Állatkísérletek Elmélete és Gyakorlata-B szint

Core modul 2/1

Az állatkísérletek elméleti háttere és jelentősége; A

Szegedi Tudományegyetem ÁOKSebészeti Műtéttani Intézet

2017. december 06-december 15.Referencia szám: AA1.0/2015; AB1.0/2015

SZTE Sebészeti Műtéttani Intézet

2017-2018-I. szemeszter

Az állatkísérletek elméleti háttere és jelentősége; A modellalkotás. Az állatkísérletek története.

Prof. Dr. Boros Mihály

Az állatkísérletek elmélete és gyakorlata c. specializációs képzésekről (HU A, B)

A képzés hátterét az 1998. évi XXVIII. törvény az állatok védelméről éskíméletéről 30. § (1), valamint a tudományos célokra felhasznált állatok

Mi a kurzus célja ?

kíméletéről 30. § (1), valamint a tudományos célokra felhasznált állatokvédelméről szóló 2010/63/EU európai parlamenti és tanácsi irányelv uniósrendelkezései jelentik, melyeket 2013. január elsejétől hazánkban isalkalmazni kell.

E kötelezettség teljesítése érdekében az irányelvben foglalt előírásokátvétele, a kapcsolódó hazai szabályozás átalakítása megtörtént, az errevonatkozó rendelet (40/2013. (II. 14.) Korm), részletesen előírja azállatkísérletetekkel foglalkozó személyek elméleti és gyakorlati képzését, arendeletben foglalt tematika alapján.

2005-02-16 20:45:51 Kókai Kata, Állatkísérletek

Amikor megveszünk egy jó nevű kozmetikumot, vagy akár egy egyszerű szappant,

”Közgondolkodás” megváltoztatása

1998. XXVIII Állatvédelmi Törvény (Ávt) : Szépítőszer, dohány- és egyéb élvezeti cikk, valamint fegyver, ennek alkatrésze, továbbá lőszer előállítása céljából tervezett kísérletre engedély nem adható. (Ávt. 25. §)

Nem remélt cél

Amikor megveszünk egy jó nevű kozmetikumot, vagy akár egy egyszerű szappant, többnyire nem tudhatjuk, hány állat életébe került annak kifejlesztése. Az Interneten borzasztó képeket látni kétfejű, és megcsonkított állatokról, s az állatvédők odaadó küzdelme ellenére a legnagyobb cégek többsége nem hagy fel a kísérletekkel. http://www.csaladinet.hu/hirek/csaladi_temak/allatbarat/1834/allatkiserletek/

2012. 02-22 11.20 SzerkesztőségTény, hogy ma Magyarországon kizárólag illegálisan folyhatnak szépészeti célú állattesztek. Az 1998-as első állatvédelmi törvény kimondja, hogy „szépítőszer, dohány- és egyéb élvezeti cikk, valamint fegyver, ennek alkatrésze, továbbá lőszer előállítása céljából tervezett kísérletre engedély nem adható”.http://tudatosvasarlo.hu/cikk/egy-doboz-kinzasmentest-kerek

FogalmamFogalmam sincssincs, , kiki azaz 5%5%

KeményKemény legénylegény 3%3%

ÉrdekesÉrdekes, , szimpatikusszimpatikus egyéniségegyéniség 22%22%

FantasztikusFantasztikus szakemberszakember lehetlehet 12%12%

EladtaEladta magátmagát a a médiánakmédiának 11%11%

Példa a ”közgondolkodásra”

mi a véleményed Csernus doktorról ?

EladtaEladta magátmagát a a médiánakmédiának 11%11%

Ki nem állhatomKi nem állhatom 36%36%

NemNem tartomtartom hitelesnekhitelesnek 11%11%

A bevezető előadás témakörei

• A tudományos módszer: problémák definiálása és megoldásuk

• A tudományos módszer része: a modellalkotás

• Az orvostudományi modellalkotás gyakorlata:

- a modellalkotás oka és célja

- a modellalkotás (az állatkísérletek) korlátai

- modellek főbb csoportjai az orvostudományi gyakorlatban

Wikipedia: ”Individualdividualss who use thewho use the

1. Kit nevezünk „tudományos” kutatónak ?

Az orvostudományi kutatás elvi alapjai

Wikipedia: ”Individualdividualss who use thewho use thescientific method”

2. A „módszerről” általában

- avagy észlelés, érzékelés és szubjektivitás

It was six men of Indostan To learning much inclined, Who went to see the elephant,

„Blind men and the elephant” John Godfrey Saxe (1816-1887)

Who went to see the elephant, Though all of them were blindThat each by observation Might satisfy his mind.

„Módszerünkkel” tehát hibás eredményeket (is) kaphatunk

And so these men of IndostanDisputed loud and long,Each in his own opinionExceeding stiff and strong.Though each was partly in the rightAnd all were in the wrong

Következtetés

A ”valóság” megismerését lehetővé tevő módszer legyen alkalmas többféle megközelítésre:

- reprodukálhatóságra, - szubjektivitás csökkentésére, kiiktatására - sz.e. kvantitatív leírásra - mérésekre

Többféle megközelítésre alkalmas módszer

Mit tudunk eddig?mások eredményeinek összegzése

Hipotézisjavaslat

Új információ

Eredményekúj adatok elemzése, mérlegelés

Vizsgálatpróba

Új információ

Igaz ? Hamis ?

Többféle megközelítésre alkalmas módszer

Következtetés

A „valóság” megismerését lehetővé tevő módszer legyen alkalmas többféle megközelítésre - és korrekciókra is

A felismerést átadjuk másoknak !

A hipotézis alapú módszer ipotézis alapú módszer -- az az orvostudományiorvostudományi kutatás lényege, alapja

Megfigyelés

Hipotézis*

Predikció

ElfogadomElvetem

*Megjegyzés: hipotézisünk csakis kontrollálható lehet !

Teszt

Az ismeretanyag teljeselfogadása

‘B’ módszer‘A’ módszer

A tudásanyag folyamatos integrálása és korrekciója

A „valóság” megismerését lehetővé tevő módszerek

Nincs örökös érvényű elmélet

elfogadásaintegrálása és korrekciója

„Tudományos” „Nem tudományos”

Változatlan/változhatatlan elmélet

Van tehát egy hipotézisem Van tehát egy hipotézisem -- mit tegyekmit tegyek

1.1. hogy a valóságot ( „igazságot”) megismerjem;hogy a valóságot ( „igazságot”) megismerjem;

2.2. hogy a következtetésem mások számára hogy a következtetésem mások számára tudományosan elfogadható legyen tudományosan elfogadható legyen ??

A mások számára is elfogadható A mások számára is elfogadható következtetések feltétele: a jó modell következtetések feltétele: a jó modell

”A tudomány nem magyaráz, nem interpretál, csak modelleket állít…”

(Neumann János)

Mit nevezünk modellnek ?

1. A valóságos rendszer egyszerűsített, a vizsgálat szempontjából lényegi tulajdonságait kiemelő mása.

2. A világ leírásának, megértésének az eszköze.

A modell legfontosabb jellemzője a jósága:- a „jó” modell használható: kísérletek útján összevetjük a forrásául szolgáló valóságos jelenséggel, azaz- a modell alkalmazásakor méréseket végzünk.

A mérés a tudományos módszerrel történő ismeretszerzés

Modellezési alapfogalmak

A mérés a tudományos módszerrel történő ismeretszerzés legalapvetőbb eleme; minden tudományterület a természet jelenségein végzett mérésekre épít.

Használhatóság és mérések:a „tudományos” modell szükségszerű jellemzői

Mérés: a „nem tudományos” modellnem szükségszerű jellemzője

„2012 második felében hatalmas természeti csapás éri a

Földet. Négy óra leforgása alatt mínusz 40-60 fokra

lehűl a hőmérséklet, és ez a helyzet 2013 májusáig áll

majd fenn.”

A modellalkotás általános érvényű elvei

- Szeparáció- Szelekció- Szelekció- Gazdaságosság

Alapfogalmak

1. Szeparáció: a modellezendő rendszert vagy jelenséget a többitől (külső környezettől, a világtól) el kell különíteni.

2. Szelekció: a modellezés során a megvalósítandó cél szempontjából szelektálni kell (a kölcsönhatások között).

3. Gazdaságosság: a modellnek (a vizsgálat célkitűzésének megfelelve) a lehetőségek közül a legegyszerűbbnek kell lennie.

Occam borotvája: ”Entia non sunt multiplicanda praeter necessitatem" (szükségtelenül ne szaporítsuk a dolgokat, és a redundáns dolgok leválaszthatók - ”Pluralitas non est ponenda sine necessitate”)

1. Következtetés

1. A szeparáció és a szelekció elvéből adódóan a modell a valóság egyszerűsített és hibás képe.

2. Hibás, DE szeparáció és szelekció nélkül a modellalkotás elképzelhetetlen.

A modellezés alapfogalmai

A modell felállításához szükséges információk forrásai:

1. A priori ismeretek: a modellezendő jelenségre vonatkozó, a vizsgálat megkezdésekor rendelkezésre álló ismeretek összessége;

2. A posteriori ismeretek: a modellezési eljárás befejezésével rendelkezésünkre álló ismeretek (előzetes ismeretek + a jelenség megfigyelése során nyert információk összessége).

A modellezés alapfogalmai

Deduktív modellalkotás => kizárólag a priori ismereteket használ

Általános érvényű törvényszerűségekből kiindulva (természettudományos ismeretanyagra támaszkodva) egy konkrét, ismert jelenség leírására törekszik.

Induktív modellalkotás => kizárólag kísérleti adatokra épít

- A kísérletek során végzett megfigyelések információt tartalmaznak a jelenség és annak környezete között érvényesülő kölcsönhatásokról (a rendszer bemenő és kimenő jeleiről)

- A kísérleti vizsgálatok célja a jelenség olyan modelljének felállítása, mely utánozni képes a jelenség tényleges lefolyását.

2. Következtetés2. Következtetés

Az orvostudományi kutatás lényegeAz orvostudományi kutatás lényegea jó modella jó modell

RelevReleváns, jó modelláns, jó modell => „G„Good ood ssciencecience””

A modellek alaptípusai

In vitro modell

In vivo modell

In vitro modellek

• Egész szerv perfúzió

• Szövet superfusio

• Primér sejttenyészet

• Immortalizált sejtvonal tenyészet• Immortalizált sejtvonal tenyészet

• Szubcelluláris vizsgálatok

• Molekuláris vizsgálatok - gén, protein expresszió

Értékes adatokat szolgáltatnak – DE sohasem biztos, hogy ezek pontosan reflektálják az integratív, élő természetet.

In vivo modellek

Humán vizsgálatok

- (általában) nem lehet invazív

- a háttér információk kérdései- a háttér információk kérdései

Nem humán (pl. állati) vizsgálat

- a fenti problémákat megoldja

- DE: nem biztos, hogy az eredmények alkalmazhatók lesznek humán esetekre

In vivo modellek

• Krónikus vizsgálatok

- Problémák: pl. tartósan beültetett eszközök, katéterek, etc. kérdésköre

• Akut vizsgálatok*• Akut vizsgálatok*

- Problémák: pl. anaesthesia hatása

- Eltérések az élettani állapottól

*A patkány élet-idő nem azonos az emberével (!)

- 7 patkány nap ≅ 27 emberi hónap

- 6 patkány óra ≅ 1 emberi hónap (!)

Az eddigiek összefoglalása

A tudományos módszer

Probléma-felvetés

A háttérelemzése

Hipotézismegfogal-mazása

Kísérletekelvégzése

További kísér-letek tervezése

KiértékelésElemzés

Végső következtetés

in vivo, in vitro

humán / nem emberi

�A hipotézis érvényessége (modell) kísérletekkel igazolható

� Kísérleti alaptípus a tárgy alapján élő vagy élettelen (alcsoport: in silico),

� in vivo kísérleti lehetőség: emberi vagy nem emberi (állati vagy növényi) lehet.

letek tervezése Elemzés

Új kísérletekProbléma-megoldás

Analógia

A tudományos módszer alkalmazása a klinikumban

PanaszokAnam-naesis

Differenciál-diagnózis

Vizsgálatok

További Adatok alapjánVégső Kezelés

A módszer ismételt

alkalmazása embereken

Az orvosi döntéshozatal analógiája: az adatgyűjtéstől a betegség kezeléséig

Továbbivizsgálatok a diagnózis

szűkítése

Végső diagnózis

Több lehetőség Csak egylehetőség

Kezelés

1. Az orvos kötelessége az alanyok életének, egészségének, magánélethez

Hogyan lehet alkalmazni a tudományos módszert – azaz a modellalkotást - az orvosi

gyakorlatban, a klinikumban ?

Helsinki Deklaráció (1964)

1. Az orvos kötelessége az alanyok életének, egészségének, magánélethez fűződő jogának, emberi méltóságának oltalmazása.

2. A kutatás feleljen meg az általánosan elfogadott tudományos elveknek.3. A kutatás alapuljon a tudományos irodalom alapos ismeretén.4. A kutatást előzze meg laboratóriumi és állatkísérlet.5. A kutatást meg kell tervezni és világosan megfogalmazott protokoll

szerint kell eljárni.

Szabályozási rendszerekSzabályozási rendszerek

Laboratóriumi eredmények

In vitro

modellek

Állatkísérletek

In vivo

modellek

Emberi (klinikai) vizsgálatok

In vivo modellek

Mi az Mi az élő állatokatélő állatokat igénylő modellalkotás oka ?igénylő modellalkotás oka ?

(Miért végzünk állatkísérleteket?)(Miért végzünk állatkísérleteket?)

MMiért végzünk állatkísérleteket?iért végzünk állatkísérleteket?

� Hogy megfeleljünk a törvények előírásainak

MMiért végzünk állatkísérleteket?iért végzünk állatkísérleteket?

� Mert szükségesek a tudományos módszer alkalmazása –vagyis a jelen (és valószínűleg a jövő) tudományos fejlődése szempontjából.fejlődése szempontjából.

� Mert bizonyos hipotéziseket nem lehet embereken vizsgálni (nem lehet emberi modelleken megoldani)

A tudományos módszer tárgyai az medicinában

� Terápia: veszettség (kutyák, nyulak); angolkór (kutya); lepra (majom, tatu); stb.

� Megelőzés: diftéria (ló); polio (nyúl, majom); � Megelőzés: diftéria (ló); polio (nyúl, majom); bárányhimlő (majom); kanyaró (majom)

� Felfedezés: inzulin (kutya); modern anaesthesia (kutya); DNS (egér, patkány)

� Fejlesztés: laparoszkópos sebészet (disznó); nyitott szívműtét (kutya); stb.

Mi korlátozza az élő állatokat igénylő modellalkotást (azaz az állatkísérleteket) ?

(a morális kérdésektől eltekintve ?)

A legfontosabb korlát: az eredményeeredményekk nem nem minden esetben minden esetben relevánsak relevánsak –– nem mindig nem mindig

alkalmazhatók alkalmazhatók -- humán körülmények között (!)humán körülmények között (!)

(1) Species különbségekCsokoládé (theobromin) toxikus a kutyákraCsokoládé (theobromin) toxikus a kutyákraKortizon teratogén egerekbenInzulin toxikus lehet több állatban (stb.)

(2) Egyes fontos jeleket, bizonyos változásokat nehéz / lehetetlen felismerni (pl. enyhébb fájdalom)

(c) Bizonyos esetekben alternatívák lehetségesek (ld. alább)

A 3 R - Russel & Burch (1959)

(a)(a) Refinement: az állati fájdalom és szenvedés csökkentése(b) Reduction: a kísérletekben felhasznált állatok számának

csökkentése a lehetőségek határáig (pl: az emberi reakcióknak megfelelően, genetikusan módosított állatok használata).

(c) Replacement: az állati modellek helyettesítése más modellekkelmodellekkel

(i) Relatív helyettesítés: olyan kísérletek, melyek teljesen megszüntetik az állati szenvedést, anélkül hogy mindez kizárná a vizsgálatok további folytatását (tökéletes finomítás, absolute

refinement)(ii) Teljes helyettesítés: olyan kísérletek, melyekhez nem szükséges

állati eredetű biológiai anyag

Replacement / helyettesítés

(a) Információ-áramlás fokozása (szükségtelen ismétlések

számának csökkentése) (√)

(b) Computer-alapú rendszerek, matematikai modellezés (?)

(c) Fiziko-kémiai technikák, pl. a kemikáliák irritációs hatását (c) Fiziko-kémiai technikák, pl. a kemikáliák irritációs hatását

előrejelző EYTEX rendszer (Draize teszt helyettesítése), stb. (?)

(d) Alacsonyabb rendű szervezetek (baktériumok, gombák)

alkalmazása (pl. Ames teszt). (?)

(e) Emberi vizsgálatok, pl. önkéntesek, populációk (?)

(f) Sejt, szövet és szerv kultúrák (?)

Mi tehát az állatkísérletek

- vagyis az állatkísérletes modellalkotás –- vagyis az állatkísérletes modellalkotás –

gyakorlati célja ?

Az állatkísérletes modellalkotás célja

� Magának a fajnak, reakcióinak tanulmányozása (állatorvosi kutatás)

� Állati viselkedés kutatása (pl. stressz-tűrő képesség mechanizmusa)

� Nem gyógyszerészeti készítmények tesztelése (pl. toxicitási vizsgálatok)

� Gyógyszerek kipróbálása (pl. in vivo tesztek új gyógyszerek, vaccinák, fázis � Gyógyszerek kipróbálása (pl. in vivo tesztek új gyógyszerek, vaccinák, fázis 2 vizsgálatok)

� Oktatási cél (pl. egyetemi hallgatók)

� Általános biológiai mechanizmusok tanulmányozása

- nem közvetlenül orvosi célú kutatás ( következtetések humán biológiai mechanizmusokra)

- általános orvostudományi cél (pl. rák, AIDS kutatás, xenotranszplantáció)

Általános biológiai mechanizmusok tanulmányozása = alapkutatások

Leíró vizsgálatokLeíró vizsgálatok-- Élettan, kórtanÉlettan, kórtan, , etológiaetológia-- Nincs valódi hipotézisNincs valódi hipotézis => => kísérleti tervezés, kísérleti tervezés,

minőségbiztosítás nehézminőségbiztosítás nehézminőségbiztosítás nehézminőségbiztosítás nehéz

Válaszreakció valamilyen intervenciót követőenVálaszreakció valamilyen intervenciót követően-- Élettan, kórtan, viselkedésÉlettan, kórtan, viselkedés-- A kísérleti tervezés meghatározó fontosságúA kísérleti tervezés meghatározó fontosságú

Biológiai mechanizmusok vizsgálata, állatokat tanulmányozva, megfigyelve, a kapott következtetéseket extrapolálva -

ilyen a legtöbb kísérlet…

• Terápiás - “preklinikai vizsgálatok”• Terápiás - “preklinikai vizsgálatok”

• Toxikológia / beavatkozások biztonsága

• Anatómia, sebészet

• Fertőzések és immunitás

• Daganatos mechanizmusok (kutatás, diagnózis)

• Viselkedés / pszichológia

Miért nem lehetséges (mindig) az extrapoláció?

Mert a fajok közötti összehasonlíthatóság mindig kérdéses lesz…

(kiragadott példa: LD50 értékek, eltérő toxikus szintek, stb…)

Világos következtetések levonására alkalmas, egyszerű modellre van Világos következtetések levonására alkalmas, egyszerű modellre van szükség !

Állati modellek főbb csoportjai

11.. SpontSpontánán modelmodelll

22.. IndIndukált ukált modelmodelll

33.. NegatNegatívív modelmodelll33.. NegatNegatívív modelmodelll

44.. „Egyéb” „Egyéb” modelmodelll

1. Spontán modellekHasonló (azonos) mechanizmusok emberben és állatban

Vizsgált

fajDefektus /

érzékenység

Humán

megfelelőjeMiért

alkalmazzák

Min egér Mutáns apc-gén Fam. adenomatosus polyposis (colon cc)

Azonos emberi végpontpolyposis (colon cc) végpont

Macska Asztma Asztma Azonos patológia

Ír szetter VIII faktor hiány

Hemophilia A Terápiás vizsgálat

Mormota Hepatitis B érzékenység

Hepatitis B Infekció vizsgálat

Tatu

(armadillo)

Lepra Lepra Terápiás vizsgálat

2. Indukált (kiváltott) modellek

Valamilyen manipuláció szükséges

� Viselkedés, pl. stressz – tanulásKérdés: azonos-e az emberi és állati stressz?

� Sebészi beavatkozások, pl. idegek átmetszése, erek elzárásaKérdés: mekkora az eltérés az élettani helyzettől ?

� Genetikai manipulációk, pl. transzgén, knock-out, knock-inKérdés: mekkora az eltérés az élettani helyzettől, mik a genetikai ”előkezelés” nem ismert következményei?

3. Negatív modell

“Miért nem modellek”

�� Miért nemMiért nem……

-- kapnak a kutyák atherosclerosist;kapnak a kutyák atherosclerosist;-- kapnak a kutyák atherosclerosist;kapnak a kutyák atherosclerosist;

-- lesznek AIDSlesznek AIDS--esek a esek a HIVHIV vírussal fertőzött csimpánzok?vírussal fertőzött csimpánzok?

4. “Egyéb” modellek

Jellegzetességek, melyeknek fontos biológiai jelentőségük lehet

- Sertéseknek sok CD4+CD8+ T-sejtjük van- Sertéseknek sok CD4+CD8+ T-sejtjük van

- Kérődzőknek sok γδT-sejtjük van

- Az állati leukosis fertőző

- Mutáció indukció, mint fontos kutatási terület

Az orvostudományi modellalkotás Az orvostudományi modellalkotás alapfeltétele: aalapfeltétele: az állati biológia ismeretealapfeltétele: aalapfeltétele: az állati biológia ismerete

A patkány mint standard modell

EmberEmber JellegzetességJellegzetesség PatkányPatkány

++++ PlaPlazmazma--protein kötésprotein kötés alacsonyalacsony

OrrOrr--szájszáj LégzésLégzés OrrOrr

Kis coecumKis coecum BélflóraBélflóra eltéréseltérés Nagy coecumNagy coecum

SzőrtelenSzőrtelen BőrBőr SzőrösSzőrös

EltérőEltérő TeratogeniTeratogenitástás EltérőEltérő

RitkaRitka AAlbilbinizmusnizmus 95%95%

++ EpehólyagEpehólyag --

Eltérés: albinizmus

� Defektus: tirozináz hiány� Idegrendszeri eltérések

� Fényérzékenység, retina károsodás� Halláscsökkenés� Szövettani eltérések� Szövettani eltérések

� Alacsony P450 aktivitás� Alacsony szérum protein szintek (befolyásolja a

xenobiotikumok reakcióit):� streptomycin, clindamycin, klorokvin, klórpromazin,

nikotin, pilocarpin, serotonin, adrenalin, noradrenalin, dopamin.

Eltérés: viselkedés

• Éjszakai vagy nappal aktív (fordított fény ciklus?)

• Szociális rangsor (természetes viselkedés vagy csak indukciós modell - úsznak-e a patkányok?)indukciós modell - úsznak-e a patkányok?)

• Tigmotropizmus (egymáshoz tapadás) - túlzsúfoltság tenyésztés alatt és kísérletek közben

Eltérés: emésztőrendszer

� Fogak

� Gyomor (üres vagy sem?)

� A táplálék (rosttartalom)

Coecum (coecotropok – koprofágia)� Coecum (coecotropok – koprofágia)

Eltérés: kórélettan

� Betegség jelei (láz vagy hipotermia)� Harder mirigy� Speciális betegségek� Speciális betegségek

Porfirin nyomok az orrnyílás környékén

Eltérés: gyógyszerek reakciói

� A species választás befolyásolja a farmakológiát, toxikológiát, anaesthesiát

� A metabolizmus hőmérséklet függő� Species különbségek gyakran összefüggnek a testfelszínnel

Szalicilátok plazma fél-életideje A trimetoprim fél-életideje

Lehetséges megoldások

1. Allometrikus extrapoláció (Watanabe & Bois. Risk Analysis 16; Watanabe & Bois. Risk Analysis 16; 741741--754: 1996754: 1996; ; K. SchmidtK. Schmidt--Nielsen: Scaling, Cambridge 1984Nielsen: Scaling, Cambridge 1984))

� Y = dosage level� A = species independent scaling coefficient� bw = body weight� B = 1.00 - if Y depends upon body weight

Y AbwB

=

� B = 1.00 - if Y depends upon body weight� B = 0,75 - if Y depends upon metabolic rate� B = 0,67 - if Y depends upon body surface

2. Egyszerű dózis-skálázási faktor a testsúlyhoz viszonyítva (Peters-Volleberg et al. Reg. Tox. Pharmacol. 20;248-258:1994)

Body weight (kg) Scaling factor

Man 60 1Beagle 8 2Monkey 6 2Rabbit 2 3Rat 0,2 5Mouse 0,02 8

Modellek a gyakorlatban = a klinikai Modellek a gyakorlatban = a klinikai gyakorlat modellezésegyakorlat modellezése

1. Szepszis – súlyos, gyakran halálos megbetegedés, főleg a pathomechanizmus tisztázatlanpathomechanizmus tisztázatlan

2. Vérzéses shock – súlyos, gyakran halálos megbetegedés, főképp a kezelési elvek tisztázatlanok

Modellek a gyakorlatban I.

Rágcsáló modellek a humán szepszis vizsgálatára

Áttekintés:

� LPS (endotoxin)

� CLP – coecum lekötés és punctio

� Fecalis inokuláció

� Intravénás baktérium

� Pneumonia

LPS (endotoxin)

�� ElőnyökElőnyök�� EgyszerűEgyszerű –– pl. i.p. pl. i.p. injectinjectio, io, shock 4shock 4--6 6 órán belülórán belül

�� DE:DE:�� AntiAnti--LPS LPS hatékonyhatékony LPS LPS ellen állatokban, de emberekben ellen állatokban, de emberekben

(klinikumban) nem(klinikumban) nem

CLPCLP

�� ElőnyökElőnyök

�� Pl. perforált aPl. perforált appendicitisppendicitishez hasonlóhez hasonló

�� DE:DE:

�� SStandardiztandardizálás nehézálás nehéz

�� Műtétet igényel (behatolás, zárás, felépülés)Műtétet igényel (behatolás, zárás, felépülés)�� Műtétet igényel (behatolás, zárás, felépülés)Műtétet igényel (behatolás, zárás, felépülés)

Fecalis inoculum

� Előny� Standard, konzisztens

� Alkalmazása egyszerű (IP injekció)

� DE� Nincs jelentős trauma

Pneumonia modellek

� Előnyök

� Egyszerű beadni (tracheába vagy az orrba)

� A dózis ellenőrizhető, reprodukálható

� DE

� Esetenként csak helyi reakció (nincs szisztémás gyulladás)

Intravénás baktérium

� Előny

� Könnyű dozírozni

� Szisztémás infekció

� DE� DE

� Gyorsan elpusztul, befolyásolja a gazdaszervezet immunitását

EredményekEredmények(intravénás(intravénás babaktérium és kezelés)ktérium és kezelés)

Kezelés Iv. E. coli

(kísérlet)

Klinikai szepszis

(humán)

Methylprednisolon hatékony1 hatástalan2 / ront3

Anti-TNFα hatékony4 hatástalan5

1Hinshaw et al. Ann Surg 1981;194:51-562VA SSCSG N Eng J Med 1987;317:659-6653Bone et al. N Engl J Med 1987;317:653-6584Tracey et al. Nature 1987;330:662-6645Abraham et al. JAMA1995;273:934-941

Mi lehet a probléma oka ?Mi lehet a probléma oka ?

Jó a modell ? EltérJó a modell ? Eltér--e a valóságtól ?e a valóságtól ?Jó a modell ? EltérJó a modell ? Eltér--e a valóságtól ?e a valóságtól ?

A modellA modell és a valóság 1. és a valóság 1.

Kísérletes szepszisKísérletes szepszis Klinikai szepszisKlinikai szepszis

HomogHomogén genetikai háttér (egy nem)én genetikai háttér (egy nem) HeterogHeterogén (mindig két nem)én (mindig két nem)

BeltenyészetBeltenyészet „„OutbredOutbred””

Eltérő fajok: patkány, kutya, sertésEltérő fajok: patkány, kutya, sertés Homo sapiensHomo sapiens

EgészségesekEgészségesek TársbetegségekTársbetegségek

Fiatal felnőttekFiatal felnőttek Újszülöttek vagy idősekÚjszülöttek vagy idősek

EEndotoxinndotoxin érzékenység eltérőérzékenység eltérő(k(koprooprofáfággiaia//szennyezett környezetszennyezett környezet))

Rendszerint tiszta környezetRendszerint tiszta környezet

A modell és valóság 2.

Kísérletes szepszis Klinikai szepszis

Általában előkezelés Addig nem lehet kezelni, amíg a betegség nincs jelen

Nincs adjuváns kezelés Aktív terápia (folyadék, antibiotikum, inotróp szerek)

Nincs pl. lélegeztetés Lélegeztetés gyakori

A fertőzés leggyakrabban hematogén utón történik

Fészek („nidus”)

Heparin, anesthesia, analgesia Optimális kezelés

Uniform inzultus Helye és mértéke változó

Gyors kialakulás Rendszerint lassú

A vizsgálat ideje standardizált Egyedi lefutás

Különféle végpontok (rendszerint nem a lethalitás)

Klinikai végpontok, szervfunkciók, mortalitás

Modellek a gyakorlatban 2.

A vérzéses shock

Alapvető lehetőségek a vérzés modellezésére

� Ellenőrzött véreztetés (konstans nyomás vagy térfogat)

� Éber vagy altatott

� Nem ellenőrzött vérzés

ÚjraélesztésiÚjraélesztési--kezelési skezelési strattratégiákégiák

A kezelés klinikai lehetőségeiA kezelés klinikai lehetőségei

�� Hipotenziós újraélesztésHipotenziós újraélesztés

Krisztalloid oldatok (pl. sóoldatok)Krisztalloid oldatok (pl. sóoldatok)�� Krisztalloid oldatok (pl. sóoldatok)Krisztalloid oldatok (pl. sóoldatok)

�� Kolloid oldatokKolloid oldatok

�� Hemoglobin sHemoglobin szzubsubsztitúció, teljes vér adásaztitúció, teljes vér adása

�� FrFriss fagyasztottiss fagyasztott pplalazzmama

�� Etc.Etc.

Az állandó nyomás modellWiggers, C.J. The present state of the shock problem. Wiggers, C.J. The present state of the shock problem.

Physiol. Rev. 1942;22:74Physiol. Rev. 1942;22:74--123.123.

• Vérzés az a. femoralis-ból egy nyitott reservoir-ba.

• Az érpálya hidrosztatikai nyomását az előre meghatározott artériás középnyomás (MAP) értékre állítják (MAP=40 Hgmm)

• Újraélesztés meghatározott időben (pl. 60perckor)

Számított vértérfogat = testsúly %-a (≈60 ml vér/tskg).

Vérzés az artéria femoralisból 1 ml/perc sebességgel a 40% vértérfogat eléréséig

Állandó térfogat modell

vértérfogat eléréséig

Reszuszcitáció 60 perckor

Eredmények állandó térfogatú vérvesztés esetén

EsetszámEsetszám SúlySúly (g)(g) OxOxigén igén felhasználásfelhasználásml/min/kgml/min/kg

Túlélés

ml/min/kgml/min/kg

n=n=88 289 289 ±± 1212 ≥ 6≥ 6 +

n=n=1111 298 298 ±± 1616 ≤ 5≤ 5 -

Tanulságok 1.

� A patkányok vértérfogat / testsúly aránya 100 és 400 g között a testsúly növekedésével lineárisan csökken.

� Rágcsálóknál a csoportok közötti kicsiny (pl. 20-30 g)súlykülönbséget nem könnyű felismerni.súlykülönbséget nem könnyű felismerni.

� Arra következtethetünk, hogy a kezelés hatékony, pedig csupán az állatok súlya kissé alacsonyabb a kezeletlen kontrollokhoz képest.

� Rágcsálók esetén a kísérletes protokoll állandó része a testsúly szigorú ellenőrzése (!)

Tanulságok 2.

Ismerni a társ- vagy távoli szakterületek irodalmát (is): a testsúly/vértérfogat következményét leíró eredeti közlemény: Lee, H.B. & Blaufox, MD. J. Nuclear Med. 1985;26:72-76.*

* The use of an arbitrary value of 7% for estimation of blood volume can lead to significant errors in calculating radiopharmaceutical distribution.

The use of the general formula for the blood-volume calculation described here should improve the accuracy and reliability of estimates of radiopharmaceutical distribution.

BV (ml) = 0.06 X BW + 0.77 (r = 0.99, n = 70, p < 0.001). The difference between male and female rats was not statistically significant.

Gainer és mtsai* vizsgálatai

� 280 g-os patkány

Kiindulási O2 felhasználás = 23 ml/perc/kg� 40% vérzés az O2 felhasználást 10 ml/perc/kg-val csökkenti� Vérzés alatt az O2 felhasználás = (23-10) 13 ml/perc/kg� Várhatóan túlélő

� 315 g-os patkány

Kiindulási O2 felhasználás = 15 ml/perc/kg� 40% vérzés az O2 felhasználást 10 ml/perc/kg-val csökkenti� A vérzés alatt az O2 felhasználás = (15-10) 5 ml/perc/kg� Várhatóan nem éli túl a vérzést

* Gainer JL et al. Hemorrhagic shock in rats. Lab Animal Sci 1995; 45(2): 169-172.

További tényezők - az anaesthesia hatása

TanulmányTanulmány Watts et al.Watts et al.11 Custalow et al.Custalow et al.22

AnesthetiAnestheticumcum(mg/kg)(mg/kg)

Éber*Éber* AltatottAltatott

KetKetaminamin// Xylazin (70/3Xylazin (70/3 mg/kg)mg/kg)

SúlySúly (g)(g) 300300--450450 350350--420420

MAP (HgMAP (Hgmmmm)) 40 40 ±± 0.80.8 38 38 ±± 11MAP (HgMAP (Hgmmmm)) 40 40 ±± 0.80.8 38 38 ±± 11

VértérfogatVértérfogat 15.5 15.5 ±± 0.60.6 14 14 ±± 0.40.4

LaLaktátktát 60’60’ 16 16 ±± 0.50.5 7 7 ±± 0.50.5

ArtArt.. pH 60’pH 60’ 7.09 7.09 ±± 0.040.04 7.27 7.27 ±± 0.020.02

* Éber vérzéses modellek csak szigorú feltételek mellett engedélyezhetők* Éber vérzéses modellek csak szigorú feltételek mellett engedélyezhetők1Watts, JA, et al. AJP 2001;281:G498-G5062Custalow, CB, et al., Shock 2001;15(3):231-238

TanulságokÉber vs altatott modellek összefoglalása

� Az anaesthesia jelentősen befolyásolja a központi idegrendszer által irányított autonóm reflexeket.

� Az anaesthesia általában jelentősen befolyásolja (deprimálja) a légzést.

� Bizonyos anaesthetikumok jelentősen befolyásolják (csökkentik) a gyulladást.

Ellenőrzött vs ellenőrizetlen vérzéses modellek összefoglalása

� Állandó nyomás és állandó térfogatú ”ellenőrzött” vérzéses modellekben a kiindulási artériás középnyomás értékekig történő újraélesztés adta a legjobb eredményt (jobb túlélés).

� 1990 évek: az „aggresszív” reszuszcitáció káros lehet, „ellenőrizetlen” vérzéses modellben a hipotenziv újraélesztés jobb eredményeket adott.

N.B. 1918:N.B. 1918: Cannon et al.Cannon et al.:: The preventive treatment of wound shock. J. Am. Med. Assoc. 1918;15:1392The preventive treatment of wound shock. J. Am. Med. Assoc. 1918;15:1392--1395.1395. ““If the pressure is If the pressure is

raised before the surgeon is ready to check the bleeding that may take place, blood that is sorely needed may be lostraised before the surgeon is ready to check the bleeding that may take place, blood that is sorely needed may be lost..

Tanulságok - a Nem szerepe� A legtöbb vizsgálatra hímeket használnak… Azonban:

� Alacsony tesztoszteron és magas ösztradiol védő hatású (és pl. kivédi az immunszuppressziót is (Angle, M.K. et al.: Effect of gender and sex

hormones on immune responses following shock. Shock 2000;14(2):81-90)

� Azóta védőhatást igazoltak (állatokban):� Ivartalanítás� Ivartalanítás� Estradiol� Flutamide (androgén receptor antagonista)� DHEA (ösztrogén agonista)� Etc. esetén

Tanulság: a ‘gyengébbik’ nem jobban tolerálja a traumás vérzést….

A vérzéses modellek tanulságai

�� A (pl. A (pl. 40 Hg40 Hgmmmm--es) középnyomás csökkenésre adott es) középnyomás csökkenésre adott reakció nem uniform (ld. testsúly…).reakció nem uniform (ld. testsúly…).

�� A nem és az altatás befolyásolja a kórlefolyást, a A nem és az altatás befolyásolja a kórlefolyást, a �� A nem és az altatás befolyásolja a kórlefolyást, a A nem és az altatás befolyásolja a kórlefolyást, a súlyosságot is…súlyosságot is…

�� AA vérvesztés (pl. vérvesztés (pl. 40 40 HHggmmmm--es MAP elérése) módja sem es MAP elérése) módja sem mellékes, és a nyomáscsökkenés sebessége is befolyásolja mellékes, és a nyomáscsökkenés sebessége is befolyásolja a vesztett vértérfogatot, különösen éber állapotbana vesztett vértérfogatot, különösen éber állapotban..

A tanulságok összefoglalása

� A hatékony kutatómunkához alapos tervezésre - és az állati modellek korlátainak ismeretére van szükség.

� Meg kell világosan határozni a célt és ezt sohasem szabad túlhaladni:

Élettani jelenség kutatása� Élettani jelenség kutatása� Kórélettani mechanizmus kutatása� Kórélettani változások befolyásolása� Kezelések (pre-klinikai) vizsgálata

A tanulságok összefoglalása

� Minden állatkísérletes vizsgálat legfontosabb eleme(eredményeit és következtetéseit leginkább befolyásolótényezője): a megfelelően tervezett modell.

� Az orvostudományi modellt mindig a klinikai valósághoz viszonyítva kell kialakítani

� Irreleváns, klinikailag nem megfelelő, alkalmatlan modellek→ elhibázott kísérletek → hibás klinikai vizsgálatok →hibás következtetések

Ajánlott irodalomGems of wisdom from Watson and his colleagues that should guide young scientists

in all fields on how to be the best that one can and how to learn from failures

1. Conventional wisdom is often wrong.2. Take real joy in the discoveries of others; what matters most is whether the result

is important.3. "Jim and Francis believed that in order to go fast, you must share information in

the expectation of learning things, rather than withhold it from fear of theft."4. Sometimes, "a beautiful insight could solve a jigsaw puzzle even when the best

solid evidence had been ignored."solid evidence had been ignored."5. There is value in scientific partnerships of equals.6. "Two people are better than one. Otherwise you get in a rut, you can get too fond

of your own ideas, you get the wrong idea, you can't get out of it."7. Young scientists who feel the need to assert their independence should not do it by

cloistering themselves.8. "Rosalind Franklin just needed a collaborator. She didn't have somebody to

break the pattern of her thinking."9. Above all, find the best mentor.

Judah Folkman: Watson and DNA: Making a Scientific Revolution. In Nature Medicine (April 2003)