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Lo studio delle varie conformazioni del DNA
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Separazione dei topoisomeri
Molecole di DNA ccc di una uguale lunghezza e composizione in basi, ma diverso Lk, sono dette topoisomeri.
I topoisomeri possono essere separati in elettroforesi su gel, pur avendo lo stesso rapporto carica/massa. La diversa mobilità è dovuta al loro diverso grado di compattamento (diverso coefficiente d’attrito).
Più la molecola è compatta (DNA superavvolto) più migra velocemente nel gel. Viceversa un cccDNA rilassato migra molto più lentamente di uno fortemente superavvolto.
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Single-strand conformation polymorphisms (SSCP)
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La banda da 229 bp indica l’allele wild type, mentre un allele mutante è indicato dalla banda da 279 bp.
1. Controllo mix2. Controllo omozigote mutato3. Controllo omozigote non mutato4. Campione omozigote non mutato5. Campione eterozigote
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• Stabilità termodinamica del duplex di DNA e suadenaturazione: dipendenza da fattori intrinseci(composizione in basi, peso molecolare) ed estrinseci(temperatura, pH, forza ionica, co-soluti caotropi).
• Cinetiche di rinaturazione del DNA sono funzione dellacomplessità e stabilità della molecola.
STABILITA’ DEL DNA e DENATURAZIONE
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Cinetiche di rinaturazione
In genere la denaturazione termica del DNA in soluzione èun processo molto rapido. Per contro il processo inverso, larinaturazione (riformazione del duplex) in seguito adabbassamento della temperatura, è un processo la cuivelocità (cinetica) può essere estremamente variabile aseconda della natura del DNA all’esame, andando davelocità non molto minori di quelle di denaturazione nelcaso di oligonucleotidi, o DNA costituito da sequenze breviripetute, a velocità talmente basse da richiedere giorni oaddirittura mesi per osservare un grado di rinaturazioneapprezzabile.
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Il fenomeno dell’ipercromismo del DNA.
Le basi del DNA assorbono la luce UV tra 300 e
230 nm (con massimo di assorbimento attorno a
260 nm). Ma l’entità dell’assorbimento a parità di
concentrazione è maggiore di quasi il 50% per il
DNA denaturato rispetto al DNA “nativo”, cioè a
doppia elica. Pertanto misure di assorbimento UV
a 260 nm, facilmente ottenibili con uno spettro-
fotometro, si sono rivelate particolarmente
comode nello studio della denaturazione (e della
rinaturazione) del DNA.
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Gli spettri di assorbimento UV dei singoli nucleotidi sono leggermente diversi l’uno dall’altro, sia come posizione del massimo che come intensità. La banda centrata a 260 nm del DNA è la media pesata per la composizione in basi del dato DNA. Da notare che gli spettri somma delle coppie C:G e A:T sono molto simili, per cui la composizione di un DNA duplex influisce molto poco sull’assorbimento del DNA.
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ANALISI FISICA
Effetto ipercromico:Aumento dell’A260nm durante il processo di denaturazione del DNA.
Temperatura di melting (Tm):Temperatura in corrispondenza della quale il DNA è denaturato al 50%.
Maggiore è G+C, maggiore è Tm.
Gra
do
di dena
tura
zione
(%)
40 60 80 100
50
0
1.3
1.2
1.1
1.0
Temperatura (°C)
Ass
orbanz
a a
260 n
m
Tm
Curva di fusione
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Effetto ipercromicoL’assorbimento di luce UV a 260 nm da parte del DNA permette di seguirne la denaturazione termica.Infatti le basi nella doppia elica hanno coefficiente di assorbimento della luce minore che nello stato a singolo filamento, a causa dello stacking delle basi.La transizione è cooperativa e il punto di mezzo Tm è detto temperatura di fusione (melting).
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CINETICA di RINATURAZIONE
Effetto ipocromico:
Diminuzione dell’A260nm durante il processo di rinaturazione del DNA.
Parametri che influenzano la rinaturazione:
1) C0 Concentrazione espressa in nucleotidi/unità di volume
2) Tempo
La misura della velocità di rinaturazione può fornire utili informazioni circa la complessità del DNA
Log Cot
Rinatu
razione
(%)
DNA arinaturazionerapida
0
50
100
-2 -1 0 1 2 3 4 5
Curva C0t
DNA arinaturazionelenta
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Human DNA
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RIASSUMENDO…………
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Transizione duplex-triplex
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APTAMERO PER L’a-TROMBINA
Organizzazione strutturale dell’aptamero per l’a-trombina e disposizione dei quartetti di guanina che ne stabilizzano la conformazione
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Quadruplex picchi positivi a 270 e a 290 nm
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Dicroismo circolare
• Il Dicroismo circolare è la differenza tra la luce destra e sinistra circolarmente polarizzata ed è misurata in funzione della lunghezza d’onda
• La differenza tra l’assorbimento a destra e quello a sinistra dà il dicroismo circolare
• L’analisi di spettri CD dà importanti informazioni sulla struttura secondaria di molecole come proteine e acidi nucleici.