n

LỜI CẢM ƠN

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Vũ Nguyên Thành, Giám đốc

Trung tâm Vi sinh vật công nghiệp, Viện Công nghiệp thực phẩm và PGS. TS. Bùi

Thị Việt Hà, Chủ nhiệm bộ môn Vi sinh vật học, Khoa sinh học, trường Đại học

Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt

thời gian thực hiện luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán bộ Trung tâm Vi sinh vật công

nghiệp, Viện Công nghiệp thực phẩm đã tạo điều kiện và chỉ bảo cho tôi để tôi có

thể hoàn thành luận văn này.

Để có được ngày hôm nay tôi không thể quên được sự dìu dắt tận tình cùng

những kiến thức quý báu mà các thầy cô trong bộ môn Vi sinh vật học và các thầy

cô trong khoa Sinh học đã truyền dạy cho tôi trong suốt hai năm học tập tại trường.

Tôi cũng xin dành tình cảm cho gia đình,bạn bè những người đã ở bên động

viên, chia sẻ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian vừa qua.

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Học viên

Hàn Thị Thu Hương

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 9

CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 10

1.1. Lignocellulose và enzyme thủy phân lignocellulose ............................................. 10

1.1.1. Lignocellulose .................................................................................................. 10

1.1.1.1. Cellulose .................................................... Error! Bookmark not defined.

1.1.1.2. Hemicellulose ............................................ Error! Bookmark not defined.

1.1.1.3. Lignin ........................................................ Error! Bookmark not defined.

1.1.2. Enzyme thủy phân lignocellulose .................... Error! Bookmark not defined.

1.1.2.1. Cellullase ................................................... Error! Bookmark not defined.

1.1.2.2. Hemicellulase ............................................ Error! Bookmark not defined.

1.1.2.3. Ligninase ................................................... Error! Bookmark not defined.

1.2. Nấm mốc chịu nhiệt và khả năng thủy phân lignocelluloseError! Bookmark not defined.

1.2.1. Nấm mốc chịu nhiệt ......................................... Error! Bookmark not defined.

1.2.1.1. Đặc điểm nhóm nấm mốc chịu nhiệt ......... Error! Bookmark not defined.

1.2.1.2. Một số nhóm nấm mốc chịu nhiệt phổ biếnError! Bookmark not defined.

1.2.2. Khả năng thủy phân lignocellulose của nấm mốc chịu nhiệtError! Bookmark not defined.

1.2.2.1. Hoạt tính cellulase ..................................... Error! Bookmark not defined.

1.2.2.2. Hoạt tính xylanase ..................................... Error! Bookmark not defined.

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined.

2.1. Đối tượng ............................................................... Error! Bookmark not defined.

2.2. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc ............ Error! Bookmark not defined.

2.2.1. Hóa chất ........................................................... Error! Bookmark not defined.

2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc ................. Error! Bookmark not defined.

2.3. Thành phần các môi trường sử dụng trong nghiên cứuError! Bookmark not defined.

2.3.1. Môi trường Malt-glucose 2°Bx có bổ sung chloramphenicolError! Bookmark not defined.

2.3.2. Môi trường PDA .............................................. Error! Bookmark not defined.

2.3.3. Môi trường lên men lỏng ................................. Error! Bookmark not defined.

2.3.4. Môi trường YM................................................ Error! Bookmark not defined.

2.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................ Error! Bookmark not defined.

2.4.1. Phương pháp phân lập nấm mốc chịu nhiệt ..... Error! Bookmark not defined.

2.4.2. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào ................ Error! Bookmark not defined.

2.4.3. Tách chiết enzyme ........................................... Error! Bookmark not defined.

2.4.4. Xác định hoạt tính cellulase bằng DNS ........... Error! Bookmark not defined.

2.4.5. Xác định hoạt tính CMCase, xylanase theo phương pháp DNSError! Bookmark not defined.

2.4.6. Điện di protein ................................................. Error! Bookmark not defined.

2.4.6.1. Phương pháp điện di SDS-PAGE ............. Error! Bookmark not defined.

2.4.6.2. Phương pháp điện di Zymogram ............... Error! Bookmark not defined.

2.4.7. Phương pháp tách chiết ADN tế bào nấm mốc Error! Bookmark not defined.

2.4.8. Phương pháp tinh chế ADN ............................. Error! Bookmark not defined.

2.4.9. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR finger printingError! Bookmark not defined.

2.4.10. Phương pháp điện di ADN ............................ Error! Bookmark not defined.

2.4.11. Nhuộm gel và đọc kết quả ............................. Error! Bookmark not defined.

2.4.12. Phương pháp phân loại nấm mốc dựa vào đọc trình tự rDNAError! Bookmark not defined.

Chƣơng 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬNError! Bookmark not defined.

3.1. Kết quả phân lập, phân nhóm và định tên các chủng nấm mốc chịu nhiệtError! Bookmark not defined.

3.1.1. Kết quả phân lập .............................................. Error! Bookmark not defined.

3.1.2. Hình thái khuẩn lạc, tế bào .............................. Error! Bookmark not defined.

3.1.3. Phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting ......... Error! Bookmark not defined.

3.1.4. Định tên các chủng nấm mốc dựa vào phương pháp đọc trình tự rDNAError! Bookmark not defined.

3.2. Đặc tính của các chủng nấm mốc chịu nhiệt đã phân lậpError! Bookmark not defined.

3.2.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme thủy phân lignocelluloseError! Bookmark not defined.

3.2.2. Phân tích hệ protein và hệ enzyme thủy phân lignoceluloseError! Bookmark not defined.

3.2.3. Kiểm tra khả năng hoạt động enzyme ở các pH khác nhauError! Bookmark not defined.

3.2.4. Kiểm tra khả năng bền nhiệt của enzyme ........ Error! Bookmark not defined.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................... Error! Bookmark not defined.

KẾT LUẬN................................................................ Error! Bookmark not defined.

KIẾN NGHỊ ............................................................... Error! Bookmark not defined.

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 11

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin trong phế phụ phẩm nông

nghiệp phổ biến và rác thải

Bảng 1.2. Tổng quan về ba nhóm enzyme cellulase nấm mốc và các đặc tính của

chúng

Bảng 1.3. Một số enzym hemicellulase và phân loại của chúng vào họ GH và CE

Bảng 2.1. Thành phần gel chạy điện di protein

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR fingerprinting

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS

Bảng 3.1. Danh sách các chủng nấm mốc phân lập được

Bảng 3.2. Ký hiệu các chủng trong phổ fingerprinting

Bảng 3.3. Tên phân loại của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt

Bảng 3.4. Hoạt tính cellulase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt

Bảng 3.5. Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt

Bảng 3.6. Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt

Bảng 3.7. Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc ở pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0

Bảng 3.8. Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc ở pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0

Bảng 3.9. Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc sau khi giữ ở nhiệt độ phòng

và 70˚C 20 phút

Bảng 3.10. Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc sau khi giữ ở nhiệt độ phòng

và 70˚C 20 phút

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc lignocellulose

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử cellulose

Hình 1.3. Cấu trúc arabino-4-O-methylglucuronoxylan trong cây gỗ mềm

Hình 1.4. Cấu trúc O-acetyl-4-O-methylglucurono-ß-D-xylan trong cây gỗ cứng

Hình 1.5. Khuẩn lạc và tế bào chủng Aspergillus fumigatus

Hình 1.6. Khuẩn lạc và tế bào chủng Rhizomucor pusillus

Hình 1.7. Khuẩn lạc và tế bào chủng Thermomyces lanuginosus

Hình 1.8. Khuẩn lạc và tế bào chủng Scytalidium thermophilum

Hình 3.1. Khuân lac va tê bao chung FCH 5.1

Hình 3.2. Khuân lac va tê bao chung FCH 5.3

Hình 3.3. Khuân lac và tế bào chủng FCH 5.5

Hình 3.4. Khuân lac và tế bào chủng FCH 10.4

Hình 3.5. Khuân lac va tê bao chung FCH 112.2

Hình 3.6. Khuân lac và tế bào chủng FCH 23.1

Hình 3.7. Phổ fingerprinting của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt

Hình 3.8. Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt

Hình 3.9. Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt

Hình 3.10. Ảnh điện di SDS-PAGE và zymogram CMC, xylan của 46 chủng nấm

mốc chịu nhiệt

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Bp: Base pair (cặp bazơ)

CBH: Cellobiohydrolase

CBM: Carbohydrate-binding module

CE: Carbohydrate esterase

CMC: Carboxymethyl cellulose

dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate

DNS: Dinitrosalicylic acid

EG: Endoglucanase

FPU: Filter paper unit

GH: Glycoside hydrolase

ITS: Internal transcribed spacer

PCR: Polymerase chain reaction (kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase)

PDA: Potato Dextrose Agar

SDS- PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

MỞ ĐẦU

Sự gia tăng tiêu thụ năng lượng, cạn kiệt nhiên liệu hóa thạch và ô nhiễm

môi trường đã chuyển trọng tâm của thế hệ năng lượng theo hướng sử dụng nhiên

liệu sinh học với nguyên liệu là chất thải giàu lignocellulose của các ngành lâm

nghiệp, công nghiệp giấy và bột giấy, nông nghiệp và thực phẩm, rác thải đô thị rắn

và chất thải động vật. Sản xuất nhiên liệu từ sinh khối lignocellulose, với thành

phần chủ yếu là cellulose và hemicellulose sẽ tạo tiền đề cho sự phát triển bền vững.

Mặc dù mang nhiều hứa hẹn, công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học từ

lignocellulose hiện nay vẫn chưa khả thi trong sản xuất thương mại. Vấn đề cốt lõi

nằm ở tính bền vững của lignocellulose. Với hầu hết các công nghệ hiện hành,

lignocellulose trước tiên cần được thủy phân thành các monomer để tạo tiền chất

cho chuyển hóa sinh học hoặc hóa học. Trong công đoạn này, enzyme thủy phân

lignocellulose thường được sử dụng. Tuy nhiên, với các hệ enzyme hiện có, quá

trình thủy phân chưa thực sự hiệu quả về mặt kinh tế. Việc tìm kiếm các hệ enzyme

hiệu quả hơn đang được quan tâm đặc biệt.

Ngoài ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học, enzyme thủy phân

lignocellulose còn có nhiều ứng dụng thực tiễn trong chế biến nông sản, thực phẩm,

trong chăn nuôi, công nghiệp giấy, trong sản xuất hóa chất, xử lý môi trường. Nội

dung của đề tài nằm trong nỗ lực dài hạn nhằm khai thác đa dạng vi sinh vật nhiệt

đới cho các ứng dụng công nghệ sinh học khác nhau, trong trường hợp này là tìm

kiếm các enzyme thủy phân lignocellulose mới từ nấm mốc chịu nhiệt, nhóm vi

sinh vật rất ít được nghiên cứu tại Việt Nam.

CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Lignocellulose và enzyme thủy phân lignocellulose

1.1.1. Lignocellulose

Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và các thực

vật khác như cỏ, lúa, ngô… Lignocellulose có cấu trúc vững chắc, dày đặc rất khó

để phân cắt với thành phần chủ yếu gồm hai polymer mạch thẳng là cellulose,

hemicellulose và một polymer có cấu trúc ba chiều là lignin, trong đó cellulose

được bao quanh bởi các phân tử hemicellulose và lignin (Hình1.1) [41].

Hình 1.1. Cấu trúc lignocellulose (Geert Potters 2010).

Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khác

nhau còn lignin là polymer của các phân tử dạng vòng được tổng hợp từ tiền

phenylpropanoid. Thành phần cấu tạo và phần trăm của các polymer này khác nhau

giữa các loài, thậm chí khác biệt giữa các độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Hồ Sĩ Tráng (2006), Cơ sở hóa học gỗ và cellulose, Nhà xuất bản khoa học và kĩ

thuật, Hà Nội.

2. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyme, NXB đại học quốc gia TP. Hồ

Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh.

Tiếng Anh

3. Almeida Elzira Maria, Maria de Lourdes T.M. Polizeli, Héctor Francisco Terenzi

andJoão Atilio Jorge (1995), “Purification and biochemical characterization

of β-xylosidase from Humicola grisea var. thermoidea”, FEMS

Microbiology Letters, 130, pp. 171–176.

4. Anand L, Krishnamurthy S, Vithayathil PJ (1990), “Purification and properties of

xylanase from the thermophilic fungus, Humicola lanuginosa (Griffon and

Maublanc) Bunce”, Archives of Biochemistry and Biophysics, 276(2), pp.

546-553.

5. Anthi Karnaouri, Evangelos Topakas, Io Antonopoulou, Paul Christakopoulos

(2014), “Genomic insights into the fungal lignocellulolytic system of

Myceliophthora thermophila”, Frontiers in Microbiology, 5: 281.

6. Anthony Levasseur, Elodie Drula, Vincent Lombard, Pedro M Coutinho and

Bernard Henrissat (2013), “Expansion of the enzymatic repertoire of the

CAZy database to integrate auxiliary redox enzymes”, Biotechnology for

Biofuels, 6(1), pp. 1-2.

7. Armand S, Drouillard S, Schülein M, Henrissat B, Driguez H (1997) “A

bifunctionalized fluorogenic tetrasaccharide as a substrate to study

cellulases”, The Journal of Biological Chemistry, 272(5), pp. 2709-2713.

8. Baldrian P, Valaskova V. (2008), “Degradation of cellulose by basidiomycetous

fungi”, FEMS Microbiology Reviews, 32(3), pp. 501–521.

9. Bayer EA, Chanzy H, Lamed R, Shoham Y. (1998), “Cellulose, cellulases and

cellulosome”, Current Opinion in Structural Biology, 8(5), pp. 548–557.

10. Bernard Henrissat (1991), ” A classification of glycosyl hydrolases based on

amino acid sequence similarities”, Biochemical Journal, 280, pp. 309-316.

11. Bernard Henrissat and Amos Bairoch (1993), “New families in the classification

of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities”,

Biochemical Journal, 293, pp. 781-788.

12. Bernard Henrissat and Amos Bairoch (1996), “Updating the sequence-based

classification of glycosyl hydrolases”, Biochemical Journal, 316, pp. 695-

696.

13. Bhat MK, Bhat S (1997), “Cellulose degrading enzymes and their potential

industrial applications”, Biotechnology Advances, 15(3-4), pp. 583-620.

14. Bhat MK, Bhat S (1998), “Clostridium thermocellum cellulosome: dissociation,

isolation and characterisation of subunits and the potential biotechnological

implications”, Recent Res Devel Biotech Bioeng, 1(1), pp. 59-84.

15. Bhat MK, Joel Solomon Gaikwad and Ramesh Maheshwari (1993),

“Purification and characterization of an extracellular β-glucosidase from the

thermophilic fungus Sporotrichum thermophile and its influence on cellulase

activity”, General Microbiology, 139, pp. 2825–2832.

16. Bhat MK, R. Maheshwari (1987), “Sporotrichum thermophile: growth, cellulose

degradation, and cellulase activity”, Applied and Environmental

Microbiology, 53, pp. 2175–2182.

17. Boisset C, Fraschini C, Schülein M, Henrissat B, Chanzy H (2000), “Imaging

the enzymatic digestion of bacterial cellulose ribbons reveals the endo

character of the cellobiohydrolase Cel6A from Humicola insolens and its

mode of synergy with cellobiohydrolase Cel7A”, Applied and Environmental

Microbiology, 66(4), pp. 1444-1452.

18. Brandi L. Cantarel, Pedro M. Coutinho, Corinne Rancurel, Thomas Bernard,

Vincent Lombard and Bernard Henrissat (2009), “The Carbohydrate-Active

EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics”, Nucleic

Acids Research, 37, pp. 233–238.

19. Cai YJ, Chapman SJ, Buswell JA, Chang ST (1999), “Production and

distribution of endoglucanase, cellobiohydrolase, and beta-glucosidase

components of the cellulolytic system of Volvariella volvacea, the edible

straw mushroom”, Appl Environ Microbiol, 65(2), pp. 553-559.

20. Cao WG, Crawford DL (1993), “Purification and some properties of β-

glucosidase from the ectomycorrhizal fungus Pisolithus tinctorius strain

SMF”, Canadian Journal of Microbiology, 39(1), pp. 125-129.

21. Christine S. Evans (1985), “Properties of the beta-D-glucosidase (cellobiase)

from the wood-rotting fungus, Coriolus versicolor”, Applied Microbiology

and Biotechnology, 22(2), pp 128-131.

22. Coutts A D and Smith R E (1976), “Factors influencing the production of

cellulases by Sporotrichum thermophile”, Appl Environ Microbiol, 31(6), pp.

819–825.

23. Dalia Shallom, Yuval Shoham (2003), “Microbial hemicellulase”, Current

Opinion in Microbiology, 6(3), pp. 219–228.

24. Dan S, Marton I, Dekel M, Bravdo BA, He S, Withers SG, Shoseyov O (2000),

“Cloning, expression, characterization, and nucleophile identification of

family 3, Aspergillus niger beta-glucosidase”, J Biol Chem, 275(7), pp.

4973-4980.

25. de Vries RP, Kester HCM, Poulsen CH, Benen JAE, Visser J (2000), „Synergy

between enzymes from Aspergillus involved in the degradation of plant cell

wall polysaccharides”, Carbohydrate Research, 327(4), pp. 401-410.

26. Divne C, Stahlberg J, Teeri TT, Jones TA (1998), “High-resolution crystal

structures reveal how a cellulose chain is bound in the 50 A long tunnel of

cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei”, J Mol Biol, 275(2), pp. 309–

325.

27. E.M Düsterhöft, V.A.J.M Linssen, A.G.J Voragen, G Beldman (1997),

“Purification, characterization, and properties of two xylanases from

Humicola insolens”, Enzyme and Microbial Technology, 20(6), pp. 437–445.

28. Eriksen J, Goksoyr J. (1997), “Cellulases from Chaetomium thermophile var.

dissitum”, Eur J Biochem, 77 (3), pp. 445-50.

29. Fengel, D., Wegener, G. (1989) Wood: Chemistry, Ultrastructure, Reactions,

Walter de Gruyter, Berlin, Germany.

30. Folan M. A., and M. P. Coughlan (1978), “The cellulase complex in the culture

filtrate of the thermophyllic fungus, Talaromyces emersonii”, International

Journal of Biochemistry, 9, pp. 717–722.

31. Foreman PK, Brown D, Dankmeyer L, Dean R, Diener S, Dunn-Coleman NS,

Goedegebuur F, Houfek TD, England GJ, Kelley AS, Meerman HJ, Mitchell

T, Mitchinson C, Olivares HA, Teunissen PJ, Yao J, Ward M (2003), “

Transcriptional regulation of biomass-degrading enzymes in the filamentous

fungus Trichoderma reesei”, J Biol Chem, 278(34), pp. 31988–31997.

32. Gaikwad, J. S., and R. Maheshwari. (1994), “Localization and release of β-

glucosidase in the thermophilic and cellulolytic fungus, Sporotrichum

thermophile”, Experimental Mycology, 18, pp. 300–310.

33. Ganju, R. K. (1986), Isolation and characterization of polysaccharide

degrading enzymes of Chaetomium thermophile var. coprophile, Ph.D.

thesis, Indian Institute of Science, Bangalore.

34. Gerben Straatsma, Robert A. Samson (1993), “Taxonomy of Scytalidium

thermophilum, an important thermophilic fungus in mushroom compost”,

Mycological Research, 97(3), pp. 321–328.

35. Gilbert M, Breuil C, Yaguchi M, Saddler JN (1992), “Purification and

characterization of a xylanase from the thermophilic ascomycete Thelavia

terrestris 255B”, Appl Biochem Biotechnol, 34-35, pp. 247-59.

36. Gilbert M, Yaguchi M, Watson DC, Wong KK, Breuil C, Saddler JN (1993), “A

comparison of two xylanases from the thermophilic fungi Thielavia terrestris

and Thermoascus crustaceus”, Appl Microbiol Biotechnol, 40(4), pp. 508-14.

37. G. Canevascini, M.-R. Coudray, R. J. G. Southgate and H. Meier (1978),

“Induction and catabolite repression of cellulase synthesis in the

thermophilic fungus Sporotrichum thermophile”, J. Gen. Microbiol, 110, pp.

91–303.

38. Hajime Yoshioka; Shinsaku Hayashida (1980), “Purification and properties of

β-glucosidase from Humicola insolens YH-8”, Agricultural and Biological

Chemistry, 44 (8), pp. 1729-1735.

39. Hayashida S., Yoshioka H. (1980), “Production and purification of thermostable

cellulases from Humicola insolens YH-8”, Agricultural & Biological

Chemistry, 44, pp. 1721–1728.

40. Hervé C, Rogowski A, Blake A, Marcus S, Gilbert H, Knox J (2010),

“Carbohydrate-binding modules promote the enzymatic deconstruction of

intact plant cell walls by targeting and proximity effects”, Proc Natl Acad Sci

U S A, 107(34), pp. 15293-15298.

41. Howard R.L, Abotsi E, Jansen van Rensburg E.L and Howard S (2003),

“Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme

production”, African Journal of Biotechnology, 2(12), pp. 602-619.

42. Ishikawa E, Sakai T, Ikemura H, Matsumoto K, Abe H (2005), “Identification,

cloning, and characterization of a Sporobolomyces singularis beta-

galactosidase-like enzyme involved in galacto-oligosaccharide production”, J

Biosci Bioeng, 99(4), pp. 331-339.

43. Jonny Eriksen, Jostein Goksöyr (1976), “The effect of temperature on growth

and cellulase (β-1,4-endoglucanase) production in the compost fungus

Chaetomium thermophile var.dissitum”, Archives of Microbiology, 110(2-3),

pp. 233-238.

44. Kawamori Mikio, Takayama Kenichiro and Seigo Takasawa (1987),

“Production of cellulases by a thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus

A-131”, Agric. Biol. Chem, 51, pp. 647–654.

45. Khandke KM (1986), Isolation and functional characteristics of xylanases and

cellulases of Thermoascus aurantiacus, Ph.D. thesis, Indian Institute of

Science, Bangalore.

46. Khandke KM, Vithayathil PJ, Murthy SK (1989), “Purification of xylanase,

beta-glucosidase, endocellulase, and exocellulase from a thermophilic

fungus, Thermoascus aurantiacus”, Arch Biochem Biophys, 274(2), pp. 491-

500.

47. Kubicek CP (1981), “Release of carboxymethyl-cellulase and β-glucosidase

from cell walls of Trichoderma reesei”, European journal of applied

microbiology and biotechnology, 13(4), pp. 226-231.

48. K. Ashok Prabhu, Ramesh Maheshwari (1999), “Biochemical properties of

xylanases from a thermophilic fungus,Melanocarpus albomyces, and their

action on plant cell walls”, Journal of Biosciences, 24(4), pp. 461-470.

49. Lindt Wilhelm (1886), “Mitteilungen u ¨ber einige neue pathogene

Shimmelpilze”, Arch. Exp. Pathol. Pharmakol., 21, pp. 269–298.

50. Lo Leggio, L., S. Kalogiannis,M. K. Bhat, and R.W. Pickersgill (1999), “High

resolution structure and sequence of T. aurantiacus xylanase I: implications

for the evolution of thermostability in family 10 xylanases and enzymes with

βα-barrel architecture”, Proteins Struct. Funct. Genet., 36, pp. 295–306.

51. Mandels M (1975), “Microbial sources of cellulase”, Biotechnol Bioeng Symp,

5, pp. 81-105.

52. Matsuo, Masaru, Yasui, Tsuneo (1985), “Properties of xylanase of Malbranchea

pulchella var. sulfurea no. 48”, Agricultural and Biological Chemistry, 49,

pp. 839–841.

53. Mehdi Dashtban, Heidi Schraft, Wensheng Qin (2009), “Fungal bioconversion

of lignocellulosic residues - opportunities and perspectives”, Int J Biol Sci,

5(6), pp. 578-595.

54. Morais H, Ramos C, Matos N, Forgacs E, Cserhati T, Almeida V, Oliveira J,

Darwish Y, Iles Z (2002), “Liquid chromatographic and electrophoretic

characterisation of extracellular beta-glucosidase of Pleurotus ostreatus

grown in organic waste”, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,

770(1-2), pp. 111-119.

55. Peter Biely (1985), “Microbial xylanolytic systems”, Trends in Biotechnology,

3(11), pp. 286–290.

56. Raj Kumar Salar and K.R. Aneja (2007), “Thermophilic Fungi: Taxonomy and

Biogeography”, Journal of Agricultural Technology, 3(1), pp. 77-107.

57. Ramesh K. Ganju, Paul J. Vithayathil, S. K. Murthy (1989), “Purification and

characterization of two xylanases from Chaetomium thermophile var.

coprophile”, Canadian Journal of Microbiology, 35(9), pp. 836-842.

58. Ramesh Maheshwari, Girish Bharadwaj, and Mahalingeshwara K. Bhat (2000),

“Thermophilic Fungi: Their Physiology and Enzymes”, Microbiol Mol Biol

Reviews, 64(3), pp. 461–488.

59. Robert J. Moon, Ashlie Martini, John Nairn, John Simonsenf and Jeff

Youngblood (2011), “Cellulose nanomaterials review: structure, properties

and nanocomposites”, Chem. Soc. Rev., 40, 3941–3994.

60. Rubens Monti, Héctor Francisco Terenzi, João Atílio Jorge (1991), “Purification

and properties of an extracellular xylanase from the thermophilic fungus

Humicola grisea var. thermoidea”, Canadian Journal of Microbiology,

37(9), pp. 675-6821.

61. Sandgren M, Stahlberg J, Mitchinson C. (2005), “Structural and biochemical

studies of GH family 12 cellulases: improved thermal stability, and ligand

complexes”, Prog Biophys Mol Biol, 89 (3), pp. 246-291.

62. Scheller HV, Ulvskov P (2010), “Hemicelluloses”, Annual Review of Plant

Biology, 61(1), pp. 263-289.

63. Sjöström, E. (1993), Wood Chemistry: Fundamentals and Applications, 2nd

edition, Academic Press, San Diego, CA, USA.

64. Shepherd MG, Tong CC, Cole AL (1981), “Substrate specificity and mode of

action of the cellulases from the thermophilic fungus Thermoascus

aurantiacus”, Biochem J., 193 (1), pp. 67-74.

65. Shinsaku Hayashida and Kaiguo Mo (1986), “Production and Characteristics of

Avicel-Disintegrating Endoglucanase from a Protease-Negative Humicola

grisea var. thermoidea Mutant”, Appl Environ Microbiol, 51 (5), pp. 1041–

1046.

66. Sternberg D (1976), “Beta-glucosidase of Trichoderma: its biosynthesis and role

in saccharification of cellulose”, Appl Environ Microbiol, 31(5), pp. 648–

654.

67. Tuohy MG, Puls J, Claeyssens M, Vrsanská M, Coughlan MP (1993), “The

xylan-degrading enzyme system of Talaromyces emersonii: novel enzymes

with activity against aryl beta-D-xylosides and unsubstituted xylans”,

Biochem J., 290 ( 2), pp. 515-523.

68. Vladimır Puchart, Petros Katapodis, Peter Biely, Lubomır Kremnický, Paul

Christakopoulos,Mária Vršanská, Dimitris Kekos, Basil J

Macris,Mahalingeshwara K Bhat (1999), “Production of xylanases,

mannanases, and pectinases by the thermophilic fungus Thermomyces

lanuginosus”, Enzyme and Microbial Technology, 24 (5–6), pp. 355–361.

69. Yoshioka Hajime, Anraku Shinichiro and Shinshaku Hayashida (1982),

“Production and purification of a novel type of CMCase from Humicola

grisea var. thermoidea YH-78”, Agricultural and Biological Chemistry,

46(1), pp. 75-82.