAN OBAT DAN OBAT TRADISIONAL
BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN RI KEMENIBRIAN KESEHATAN RI
2011
LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Standarisasi Tanaman Echinacea purpurea (L.) Moench Untuk Bahan Baku Imunomodulator "�""'· ·
SubJudul
Kajian Karakteristik Aksesi dan Pengembangan Teknis Pembibitan Secara In Vitro Echinacea purpurea L.
Dyah Snbositi, M.Se.
DALAi BESAR PENELITTAN DAN PENGEMBANGAN
TANAMAN OBAT DAN OBAT TRADISIONAL
BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHA TAN RI KEMENTERJAN KESEHA TAN RI
2011
KEMENTERIAN KESEllATAN RI SADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN
BALAI BESAR PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN TANAMAN 08AT DAN OBAT TRADISIONAL
Jalan Raya Lawn No. 11 Tawangmangu, Karanganyar, Surakarta, Jawa Tengah Telepon: (0271) 697010 Faksimile: (0271) 697451
E-mail: [email protected] Website: http://www.b2p2toot.litbang.depkes.go.id
SURAT KEPUTUSAN
KEPALA BALAI BESAR PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN
TANAMAN OBAT DAN OBAT TRADISIONAL
BADAN LITBANG KESEHATAN
NO. HK.03.07/3/242e/2011
Tentang
KAJIAN KARAKTERISTIK AKSESI DAN PENGEMBANGAN TEKNIS PEMBIBITAN SECARA
IN VITRO Echinacea purpurea L.
MENIMBANG
MENGINGAT
MENETAPKAN Pertama
1. Bahwa Echinacea purpurea L. yang ditanam di B2P2T02T telah mengalami variasi aksesi yang berbeda secara morfotogis
2. Bahwa untuk mendapatkan bibit Echinacea purpurea L. yang identik dengan induknya, · perlu ditakukan perbanyakan secara in vitro dengan teknik kultur jaringan tanaman.
3. Bahwa mereka yang namanya tercantum dalam Surat Keputusan ini dipandang cukup cakap untuk melaksanakan penelitian tersebut.
1 . Undang-undang No. 18 Tahun 2001 tentang Sistem Nasional Penelitian, Pengembangan dan Penerapan llmu Pengetahuan dan Teknologi.
·
2. Peraturan Pemerintah Nomor 39 Tahun 1995 tentang Penelitian dan Pengembangan Kesehatan
3. $urat Persetujuan Pelaksanaan Penelitian No: LB.01.07 /3/ /2011 tanggal Januari 2011, tentang Kajian Karakteristik aksesi dan Pengembangan teknis Pembibitan secara in vitro Echinacea purpurea L.
4. Daftar lsian Pelaksanaan Anggaran Balai Besar Litbang Tanaman Obat dan Obat Tradisional tahun Anggaran 2010, No. 0156/024-11.2/Xlll/2011 tanggal 31 Desember 2010, Program Penelitian dan Pengembangan Kesehatan llmu Pengetahuan dan Teknologi.
MEMUTUSKAN
Membentuk Tim f:>elaksana Penelitian Kajian Karakteristik aksesi dan Pengembangan teknis Pembibitan secara in vitro Echinacea purpurea L
1. Ketua Pelaksana Dyah Subositi, M.Sc.
2. Peneliti
3. Pembantu Peneliti
DR. Budi Sediadi D., M.Agr.Sc Fauzi, SP Awai Prichatin KD; M.Sc., Apt Nurul Husniati L., SP
Fitriana, Amd Didik Suharto Suparno, S.Pd
KEMENTER:f_AN KESEHATAN RI SADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN
BALA! BESAR PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN TANAMAN OBAT DAN OBAT TRADISIONAL
Jalan Raya Lawu No. 11 Tawangmangu, Karanganyar, Surakarta., Jawa Tengall Telepon: (0271) 697010 Faksimile: (0271) 697451
·
E-mail: [email protected] Website: http://www.b2p2toot.litbang.depkes.go.id
Kedua
Ketiga
Keempat
Tim bertugas: a. Melaksanakan penelitian sampai selesai ��'"dengan
menyerahkan laporan kepada Kepala Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional sesuai dengan Surat Persetujuan Pelaksanaan Penelitian.
b. Membuat pertanggung jawaban penggunaan anggaran sesuai ketentuan yang berlaku.
Semua pengeluaran untuk pelaksanaan Surat Keputusan ini dibebankan pada DIPA Balai Besar Litbang Tanaman Obat dan Obat Tradisional tahun anggaran 2011 sesuai peraturan yang berlaku.
Surat Keputusan ini berlaku sejak tanggal 1 Februari,12011 sampai dengan 31 Desember 2011, dengan catatan segala'sesuatu akan ditinjau kembali apabila di kemudian hari ternyata terdapat kekeliruan dalam penetapan ini.
Ditetapkan di : Tawangmangu �r-'' Pada Tanggal : 8 Februari 2011
A.n. Kepala Sadan Penelitian dan Pengembarigan Kesehatan Kepala Balai Besar Litbang Tanama9- 0bat dan
Obat Tradisional /6
lndah Yuninq Prapti. SKM., MKes NIP. 19550810 197712 2001
Surat Keputusan ini disampaikan Kepada Yth: 1. Kepala Sadan Litbang Kesehatan, Kemenkes RI 2. Jnspektur Jenderal Kemenkes RI 3. Sekretaris Jenderal Kemenkes RI 4. Oekan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada 5. Kepala Biro Keuangan dan Perlengkapan Set. Jend. Kemenkes RI 6. Kepala Kantor Pelayanan t=>erbendaharaan Negara Sragen 7. Bendahara Pengeluaran Balai Besar Litbang Tanaman Obat dan Obat Tradisional 8. Yang bersangkutan
KEMENTERIAN KESEHATAN RI SADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN
BALAI BESAR PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN TANAMAN OBAT DAN OBAT TRADISIONAL
Jalan Raya Lawu No. 11 Tawangmangu, Karanganyar, Surakarta, Jawa Tengah Telepon: (0271) 697010 Faksimile: (0271) 697451
E-mail: [email protected] Website: http://www.b2p2toot.litbang.depkes.g�.id
LAMPIRAN KEPUTUSAN KEPALA BALAI BESAR PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN
TANAMAN OBAT DAN OBAT TRAOISIONAL
NO. HK.03.07/3/242e/2011
TENTANG PENELITIAN:
KAJIAN KARAKTERISTIK AKSESI DAN PENGEMBANGAN TEKNIS PEMBIBITAN SECARA
IN VITRO Echlnacea purpurea L. ·
Rinclan Honorarium Ketua Pelaksana, Peneliti dan Pembantu Peneliti tahun 2011 adalah sebagai berikut:
No N A M A JABATAN URAIAN TUGAS HONOR/JAM
FUNGSIONAL (Rp) 1 Dyah Subositi, M.Si. Ca Ion Peneliti Ketua Pelaksana 27.500,-
._ /Gol 111
2 DR. Budi Sediadi D., M.AQSc Peneliti/Gol 1111 Peneliti 35.000,-3 Fauzi, SP Peneliti peneliti 35.000,-
Muda/Gol 111 4 Awai Pri�hatin KO, M.Sc., Apt Calon
Peneliti/Gol 1 1 1 Peneliti 27.500,-
5 Nurul Husnia, SP Caton Penellti ' 27.500,-Peneliti/Gol 111
6 Fitriana, Amd Calon Pembantu 20.000,-Litkayasa/Gol II Peneliti
7 Didik Suharto Cal on Pembantu 20.000,-Litkayasa/Gol 11 Peneliti
8 Suparno, S.Pd Litkayasa/Gol 111 Pembantu 20.000,-Peneliti
Sesuai dengan DIPA No. 0811/024-11.2.01/13/2011 tanggal 20 Desember 2011 dan Perdirjen No. Per-6i:l/PB/2005 tantang Mekanisme Pelaksanaan Pembayaran Atas Beban Anggaran Pendapatan dan Belanja Negara, dan Perdirjen No Per-11/PB/2011 tentang Perubahan ·atas Perdirjen No Per-66/PB/2005, yang bersangkutan berhak menerima honor yang terkait dengan operasional satuan kerja sebesar tersebut pada tabel diatas.
Tawangmangu, 08 Februari 2011 / Kuasa Pe una Anggaran Vr5
lndah Yunin Pra ti KM. MKes NIP. 19550810 197712 2001
KATA PENGANTAR
Alhamdulil lahirobbil'alamin, segala puji hanya bagi Allah SWT afas , .. ,.'-::._ .
rahmat dan hidayah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan Laporan Akhir
Penelitian ini dengan lancar.
Terwujudnya Laporan Akhir ini tidak Jepas dari bantuan berbagai pihak
yang telah mendukung baik secara moril rnaupun rnateriil. Pada kesempatan ini,
penulis mengucapkan terima kasih kepada:
I. Indah Yuning Prapti, SKM, M. Kes., selaku Kepala Balai Besar Penelitian
dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2 P2TO-OT)
yang telah rnengijink.an penulis menggunakan sarana dan prasarana
penelitian di Laboratorium Terpadu
2. Ketua PPI B2P2TO-OT, Ir. Yuli Widiyastuti, MP yang telah memberikan
arahan dan masukan mulai dari perencanaan, pe!aksanaan dan pelaporan
penelitian
3. Segenap anggota peneliti dan pembantu penelitian dalam penelitian ini
yang telah rnelaksanakan kewaj ibannya sehingga penelitian dapat
terlaksana dengan lancar
4. Pihak-pihak lain yang telah banyak mernbantu dan tidak dapat disebutkan
satu persatu oleh penulis
Laporan akhir penelitian ini masih jauh dari kata sernpurna, oleh karena itu
kritik dan saran yang bersifat membangun sangat dibutuhkan. Semoga karya yang
sederhana ini dapat bermanfaat bagi pihak-pihak yang membutuhkan.
Tawangrnangu, J anuari 2012
Penulis
v
---��-- - ---
RINGKASAN EKSEKUTIF
Tanaman Echinaceapurpurea (L.) Moench (ekiJ1ase) berasal dari Amerika r,.i"'.._��
•
Utara dan ikenal sebagai tumbuhan obat yang penting. Ekinase rnenunjukkan efek
imunoregulasi, anti inflamasi dan sebagai antioksidan serta tidak mempunyai efek
samping ataupun hipersensitivitas pada uj i klinis. Ekinase mengandung senyawa
metabolit sekunder antara lain yaitu derivate asam cafein, alkamid, flavonoid dan
poliasetilen. Alkamid dan derivat asam cafein merupakan senyawa aktif yang
menunjukkan efek imunoregulasi (Lee et al., 20 I 0).
Di Indonesia tanaman ini mulai diteliti pada tahun 1998 dan berdasarkan
hasil adaptasi menunjukkan bahwa ekinase .mampu tumbuh baik di daerah Tropis
dari ketinggian 400 - 1.200 m dpl. Pertumbuhan optimal dihasilkan apabila
ekinase ditanam pada ketinggian 800 m dpl dengan curah hujan 2.000 - 3.000
mm/tahun serta jenis tanah andosol dan latosol yang mempunyai sifat fisik baik
def!gan kandungan bahan organik tinggi (Rahardjo, 2000)
Echinacea purpurea yang ditanaman di Balai Besar Litbang Tanaman
Obat dan Obat Tradisional (B2P2TO-OT) telah mengalami variasi, saat ini telah
ditemukan 10 aksesi yang berbeda secara morfologi, molecular dan kandungan
fenol (Fauzi et al., 20 I 0). Penelitian lanjutan aksesi ekinase pilihan perlu
dilakukan untuk melihat ada tidaknya variasi Fl aksesi dalam rangka pemurnian
aksesi ekinase serta perlu dilakukan pengembangan teknis pembibitan secara in
vitro ekinase yang merupakan salah satu langkah menuju standarisa.si tanaman
ekinase sebagai bahan baku untuk imunomodulator.
Tiga aksesi unggulan (BH2, BHU3 dan BHU5) ditanam di tiga lahan yang
berbeda tetapi mempunyai kemiripan kondisi lingkungan, scrta 7 aksesi lainnya
ditanam dalam lahan yang sama. Karaktcr morfologi, data tumbuh, karakter
molekular dan kadar fenol masing-masing Fl aksesi diamati. Selain itu juga
dilakukan pembibitan in vitro terhadap 3 aksesi ekinase unggulan tersebut.
Tiga aksesi pilihan ekinase yaitu aksesi BH2, BHU3 dan BHU5 yang
ditanan1 di masing-masing lahan penelitian masih menunjukkan adanya variasi
dan keturunan pertama (Fl) yang mempunyai sifat morfologi yang sama dengan
VI
- -� -�� _-
_
-�� _-�_::=-� =- __ _:__--u
induknya masih rendah. Aksesi BH2 mempw1yai kemurnian ketunman sebesar
13,6% dari total populasi aksesi BH2 yang ditanam, sedangkan kemurnian
keturunan aksesi BHUJ sebesar 18% dan BHU5 sebesar 24%. Keturunan Fl dari
aksesi BH2 menunj ukkan adanya keragaman, terdapat 6 varian dari F 1 aksesi ini
berdasarkan karakter morfologi dan 2 varian dari keturunan BHUJ. Sebelas aksesi
termasuk varian-varia:n tersebut menunjukkan adanya perbedaan genetic dengan
menggunakan penanda molecular ISSR dan RAPD.
Pembibitan in vitro aksesi ekinase menggunakan 4 macam Zat pengatur
tumbuh (ZPT) yaitu NAA, BAP, IBA dan Giberelin dengan konsentrasi 2,4,dan 6
ppm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa NAA da:n BAP memberikan hasil
pertumbuha:n yang optimum pada konsentrasi 2 ppm, sedangkan IBA dan
Giberelin menu:njukkan hasil yang optimum dalam penumbuhan ekinase pada
konsentrasi 6 ppm.
Vll
Kajian Karakteristik Aksesi dan Pengembangan Teknis Pembibitan Sccara In Vitro Ec/1inacea purpurea L.
Dyab Subositi , dkk
Balai Penelitian dan Pen gembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional Sadan Litbang Kesehatan, Kementerian Kesehatan RI
ABSTRAK
Ekinase (Echinacea purpurea (L.) Moench) merupakan tw11buhan obat yang mempunyai aktivitas sebagai imunomodulator. Ekinase pertama kali ditanam di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TO-OT) sejak tahun 2002. Ekinase selama ditanam hingga saat telah mengalami variasi morfologi, sebanyak 1 0 aksesi ditemukan pada tahun 20 I 0. Penelitian ini bertujuan untuk melihat keragaman Fl dari 3 aksesi unggulan (BH2, BHU3 dan BHU5) secara morfologi, molecular dan kadar fenol total, selain itu untuk membudidayakan ekinase secara in vitro. Tiga aksesi unggulan (BH2, BHU3 dan BHU5) ditanam di tiga lahan yang berbeda tetapi mempunyai kemiripan kondisi lingkungan, serta 7 aksesi lainnya ditanam dalam lahan yang sam a. Karakter morfologi, data tumbuh, karakter molekular dan kadar fenol masing-masing Fl aksesi diamati. Selain itu juga dilakukan pembibitan in vitro terhadap 3 aksesi ekinase unggulan tersebut. Tiga aksesi unggulan masih menunjukkan adanya variasi dan keturunan pertama (Fl) yang mempunyai sifat morfologi yang sama dengan induknya masih rendah. Keturunan F 1 dari aksesi BH2 menunjukkan adanya keragaman, terdapat 6 varian dari Fl aksesi ini berdasarkan karakter morfologi dan 2 varian dari keturunan BHU3. Sebelas aksesi termasuk varian-varian tersebut menunjukkan adanya perbedaan genetic dcngan menggunakan penanda molecular ISSR dan RA.PD. Zat pengatur tumbuh NAA dan BAP memberikan basil pertumbuhan yang optimum pada konsentrasi 2 ppm, sedangkan IBA dan Giberelin menunjukkan hasil yang optimum dalam penumbuhan ekinase pada konsentrasi 6 ppm.
Kata kunci: £kinase (Echinacea purpurea), karakter morfologi, molecular, pembibitan in vitro
- � � � - - - -
- - � � �
VJll
DAFTAR ANGGOTA TIM PENELITI
Sesuai dengan Surat Keputusan Kepala Balai Besar PeneJitian dan Pengembangan
Tanaman Obat dan Obat Tradisional, Badan Penelitian dan Pengembangan
Kesehatan, Depa11emen Kesehatan RI Nomor: HK.03.07/3/242e/20 1 1, tertanggal
8 Februari 201 1 telah ditetapkan susunan tim peneliti pada penelitian "Kajian
Karakteristik Aksesi dan Pengembangan Teknis Pembibitan Secara In Vitro Echinacea purpurea L." dengan susunan sebagai berikut :
Ketua Pelaksana
Peneliti
Pembantu Peneliti
Administrator
Dyah Subositi, M.Sc
DR. Budi Setiadi Daryono, M.A grSc
Fauzi , SP
A wai Prichatin Kusuma Dewi, S . S i , Apt
Nurul Husniati L, SP
Fitriana, A .Md
Didik Suharto, A .Md
Suparno, S.Pd
Samingan
Prasetyo Her11.1antoi S.Kom
IX
DAFTAR ISi
HALAMAN JUDUL
SK PENELITIAN
CHECKLIST
KATA PENGANTAR
RINGKASAN EKSEKUTIF
ABSTRAK
DAFT AR ANGGOTA TIM PENELITI
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR/TABEL
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
TUJBAN DAN MANFAAT
A. Tujuan
B. Manfaat
METODE PENELITIAN
HASIL dan PEMBAHASAN
A. Karakter Morfologi
B. Karakter Molekular
C. Pembibitan In vitro
KESIMPULAN DAN SARAN
UCAPAN TERIMAKASIH
DAFT AR PUST AKA
LAMP IRAN
LEMBAR PENGESAHAN
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . �
. . . . . . · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · . . . . . . . . . . . .
· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
x
II
IV
v
vi
Vlll
lX
x
Xlll
xv
4
4
5
1 7
23
39
4 1
42
43
45
47
DAFT AR GAMBAR
Gambm I. Morfologi bunga ekinase aksesi Fl BH2 var.ian A (BH2-V,?,;L 18 pada lahan di ketinggian 1200 mdpl; A. Bunga mekar, B.
=-
Kuncup Gambar 2. Morfologi bunga ekinase aksesi F l BH2 varian B (BJ-12-Vb)
pada lahan di ketinggian 1 200 mdpl; A. Bunga mekar, B. 1 8
Kuncup Gambar 3. Morfologi bunga ekinase aksesi FI BH2 varian C (B.H2-Ve) 1 9
pada lahan di ketinggian 1 200 mdpl; A. Bunga mekar, B. Ktmeup
Gambm 4. Morfologi bunga ekinase aksesi Fl BH2 varian D (BH2-Vd) 1 9 pada lahan di ketinggian 1 200 mdpl; A . Bunga mekar, B. Kuneup
Gambar 5. Morfologi bunga ekinase aksesi F I BH2 varian E (BH2-Ve) 20 pada lahan di ketinggian 1 200 mdpl; A. Bunga mekar, B. Kunc up
Gambar 6. Morfologi _bunga ekinase aksesi Fl BH2 vmian F (BH2-Vf) 20 pada lahan di ketinggian 1 200 mdpl; A. Bunga mekar, B. Kuneup
Gambsir 7. Morfologi bunga ekinase aksesi Fl BHU3 varian A (BHU3- 2 1 Va) pada lahan di ketinggian 1 200 mdpl; A. Bunga mekar, B. Kuneup
Gm11bar 8. Morfologi bunga ekinase aksesi F l BHU3 varim1 B (BHU3- 22 Vb) pada lahan di ketinggian 1200 mdpl; A. Bunga mekar, B. Kuncup
Gambm· 9. DNA genom Fl tiga aksesi ekinase (BH2, BHU3 dan BHU5) 24 menggunakan metode CT AB
Gmnbar 1 0. DNA genom Fl aksesi ekinase menggunakan kit isolasi DNA; 24 L-l:Ladderl kb, 1: aksesi Fl-BH2, 2: aksesi F1-BHU3, 3: aksesi F1-BHU5, 4-9: aksesi Fl-BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi F l-BHUJ-Va dm1 Vb
Gambar 1 1 . Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer 26 TSSR UBC-866: L-l:Ladderl kb, 1: aksesi F1-BH2, 2: aksesi F1-BHU3, 3: aksesi Fl-BHU5, 4-9: aksesi F l-BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dm1Vf, 10-11: aksesi F 1 -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 1 00 bp
Gmnbar 12 . Fragmen DNA hasil mnplifikasi dengan menggunakan primer 27 ISSR UBC-834: L-l:Ladderl kb, 1: aksesi Fl-BI-12, 2: aksesi Fl-BHU3, 3: aksesi Fl-BHU5, 4-9: aksesi FI-BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dm1 Vf, 10-11: aksesi Fl-BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 1 00 bp
Gambar 13 . Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer 28 ISSR UBC-834: L-l:Ladderl kb, 1: aksesi Fl-BH2, 2: aksesi Fl-BHUJ, 3: aksesi Fl-BHU5, 4-9: aksesi F l-BH2-Va, Vb,
XI
Ve, Vd, Ve dan V±: 10-11: aksesi Fl -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
Gambar 14. Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer 28 ISSR UBC-807: L-1 :Ladder! kb, 1: aksesi Fl-BH2, 2: aksesi F l - BHU3, 3: aksesi Fl-BHUS, 4-9: aksesfF l-BH2 -Va, Vl)��-Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi F l -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 1 00 bp
Gambar I 5. Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer 29 ISSR UBC- 825: L-l :Ladderl kb, 1: aksesi F l -BH2, 2: aksesi F l -BHU3, 3: aksesi F l -BHU5, 4-9: aksesi Fl-BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan v±: 10-11: aksesi F l -BHU3-Va dan Vb, L -2: Ladder 100 bp
Gambai· 16. Fragmen DNA hasil an1plifikasi dengan menggunakan primer 30 ISSR UBC-812: L-l:Ladderl kb, 1: aksesi F l - BH2, 2: aksesi F l -BHU3, 3: aksesi F l -BHU5, 4-9: aksesi Fl-BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi Fl -BHU3-Va dat1 Vb, L-2: Ladder 1 00 bp
Gambai· 17 . Fragmen DNA hasil ainplifikasi dengan menggunakan primer 3 1 ISSR A83024 1 : L-l:Ladderl kb, 1: aksesi Fl-BH2, 2: aksesi Fl-BHU3, 3: aksesi Fl -BHU5, 4-9: aksesi F l -BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi F l-BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
Garnbcn: 18 . Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer 31 ISSR (CAG)5: L- l : Ladderl kb, 1: aksesi Fl-BH2, 2: aksesi F l -BHU3, 3: aksesi F l -BHU5, 4-9: aksesi F l- BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi Fl-BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
Gambar 19. Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer 32 ISSR 178988: L-l:Ladderl kb, 1: aksesi Fl -BH2, 2: aksesi Fl -BHU3, 3: aksesi F l -BHU5, 4-9: aksesi F l -BH2-Va, Vb, Ve, Yd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi FI-BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder I 00 bp
· Gambar 20. Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer 33 ISSR 814: L-l:Ladderl kb, 1: aksesi F l -BH2, 2: aksesi F l -BHU3, 3: aksesi F l -BHU5, 4-9: aksesi F l -BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi Fl -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
Gambar 2 1 . Dendograin 1 1 aksesi Echinacea purpurea (ekinase) 36 berdasarkan penanda molekular TSSR
Gainbar 22. Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer 37 RAPD OPA-10: L-l:Ladderl kb, 1: aksesi F l-BH2, 2 : aksesi F l-BHU3, 3: aksesi F l -BHU5, 4-9: aksesi F l -BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi F l - BHU3-Va dan Vb, L-2:
Ladder 1 00 bp Gan1bar 23. Fragmen DNA hasil amplifi.kasi dengan menggunakan primer 38
RAPD OPA-16: L-l :Ladderl kb, 1: aksesi F l -BH2, 2: aksesi
Xll
Fl -BHU3, 3: aksesi Fl -BHU5, 4-9: aksesi F l -BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi F l -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 1 00 bp
Gambar 24. Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer 38 RAP D OPA - 1 7: L-l:Ladderl kb, 1: aksesi ftl -BH2, 2: akseSi..::�_ F l -BHU3, 3: aksesi F l -BHU5, 4-9: aksesi F 1 -BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi Fl -BHUJ-Va dan Vb, L-2: Ladder 1 00 bp
Gambar 25. Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer 39 RA PD OPA - 1 8: L-l :Ladderl kb, 1: aksesi Fl -BH2, 2: aksesi F l -BHU3, 3: aksesi F1-BHU5, 4-9: aksesi FI-BI-12-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi F l -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 1 00 bp
Gambar 26. Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer 40 RAPD OPA-19 : L-l :Ladderl kb, 1: aksesi Fl -BH2, 2: aksesi F 1 -BHU3, 3: aksesi Fl -BHU5, 4-9: aksesi Fl -BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi F l -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 1 00 bp
Gambar 27 . Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer 40 RAPD OPB-4: L-l :Ladderl kb, 1: aksesi F l -BH 2 , 2 : aksesi F l -BHU3, 3: aksesi Fl -BHlJ 5, 4-9: aksesi F l -BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi F1 -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 1 00 bp
Gambar 28. Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer 4 1 RAPD OPE-5: L-l :Ladderl kb, 1: aksesi Fl-BH2, 2: aksesi Fl -BHU3, 3: aksesi Fl -BHU5, 4-9: aksesi Fl -BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi Fl -BH U3-Va dan Vb, L-2: Ladder I 00 bp
Gambar 29. Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunak.an primer 42 RAPD OPE-6: L-l:Ladderl kb, 1: aksesi F l -BH2, 2: aksesi F l -BHU3, 3: aksesi F l -BHU5, 4-9: aksesi F1 -BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi F l -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder I 00 bp
Gambar 30. Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer 42 RAPD OPH- 1 3 : L-l: Ladderl kb, 1: aksesi Fl -BH2, 2: aksesi F l -BH U3, 3: aksesi F l -BHU5, 4-9: aksesi F l -BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi f l -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 1 00 bp
Gambar 3 1 . Dendogram 1 1 aksesi Echinacea purpurea (ekinase) 45 berdasarkan penanda molekular RAPD
Gambar 32. Kurva standar penetapan kadar fenol total 46
Gambm· 33. Bibit ekinase usia 2 bulan hasi] pembibitm1 In Vitro dengan 47 berbagai konsentrasi Zat Pengatur T umbuh (ZPT) yang optimum; (A) BAP 2 ppm, (B) NAA 2 ppm, (C) Giberelin 6 ppm, (D) IBA 6 ppm
Xlll
=-:"=-="'7:-___ 7 = - - :_ -=---::""= --":§:'._ -�_--_;;::,,--:::: _ _ _ �� -.::_-�=�- �-= - - -- ----_
---=-=;;;;;__;;;;;;;;;;;:; =---====-�.;::¥� =- --= =--=-=----=. __ .:;:;..:::..::....-::::: -_- --
---=---===::;_-= =--=
-
-=--==----=---
-- -
TabeJ I. Tabel 2.
TabeJ 3.
Tabel 4.
Tabel 5.
DAFTAR TABEL
Data_twnbuh I 1 aksesi ekinase sebelum pane.fl Primer ISSR dan RA PD serta annealing temperature (Ta) optimal yang digunakan untuk amplifikasi Total fragmen DNA basil amplifikasi dengan menggunakan I 0 primer ISSR dan prosentase fragmen polimorfik pada I 1 aksesi ekinase Total fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan 10 primer RAPD dan prosentase fragmen polimorfik pada 1 I aksesi ekinase Rerata Jumlah daun dan akar ekinase menggunakan ZPT berbeda dan konsentrasi yang optimum
25
33
43
46
xiv
---=----:==
--==
�------=--=-=--=-- --=---=- -= - = ----= --==-- --=----= ----=---- ----=---=---- -- - - - -- ----==--==------=---=--== --_ -�-
--=--::::. -
��-=�=-=-=-�--==== =-- _--=-�--:::;;;::-= - -- - -=-- - - - - - - -
-
- �-----::;:- ---
=-=-o.=
Lampiran I.
Lampiran 2.
DAFTAR LAMPIRAN
Bentuk reseptakel masing-masing varian ak.s.esi (A. BH2-Va, _ S2 B . BH2-Vb, C. BH2-Vc, D. BH2-Vd, E. BH2-Ve, F. BH2-Vt�"""-G. BHU3-Va, H. BHU3-Vb) Data berat basah masing-masing aksesi · 53
xv
PENDAHULUAN
Tanaman Echinacea purpurea (L.) Moench (ekinase) berasal dari Amerika -.;'-.:. .
Utara dan ikenal sebagai tumbuhan obat yang penting. Eki nase menunjukkan efek
imtmoregulasi, anti inflamasi dan sebagai antioksidan serta tidak mempunyai efek
samping ataupun hipersensitivitas pada uj i kl inis. Ekinase mengandung senyawa
metabolit sekunder antara lain yaitu derivate asarn cafcin, alkamid, flavonoid dan
poliasctilen. Alkamid dan dcrivat asam cafein merupakan senyavva aktif yang
menunjukkan efek imunoregulasi (Lee et al., 2010) .
D i Indonesia tanaman in i mulai diteli6 pada tahun 1998 dan berdasarkan
basil adaptasi menunjukkan bahwa ekinase mampu tumbuh baik di daerah Tropis
dm·i ketinggian 400 - 1 .200 m dpl. Pertumbuhan optimal dihasilkan apabila
ekinase. ditanam pada ket:inggian 800 m dpl dengan curah httjan 2.000 - 3.000
mm/tahun serta jenis tanah andosol da.n latosol yang mempunyai sifat fisik baik
dengan kandungan b ahan organik tinggi (Rahardjo, 2000)
Echinacea purpurea yang ditanaman di Balai Besar Litbang Tana.man
Obar dan Obat Tradisional (B2P2TO-OT) telah mengalami variasi, saat ini tclah
ditemukan 1 0 aksesi yang berbeda secara morfologi, molecular dan kandungan
fenol total (Fauzi et al., 20 1 0). Variasi tanm11an merupakan hasil ke1ja sama antara
genotip dan faktor l i ngkungan sehingga menghasilkan variasi anatomi, sito logi
dan kandungan kimia (Allard, 1992).
Sampai saat ini karakter morfologi masih digunakan sebagai dasar
pengenalan dari penyusunan klasifikasi tumbuhan. Klasifikasi yang didasarkan
pada sifat morfologi dapat dipakai sebagai acuan umum yang tepat dan cepal
untuk. penyusunan peta k.eanekaragaman turnbuhan, khususnya Angiospcrmae.
Sifat morfologi dapat diamati dengan lebih mudah dan praktis dibandingkan
dengan sifat-sifat yang Jainnya (Jones dan Luchsinger, 1986).
Karakter mo1fologi mempw1yai kekurangm1 yaitu di pengaruhi oleh faktor
lingkungan dan umur fisiolog is tanaman sehingga hams didukung dengan
karakter lainnya misalnya karaktcr biokimia dan molckular unluk menentukm1 dan
mengidentifikasi keragaman baik interspesifik maupun intraspesifik tumbuhan
(Zhao et al., 2007). Beberapa penanda molekular telah digtmakan untuk studi
studi keanekaragaman atau variasi genetik diantara atau antar populasi spesies
tanaman. Penanda molekular tcrsebut antara lain Restriction Fragment Length - - . Polymorphism (RFLP), Random Ampl[fied Poly11101phic DNA (RAPD), Ali1pl�fied
Fragment Length Po/morphism (AfLP). Mikrosatelit atau Simple Sequence
Repeats (SSRs) dan Inter Simple Sequence Repeats (ISSRs) (Muthus amy et al.,
2008).
Penanda molekular RAPD merupakan metode efektif yang umum
digunakan oleh peneliti untuk identifikasi variasi genetik intraspesies maupun
interspesies karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu: I. Tidak perlu
mengetahui sekuen DNA. 2 . Lebih cepat dan mudah pelaksanaannya, 3.
Aplikasinya dapat digunakan untuk identifikasi kultivar atau plasma nutfah dan
pemctaan genetik, 4. Pita DNA yang dihasilkan lebih banyak (Hasan et al., 2009;
Hasnaoui et al., 2010).
Menurut Xiao-Ying et al. (2007) ISSR mcrupakan teknik atau penanda
molekular yang berkembang lebih akhir dibanding marker lainnya dan paling
banyak digunakan untuk studi genetik pada tanaman karena mempunyai sifat yang
sangat sensitif, efektif dan reprodusibel . lSSR merupakan penanda molckular
yang menunjukkan sifat dominan tetapi menunju kkan variabilitas yang tingg i
sehingga ISSR sangat cocok Lmtuk menyelidiki variasi gcnetik di antara individu
yang berkerabat sangat dckat dan klasifikasi kultivar tanaman budidaya (Djc et
al., 2006). Echinacea pwpurea (L.) Moench termasuk familia Asteraceae, bunga
majemuk cawan dan. ta naman menyerb uk bebas, bila dipcrbanyak dengan biji
terutama jika berasal dari tanaman yang belum stabil secara genetis akan te1:jadi
segregasi pada ketunmannya sehingga bibit yang dihasilkan tidak sama dengan
induknya. Untuk mendapatkan bibit ekinase yang idcntik dengan induknya secara
konvensional sulit untuk dilakukan sehingga perlu dilakukan perbanyakan dengan
cara kultur jaringan (in vitro) karcna perbanyakan tanaman meJalui teknik kultur
jaringan tersebut dapat me nghasi lkan tanaman yang idcntik dengan sifat induknya
seragam dalam jumlah besar dan waktu singkat (Priyono et al., 2000).
2
Media kultur merupak an salah satu faktor pcnentu keberbasi Ian
perbanyak.an tanaman secara kultur jaringan. Berbagai komposisi media kultur
tclah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbu han dan perkembangan
tana man yang dikulturkan. Dalam media ku ltur jaringan diperlu kan pen;rnbal1an
zat pengatur tumbuh untuk mendukung pertumbuan ekspal an. Dalam kultur
jaringan, dua golongan zat pengatur tumbuh yang sangat penting adalab s·itokinin
dan auksin (G rniawan, 1990). Dalam pertumbuhan jaringan , sitokinin bersama
sama dengan auksin memberikan pengaruh interaksi terhadap d.eferensiasi
jaringan (Sriyanti dan Wijaya ni, 1994).
Sitokinin memacu pembe lahan sel, serta mampu mcmacu tunas samping
dan menstimulasi perluasan daun sebagai basil dari pembesaran sel. Sitokinin
m enye babkan mobilisasi me tabolit dari daerab yang tidak diperlukan k.e dacrah
yang diperlukan sehingga mcmbentuk hubungan source-sink dan sintesis asam
nukleat serta protein dapat ber l anjut (Moore, 1979). Menurut Badriah et al. (1998)
sitokinin berpengaruh t crhadap inisiasi tunas . .lenis sitokinin yang paling sering .
dipa kai adalah 6-Benzyl Amino Purine (BAP) karena efektivitasnya tinggi dan
harganya mmah (Yusnita, 2003). IBA (Indole Butiric Acid) adalah zat pengatur
tumbuh yang tergolong auksin yang bersifat lebih aktif dibanding auksin yang
lainnya (Sal isbury dan Ross, 1995).
Pene litian lanjutan aksesi ekinase pilihan perlu dilakukan untuk melihat
ada tidak.nya variasi Fl aksesi dalarn rangka pemurnian aksesi ekina se serta perlu
dilakukan pengembangan teknis pembibitan seca ra in vitro ekinase yang
merupakan salah satu langkah menuju standarisasi tanaman ek ina se sebagai bahan
baku tmtuk imunomodulator.
3
TUJUAN DAN MANFAAT
A. TUJUAN
1. Tujuan Umum : Mendapatkan tanaman Echinacea pWJJurea L. (ekinase) yang
standar guna penyediaan bahan bairn imunomodulator
berkualitas
2 . Tujuan Khusus :
B. MANFAAT .
a. Mengetahui karakter
tanaman ekinase
. . mas1ng-rnas111g keturunan aksesi
b. Mendapatkan aksesi tanaman ekinase yang stabil guna
menghasilkan varietas unggul
c. Mendapatkan metode perbanyakan ekinase secara in vitro
bibit yang identik dengan sifat induknya
Mendapatkan karakter aksesi unggul dan metode perbanyakan tanaman
Echinacea pwpurea (ekinase) secara in vitro untuk mendukung standardisasi
tanan1an ekinase sebagai bahan baku imunomodulator.
4
METODE PENELITIAN
A. Kerangka Plkir
Mendukung Kernandirian Bahan Baku Obat Surat Menkes No. I 6 I 3/lvfenkes/XI/2005
c·-·c1 Budidaya Echinacea purpurea (L.) J'v1oench
Varietas Unggul
L , I �
Echinacea purpurea L. Mengalami V ariasi Morfologi
Kharakterisasi /Seleksi Aksesi Echinacea purpurea
Kajian Karakteristik aksesi Echinacea purpurea
Menghasilkan Bibit Iclentik Induknya Secara !n Vitro
Pemuliaan T anaman Echinacea ourourea
Tanaman Echinacea purpurea Unggul
5
B. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di 4 kebun percobaan pada ketinggian 1 .200 m dpl dan di
Laboratoritm1 Te�-padu Balai Besar Litbang Tanaman Ob
.at dan Obat Tr;Jfsio
.nal
pada bulan Februari 201 1 -Desember 20 1 1
C. Desain Penelitian
1. Karakterisasi Aksesi
Merupakan penelitian deskriptif ekploratif yang meliputi pengambilan data
morfologi, pengambilan data molekuler untuk menguj i karakteristik keturunan
masing-masing aksesi Echinacea purpurea (L.) Moench
2. Pembibitan Echinacea purpurea Secara 1n Vitro
Penelitian ini menggunakan media MS dan zat pengatur tumbuh bertujuan untuk
menginduksi tunas. Penelitian ini menggtmakan Rancangan Acak Lengkap (RAL)
yang disusun secara faktorial dengan menggunakan dua faktor. Faktor pertama
adalah Jenis Zat Pengatur Tumbuh IBA yang terdiri dari 3 taraf yaitu:
N l = IBA konsentrasi 2 ppm
N2 = IBA konsentrasi 4 ppm
N3 = IBA konsentrasi 6 ppm
Faktor kedua adalah konsentrasi Zat Pengatur Tumbuh BAP yang tercliri dari 3
taraf yaitu:
K 1 = BAP konsentrasi 2 ppm
K2 = BAP konsentrasi 4 ppm
K3 = BAP konsentrasi 6 ppm
Faktor kedua adalah konsentrasi Zat Pengatur Tumbuh NAA yang tercliri dari 3
taraf yaitu:
K l = NAA konsentrasi 2 ppm
K2 = NAA konsentrasi 4 ppm
K3 = NAA konsentrasi 6 ppm
Faktor kedua adalah konsentrasi Zat Pengatur Tumbuh Giberelin yang terdiri dari
3 taraf yaitu:
K l = Giberelin konsentrasi 2 ppm
6
K2 = Giberelin konsentrasi 4 ppm
K3 = Giberelin konsentrasi 6 ppm
Kontrol= tanpa zat pengatur tumbuh
D. Jenis Penelitian
Penelitian 1111 merupakan penelitian eksperimental di lapangan dan di
laboratorium.
E. Populasi dan Sampel
1. Karakterisasi Aksesi
Keturunan 3 aksesi Echinacea purpurea (L.) Moench ditanam di tempat yang
berbeda pada kondisi Iingkungan sama dan 7 aksesi lainnya di laban yang sama
tmtuk melihat keragaman F 1 . 2. Pembibitan Echinacea pw7Jurea (L.) .Moench Secara In Vitro
Kombinasi perlakuan sebanyak 10 perlakuan yang diulang sebanyak 3 kali,
masing-masing perlakuan menggunakan 3 sampel eksplan tanaman ekinase.
Sehinga jumlah semua populasi eksplan tanaman ekinase adalah 270 . .
F. Variabel dan Cara Pengumpulan Data
1. Karakterisasi Aksesi
Variabel bebas adalah aksesi Echinacea purpurea (L.) Moench
Variabel tergantung ad al ah:
a. Tinggi tanaman: pengamatan tinggi tanaman dilakukan dengan cara
mengukur tinggi dari pangkal batang sampai titik tumbuh tertinggi
dilakukan setiap bulan
b. Ukuran Tajuk
c. Jumlah Kuntum Sunga
d. Jurnlah daun: pengan1atan j umlah daun dengan menghitung seluruh daun
yang muncul setiap bulan
e. Saat berbtmga: dilakukan pengamatan saat nrnlai tanaman ekinase
berbunga
f. Jumlah anakan
7
g. Berat segar herba: dilakukan apa bila tanaman telah berproduksi,
pengukuran dilakukan dengan cara menimbang hasi I pan en dalam keadaan
segar.
h. Berat kering: dilakukan penimbangan setelah hasil panen d ik�?111gkan
sehingga mencapai kadar air 10 %.
1. Rendemen kering simplisia: dihitLmg berdasarkan selisih antara berat segar
dengan berat kering herba dibagi beraL segar herba d ika likan 100 %.
J . Kadar polifenol, diperoleh dari penetapan kadar po l ifcnol menggunakan
Reagen f olin Cio-chalteu
2. Pembibitan Echinacea purpurea Secara Jn Vitro Variabel bebas adalah Zat Pengatur Tumbuh IBA, BAP, NAA dan Giberelin.
Variabel tergantung adalah
a) Saat muncul kalus: eksplan diamali setiap hari setelah penanaman sampai
mulai terbentuk tanda munculnya kalus dinyatakan hari setelah tanam
b) Kondi si kalus diamati secara kualitatif berdasarkan banyak atau sedikitnya
kalus yang tmnbuh, warna kalus, jenis kalus dan tempat turnbuhnya kalus
pada pangkal batang atau akar
c) Warna dan tekstur kalus: warna dan tekstur kalus d.iamati mulai 3 HST
d) Saat muncul tunas: terbentuknya tunas ditandai dengan adanya tonjolan
berwarna putih kehijauan (± 2 mm) pada permukaan eksplan bagian atas
e) Jumlah tunas: JLUnlah tunas dihitung berdasarkan akumulasi jumlah tunas
pada eksplan
f) Saat muncul daun: penentuan saat muncul daun yaitu pada saat daun telah
terbuka sempurna dinyatakan dalam HST
g) Jumlah daun: jumlah daw1 dihitung berdasarkan akumulasi jumlah daun
yang telah membuka sempurna, termasuk daun yang sudah kering.
h) Panjang akar, diukur dari leher akar sampai ujung akar dengan
menggunakan kertas milimetcr yang diletakkan di bavvah cawan petri.
Plan let dikeluarkan dari botol clan di letakkan pada cawan petri, kemudian
planlet diluruskan dengan bantuan pinset untuk diukur akarnya.
Pengan1a tan clilakukan di clal am LAF.
8
-
-
- - � -- - - - - � - - --
H. Bahan dan Cara Ker.ia
1. Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain bahan kimia untuk -
- .. .
analisis, bahan kimia untuk kultur jaringan (Unsur J -lara Makro, Mik'i�ci:-zPT, Vitamin) benih dan bibit E. purpurea, pupuk organik, pupuk NPK dan
perlengkapan panen. Bahan yang diperlukan untuk karakterisasi morfologi antara
lain yaitu aksesi tanaman eki nase dan alkohol 70%, sedangkan bahan yang
digunakan untuk karakterisasi molekular menggunakan penanda molekular ISSR
dan RAPD adalah datm dari aksesi ekinase. Kemikalia yang digunakan dalam
penelitian dikelompokkan untuk setiap tahap penelitian yaitu tahap isolasi ONA,
kuantifikasi, amplifikasi dan visualisasi. Bahan-bahan untnk isolasi DNA genom:
larntan buffer CTAB (3% CTAB, 2% PVP), P-mercaplhoetanol, isopropanol,
natrium asetat, etanol 70%, etanol absolut, buffer TE, larutan FKI
(Fenol:K loroform: Tsoami lal kohol==25:24: 1 ), larutan K l (klorofonn:
lsoamilalkohol=24: 1 ) dan RN Ase, selain itu juga digunakan kit isolasi DNA .
Genelute dari Sigma. Bahan-bahan untuk kuantifikasi: akuabides steri I dan DNA
genom. Bahan-bahan untuk amplifikasi: PCR mix, aquades steril, DNA template,
1 0 primer RAPD dan 10 primer ISSR. Bahan-bahan untuk visualisasi: agarosa,
parafilm, TBE J X , ethidium bromide 0,0 I%, marker DNA I kb dan 1 00 bp,
aquades steril dan loading dye. 2. Cara kerja:
a. Budidaya Aksesi
1) Penentuan lokasi penanaman, penanaman keturunan masing-masing aksesi
E. purpurea d ilakukan di tempat berbeda tetapi pada keadaan lingkungan
yang sama. Untuk mencegah perka\vinan silang antar aksesi.
2) Penyiapan dan pengolahan Jahan: lahan dibersihkan dari gulma lalu
dicangkul dan diratakan, dibuat 3 blok yang masing-rnasing blok berisi 9
petak tanam. Jarak antar blok 1 00 cm, sedangkan jarak antar petak 50 cm.
3) Penanaman: penanaman dilakukan dengan jarak tanam 30 cm x 30 cm,
pada setiap lobang tanam diberi 500 gram pupuk organik, dan 3
gramilobang tanam pupuk NPK
9
4) Penyiangan: dilakukan secara manual atau dengan menggm1akan sabit apabi la gulma banyak
5) Pengairan atau penyiraman: penga1ran dilakukan semmggu sekali,
sedangkan penyiraman dilakukan melihat kondisi dilahan.
6) Panen: dilakukan setelah 75 % populasi yang ditanarn sudah mulai
berbunga.
7) Pengamatan: dilakukan sesuai dengan earn pengumpulan data
8) Analisis laboratorium untuk analisa kandungan kimia masing-masing
aksesi ekinase
b. Karakterisasi Aksesi
1) . Pengambilan Data Morfologi
Langkah pertama dalarn pengambilan data morfologi adalah
pemilihan dan pengambilan sampel secara random di kebun penelitian
ek.inase, tiap aksesi ek.inase diambil 5 individu sebagai ulangan. Masing
masing sampel diamati karakter morfologinya baik kualitatif dan k.uantitatif
pada bagian vegetatif dan generatif tanaman yaitu meliputi organ batang,
daun, bunga, buah dan biji. Smnpel didokumentasikan dalam bentuk foto dan
herbarium kering.
2). Pengan1bilan data molekular
Pengambilan data molekulm- adalah pemil ihan dan pengambilan
sampel secara random, tiap aksesi ekinase diambil 3 individu sebagai
ulm1gan. Langkah-lm1gkah ke1:ja pengambilan data molekular dengan
menggunakan penanda molekular TSSR dan RAPD meliputi:
a). Isolasi DNA
Daun ekinase dibersihkan clengan akuades clan clitimbang sebanyak 0 , 1
gram kemudian cligerus daJam nitrogen cair sampai halus menggunakan
pestel dan mortar kemudian ditmnbahkan buffer CTAB (3% CTAB, 2%
PVP) sebm1yak 800 µI clan 2% �-mercapt.hoetanol setelah itu dimasukkan ke
dalam tabung 1 ,5 ml yang sela.njutnya diinkubasi pada suhu 65°C selama 60
menit. FIG sebanyak 500 �d ditmnbahkm1 dan digojog selama 1 5 menit
10
��::;;::-=-- �-�""�� �-==--=---
,,:=..
-=--
��-----===-:::;;=--=-----�::--=
- -=- -- _-- ---= --::--=-�----"- -
-
--
- -=-= --= :=---=-�-=-= -
� -
--=--�= -=-=-=--�---
---
---==---===---
--
-
-
hingga terjadi emulsi kemudian disentri:fus pada kecepatan 1 2 .000 qnn
sclama 1 0 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung baru dan diukur
volume pengambilan supcrnatan kemudian ditambahkan KI sebanyak . .
volume yang sama dengan supernatan dan discntri:fus pada k�c'ep�tan
12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan kc tabung barn dan
diukur volume pengambilan supernatan kcmudian dilambahkan natrium
asetat sebanyak 0, 1 volwne supernatan dan isopropanol dingin sebanyak 2/3
vohune supernatan. Tabung tersebut digojog perlahan kemudian diinkubasi
di .feezer selan1a 60 menit, setelah itu disentrifus pada kecepatan 1 2 .000
rpm, suhu 4°C selama 1 0 menit. Supernatan dibuang dan ditambahkan 500
µl etanol 70% dingin kemud1an disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm,
suhu 4°C selama 1 0 mcnit. Supernatan dibuang dan endapan
dikeringanginkan kemudian pelct diresuspensi dengan penambahan 30 �tl
buffer TE kemudian diti:m1bahkan 1 �LI larutan RNase A. Isolasi DNA
menggunakan kit isolasi mengikuti prosedur dalam kit isolasi tersebut.
b ). Kuantifikasi DNA
i). Estimasi konsentrasi DNA secara elektroforetik
Kualitas DNA gen.om cliukur dengan membandingkan kejelasan dan
ketebalan pita DNA genom dengan DNA marka pada 0,8% gel
clektroforesis.
ii). Penentuan konscntrasi DNA dengan spektrofotometri
Larutan DNA genom diencerkan l OOOx dengan akuabides. DNA yang tclah
diencerkan diukur konsentrasi dan nilai OD-nya pada cahaya UV dengan
panjang gelornbang 260 nm dan 280 nm (1,260/ 1�2 80). Konsentrasi dan
kemurnian DNA genom dihitung dengan rumus :
Konsentrasi DNA genom (ng) : 'J.v 260 x 50 x faktor pengenceran
1 000
Kemurnian DNA genom : �260/�280
Kemumian DNA dianggap baik apabila nilainya berkisar antara: 1 .8-2.
c). Amplifik.asi (PCR/ Polymerase Chain Reaction)
1 1
Bahan-bahan untuk amplifikasi PCR dimasukkan dalam PCR lube yang
meliputi: 2 �d Template (30 ng DNA genom), 1 2,6 µI PCR mix, 1 �d primer
(semua primer) I 00 mM, kemuclian clitambah steril aquadest sampai -
- .
volLm1e 25 µl. Carnpuran reagen-reagen pacla PCR tube tersebut cli1na':Stikkan
dalam mesin PCR (Thermocycler) dengan program sebagai berikut:
1 . Denaturasi T 2. Denaturasi 11 3. Annealing
4. Elongation
: 94°C 3 '
: 94°C 1 '
: 52°C 1 ' (tergantung primer)
: 72°C 1 '30"
5. Kembali ke langkah ke-2 dengan ulangan 44 kali
6. Extention : 72°C 8'
7. Hold 4°C
Amplifikasi d iulang sebanyak 3 kali untuk memastikan reprodusibilitas
metode.
d). Visualisasi Hasil PCRJ Elektroforesis
Produk PCR dicek dengan metode elektroforesis pada minigel agarosa
1,8%. Sebanyak 0,396 gram bubuk agarosa dimasukkan dalam erlenmeyer
clan ditambahkan 22 ml TBE 1 X kemudian dipanaskan di microwave selama
± 45 detik atau agarosa larut sempurna. Lannan dibiarkan setengah dingin
kemudian dituang dalam cetakan gel dengm1 sisir tegak lurus. Gel clibiarkan
menjendal clan sisir diangkat kemuclian gel direnclam dalam bu fer TBE 1 X.
Prociuk PCR sebanyak 5 µl dipipet clan dicampur dengan 1 �tl loading dye
(pencampuran dilakuan d i atas kertas parafilm clan dalam pipet tip)
kemudian dimasukkan dalm11 sumuran gel. Sumuran sebelah kiri diisi
dengan marker. Elek troda kemudian clihubungka:n clengan pm11er supply
pada voltase 70 volt selmna 90- 1 10 menit. Minigel terse but kemudian
direndam dalarn ethidium bromide selama 20 menit kemudian visualisasi
basil di bmvah sinar UV pada alat gel documentation.
e ). Analisis data
Data yang diperoleh dmi karakter morfo logi cliberi skor yang ditabulasikan
dalam bentuk angka, yaitu 1 , 2, 3, . . . . . dan seterusnya. Sifat yang sudah
1 2
dalam bentuk angka (numerik) dikelompokkan dalam jangkauan tertcntu,
sedangkan sifat-sifat yang bersifat deskriptif seperti wama daun dini lai
secara munerik dengan memberikan angka-angka yang menggambarkan . . perbedaan warna yang ada. Setelah itu di lakukan pembakuan tel'hadap
semua sifat yang tclah dinilai sccara numerik. Data diperoleh dari hasil
visualisasi fragmen DNA tiap aksesi ckinase pada primer yang berbeda. Bila
terdapat fragmen di berikan skor 1 dan bila tidak terdapat fragmen diberi
skor 0. Indeks similaritas karakter morfologi dihitung menggunakan rumus
indeks similaritas SSm (simple matching coefficient), sedangkan karakter
molekular dihitm1g mcnggunakan rumus Dice. Jndeks similaritas masing
masing karakter kemuclian disusun analisis kelompok (cluster analysis)
mcnggLmakan metode Sequential Agglomerative Hierarchial Non
overlaping (SAlfN). Konstruksi dendogram dilakukan dengan
menggunakan metode Unweighted Pair Group Method Using A rithmetic
Mean (UPGMA). Analisis data ini dilakukan dengan menggunakan software
NTSYS ver. 2.02.
c. Pembibitan Echinace(t purpurea L. Secara ln Vitro 1 ) . Pembuatan Larutan Stok
Media yang digtmakan adalah media dasar MS yang mengandu11g hara
makro dan mikro. Media dikelompok.kan menjadi beberapa stok dengan kode
sebagai berikut: (A) nit.ratos (NH4N03 4 1 ,25 g dan KN03 47,5 g); (B)
sulfates (MgS047H20 9,.25 g, ZnS047H20 0,2 150 g, MnS044H20 0,5575
g, CuS045H20 0,0006 g); (C) holidos (CaC126H20 1 1 g, Kl 0,0208 g,
CoC126H20 0,0006 g); (D) P-B-Mo (KH2P04 4)5 g, H3B03 0. 1 5 5 g,
NaMo04H20 0,0063 g); (E) Fe-EDTA (FeS047H20 0,6950 g, Na2-EDTA
0,9325 g); (P) garam organik (tiamin-1- JC I 0,0025 g, asam nikotinat 0,0125 g,
piridok sin-HCl 0,0125 g, glisin 0,05 g) dan (G) mioinositol 2,5 g. Masing
masing balwn kimia ditimbang lalu dilarutkan dalam I 00 ml akuades steril.
Sctc!ah semua bahan larut, ditambahkan akuades hingga volume 250 ml
kemudian masing-masing diberi label nitratos, sulfatos, holidos, P-BMO, Fe-
1 3
EDTA, garam organik dan mioinositol sesuai dengan kelompoknya. Untuk
BAP ditimbang 1 00 mg dan di larutkan dengan NaOH ] N, ditambahkan
akuades steril hingga volrnne 100 ml. Semua larutan stok disimpan dalam - ·
refrigeralor. ·
2). Pembuatan media
Media yang digunakan pada tahap inisiasi dan tahap multipikasi adalah
media MS yang telah dimodifikasi dengan penambahan Zat Pengatur Tumbuh
IBA, BAP, NAA dan Giberelin. Untuk pembuatan media, senyawa
makronutrient, myo-inositol clan sukrosa ditimbang clan clilarutkan ke dalam
erlenmeyer. Kemudian ditambahkan larutan mikronulrient, vitamin, Fe. Na
EDTA clan zat pengatur tumbuh sesuai perlakuan yang dibuat dalam larutan
stoic
Keasaman larutan disesuaikan pH-nya sekitar 5,7 dengan bantuan I-IC! 0, 1
N atau KOH 0,1 N . Tambahkan agar dan panaskan di atas hot plate dengan
di bantu magnetic stirer sebagai pengacluk sampai larutan jernih clan . mendidih.
Media yang suclah dimasukkan ke dalarn botol-botol kultur clengan volume
masing-masing lebih kurang 20 ml, mulut botol ditutup aluminium foil clan
dilapisi plastik kemuclian d iikat clengan gelang karet. Kemudian botol-botol
itu di steril kan dengan otoklaf pad a tekanan 1 ,5 atm, suhu 1 2 1 ° C selama 1 5
menit, lalu disimpan dalam ruangan dengan suhu kamar 23 - 28° C.
3). Sterilisasi clan penanaman eksplan
Daun E. pwpurea dicuci clengan air mengalir, direndam dalam larutan
agrept selmna 3 menit, dalarn larutan Dithane 3 menit dm1 dalam larutm1
Clorox selama 3 menit kemuclian dibilas dengan aquadest steril sebanyak 3
kali JaJu dibawa ke Laminar Air Flow (LAF).
4). Penanaman eksplan
Eksplan yang digunakan aclalah bagian daun E. purpurea, eksplan tersebut
ditmmm dalam botol kultur yang berisi media MS yang dimoclifikasi dan zat
pengatur tumbuh sesuai dengan perlakuan, lalu d iinkubasi di ruang kultur
yang suhunya dipertahankan antara 23°-28° C.
14
= -§='�=--;;:=---=-=--=-� -=:==:---==-=-.::;o.=-=-�-=-= ---==-= -- - --�=--_-_ -- - - -- -= � --------
---
--�-== --==------==��=-------= = -----=---=---=---= -
--
��----=-=-=------
d. Penentuan Kadar Fenol Total
Pembuatan Reagen a. Pembuatan larutan induk asam galat ( 5 mg/ml) (Waterhouse, A, 1 999)
,.,,i'�..: Ditimbang 0,25 g asam galat tam bahkan 5 m l etanol 96 % tambahkan
aquabidest sampai 50 ml .
b . Na2C03 20 % (\Vaterhouse A, 1 999) Ditimbang 5 g Na2C03 dan tambahkm1
20 m l aquabidest lalu didihkan kemuclian cliamkan selama 24 jam, saring dan
encerkan dengan aquabidest sampai 25 ml.
c. Reagent Folin-ciocalteau (f\-1uruganathan, 2008). Dibuat larutan reagen Folin-
ciocalteau (RFC) 1 :2 clalam aquaclest.
cl. Pembuatan Kurva Kalibrasi Asam Galat dengan Reagen Feno! Polin -
Ciocalteu (Waterhouse A, 1999) d. l Pembuatan larutan induk asan1 galat (5 mg/ml) Timbm1g 0,25 g asam galat
tambahkan 5 ml etanol 96 % tambahkan aquabidest sampai 50 ml, sehingga
d!peroleh konsent.rasi 5 mg/ml.
Dari larutan induk dipipet 6, 8, 1 0, 1 2, 1 4 ml dm1 diencerkan dengan
aquabidest sampai volume 100 ml. sehingga dihasilkan dengan konsentrasi
300, 400, 500, 600, dan 700 mg/L asam galat.
Dari masing-masing konsentrasi cliatas dipipet 0,2 ml tambah 1 5,8 ml
aquabidest ditambah I
ml Reagen Folin Ciocalteu kocok. Diamkan selama 8 menit tambah 3 ml
larutan Na2C03 kocok homogen. Diarnkan selama 2 jam pada suhu kamar.
Ukur serapan pada panjang gelombang serapan maksimum 765 nm, lalu buat
kurva kalibrasinya hubungan antara konsentrasi asam galat (mg/L) dengan
absorban.
d. 2. Penentuan Kandungan Feno/ Total dengan Metoda Falin -Ciocalleu (Orak,
H.H, 2006) Ditimbang 0,3 gram ekstrak kemudian clilarutkm1 sampai 1 0 m l
dengan metanol : air ( 1 : 1 ). D i p i pet 0,2 1Tll larutan ekstrak dan tambahkan 1 5 ,8
ml aquabidest tambahkan I ml reagen folin - Ciocalteu kocok. Dimnkan
selama 8 men_it kemudian tambahkan 3 ml Na2C03 20 % kedalam campuran,
dimnkan larutan selama 2 jam pada suhu kamar. Ukur se.rapannya dengan
---== �-���=====-� .;_ - ::��� =:. = --=�-�-� -=--=----�--:.__-:. =-� --== - -----=-�-----��-� - - -�=---=----==--=--==--=-=-=-__::_:: � --=-
__ - - - - - -=-- --=---- - - ----=---=-=-----=----- - --- ----- ---=-=--=----
- -
15
spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang serapan maksimum 765 run
yang akan memberikan komplek biru. Lakukan 3 kali pengulangan sehingga
kadar fenol yang diperoleh hasilnya didapat sebagai mg ekuivalen asam galat/g
sa.mpel segar. ·
16
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. KARAKTER MORFOLOGI .. - . .. .
Tiga aksesi pilihan ekinase yaitu aksesi BJ-12, BHU3 d<m BHU5 yang
d itanam di masing-masing lahan peneliti m1 masih menunjukkan adanya variasi
dan keturunan pertama (Fl) yang mempunyai sifat morfologi yang sama dengan
induknya masih rendah. Aksesi BH2 mernpunyai kemurnian keturunan sebesar
1 3,6% dari total populasi aksesi BH2 yang ditanam, seclangkan kemmnian
keturunan aksesi BHU3 sebesm· 1 8% clan BHU5 sebesar 24%.
Keturunan Fl dari aksesi BH2 menunj ukkan adanya keragaman, terdapat 6
var1an dari Fl aksesi ini berdasarkan karakter morfologi clan 2 varian dari
keturunan BHU3. Karakter morfologi yang dapat digunakan untuk membedakm1
vmian aksesi tersebut (polirnorfik) sebanyak 23 karakter, 1 9 diantaranya
rnerupakan karakter dari perbungaan. Jones dan Luchsinger (1 986) menyatakan
ciri l]lOrfologi bunga merupakan ciri-ciri yang paling penting dalam klasifikasi
tumbuhan berbunga. Ciri tersebut rnudah diamati dan praktis digunakan dalam
pembuatan kunci dan pendeskripsian. Lebih lanjut clinyatakan bahwa ciri-ciri
generatif ideal untuk mencirikan kelompok taksonorni karena konstan, lebih
banyak jumlahnya dan rnenyediakan lebih banyak karakter untuk perbedaan
taksonomi. Beri.kut adalah varian-varian dari F l aksesi BH2 dm1 BHU3:
1. Fl aksesi BH2 Varian A (BH2-Va)
Tinggi tanaman mencapai 82 cm, batang hijau keunguan. Daun bulat telur
memanjang, tepi daun bergigi-bergerigi jarang, rasio panj<mg: lebar
daun=4-5 : 1 . Filaris 3-4, rapat, melengktmg . Reseptakel bentuk segitiga,
tepi ungu tua. Bunga tepi be1jumlah 18-2 1 , warna merah muda tk.2, rapat,
bentuk bulat telur memanjang, rasio panjang: lebar=5: I , ujung berlekuk 3,
posisi bunga tepi terhadap ibu tangkai bunga 90°. \Varna bunga saat
kuncup merah (Gambar 1 ).
1 7
(A)
Gambar 1. Morfologi bunga ekinase aksesi Fl BH2 varian A (BH2-Va) pada lahan di ketinggian 1200 mdpl; A. Bunga mekar, B. Kuncup
2. Fl aksesi BH2 Varian B (BH2-Vb)
Tinggi tanaman mencapai 50 cm, batang hijau keunguan. Daun bulat telur,
tepi daun hampir rata, rasio panjang: lebar daun=4: 1 . Filaris 3, tidak rapat,
menyebar. Reseptakel bentuk segitiga, tepi putih. Bunga tepi berjumlah
17-19, warna merah muda tk.1, jarang, bentuk sudip/bulat telur terbalik,
rasio panjang: lebar=3-3,5:1 , ujung bercangap 2, posisi bunga tepi
terhadap ibu tangkai bunga 80-90°. Warna bunga saat kuncup merah tua
(Gambar 2).
(A)
Gambar 2. Morfologi bunga ekinase aksesi Fl BH2 varian B (BH2-Vb) pada lahan di ketinggian 1200 mdpl; A. Bunga mekar, B. Kuncup
3. Fl aksesi BH2 Varian C (BH2-Vc)
(B)
Tinggi tanaman mencapai 95 cm, batang ungu kehijauan. Daun bulat telur,
tepi daun hampir rata, rasio panjang: lebar daun=4:1. Filaris 3-4, rapat,
melengkung. Reseptakel bentuk segitiga, tepi ungu tua. Bunga tepi
berjumlah 15-18, warna merah muda, jarang, bentuk bulat telur terbalik,
rasio panjang: lebar=3,5-4:1, ujung bergerigi 3, posisi bunga tepi terhadap
18
-==- =-::---O::::��b=-=--- =---=--��� - -'=-=:;- -=_--=-==-�=-------:o---=----= • -
- - -- �--=-���--=-" �---- -�= -
��---=-�=-�----=---� =--=----� ---::___� =---= ===------==-=-----=----=- - ----=- -- -=- --- -----==---=----- =----=-=
ibu tangkai bunga 80-90°. Warna bunga saat kuncup merah tua (Gambar
3).
(A)
Gambar 3. Morfologi bunga ek.inase aksesi Fl BH2 varian C (BH2-V c) pada lahan di ketinggian 1200 mdpl; A. Bunga mekar, B. Kuncup
4. Fl aksesi BH2 Varian D (BH2-V d)
Tinggi tanaman mencapai 80 cm, batang hijau kemerahan. Daun bulat
telur, tepi daun bergerigi-bercangap, rasio panjang: lebar daun=4: 1 . Filaris
3, rapat, melengkung. Reseptakel bentuk segitiga, tepi ungu mud.a. Bunga
• tepi berjumlah 19-21, warna merah muda, rapat, bentuk lanset, rasio
panjang: lebar=3-4: I , ujung bergerigi 2, posisi bunga tepi terhadap ibu
tangkai bunga 80-90°. Warna bunga saat kuncup merah muda cerah
(Gambar 4).
(A) (B)
Gambar 4. Morfologi bunga ekinase aksesi Fl BH2 varian D (BH2-Vd) pada lahan di ketinggian 1200 mdpl; A. Bunga mekar, B. Kuncup
5. Fl aksesi BH2 Varian E (BH2-Ve)
Tinggi tanaman mencapai 70 cm, batang hijau. Daun bulat telur
memanjang, tepi daun rata, rasio panjang: lebar daun=3-4:1 . Filaris 2-3,
19
-
-
�= -=---� �-� -
_
-
�:=
-=-3'-�=-==--=�-�=-=--::_-:.::_:_
-=---=----- �---=-� " ----
£-::§: - --=-=--=""'..'. �=� - �-------�-. --��--- -=---=-=---=-=--
--
tidak rapat, melengkung. Reseptakel bentuk segitiga, tepi putih. Bunga
tepi berjumlah 13-17, warna merah muda, jarang, bentuk oval-bulat telur
terbalik, rasio panjang: lebar=3-3,5:1, ujung bergerigi 2, melipat, posisi . . . --
bunga tepi �rhadap ibu tangkai bunga 80-95°. Wama bunga saat k�cup
hijau kemerahan (Gambar 5).
(A) (B)
Gambar 5. Morfologi bunga ekinase aksesi Fl BH2 varian E (BH2-Ve) pada lahan di ketinggian 1200 mdpl; A. Bunga mekar, B. Kuncup
6. Fl aksesi BH2 Varian F (BH2-Vf)
Tinggi tanaman mencapai 60 cm, batang hijau. Daun bulat telur
memanjang, tepi daun bergerigi, rasio panjang: lebar daun=4-4,5 : 1 . Filaris
3-4, rapat, melengkung. Reseptakel bentuk membulat, tepi ungu muda
Bunga tepi berjumlah 12-13, warna merah muda tk.2, jarang, bentuk
lanset, rasio panjang: lebar=6: 1 , ujung berlekuk 2, posisi bunga tepi
terhadap ibu tangkai bunga 60-80°. Warna bunga saat kuncup hijau
kemerahan (Gambar 6).
Gambar 6. Morfologi bunga ekinase aksesi Fl BH2 varian F (BH2-Vt) pada lahan di ketinggian 1200 mdpl; A Bunga mekar, B. Kuncup
20
-=��-� -
-
----=---=-" -= -
--= �-
-
--- --
- - --- -----
--==----=-�---==--= ---=-=----=-------- -� - .:!::�---
--==-=---= --= =----=== =- =----= -==---� �--=------ - -- -
-- - - -----= ----=-==---=--- - �--
--- - --- -- --- - - -- � �"
7. Fl aksesi BHU3 Varian A (BHU3-Va)
Tinggi tanaman mencapai 80 cm, batang hijau. Daun bulat telur memanjang, tepi daun berlekuk-bergerigi, rasio panjang: lebar dallll=3-4: 1 . ,
Filaris 3, rapat, menyebar. Reseptakel bentuk me�bulat, tepi ungti"'t'ifuda Bunga tepi berjumlah 18-21, warna merah muda pucat-putih, rapat, bentuk oval, rasio panjang: lebar=4,5-5:1, ujung berlekuk 2, posisi bllllga tepi terhadap ibu tangkai bunga 50°. Warna bunga saat kuncup hijau (Gambar
7).
(A) (B)
Gamb� 7. Morfologi bunga ekinase aksesi Fl BHU3 varian A (BHU3-Va) pada lahan di ketinggian 1200 mdpl; A. Bungamekar, B. Kuncup
8. Fl aksesi BHU3 Varian B (BHU3-Vb)
Tinggi tanaman mencapai 80 cm, batang hijau keunguan. Daun bulat telur memanjang, tepi daun rata, rasio panjang: lebar daun=4: 1 . Filaris 3, rapat, menyebar. Reseptakel bentuk segitiga, tepi ungu muda. Bunga tepi berjumlah 13-19, warna merah muda tk:.2, jarang, bentuk oval, rasio panjang: lebar=3,5-4: 1, ujung berlekuk 2, posisi bunga tepi terhadap ibu tangk:ai bunga 90°. Wama bunga saat kuncup merah (Gambar 8).
21
- __ ---==-=�·-=- --- �:� = � �-:�----�-: =-=-� -
� � - -� - - ---
--
- -
�-:;_-_
�:-�-
�-
- -=�-_-- _-:: ___ =-.. -�-=
(A) (B)
Gambar 8. Morfologi bunga ekinase aksesi Fl BHU3 varian B (BHU3-Vb) pada lahan di ketinggian 1200 mdpl; A. Bunga mekar, B. Kuncup
Variasi morfologi ekinase juga ditemukan di Jerman sebanyak 7 aksesi ekinase (Banga et al., 2010) dan sebanyak 9 genotip ekinase yang juga diteliti di Jerman (Varban et al., 2010). Karakter morfologi lainnya yang diamati adalah karakter tumbuh, berikut data tumbuh 1 1 aksesi ekinase sebelum panen: Tabel 1 . Data tumbuh 1 1 aksesi ekinase sebelum panen
no Kode Karakter
1 2
3 4 5 6
7 8 9
10 11
Aksesi Tinggi Lebar Tajuk Jumlah Jumlah panjang (cm) (cm) Kuntum Bunga anakan akar (cm)
BH2 D 88 50 36 1 1 22,5 BH2 VA 92 59 47 7 27 BH2 VB 48 38 13 1 1 23,5 BH2 VC 106 64 102 8 27,5 BH2 VD 87 45 29 10 25 BH2 VE 83 65 34 5 22 BH2 VF 88 55 71 15 26,5 BHU3 D 102 78 66 13 34 BHU3 VA 1 14 77 45 15 28 BHU3 VB 104 74 62 14 27,5 BHU5 G 103 59 72 15 29
Langkah pertama untulc pengembangan kultivar adalah dengan karakterisasi aksesi, cara yang paling mudah adalah dengan menggunakan karakter morfologi. Karakter morfologi mudah dan cepat untuk diamati tetapi karakter morfologi mempunyai kelemahan yaitu dipengaruhi oleh faktor luar atau
22
= --d
--
_---- -
-
--
--=-�--=---
--=----=-�-
faktor lingkungan. Pcngelompokkan berdasarkan karakter morfologi dapat
diperkuat dengan menggunakan karakter lainnya antara lain yaitu karaktcr
molekular dan fitokimia. Pengetahuan tentang kem��karagaman geneti k pada - �,�
spesies tanaman budidaya sangat penting untuk peningkatan kualitas. Karakter
molekular, fitokimia dan morfologi digunakan untuk karaktcrisasi
keanekaragamm1 genetik interspesies dan intraspesies tanaman budidaya (Ozkaya
et al., 2006)
B. KARAKTER MOLEKULAR
Selain berdasarkan karakter morfologi, F l tiga aksesi dan vm·ian-variannya
JUga dilihat berdasarkan karakter molecular untuk melihat ada tidaknya
keragaman genetik. Untuk mendapatkan karakter molekular dengan menggunakan
penanda molekular ISSR, langkah pertama yang harus dilakukan adalah isolasi
DNA genom masing-masing aksesi ekinase. Metode yang digunakan untuk isolasi
DNA genom adalah dengan mengguna.kan metode CTAB (cethyl trimethyl
ammonium bromide). Ekinase mengandung senyawa-scnyawa metabolit sekunder
salah sattmya polifenol yang akan mengganggu dalam isolasi DNA. Penambahan
PVP (polyvinylpyrolidone) bertujuan w1tuk mengikat protein terutarna polifcnol
oksidase yang dapat mengoksidasi senyawa fenolik pada sampel dan bcrikatan
dengan DNA yang menyebabkab wama coklat serta mendegradasi DNA.
Senyawa fenol akan diikat oleh PVP yang ditambahkan pada buffer ekstraksi
(Vaze et al., 2010).
Kuantifikasi DNA genom ekinase dengan metode spektrofotometri
mempunyai kemurnian 1 ,54-1,68. Nilai lersebut menunjukkan bahwa DNA
genom mempunyai kemw·nim1 yang cukup tinggi. Berikut adalah basil isolasi
DNA genom ekinase menggunakan metode CTAB:
23
��- -=== - =-__ -- - - = =-
---=--======-I =- -
� -� - -_ � -_ - -=
_- -= -=:,--=-- - -
-
10.000 bp
250 bp
BH2 BHU3 BHU5
Gambar 9. DNA genom Fl tiga aksesi ekinase (BH2, BHU3 clan BHU5) menggunakan metode CT AB
Dari gambar 9 tersebut menunjukkan pita DNA yang bersih dan tebal,
\Valaupu masih ada kontaminan yang kemungkinan senyavva fenol dan
polisakarida, akan tetapi tidak dapat diamplifikasi (PCR) atau tidak terbentuk
fragmen-fragmen DNA. Hal tersebut kemungkinan disebabkan karena RNA
dal<:tm genom rnasih ada dan selain itu daun yang digunakan sudah terlalu tua
sehingga DNA yang dihasilkan sangat sedikit. Oleh karena itu diglmakan kit
isolasi DNA, berikut hasil isolasi DNA menggunakan kit:
L-1 1 . 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 L-1
1 0.000 bp
Gambar 10. DNA genorn F l aksesi ekinase rnenggtmakan kit isolasi DNA; L
l :Ladderl kb, 1: aksesi F 1 -BH2, 2: aksesi Fl-BHU3, 3: aksesi F l -
24
250 bp
BHU5, 4-9: aksesi F l -BI-12-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi F l -BI- IUJ-Va dan Vb
Amplifikasi DNA menggunakan I 0 primer ISSJ� .. dan I 0 primer RAPE> �-=..-�Pl
harus dilakukan optimasi masing-masing primer terutama annealing tempel·ature
yang optimal dan konsentrasi primer. Berikut daftm primer TSSR dan RAPD
yang digunakan dan hasil optimasi annealing temperature masing-masing primer:
Tabel 2. Primer ISSR dan RAPD serta annealing temperature (Ta) optimal yang
digunakan untuk ampl ifikasi
25
1 .000 bp
250 bp
Tiap primer ISSR mempunyai annealing temperature (Ta) yru1g spesifik
dan umurnnya selalu lebih tinggi dari Tm karena dibutullkan kekuatan
(stringency) untuk rnemfasilitasi primer menempel pada. r.emplate (Ol ivi�·�. et (JI.,
201 0). Jabbarzadeh et al. (2010) menyatakan bahwa Ta yang optimal untuk
hibridisasi adalah 2° - 14°C lebih tinggi dari pada Tm. Dalam penelitian ini
dilakukan optimasi tmtuk memperoleh nila Ta yang optimal pada ketujuh primer
ISSR dan nilai Ta lebih tinggi dari pada Tm. Jika nilai Ta terlaJu rendah maka
primer akan menempel di semba.rang tempat dan menghasi lkan fragmen DNA
yang tidak diinginkan, akan tetapi bila nilai Ta terlalu tinggi maka fragm en yang
teramphfikasi sedikit dan tidak sempurna (Oliviera et al., 201 0). Annealing
temperature lebih tinggi dan primer dengan panjang basa 1 6 - 1 8 menghasilkan
lebih banyak pita atau fragmen polimorfik yang reliabel dan reprodusibel apabil a
dibandingkan dengan penanda molekular RAPD (Mohsen dan Ali, 2008;
Wahyuni et al., 2004). Berikut basil amplifikasi F I aksesi ek inase dan variannya:
L-1 1 2 3 4 7 8 9 1 0 1 1 L-2
500 bp
1 0 0 bp
Gambar 1 1 . Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer ISSR UBC-866: L-l :Ladder l kb, 1 : aksesi F l -BH2, 2: aksesi F l -BHU3, 3: aksesi Fl -BHU5, 4-9: aksesi F l -BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-1 1 : aksesi F l-BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
Berdasarkan Gambar l l dapat diketahui fragmen DNA hasil amplifikasi
menggunakan primer UBC-866 pada 1 1 aksesi ekinase menghasilkan I 0 fragmen
berukuran 387-1350 bp. Terdapat 2 fragmen DNA spesifik yang dimiliki oleh dua
26
1 . 000 bp
250 bp
aksesi ekinase yaitu fragmen berukuran 700 bp pada aksesi BH2 dan 533 bp pada
aksesi BH2-Ve. Fragmen DNA tersebut dapat dijadi kan acuan untuk identifikasi
aksesi ekinase bila diamplifikasi menggunakan primer UBC-866. �·
.. ... .
600 bp
1 0 0 bp
Gambar 1 2 . Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan prim er ISSR UBC-834: L-l:Ladderl kb, 1 : aksesi F l -BH2, 2: aksesi F l -BHU3, 3 : aksesi F l -BHU5, 4-9: aksesi F l -BH2-Va, Vb, Ve, Vcl, Ve da11 Vf, l 0-1 1 : aksesi F l -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
Berdasarkan Gambar 1 2 dapat diketahui fragmen DNA hasil arnplifikasi
menggunakan primer UBC-834 pada 1 1 aksesi ekinase rnenghasilkan 1 1 fragmen
berukuran 281 bp-1743 bp.
27
1 .000 bp
250 bp
1 . 000 bp
250 bp
. .. L-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 : L-2
500 bp
1 00 bp
Gambar 13 . Fragmen DNA basil amplifikasi dengan menggmrnkan primer ISSR UBC-872: L-l:Ladderl kb, 1: aksesi F l -BH2 , 2: aksesi F 1 -BI-IU3, 3: aksesi F l -BI-IU5, 4-9: aksesi F l -BH2-Va, Vb, Ve, Yd, Ve dan Vf, 10-1 1 : aksesi F l -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
Berdasarkan Gambar 13 dapat diketahui fragmen DNA hasil amplifikasi
menggunakan primer UBC-872 pada I l aksesi ekinase menghasilkan 4 fragmen
berukuran 288-607 bp.
2 .. 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 L-2
Gambar 14 . Fragmen DNA hasil amptifikasi dengan menggunakan primer ISSR UBC-807: L-l:Ladderl kb, 1: aksesi F l -BH2, 2: aksesi F l -BHU3 , 3:
500 bp
100 bp
28
1 .000 bp
250 bp
aksesi F l -BHU5, 4-9: aksesi F l -BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-11 : aksesi F 1 -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
Berdasarkan Gambar 14 dapat diketahui fragmeu DNA hasil amplifikasi "'V'..._--::.._ .
menggunakan primer UBC-807 pada 1 1 aksesi ekinase menghasilkan 1 3 fragmen
berukuran 192-1242 bp. Terdapat 3 fragmen DNA spesifik yang dimiliki oleh dua
aksesi ekinase yaitu fragmen berukuran 1035 bp dan 522 bp pada aksesi BHU3
dan 903 bp pada aksesi BHU3-Va. Fragmen DNA tersebut dapat dijadikan acuan
untuk identifikasi. aksesi ekinase bila diamplifikasi menggunakan primer UBC-
807.
500 bp
200 bo
Gambar 15 . Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer TSSR UBC-825: L-l:Ladderl kb, 1: aksesi F l -BH2, 2: aksesi F l -BHU3, 3: aksesi F l -BI-IUS, 4-9: aksesi F l -BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf: 10-11: aksesi FJ -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
Berdasarkan Gambar 15 dapat diketahui fragmen DNA hasil amplifikasi
menggunakan primer UBC-825 pada 1 1 aksesi ekinase menghasilkan 8 fragmen
berukuran 301-932 bp.
29
1.000 bp
250 bp
L-t 1 2 3 4 5 6 7 8 9
500 bp
1 0 0 bp
Gambm 1 6. Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer ISSR UBC-8 12: L-l:Ladderl kb, 1: aksesi F l -BH2, 2: aksesi F 1 -BHU3, 3: aksesi Fl-BHU5, 4-9: aksesi F l-BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 1 0-1 1 : aksesi F l-BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
• Berdasarkan Gambar 16 dapat diketahui fragmen DNA hasil amplifikasi
menggunakan primer UBC-8 1 2 pada 1 1 aksesi ekinase menghasilkan 1 1 fragmen
berukuran 283-1438 bp. Terdapat 2 fragmen DNA spesifik yang dimiliki oleh dua
aksesi ekinase yaitu fragmen berukuran 1438 bp pada aksesi BHU3 dan 283 bp
pada aksesi BHU5. Fragmen DNA tersebut dapat dijadikan acuan untuk
identifikasi aksesi ekinase bi la diamplifikasi menggunakan primer UBC-8 12 .
30
1 . 000 bp
250 bp
1 .000 bp
250 bp
L-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 L-2
500 bp
100 hn
Gambar 17. Fragmen DNA basil amplifikasi dengan menggunakan primer ISSR A83024 1 : L-l :Ladderl kb, l : aksesi F l -BH2, 2: aksesi F l -BHU3, 3: aksesi F l-BHUS, 4-9: aksesi F 1 -BI-12-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 1 0-1 1 : aksesi F l -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder I 00 bp
Berdasarkan Gambar 1 7 dapat diketahui fragmen DNA hasil amplifikasi
menggunakan primer A830241 pada 1 1 aksesi ekinase menghasilkan 9 fragmen .
berukman 439- 1 5 12 bp. Terdapat 1 fragmcn DNA spesifik yang dimiliki oleh
aksesi BH2-Vd yaitu fragmen DNA berukuran 1 387 bp. Fragmen DNA tersebut
dapat dijadikan acuan w1tuk identifikasi aksesi ekinase bila diamplifikasi
menggunakan primer A830241 .
L-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 L-2
500 bp
100 hn
Gan1bar 1 8. Fragmen DNA basil amplifikasi dengan menggunakan primer lSSR (CAG)5: L-l :Ladderl kb, 1 : aksesi F l -BH2, 2: aksesi F l -BHU3, 3 :
3 1
aksesi F l -8HU5, 4-9: aksesi F 1 -8H2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-1 1 : aksesi F l-8HU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
8erdasarkan Gambar 18 dapat diketahui fragmen DNA hasil amplifi kasi ...
• • �� -- .-! •
menggunakan primer (CAG)5 pada 1 1 aksesi ekinase menghasilkan 8 f�:agmen
berukuran 467-1285 bp. Terdapat 2 fragmen DNA spesifik yang dimiliki oleh dua
aksesi ekinase yaitu fragmen berukuran 5 1 0 bp pada aksesi 8H2 dan 1 249 bp
pada aksesi 8HUJ-Va. Fragrnen DNA tersebut dapat dijadikan acum1 untuk
identifikasi aksesi ekinase bi la diamplifikasi menggunakm1 primer (CAG)5.
L-f 1 2 3 . 4 5 6 ' 7 8 9 10 1 1 L-2
1 . 000 bp
250 bp
600 bp
100 bo
Gambm· 1 9. Fragmen DNA hasil amplifikasi dengm1 menggunakan primer ISSR 178988: L-l:Ladderl kb, 1: aksesi F l -8H2, 2: aksesi F l -8HUJ, 3: aksesi F l -BHU5, 4-9: aksesi F l -8H2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vt: 10-1 1 : aksesi F 1 -8HU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
8erdasarkan Gambm· 1 9 dapat diketahui fragmen DNA hasil amplifikasi
menggunakan primer 1 78988 pada 1 1 aksesi ekinase menghasilkan 16 fragmen
berukuran 1 70- 1 903 bp. Terdapat 7 fragmen DNA spesifik yang dimiliki oleh
I ima aksesi ekinase yajtu fragmen berukuran 1 903 bp pad a aksesi 8H2-Vb, 507
bp pada aksesi 8H2-Vd, 439 pada aksesi 8H2-Va, 4 1 5 pada aksesi 8HU3-Va,
sedangkan 3 fragmen spesifik dimiliki oleh aksesi 8HU5 yaitu 638bp, 262 bp dan
196 bp . Fragmen DNA tersebut dapat dijadikan acuan untuk identifikasi aksesi
ekinase bila diamplifikasi menggunakan primer 1 78988.
32
1 . 000 bp
250 bp
L-1 1 2 3 4 5
, " ·-····· ···- . . ,,, --.-.
6 7 8 9 1 0 1 1 L-2
500 bp
1 200 bo
Gambar 20. Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer ISSR 8 14: L-l :Ladderl kb, 1: aksesi Fl -BH2, 2 : aksesi F l -BHU3, 3: aksesi F l -BHUS, 4-9: aksesi F l -BH2-Va, Vb, Ve, Vcl, Ve clm1 Vf, 10-11: aksesi F l -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
Berdasarkan Gambar 20 dapat diketahui fragmen DNA hasil amplifikasi
menggunakan primer 814 pacla 1 1 aksesi ekinase menghasi lkan 1 8 fragmen
berukuran 230-1753 bp. Terdapat 3 fragmen DNA spesifik yang hanya dimiliki
oleh aksesi ekinase BH2-Vc yaitu fragmen berukuran 1540 bp, 878 bp dan 439
bp. Fragmen DNA tersebut dapat d ijadikan acuan untuk identifikasi aksesi ekinase
bila diamplifikasi menggtmakan primer 814.
Hasil penelitim1 1111 menunjukkan semua pnmer ISSR clapat
mengamplifikasi clan menghasilkan f:ragmen DNA dengan jumlah 2': 4 fragmen
DNA tiap primer. Jumlah total fragmen DNA yang teran1plifikasi dan prosentase
fragmen DNA polimorfik dapat dil ihat pacla tabel berikut ini:
Tabel 3. Total fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan 10 primer ISSR dan prosentase fragmen polimorfik pada 1 1 aksesi ekinase
,.., .., _} _)
4 , . 5
. ri
UBC-807 (AG)8T 1 3 UBC-825 (AC)8T 8
(GA)8A 1 1
(ACTG)5_ 9 (CAG)5 8
(CA)6GT 1 6
(CT)8TG 1 8
108
1 0,8
4 .... -'· 2
2 0
20
2
92,3 1 50
7J;l�2 77,78
87,5
87,5
100
81 ,48
Tabel 3 menunjukkan bahwa 10 pnmer ISSR yang digi.makan dapat
mengamplifikasi DNA dan menghasilkan fragmen polimorfik. Polimorfisme
tertinggi dihasilkan amplifikasi menggunakan primer UBC-814 yaitu 100%,
polimorfisme rata-rata yaitu 8 1 ,48%.
Menurut Mansyah et al. (2010) jum lah fragmen DNA polimorfik yang
dihasilkan terga11tlmg pada spesies (sampel) dan primer lSSR yang d igunakan.
Pemilihan primer LSSR yang tepat juga akan menghasilkan fragmen DNA
polimorfik yang lebih tinggi, reprodusibilitas tinggi dan lebih inforrnatif terutama
dalam analisis keragaman genetik (Denduangboripant eL al., 2010).
Primer ISSR yang digunakan dalam penelitian in i menggunakan primer di-
nukleotida dengan pengulangan (CA), (CT), (AC), (AG) dan (GA), sedangkan
primer tri-nukleotida yang digunakan menggunakan pengulangan (CAG) dan
(CTC) dan primer tetra-nukleotida dengan pengulangan (GATA) dan (/\CTG).
Primer dengan motif pengulangan dinukleotida lebih banyak mengasilkan
fragmen DNA polimor:fik daripada amplifikasi dengan menggunakan motif
pengulangan trinukleotida. Reddy et al. (2002) menyatakan bah\va secara umum
34
primer dengan pengulangan nukleotida (AG), (GA), (CT), (TC), (AC) dan (CA)
memmjukkan polimorfisme yang lebih tinggi dibandingkan dengan primer dengan
motif pengulangan di-, tri-, tetra- nukleotida lai1mya� · Pengulangan HtlkJeotida
(AT) adalah yang terbanyak pada tumbuhan tetapi primer berdasarkan
pengulangan tersebut akan se(f-anneal dan tidak dapat mengamplifikasi.
Pengulang<m nukleotida tri- dan tetra-nukleotida lebih sedikit ditemukan di genom
tumbuhan dibandingkan dengan pengulangm1 di-nukleotida (Kumar et al. , 2008).
Fragmen-fragmen DNA yang dihasilkan kemudian dianalisis berdasarkan
ada atau tidaknya fragmen DNA yang muncul pada tiap aksesi. Jika terclapat
fragmen DNA maka diberi skor 1 sedangkan jika tidak acla fragmen DNA diberi
skor 0. Skor tersebut d igunakan untuk menghitung koefisien asosiasi atau indeks
siniilaritas antar aksesi ekinase. Koefisien similaritas yang digunakan adalah
koefisien Dice. Berdasarkan nilai koefisien asosiasi tersebut, maka dapat dibuat
clendogram melalui analisis klaster dengan menggtmakm1 metode UPGMA
(Unweighted Pair Group 1\1ethod [J1·ing Arithmetic },Jean). 1-fobungan kemiripan
antar 1 1 aksesi ekinase berdasarkan penanda molekular ISSR dapat diketahui dari
dendogram berikut ini:
35
13112
� BHU3
. . •
• I rJo(_�._ - - I Bf-12\lb
BH2Vf
I 13112\lc
- I 13HU3v1J
� BHU5
BH2Va
BHU3Va
BH2Vd
BH2Vc
0.60 0.68 0.75 Kocfisicn
0.82 0.90
Gambar 2 I . Dendogram 1 I aksesi Echinacea purpurea ( ekinase) berdasarkan penanda molekular ISSR
Dari dendogram (Gambar 2 1 ) 1 1 aksesi ekinase terbagi menjadi S klaster
pada koefisien similaritas 68,96 %. Klaster I terdiri dari aksesi BH2, BHU3, BH2-
Vb dan BH2-Vf. Klaster II terdiri dari aksesi BH2-Vc dan BfIU3-Vb, klaster III
terdiri dari aksesi BHUS dan BH2-Va, klaster IV hanya beranggotakan BHU3-Va,
sedangkan klaster V terdiri dari aksesi BH2-Vd dan BH2-Ve. Kemiripan tertinggi
yaitu antara BH2-Vb dan BH2-Vf sebesar 81 ,25%.
Nilai koefisien asosiasi tersebut menunjukkan antar aksesi ekinase
mempunyai kemiripan atau kedekatan dengan pendekatan karakter molekular
ISSR. Kemiripan genetik dapat digunakan untuk mengukur hubungan kemiripan
pada sampel. Apabila suatu kelompok tumbuhan atau OTU mempunyai kemiripan
antara 85% - 100% di1mmgkinkan masih dapat dikelompokkan sebagai satu
spesies yang sama, kemiripan sebesar 65% digunakan untuk mengelompokkan
pada tingkat genus. Akan tetapi pada akhirnya interpretasi dari dendogram tergantung pada pengetahuan taksonom pada OTU yang diteliti (Chaveerach et
al., 2008).
-:::=:,;; =-=-
;;--��-:;;;;;-::;;: =-
::;::: :-=-;_:: -:-� :=;::� ---§:§:;:.=-:_:;:-:_ -=._- ---=o---"---=---- -- -=--=--.=-- -- �---:: ---=--=--- --
==-==-=-
-----
-
--==----=-====--= ---= ------------------ --
36
1 . 000 bp
250 bp
Selain menggunakan penanda molecular ISSR untuk melibat
keanekaragaman dan kemumian keturunan F l aksesi ekinase juga menggunakan
penanda molecular RAPD. Berikut hasil amplifikasi .. DNA aksesi ekinase "'1'�� ....
menggunakan 1 0 - prirner RAPD:
L-1 •·· 1 2 . 3 4 ' 5 6 > 7 8 9 1 0 1 1 L-2
500 bp
1 0 0 bp
Gambar 22. Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer RAPD OPA- 10 : L-l:Ladderl kb, 1 : aksesi F l -BH2, 2: aksesi F l - BHU3, 3 : aksesi F 1 -BHU5, 4-9: aksesi Fl-BH2-Va, Vb, Ve, Yd, Ve dan Vf, 10-1 1 : aksesi F l -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 1 00 bp
Berdasarkan Gambar 22 dapat diketahui fragmen DNA hasil amplifikasi
rnenggunakan primer OPA- 1 0 pada 1 1 aksesi ekinase menghasilkan 1 0 fragrnen
berukuran 327-1320 bp. Terdapat 2 fragmen DNA spesifik yang hanya dimiliki
oleh aksesi BHUS yaitu fragmen DNA berukuran 998 bp dan 1095 bp_ Fragmen
DNA tersebut dapat dijadikan acuan untuk identifikasi aksesi eki nase bila
di.amplifikasi menggunakan primer OPA- 10 .
37
1 . 000 bp
250 bp
1 . 000 bp
250 bp
L-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 L-2
500 bp
1 0 0 bp
Gambar 23. Fragmen DNA basil amplifikasi dengan menggunakan primer RAPD OPA-1 6: L-l :Ladder1 kb, 1 : aksesi F l -BH2, 2: aksesi Fl-BHU3, 3: aksesi F l -BHUS, 4-9: aksesi F l-BH2-Va, Vb, Ve, Yd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi F l-BHU3-Va dm1 Vb, L-2: Ladder 1 00 bp
Berdasarkan Ganibm· 23 dapat diketahui fragmen DNA hasil m11plifikasi
menggunakm1 primer OPA- 1 6 pada 1 1 aksesi ekinase menghasilkan 6 fragmen
berukuran 5 1 8- 1499 bp. Terdapat 1 fragmen DNA spesifik yang tidak dimiliki
oleh aksesi BHU3-Vb yaitu fragmen DNA berukuran 989 bp. Fragmen DNA
tersebut dapat dijadikan acuan untuk identifikasi aksesi ekinase bila diamplifikasi
menggunakan primer OPA-1 6 .
. ' l.:·1 . . 1 2 . 3. 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 L-2
500 bp
1 00 bp
38
1.000 bp
250 bp
Gambar 24. Fragmen DNA hasil arnplifikasi dengan menggunakan primer RAPD OPA-1 7 : L-l :Ladderl kb, 1 : aksesi Fl -BH2, 2: aksesi F l -BHUJ, 3: aksesi FI -BHU5, 4-9: aksesi F 1 -BH2-Va, Vb, Ve, Yd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi F l-BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
' . �'(·�- .
Berdasarkan Gambar 24 dapat diketahui fragmen DNA hasil amplifikasi
menggunakan primer OPA- 1 7 pada 1 1 aksesi ekinase hanya menghasilkan I fragmen DNA 805 bp.
4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 L-2
500 bp
1 0 0 bp
Gambar 25. Fragmen DNA basil amplifikasi dengan menggunakan primer RAPD OPA-1 8: L-l:Ladderl kb, 1 : aksesi F 1 -BH2, 2 : aksesi F l -BHU3, 3: aksesi F l -BHU5, 4-9: aksesi F l-BH2-Va, Vb, Ve, Yd, Ve clan Vf, 10-1 1 : aksesi Fl -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
Berdasarkan Gambar 25 dapat diketahui fragmen DNA basil amplifikasi
menggtmakan primer OPA- 18 pada 1 1 aksesi ekinase menghasilkan l 0 fragmen
berukuran 269-1405 bp. Terdapat 2 fragmen DNA spesifik yang dimiliki oleh
aksesi BHU3-Va yaitu fragmen DNA berukuran 1 143 bp dan 298 bp. Fragmen
DNA tersebut dapat dijadikan aeuan untuk identifikasi aksesi ekinase bila
diamplifikasi menggunakan primer OPA-1 8.
1 . 000 bp
250 bp
1 .000 bp
250 bp
L-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 L-2
I � -· ' �
500 bp
100 bp
Gambar 26. Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer RAPD OPA-1 9 : L-l:Ladderl kb, 1: aksesi F l -BH2, 2: aksesi F l -BHUJ, 3: aksesi Fl -BHU5, 4-9: aksesi F l-BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-11: aksesi F l-BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
Berdasarkan Gambar 26 dapat diketahui fragmen DNA hasi l amplifikasi
menggunakan primer OPA-19 pada 1 1 aksesi ekinase menghasilkan 4 fragmen
ber�kuran 383-1495 bp. Terdapat 2 fragmen DNA spesifik yang dimil iki aksesi
BHU3-Vb yaitu fragmen DNA berukuran 1495 bp dan fragmen DNA berukurai1
702 bp pada aksesi BHU3-Va. Fragmen DNA tersebut dapat dijadikan acuan
untuk identifikasi aksesi ekinase bila diamplifikasi menggunakan primer OPA-19.
500 bp
100 bp
Gambm 27. Fragmen DNA hasil ampl ifikasi dengan menggunakan primer RA.PD OPB-4: L-l :Ladder1 kb, 1 : aksesi F l -BH2, 2: aksesi Fl -BHU3, 3:
40
1 . 000 bp
250 bp
aksesi F l -BHU5, 4-9: aksesi F l -BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-1 1 : aksesi F l-BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
Berdasarkan Gambar 27 dapat diketahui fragmen DNA hasil amplifil<asi � · .--... .,..,.'--�- .
menggunakan primer OPB-4 pada 1 1 aksesi ekinase rnenghasilkan 7 fragrnen
berukuran 273- 1046 bp. Terdapat 2 fragmen DNA spesifik yang dimiliki aksesi
BH2-Vb yaitu fragmen DNA berukuran 455 bp dan fragmen DNA bernkman 3 1 4
bp pada aksesi BI-I2-Ve. Fragmen DNA tersebut dapat dijadikan aeuan untuk
identifikasi aksesi ekinase bila diarnplifikasi menggunakan primer OPB-4.
L-1 1 2 3 4 6 7 8 9 10 1 1 L-2
500 bp
100 bo
Gambar 28. Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer RA.PD OPE-5: L-l :Ladder1 kb, l: aksesi F l -BH2, 2: aksesi Fl -BI-IU3, 3: aksesi F l -BHU5, 4-9: aksesi F l -BI-I2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, l0-11: aksesi Fl -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
Berdasarkan Gambar 28 dapat diketahui fragmen DNA hasil arnplifikasi
menggm1akan primer OPE-5 pada 1 1 aksesi ekinase menghasilkan 6 fragmen
berukuran 596-1973 bp. Terdapat 1 fragmen DNA spesifik yang dimiliki aksesi
BI-I2 yaitu fragmen DNA berukuran 1 973 bp. Fragmen DNA tersebut dapat
dijadikan aeuan untuk identifikasi aksesi ekinase bila cliamplifikasi menggunakan
primer OPE-5.
4 1
----""'=�-==-:;---� :=--- -= --= -=- �---=---=-� � --===- -- - - - - - - ------- ----- --� -------=-- � -��� =-- �-=-=---= = �-=--� � ---==- --_.=__ -
- -=-----�--_
- ------
-
-----
- - - - - -_ -----=--- --
1.000 bo
250 bp
1.000 bp
250 bp
L-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 L-2
500 bp
1 0 0 bp
Gambar 29. Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer RAPD OPE-6: L-l:Ladderl kb, 1: aksesi F1 -BH2, 2: aksesi Fl -BHU3, 3: aksesi Fl -BHU5, 4-9: aksesi F l -BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-1 1 : aksesi F l -BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
Berdasarkan Gambar 29 dapat diketahui fragmen DNA hasil amplifikasi
lilenggunakan primer OPE-6 pada 1 1 aksesi ekinase menghasilkan 9 fragmen
berukuran 543-1707 bp. Terdapat 1 fragmen DNA spesifik yang dimiliki aksesi .
BHU3 yaitu fragmen DNA berukuran 543 bp. fragmen DNA tersebut dapat
dijadikan acuan untuk identifikasi aksesi ekinase bila diamplifikasi menggunakan
primer OPE-6.
L-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 L-2
j soo bp
I I I 1 oo bp
.... ... . . .... . ..... l
Gambar 30. Fragmen DNA basil amplifikasi dengan menggunakan primer Rf.\PD OPH-1 3 : L-l:Ladderl kb, l : aksesi Fl-BH2, 2: aksesi Fl -BHU3, 3: aksesi F l-BHU5, 4-9: aksesi F 1 -BH2-Va, Vb, Ve, Vd, Ve dan Vf, 10-11 : aksesi Fl-BHU3-Va dan Vb, L-2: Ladder 100 bp
42
Berdasarkan Gambar 30 dapat diketahui fragmen DNA hasil amplifikasi
menggunakan primer OPH- 1 3 pada 1 1 aksesi ekinase menghasilkan 1 1 fragmen .
berukuran 253-9n2 bp. Terdapat 1 fragmcn DNA spesifik yang dimilikl eaksesi
BH2-Vb yaitu fragmen DNA berukuran 500 bp. Fragmen DNA tersebut dapat
dijadikan acuan untuk identifikasi aksesi ekinase bila diamplifikasi rnenggunakan
primer OPH-1 3 .
Primer RAPD OPA-6 tidak dapat mengamplifikasi DNA semua aksesi
ekinase, hal tersebut kemungkinan disebabkan karena DNA ekinase tidak
mempunyai urutan basal sekuen dalam primer tersebut sehingga primer tidak bisa
menempel. Jumlah total fragmen DNA yang teramplifikasi dan prosentase
fragmen DNA polimorfik dapat dilihat pada tabel berikut ini:
Tabel 4. Total fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggtmakan 1 0 primer RAPD dan prosentase fragrnen polirnorfik pada 1 1 aksesi ekinase
�'iNo , � ' ,I
.
.
3
OPA-6
OPA- 1 0
OPA-16
• 4 . OPA-17
r" s , OPA - 1 8
OPA-19
OPB-4
OPE-5
QPE-6
OPH-1 3
GGTCCCTGAC
GTGATCGCAG
AGCCAGCGAA
GACCGCTTGT
AGGTGACCGT
CAAACGTCGG
'GGACTGGAGT
TCAGGGAGGT
AAGACCCCTC
GACGCCACAC
Jumlah
Rata-rata
'[
1 0
6
1 0
4
7
6
9 1 1
64
6.4
0
2
3
2 2 2 2
1 6
1 ,6
0
80
83,33
0
70
75
7 1 ,43
66,67
77,78
8 1 ,82
75
Tabel 4 menunjukkan bahwa 10 pnmer RAPD yang d igunakan tidak
semua dapat mengamplifikasi DNA, primer OPA-6 tidak dapat mengamplifikasi,
sedangkan primer OPA- 17 menghasilkan fragmen tunggal dan bersifat
43
monomorfik. Polimorfisme tertinggi dihasilkan arnplifikasi menggunakan primer
OPA- 16 yaitu 83,33 %, pol imorfisme rata-rata yaitu 75%.
Primer -- rssR menghasilkan lebih banyak - • polimorfisme .. �.:('8 1 ,48)
dibandingkan dengan amplifikasi RAPD (75%). Primer ISSR umumnya
mempunyai panjang 1 6 - 1 8 pasangan basa dan annealing temperature lebih
tinggi dibandingkan RAPD sehingga menghasilkan lebih banyak pita atau
fragmen yang reliabel dan reprodusibel (lvfohsen dan Ali, 2008; \\lahyuni et al.,
2004). ISSR merupakan penanda molekular yang memmjukkan sifat dominan
tetapi menunjukkan variabilitas ym1g tinggi sehingga ISSR sangat cocok untuk
menyelidiki variasi genetik di antara individu yang berkerabat sangat dekat dm1
klasifikasi kultivar tanmnan budidaya (Dje et al., 2006).
Fragmen-fragmen DNA yang dihasilkan kernudian dianalisis berdasmkan
ada atau tidaknya fragmen DNA yang muncul pada tiap aksesi. Jika terclapat
fragr;nen DNA maka di beri skor 1 sedangkan jika tidak ada fragmen DNA di beri
skor 0. Skor tersebut digunakan untuk menghitung koefisien asosiasi atau indeks
similm·itas antm· aksesi ekinase. Koefisien similaritas yang digunakan adalah
koefisien Dice. Berdasm·kan nilai koefisien asosiasi tersebut, maka clapat dibuat
denclogram melalui analisis klaster dengan menggunakan metode UPGMA
(Unweighted Pair Group J\!Jethod Using Arithmetic Afean). Hubungan kemiripan
antar 1 1 aksesi ekinase berdasarkm1 penancla molekular RAPD clapat diketahu.i
dari denclogrmn berikut ini:
44
-= - =- -�§:: --=. k_ - - -- --=: -�- ffi::,� � -�--==��=-- =:-_:_-_ _ -=;:=-.=- -� - - =-�--=-=�- - - _ ::. ��--=-== =-=--==-==- ----:=--=-:._- _ _ _ __ -- . -*-
- - =-
- = -- --=--
""--- � -=--- :___ _-= =-=-
=---=--- -
81-12
I 13112Vd
I 1
. ..,,,.� - - -BHlVe
� I 13112\lf
I
� BHU3Va
I BHU:l
I B!'JU5
I lll-12Vb
I BH2Yc
AH2Va
0.70 0.74 0.78 0.82 0.86 0.90 l<oc!isicn
Gambar 3 1 . Dendogram 1 1 aksesi Echinacea purpurea (ekinase) berdasarkan penanda molekular RAPD
Dari dendogram (Gambar 3 1 ) 1 1 aksesi ekinase terbagi menjadi 4 klaster
padi koefisien similaritas 75,49 %. Klaster J terdiri dari aksesi BH2, BH2-Vd,
BH2-Ve, BH2-Vf dan BHU3-Vb. Klastcr II hanya beranggotakan aksesi BH.U3-
Va, klaster III terdiri dari aksesi B I- l U3, BHU5, BH2-Vb dan BH2-Vc, klaster IV
hanya beranggotakm1 BH2-Va,. Kemiripan tertinggi yaitu m1tara BH.2-Vb dan
BH2-Vc sebesar 84,21%.
Sela.in karakter morfologi dan molekular, kadar fenol total juga
dihitung untuk masing-masing aksesi, berikut kurva standar penetapan kadar fenol
total:
45
-=
- --
-
-=-=--�-- =-==�� - --_- -�-
---
---·=--�
1,2 -
L ._y __ :;:_QrOOlx , 0.-487� . .
_ R1 -= 0 . 988 ·· 0,8 + - . . • . .
0,6 . -
0,4
0,2
0
0 100 200 300 400
-+-SC'ncsl
---Linear (Scricsl)
Gambru· 32. Kurva standar pcnetapan kadar fenol total
3. PEMBIBIT AN IN VITRO Ekinase merupakan tanaman yang bersifat heterozigot, kandungan kimia
kemungkinru1 berbeda untuk tiap individu, selain itu juga kual itasnya juga berbeda
(Da!Janayake et al., 2010). Teknik pemb ibitan secara in vitro pada tanaman
ekinase diperJukan untuk kcseragaman dan kualitas genotip yang dihas i lkan.
Eksplan yang digunakan biasanya dari daun ataupun tangkai daun (Dahanayake et
al., 20 J 0).
Pembibitan in vitro aksesi ekinase 111cnggunakan 4 ma.earn Zat pengatur
tumbuh (ZPT) yaitu NAA, BAP, IBA dan Giberelin dengan konsentrasi 2,4,dan 6
ppm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa NAA dan BAP mernberi kan hasil
pertumbuhan yang optimum pada konsentrasi 2 ppm, sedangkan IBA dan
Giberelin menunjukkan basil yang optimum dalam penumbuhan ekinase pada
konsentrasi 6 ppm. Berikut hasil rerata jumlah daun dan akar ekinase pada ZPT
yang berbeda:
Tabel 5 . Rerata Jumlah daun dan akar ek inase menggunakan ZPT berbeda dan
: _N-15� � .;., .....
1
konsentrasi yang optimum
Zat Peng'Njp?,, Ko��r�t' �asi Tumbuh NAA
. 2 BAP 2 ppm
2 ppm [�- - -- ��= ..... IBA 6 ppm
_., � �:·: ·-c ·::��-
J umlalf da U D
30 2 1 25
1 1 ,3
3 ,3
46
--------------Giberelin 6 ppm 33,5 1
Morfologi atau penampakan bibit hasil pembibitan in vitro menunjukkan
basil yang berbeda· dengan berbagai jenis ZPT. Tinggi ·bibit yang maksjI;nal
diperoleh dengan menggunakan zat pengatur tumbuh BAP dan Giberelin. W arna
daun bibit umumnya berwarna hijau muda kecuali ekinase yang ditumbuhkan
menggunakan ZPT giberelin yang berwarna hijau tua (Gambar 30).
(A)
(C) (D)
Gambar 33. Bibit ekinase usia 2 bulan hasil pembibitan In Vitro dengan berbagai konsentrasi Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) yang optimum; (A) BAP 2 ppm, (B) NAA 2 ppm, (C) Giberelin 6 ppm, (D) IBA 6 ppm
Menurut Choffe et al. (2000), IBA dengan konsentrasi 2,5-20 ppm
merupakan konsentrasi efektif dalam pembentukan akar baik dari hipokotil
maupun kotiledon eksplan. Konsentrasi BAP yang optimal dalam pembentukan
tunas ekinase sebesar 2,5 ppm.
47
--- -� ---====
-= -__
--=-
---=-= � _::_ ------·-------- = - ===-=-- -- -=-----.:::=::-- - =--= - ==---=- -
--=--= - --=-------
----
A.
KESIMPULAN DAN SARAN
KESIMJ?ULAN
I . Keturunan pertama F l dari tiga aksesi ekinase pilihan memmjukkan adanya keseragaman yang rendah dan masih menur�jukkan beberapa variasi yang mencolok
2. Aksesi BH2 memmjukkan varian sebanyak 6 aksesi dan varian aksesi BHU3 sebanyak 2 aksesi yang berbeda secara morfologi maupun molekular dengan indukannya
3. Ekinase dapat dikembangkan dengan pembibitan melalui pembibitan in vitro dengan menggunakan eksplan daun
4. Zat pengatur tumbuhan yang optimum dalam pembibitan in vitro ekinase yaitu NAA dan BAP konsentrasi 2 ppm, IBA dan Giberelin konsentrasi 6 ppm
B. SARAN
1 . Aksesi eki nase perlu dimurnikan lagi untuk mendapatkan tanaman standar yang seragam
2. Bibit ekinase hasil pembibitan in vitro perlu diaklimatisasi dan ditanam secara bertahap untuk dapat sampai ke lahan dan dicek keseragaman antar bi bit
48
UCAPAN TERIMAKASIH
Alhamdulillahirobbil'alamin, segala puji hanya_ .bagi Allah SWT atas - ... ,,,..�---·
ralunat dan hidaya11-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan Laporan Akhir
Penelitian ini dengan lancar. Pada kesempatan ini, penulis mengucapkan terima
kasih kepada:
1 . lndah Yuning Prapti, SKM, M. Kes., selaku Kepala Balai Besar Penelitian
dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TO-OT)
yang telah mengijinkan penulis menggunakan sarana dan prasarana
penelitian di Laboratorium Terpadu serta memberi.kan ijin pembiayaan
penelitian melalui DIPA B2P2TO-OT tahun 20 1 1
2. Ketua PPI B2P2TO-OT, Ir. Yuli Widiyastuti, MP yang telah memberikan
arahan dan masukan mulai dari perencanaan, pelaksanaan dan pelaporan
penelitian
3. Segenap anggota peneliti dan pembanh1 penelitian dalam penelitian ini
yang telah melaksanakan kewaj ibannya sehingga penelitian dapat
terlaksana dengan lancar
4. Pihak-pihak lain yang telah banyak membantu dan tidak dapat disebutkan
satu persatu oleh penulis
49
DAFTAR PUSTAKA
Al lard, R.W. 1 992. Pemuliaan Tanaman jilid I. Terjeru�han oleh Manna, Bina ""'�-:.
Aksara. Jakarta ·
Ambarwati, A.D. 1 987. lnduksi Ka/us dan Differensiasi pada Kultur Jaringan Gnetum gnemon L. Fakultas Biologi. Universitas Gadjah Mada. Y ogyakarta.
Aslamyah, S . 2002. Peranan Hormon Tumbuh Dalam Memacu Pertumbuhan Algae, Makalah Falsafah Sains. Program Pasca Smjana/S3. IPB. Bogor.
Badriah. D.N., N .T.Mathius, T.Sutater, 1 998. Tanggap Dua Kultivar Gladiol Terhadap Zat pengatur tumbuh pada perbanyakan in Vitro. J. Hort. 8 (2): 1 048-1059
Banga, D., Ardelean, M., Duda, M. and Varban, D. 2007. Phenotypical Variability of Several Important Characters at Seven Echinacea
purpurea Cultivars Tested Jn Collection Field of USA Vi\1 CLUJ NAPOCA
Choffe, K.L., SJ. Murch and P.K. Saxena, 2000a, Regeneration of Echinacea purpurea : induction of root organogenesis from hypocotyl and cotyledon explants, Plant Cell, Tissue Organ Cult. , 62: 227-234.
Dahanayake, N., Chen, X.L., Zhao, F.C., Yang, Y.S. and Wu, H . An Efficient In Vitro Propagation System For Purple Cone-Flovver (Echinacea purpmea L.). Tropical Agricultural research & Extension 13(2):20 1 0
Dje, Y., Tahi, G.C., Zoro, B.l .A., Malice, M., Baudin, J.P. and Bertin, P. 2006. Optimization of JSSR 1'.1arker for African Edible-Seeded Cucurbitaceae Species Genetic Diversity Analysis. African Journal of Biotechnology 5(2): 83-87
Douglas, J., 1 993. Echinacea-the purple coneflowers, Rualrnra Sgricultural Research center
Fitriani, A. 2003. Kandungan Ajmalisin pada Kultur Kalus Catharanthus roseus (L.) G. Don Setelah Dielisitasi Homogenat Jamur Pythium aphanidermatum Edson Fitzp. Makalal1 Pengantar Falsafah Sains (PPS702). Program Pasca Sar:jana I SJ. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Hasan, S.M.Z., Shafie, M., Shafie, B. and R.M., Shah. 2009. Analysis (�/ Random Amplified Polymorphic DNA (RAP D) of Artemisia capillaries (Wormwood capillary) in East Coast of Peninsular Malaysia. World Applied Sciences Journa 6(7): 976 - 986
Hasnaoui, N., Messaound, M., Chi bani, J. and M., Trifi . 20 1 0. JV!olecular Polymorphisms in Tunisian Pomegranate (Punica granatum L.) as Revealed by RAPD Fingerprints. Diversity 2 : 107 - 1 1 4
Hobbs, C., 1994. Echinacea the Immune Herbs, Botanica Press. Capitola, CA Jones, S.B. and Luchsinger, A.E. 1986. Plant Systematics. Second Edition.
McGraw Hill Book Company. New York. Lee, T.T., Huang, C.C., Shieh, X.H., Chen, C.L., Chen, L.J. and Yu, B. 20 I 0.
Flavonoid, Phenol and Polysaccharide Contents of Echinacea purpurea L.
50
--== �-� -::.=-:�� -z - -_- -.::._==¥-::;-:-=-= :§:_-=-=::�::_:-_-=:::= -
-----=�--=�=-:;-=--�;=---=-------- - -�-:..._:-=-:-__ §':-:-::-.=_ ':""":.:=:_=:: - -= �-=----
·
�- � -�
------------=-
--
And Its lmmunostimulant Capacity In Vitro. International Journal of Environmental Science and Development I ( I ):5-9
Moore, T.C . . 1979. Biochemistry and Physiology of Plant Hormones. Springer Verlag. New York. Heiderlberg. Berlin.
Muthusamy, S., Kanagarajan, S. and Ponnusamy. S. 2008. Efficiency of RAPD and ISSR Markers System in Genetic Variation of Rice Bean (Vigna umbellata) Landraces. Electronic Journal ofBiotechology 1 1 (3): 1 - 1 0
Oliveira, E.C., Junior, A.T.A., Goncalves, L.S.A., Pena, G.F .. Junior, S.P.F., Ribeiro, R.M. and Pereira, M.G. 2010. Optimizing the efficiency of the touchdown technique for detecting inter-simple sequence repeat markers in corn (Zea mays). Genetics and Molecular Research 9(2): 835-842
Ozkaya, M.T., Cakir, E., Gokbayrak, Z, Ercan, H. and Taskin N. 2006. Morphological and molecular characterization of Derik Halhali olive (Olea europaea L.) accessions grown in Derik-Mardin province of Turkey. Scientia Horticulturae I 08: 205-209
Raha1jo, M., 2000. Echinacea Tanaman Obat lntroduksi Potensial. Warta Penelitian dan Pengembangan Tanaman Industri
Raharjo, M., Sudiarto, A. Dhalimi, Rosita-SDM, I. Darwati Hemani, Kosasih, S.N. Syamsiah, 2000., Tingkat produktivitas dan mutu simplisia tanaman introduksi Echinacea purpurea pada beberapa umwpanen. Warta Penelitian dan Pengembangan Tanaman Industri
Reddy, M.P., Sarla, N. and Siddiq, E.A. 2002. Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its applicatfon in plant breeding. Euphytica 128:9- 1 7
Setiyoko, B . 1 995. Kultur Meristem Tanaman Pisang (Musa paradisiaca L.) Kultivar Ambon untuk Memperoleh Tanaman yang Bebas Cucumber Mosaic Virus. Laporan Skripsi Fakultas Biologi UGM. Yogyakarta.
Varban, D.l . , Duda, M.M., Varban, R., Muntean, S. and Mtmtean, L. 2010. The study of Several Genotypes of Echinacea purpurea (L.) Moench. Research Journal of Agricultural Science 42(1): 3 1 9-325
Vaze, A., Nerkar, G., Pagariya, M., Devarumath, R.M. and Prasad, T. 20 I 0. Isolation and PCR Amplification of Genomic DNA From Dry Leaf Samples of Sugarcane. International Journal of Pharma and Bio Science VI(2)20 1 0
Wahyuni, S . , Xu, D.H., Bermawie, N., Tsunematsu, H. and Ban, T. 2004. Skrining ISSR Primer Studi Pendahuluan Kekerabatan Antar Jahe Merah. Jahe Emprit dan Jahe Besar. Buletin TRO 15(1) : 33-41
Xiao-ying, L., Xue-ying, z. and Yue-sheng, Y. 2007. Genetic d;versity of Camellia changii Ye (Theaceae) Using ISSR Markers. Journal of Tropical and Subtropical Botany 1 5(2): 93-100
Zhao, K., Zhou, M. and Chen, L. 2007. Geneac Diversity and Discrimination of Chimonanthus praecox (L.) link Germplasm U>ing !SSR and RAPD }vfarkers. HortScience 42 (5): 1 144-1 148
--=----===-------- ------=-� - -
-==--=-
-�
-- - �-
- _-
5 1
----�=-------
(A) (B)
(C) (D)
(E) . (F)
(G) (H)
Lampiran 1 . Bentuk reseptakel masing-masing varian aksesi (A. BH2-V a, B. BH2-Vb, C. BH2-Vc, D. BH2-Vd, E. BH2-Ve, F. BH2-Vf, G. BHU3-Va, H. BHU3-Vb)
52
--
-=;;::..===--=---- -�--
--
----=:
--
---
---
--== -�-::::;;;;;-�--_-_ �� -�---=-----=--=--
-- ---__ -
-
-
=
_-_
=-
�
�
-���-
=----
Lampiran 2. Data berat basah masing-masing aksesi
no
1
2
3
4
5 --
6
7
8
9
10
11
Kode A.ksesi Berat Basah (gr)
Akar Batang Daun Bunga . -
BH2 D 45 187 97 53 •
... .,.r·
BH2VA 48 203 75 136
BH2VB 31 52 80 51
BH2 VC 40 385 264 250
BH2 VD 28 128 109 98
BH2VE 25 175 77 92
BH2 VF 79 364 246 307
BHU3 D 90 350 260 334
BHU3 VA 125 374 202 279
BHU3 VB 59 296 201 146
BHU5 G 1 14 379 165 250
53
-=-
��
---=- -= �.=:-= _:,._-::::__-==:;_-=---"-=--� --==-
---- �,;;; �---=-� -�--------
-� --=-� --=------ -
-
-� =----� =--=--=---=--� =--=-----=�--=---=--=-------=------=------------
-------= = --- -=---= -=---
,.
LEMBAR PENGESAHAN
Penelitian dengan judul "Kajian Karakteristik Aksesi dan Pengemhang::m
Teknis Pembibitan Secara In Vitro Echinacea purpurea L.", dinyatakmJelah
selesai dan telah dibahas Panitia Pembina Ilmiah Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional, Badan Litbang Kesehatan.
Menyetujui Ketua PPI
Ir. Yuli Widiyastuti, M.P NIP.197607171993032002
Tawangmangu, Januari 2012
Ketua Pelaksana
Dyah Subositi, M.Sc. NIP. 1983081 52006042003
54
- -----= =--=-
_- -___ ---- -�---=- - -� -=- ::§-=----= -=-- =-_
--E._--- - --- ----_ :__--
��-=-----�---------.--=: