lỜi cẢm Ơn Ứ - gust.edu.vngust.edu.vn/media/27/uftai-ve-tai-day27326.pdf · trƣớc hết,...

LỜI CẢM ƠN

Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Đình Hùng -

Trƣởng phòng Công nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng

Công nghệ Nha Trang, ngƣời đã giúp tôi chọn đề tài và tận tình hƣớng dẫn,

giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Và tôi cũng xin chân

thành cảm ơn Ths Đinh Thành Trung - Phòng Công nghệ sinh học biển - Viện

Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, ngƣời đã giúp tôi hoàn thành

tốt phần thực nghiệm của mình.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công

nghệ, Phòng Đào tạo, Khoa Hóa học và Quý Thầy Cô giáo đã dạy dỗ và tạo

mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn cũng nhƣ hoàn thành mọi

thủ tục cần thiết.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng

Công nghệ Nha Trang đã giúp đỡ và tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tôi thực

hiện luận văn.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô giáo Viện Nghiên cứu và

Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Trƣờng Đại học Nha Trang, Trƣờng Đại

học Khánh Hòa đã dạy dỗ, cung cấp nhiều kiến thức bổ ích và tạo mọi điều

kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập.

Và cuối cùng, tôi xin cảm ơn Sở Giáo dục và Đào tạo Tỉnh Khánh Hòa,

Trƣờng THPT Chuyên Lê Quý Đôn – Nha Trang đã tạo điều kiện để tôi có

thể hoàn thành khóa học sau đại học tại Học viện Khoa học và Công nghệ.

Xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày 09 tháng 09 năm 2019

Học viên

Trần Thị Hải Yến

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng

dẫn, chỉ bảo của Thầy hƣớng dẫn và sự giúp đỡ của cán bộ phòng Công nghệ

sinh học biển - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang. Các số

liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên.

Nha Trang, ngày 09 tháng 09 năm 2019

Học viên

Trần Thị Hải Yến

1

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 9

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................ 12

1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN ........................................................ 12

1.2. TỔNG QUAN VỀ LECTIN ............................................................... 14

1.2.1. Lịch sử nghiên cứu lectin ............................................................. 14

1.2.2. Sự phân bố lectin trong sinh giới .................................................. 16

1.2.3. Vai trò sinh học của lectin ............................................................ 18

1.3. LECTIN TỪ RONG BIỂN ................................................................. 19

1.3.1. Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trên thế giới .................. 19

1.3.1.1. Các phƣơng pháp tinh chế lectin từ rong biển ......................... 19

1.3.1.2. Đặc tính liên kết carbohydrate của lectin ................................ 21

1.3.1.3. Điểm đẳng điện và hàm lƣợng acid amin của lectin từ rong

biển. .................................................................................................... 23

1.3.1.4. Ảnh hƣởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính của lectin từ rong

biển. .................................................................................................... 24

1.3.1.5. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt tính của lectin rong biển

............................................................................................................ 25

1.3.1.6. Hàm lƣợng carbohydrate trong lectin từ rong biển.................. 25

1.3.1.7. Trọng lƣợng phân tử của lectin từ rong biển. .......................... 25

1.3.1.8. Cấu trúc của lectin từ rong biển. ............................................. 26

1.3.1.9. Ứng dụng của lectin từ rong biển ............................................ 29

1.3.2. Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nƣớc .................... 32

2

1.4. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TINH CHẾ LECTIN .............................. 33

1.4.1. Sắc ký trao đổi ion ........................................................................ 33

1.4.2. Sắc ký lọc gel ............................................................................... 33

1.4.3. Sắc ký ái lực ................................................................................. 34

1.5. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ PROTEIN

DỰA VÀO PHỔ KHỐI LƢỢNG .............................................................. 35

1.5.1. Nguyên tắc chung ......................................................................... 35

1.5.2. Phƣơng pháp xác định phân tử khối của protein ........................... 36

1.6. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ AXIT AMIN TRONG

LECTIN .................................................................................................... 36

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 39

2.1. VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ................. 39

2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU . 40

2.2.1. Nguyên vật liệu ............................................................................ 40

2.2.2. Hóa chất ....................................................................................... 40

2.2.3. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ................................................ 41

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................... 42

2.3.1. Chuẩn bị huyền phù hồng cầu máu 2 % (hồng cầu máu thỏ, cừu, gà

và các nhóm máu ngƣời A, B, O) : ......................................................... 42

2.3.2. Phân tích hoạt tính lectin bằng phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu

(hồng cầu máu thỏ, cừu, gà và các nhóm máu ngƣời A, B, O). ............... 43

2.3.3. Xác định hàm lƣợng protein. ........................................................ 44

2.3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thực nghiệm:............................................ 46

2.3.5. Phân tích các điều kiện tối ƣu để chiết lectin từ rong đỏ H.

eucheumatoides ...................................................................................... 47

2.3.5.1. Phân tích tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết ............................. 48

3

2.3.5.2. Phân tích nồng độ ethanol chiết .............................................. 48

2.3.5.3. Phân tích thời gian chiết ......................................................... 48

2.3.6. Phân tích nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa lectin từ dịch chiết.

............................................................................................................... 49

2.3.7. Tinh sạch lectin bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-

Sepharose ............................................................................................... 50

2.3.8. Tinh sạch lectin bằng phƣơng pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S –

200 . ....................................................................................................... 51

2.3.9. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lƣợng phân tử lectin bằng

phƣơng pháp điện di SDS-PAGE ........................................................... 52

2.3.10. Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng các đặc tính lý, hóa đến lectin

từ rong đỏ H. eucheumatoides ................................................................ 56

2.3.10.1. Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính

ngƣng kết hồng cầu ............................................................................. 57

2.3.10.2. Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính ngƣng

kết hồng cầu ........................................................................................ 57

2.3.10.3. Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng của cation hóa trị 2, EDTA

đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu ........................................................ 58

2.3.10.4. Phƣơng pháp phân tích đặc tính liên kết carbohydrate của

lectin ................................................................................................... 58

2.3.11. Điều chế porcine stomach mucin đƣợc xử lý enzyme trypsin ..... 60

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 61

3.1. PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH NGƢNG KẾT HỒNG CẦU THỎ, CỪU,

GÀ VÀ CÁC NHÓM MÁU NGƢỜI A, B, O VỚI DỊCH CHIẾT TỪ

RONG ĐỎ H. eucheumatoides ................................................................. 61

3.2. PHÂN TÍCH CÁC ĐIỀU KIỆN ĐỂ CHIẾT LECTIN TỪ RONG H.

eucheumatoides ......................................................................................... 61

4

3.2.1. Tỷ lệ nguyên liệu và dung môi chiết ............................................. 61

3.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến quá trình chiết ..................... 63

3.2.3. Ảnh hƣởng của thời gian chiết ...................................................... 64

3.3. TINH CHẾ LECTIN .......................................................................... 65

3.3.1. Phân tích nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa lectin ................... 65

3.3.2. Tinh sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose ......... 67

3.3.3. Tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S - 200 ................. 68

3.3.4. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định trọng lƣợng phân tử lectin bằng

phƣơng pháp điện di SDS-PAGE ........................................................... 69

3.3.5. Kết quả tổng hợp quá trình tinh sạch lectin từ rong đỏ H.

eucheumatoides ...................................................................................... 71

3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH LÝ, HÓA CỦA LECTIN TỪ

RONG ĐỎ H. eucheumatoides ................................................................. 72

3.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của

lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides. ..................................................... 72

3.4.2. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ

rong đỏ H. eucheumatoides. ................................................................... 74

3.4.3. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của

lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides. ..................................................... 75

3.4.4. Phân tích khả năng liên kết carbohydrate của lectin từ rong đỏ H.

eucheumatoides. ..................................................................................... 76

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 88

4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................ 88

4.2. KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 88

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 89

5

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

HC Hồng cầu

HTR Hoạt tính riêng

HTTS Hoạt tính tổng số

NKHC Ngƣng kết hồng cầu

OD Optical Density Mật độ quang

PBS Phosphate Buffered Saline Đệm muối photphat

6

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Sự phân bố của lectin trong sinh giới ........................................... 17

Bảng 1.2. Một số phƣơng pháp tinh chế lectin từ rong biển. ......................... 19

Bảng 2.1. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ........................ 41

Bảng 2.2. Các loại đƣờng đơn và glycoprotein sử dụng để khảo sát đặc tính

liên kết carbohydrate của lectin .................................................................... 59

Bảng 3.1. Phân tích hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của dịch chiết thô từ rong

đỏ H. eucheumatoides với các dạng hồng cầu khác nhau ............................. 61

Bảng 3.2. Kết quả tinh sạch lectin từ 300 gam rong thô H. eucheumatoides . 71

Bảng 3.3. Kết quả thí nghiệm ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt tính ngƣng

kết hồng cầu của lectin từ rong H. eucheumatoide ........................................ 75

Bảng 3.4. Nồng độ đƣờng và glycoprotein nhỏ nhất có khả năng ức chế hoạt

tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ rong H. eucheumatoides .................... 79

Bảng 3.5. Khả năng ức chế đƣờng và glycoprotein của lectin từ rong đỏ và

rong lục. ....................................................................................................... 85

7

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc bậc 1 của các lectin từ rong đỏ EDA-1 và EDA-2 từ rong

Eucheuma denticulatum; ESA-2 từ rong Eucheuma serra; KSA-1 và KSA-2

từ rong Kappaphycus striatum, KAA-1 và KAA-2 từ rong Kappaphycus

alvarezii , SfL-1 và SfL-2 từ rong Solieria filiformis . .................................. 27

Hình 1.2. Cấu trúc Man9GlcNAc2. ................................................................ 28

Hình 1.3. Cấu trúc lõi của Man3GlcNAc2 ..................................................... 28

Hình 1.4. Cấu trúc của lectin từ rong đỏ, carrageenophytes. ......................... 29

Hình 1.5. Biểu đồ thể hiện ứng dụng y sinh của lectin từ rong biển. ............. 30

Hình 2.1. Hình ảnh rong Hydropuntia eucheumatoides ................................ 39

Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của tỷ lệ dung môi chiết:nguyên liệu

đến hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của lectin. ....................................... 62

Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hoạt tính tổng

số và hoạt tính riêng của quá trình chiết lectin. ............................................. 63

Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của thời gian chiết (giờ) đến hoạt tính

tổng số và hoạt tính riêng của lectin. ............................................................ 64

Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến khả năng kết

tủa lectin. ...................................................................................................... 65

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự tƣơng quan giữa giá trị A280nm và hoạt tính

ngƣng kết hồng cầu theo thứ tự các phân đoạn trong quá trình sắc ký trao đổi

ion DEAE – Sepharose ................................................................................. 67

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn A280nm và hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của các

phân đoạn trong quá trình sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 ............................ 68

Hình 3.7. Kết quả điện di lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides .................... 69

Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin

từ rong đỏ H. eucheumatoides. ..................................................................... 73

8

Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ

rong đỏ H. eucheumatoides. ......................................................................... 74

Hình 3.10. Các dạng cấu trúc lõi mở rộng của O-glycan. ........................... 77

Hình 3.11. Các dạng cấu trúc N-glycan. . ..................................................... 78

Hình 3.12. Cấu trúc của một số đƣờng đơn. ................................................. 82

Hình 3.13. Cấu trúc của Fetuin và Asialofetuin. ........................................... 82

Hình 3.14. Cấu trúc của yeast mannan, porcine thyroglobulin và porcine

stomach mucin.. ........................................................................................... 84

9

MỞ ĐẦU

Lectin có bản chất là protein hoặc glycoprotein có nguồn gốc không

miễn dịch và có mặt khắp nơi trong tự nhiên từ vi khuẩn đến động vật. Lectin

có khả năng liên kết với các monosaccharide, oligosaccharide và glycoprotein

đặc hiệu trên bề mặt tế bào hồng cầu và ngƣng kết hồng cầu, mà không làm

thay đổi tính chất của carbohydrate. Khả năng sử dụng lectin phụ thuộc chủ

yếu vào đặc tính liên kết carbohydrate của chúng. Hàm lƣợng lectin thay đổi

phụ thuộc vào các nguồn sinh vật khác nhau. Hiện tại, một số lƣợng lớn lectin

từ các nguồn sinh vật khác nhau đã đƣợc tinh chế. Thêm vào đó, lectin tái tổ

hợp cũng đã đƣợc sản xuất đối với một số mẫu sinh vật có sinh khối nhỏ [1].

Do khả năng có thể phân biệt sự khác nhau trong các cấu trúc carbohydrate,

lectin không chỉ đƣợc dùng cũng nhƣ thuốc thử hóa sinh trong nhiều lĩnh vực

nghiên cứu, bao gồm glycomic, mà còn đang hứa hẹn sử dụng trong các liệu

pháp chữa bệnh kháng virus và ung thƣ và cây trồng chuyển đổi gen [2].

Nguồn lợi sinh vật biển bao gồm vi tảo, rong biển, động vật không

xƣơng sống, cá, vi khuẩn, nấm và virus đã cung cấp một số lƣợng lớn các

phân tử hoạt tính sinh học tự nhiên đặc hiệu nhƣ thuốc kháng vi khuẩn, kháng

virus HIV, kháng virus cúm, kháng ung thƣ và thuốc chữa bệnh Alzheimer [3,

4]. Trong số đó, lectin là một trong số nhóm hợp chất nổi bật nhất cho sử

dụng làm thuốc chữa bệnh, bởi vì chúng có thể nhận biết các cấu trúc

carbohydrate khác nhau trong proteoglycan, glycoprotein và glycolipid, kết

quả là chúng có thể điều chỉnh các tế bào thông qua sự hình thành glyco liên

hợp và ngăn chặn sự tƣơng tác giữa tác nhân gây bệnh với vật chủ qua liên

kết với các cấu trúc oligosaccharide trên bề mặt của tác nhân gây bệnh [5].

Lectin từ rong biển đã cho thấy sự đa dạng trong hoạt tính sinh học nhƣ

lectin từ rong đỏ Eucheuma serra đã cho thấy hoạt tính phân bào trong cả hai

lympho bào ngƣời và chuột [6], hoạt tính kháng các chất gây ung thƣ [7], hoạt

tính kháng virus HIV [8] và hoạt tính kháng virus cúm [9], lectin KAA-2 từ

rong Kappaphycus alvarezii đã có hoạt tính ức chế mạnh sự lây nhiễm của

các dòng virus cúm (H1N1 và H3N2) với nồng độ nanomol [10, 11], và lectin

10

BCA từ rong lục Boodlea coacta cũng đã cho thấy hoạt tính mạnh kháng lại

virus HIV và virus cúm H1N1 [12]. Vì vậy rong biển hứa hẹn sẽ là nguồn

lectin giá trị cho sử dụng trong y sinh để làm thuốc kháng ung thƣ và virus

trong tƣơng lai.

Việt Nam với chiều dài bờ biển khoảng 3.260 km, ở đó có một hệ thực

vật rong biển đa dạng với khoảng 1000 mẫu đƣợc dự đoán, trong đó 639 mẫu

đã xác định. Đó là nguồn sinh vật biển phong phú để nghiên cứu và khai thác

sử dụng lectin trong hóa sinh, y sinh hoặc trong thực phẩm chức năng để

phòng ngừa bệnh trong tƣơng lai. Tuy nhiên, các nghiên cứu về lectin từ rong

biển ở nƣớc ta chƣa đƣợc công bố nhiều, ngoại trừ một vài công bố về lectin

rong biển [13, 14, 15, 16, 17, 18]. Rong đỏ Hydropuntia eucheumatoides là

một trong số loài rong đƣợc dùng để sản xuất agar trên thế giới và Việt Nam,

ở nƣớc ta rong này đƣợc thu hoạch tự nhiên ở Nha Trang và Ninh Thuận, và

cho đến hiện tại chƣa có bất kì công bố nào về lectin từ loài rong này. Trên cơ

sở đó tôi tiến hành thực hiện đề tài “Tinh chế và phân tích đặc tính liên kết

O-glycan của lectin từ rong đỏ Hydropuntia eucheumatoides” với mục

đích không chỉ bổ sung thêm về số liệu lectin từ nguồn rong biển Việt Nam,

mà còn hƣớng đến sử dụng lectin trong y học.

Mục tiêu nghiên cứu:

Phân tích các đặc tính của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides hƣớng

đến đánh giá khả năng khai thác và sử dụng chúng trong hóa sinh, y sinh và

dƣợc liệu phòng trị bệnh.

Nội dung nghiên cứu:

+ Tinh chế lectin từ rong đỏ H.s eucheumatoides bằng phƣơng pháp

sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel.

+ Phân tích tính chất của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides, bao

gồm:

* Phân tích đặc tính liên kết O-glycan bằng phƣơng pháp ức chế sự

ngƣng kết hồng cầu.

11

* Xác định khối lƣợng phân tử lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides

bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE.

* Phân tích khả năng bền nhiệt, ảnh hƣởng của pH, cation hóa trị 2 và

EDTA đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ rong đỏ H.

eucheumatoides.

12

1CHƢƠNG 1. T NG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN

Rong biển có vai trò quan trọng đối với hệ sinh thái biển và đời sống

của con ngƣời. Ngoài giá trị về môi trƣờng, sinh thái nhƣ tham gia vào các

chu trình dinh dƣỡng của thủy vực, là nơi sống, trú ẩn, kiếm ăn của nhiều loài

sinh vật biển nhất là thời kỳ cây non, rong biển còn có giá trị lớn đối với đời

sống con ngƣời nhƣ cung cấp nguyên liệu cho các ngành công nghiệp chế

biến (chiết xuất keo agar, alginat, carrageenan, fucoidan…), làm thực phẩm,

thuốc chữa bệnh….

Rong biển là món quà thiên nhiên quý giá rất giàu chất dinh dƣỡng.

Trong các phƣơng pháp dƣỡng sinh của nhiều dân tộc trên thế giới, rong biển

đƣợc coi là thức ăn tạo sự dẻo dai, khỏe mạnh về thể chất và tinh thần cho con

ngƣời. Rong biển khô rất giàu chất bột, chất xơ, đạm và chất khoáng. Phân

tích giá trị thành phần dinh dƣỡng của rong biển cho thấy hàm lƣợng vitamin

A trong rong biển cao gấp 2 - 3 lần so với cà rốt, hàm lƣợng canxi cao gấp 3

lần so với sữa bò, vitamin B2 cao gấp 4 lần trong trứng. Theo nhiều nghiên

cứu tại Nhật Bản, trong rong biển chứa hàm lƣợng iốt khá cao. Trong đó, hàm

lƣợng iốt cao nhất đƣợc tìm thấy trong rong nâu, tiếp sau rong đỏ và rong lục,

khoảng 100 - 300 ppm trong rong biển khô. Ngoài ra, trong rong biển chứa

một lƣợng chất khoáng rất phong phú, có tác dụng điều tiết máu lƣu thông,

tiêu độc, loại bỏ các cặn bã có trong cơ thể; thêm vào đó, nó còn là chất

không thể thiếu của tuyến giáp, nơi tiết ra hooc-môn sinh trƣởng, giúp cơ thể

phát triển [19].

Từ thế kỷ thứ 18, rong biển đã đƣợc sử dụng phổ biến tại Nhật Bản, về

sau có các quốc gia châu Á nhƣ Trung Quốc, Hàn Quốc, Malaysia, Philippin.

Do đó, ngành rong biển ở các quốc gia này rất phát triển. Trong những năm

gần đây, do có sự giao lƣu văn hóa giữa các nƣớc, ngƣời Việt cũng bắt đầu

quan tâm đến rong biển. Việt Nam là một trong những nƣớc có tiềm năng để

https://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=B%E1%BB%99t&action=edit&redlink=1

https://vi.wikipedia.org/wiki/Ch%E1%BA%A5t_x%C6%A1

https://vi.wikipedia.org/wiki/%C4%90%E1%BA%A1m

https://vi.wikipedia.org/wiki/C%C3%A0_r%E1%BB%91t

13

phát triển ngành rong biển, với bờ biển dài 3.260 km và diện tích mặt nƣớc

khoảng một triệu km2, đặc biệt là khu vực miền Trung có bờ biển đá và dải

biến thiên nhiệt độ hẹp. Tại Việt Nam đã xác định đƣợc 800 loài rong biển

thuộc 4 ngành, trong đó, ngành rong đỏ chiếm hơn 400 loại, ngành rong lục

chiếm 180 loại, ngành rong nâu hơn 140 loại và ngành rong lam gần 100 loại;

và trong số hơn 800 loài thì ở vùng biển nƣớc ta có 90 loài mang lại giá trị

kinh tế; hiện nay có 7 loài rong kinh tế (rong nho, rong câu chỉ vàng, rong câu

thắt, rong câu cƣớc, rong sụn, rong bắp sú, rong sụn gai) đang đƣợc trồng phổ

biến ở Việt Nam.

Ngày nay, xuất phát từ nhu cầu nâng cao chất lƣợng cuộc sống, các nhà

khoa học đã và đang nghiên cứu chuyển nguồn rong biển thành các sản phẩm

có giá trị nhƣ: phlorotannin từ rong nâu Sargassum có khả năng chống gốc tự

do mạnh gấp 5 lần so với catechin trong trà xanh [20]; hợp chất carrageenan

trong rong biển đƣợc tách chiết và sử dụng làm chất phụ gia trong công nghệ

thực phẩm, dùng làm phụ gia chế biến và bảo quản thực phẩm [21], đƣợc bổ

sung vào bia rƣợu làm tăng độ trong, dùng trong sản xuất bánh pudding, kem,

phomat, ngoài ra, carrageenan có khả năng liên kết với protein qua gốc amin

nên nó đƣợc sử dụng trong công nghiệp sữa với vai trò làm cho các sản phẩm

sữa có độ ổn định khá cao, tạo nhũ tƣơng, chống tách lỏng mà không cần

dùng đến tinh bột và lòng trắng trứng [22]. Trong Y học, rong biển cũng đƣợc

sử dụng nhƣ một nguồn dƣợc liệu quý. Các hợp chất đƣợc tách chiết từ rong

biển đã có những tác dụng trong phòng ngừa các bệnh. Chẳng hạn: theo

Nghiên cứu đăng trên Thƣ viện y khoa quốc gia Mỹ cho thấy Fucoidan từ

rong nâu giúp tăng miễn dịch, góp phần làm chậm sự phát triển của khối u

thực tràng và ung thƣ vú; ngoài ra, chúng góp phần hỗ trợ chống viêm, giảm

đau khớp, hỗ trợ giảm tác dụng phụ của hóa, xạ trị.

14

Bên cạnh những hiệu quả về kinh tế, rong biển còn góp phần giảm khí

thải nhà kính, làm sạch môi trƣờng, hấp thụ kim loại nặng tại các vùng biển ô

nhiễm, nuôi trồng thủy sản [19].

1.2. TỔNG QUAN VỀ LECTIN

1.2.1. Lịch s nghi n cứu ectin

Vào những năm cuối thế kỉ 19 con ngƣời đã bắt đầu có những bằng

chứng đầu tiên về một loại protein có khả năng gây ngƣng kết hồng cầu, dạng

protein này đƣợc tìm thấy nhiều trong các loại hạt, và tại thời điểm này các

nghiên cứu tập trung chủ yếu vào làm sáng tỏ nguyên lý gây độc của dạng

protein này. Đến năm 1884, Warden và Waddel đã giải thích đƣợc nguyên lý

gây độc của các hạt Aprus precatorius. Năm 1887, Dixson đã xác định đƣợc

một dịch lỏng có độc tố, đƣợc tách chiết từ hạt thầu dầu Ricinus precatorius là

một protein, vì những protein này đƣợc tìm thấy trong các mẫu chiết từ thực

vật nên chúng đã đƣợc đề cập dƣới tên gọi là hemagglutinin hay agglutinin

thực vật (phytoagglutinin). Peter Hermann Stillmark là ngƣời đầu tiên mô tả

đầy đủ về lectin trong luận án tiến sĩ vào năm 1888 ở Đại học Dorpat (một

trong những trƣờng đại học lâu đời nhất dƣới thời nƣớc Nga Sa Hoàng, nay là

Tartu, Estonia,). Stillmrak đã phân lập và tách chiết đƣợc ricin, một

chất hemagglutinin cực độc từ hạt của cây thầu dầu (Ricinus communis) [23].

Sau đó H. Hellin, cũng ở Đại học Tartu cho thấy sự hiện diện của một

hemagglutinin độc, gọi là abrin ở mẫu chiết của cây đậu Abrus precatorius.

Ricin và abrin đƣợc sử dụng để làm mô hình kháng nguyên cho các nghiên

cứu miễn dịch. Mặc dù các mẫu ông nghiên cứu khá thô so với các tiêu chí

hiện nay (ricin và abrin mỗi loại đều chứa một chất ngƣng kết yếu nhƣng có

độc tính mạnh và một chất độc yếu nhƣng có tính ngƣng kết mạnh, tất cả đều

đặc hiệu với galactose) nhƣng đó là nền tảng để xây dựng nguyên lý cơ bản

về miễn dịch học vào những năm 1890. Cũng chính Ehrlich phát hiện ra rằng

chuột đƣợc miễn dịch với ricin hoặc abrin ở liều dƣới ngƣỡng gây chết đã

giúp cho chuột có khả năng kháng lại ricin và abrin. Kết quả này cung cấp

bằng chứng rõ ràng cho tính đặc hiệu của các đáp ứng miễn dịch. Ehrlich

https://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Peter_Hermann_Stillmark&action=edit&redlink=1

https://vi.wikipedia.org/wiki/Ricin

https://vi.wikipedia.org/wiki/Hemagglutinin

https://vi.wikipedia.org/wiki/Th%E1%BA%A7u_d%E1%BA%A7u

15

cũng chứng tỏ đƣợc rằng tính miễn dịch đối với các độc tố đƣợc truyền từ mẹ

sang con bằng đƣờng máu trong quá trình mang thai và trong quá trình cho

con bú sau khi sinh. Bằng cách nghiên cứu hiệu ứng ức chế của huyết thanh

kháng ricin, ông đã chứng minh đƣợc rằng có một mối quan hệ định lƣợng

giữa lƣợng kháng huyết thanh và lƣợng kháng nguyên mà nó có thể trung hoà

và dựa trên cơ sở này để thực hiện việc định lƣợng đầu tiên đối với kháng thể

trong cơ thể sống. Những nghiên cứu này đã chứng minh tính đặc hiệu của

đáp ứng miễn dịch, hiện tƣợng ghi nhớ miễn dịch và sự truyền miễn dịch thể

dịch từ mẹ sang con.

Những kết quả ban đầu của Stillmark cũng đã nói lên một phần tính đặc

hiệu của hiện tƣợng ngƣng kết bởi ricin đối với hồng cầu của các động vật

khác nhau. Sự quan sát này đƣợc củng cố và mở rộng thêm bởi Karl

Landsteiner ở đại học Vienna, ngƣời khám phá ra các nhóm máu ngƣời A, B

và O vào năm 1900. Gần một thập kỷ sau ông đã công bố các hoạt tính ngƣng

kết của các chất chiết từ các hạt khác nhau thì khác nhau khi thử nghiệm trên

hồng cầu của các động vật khác nhau [24]. Vì tính đặc hiệu này, Landsteiner

kết luận rằng hoạt tính ngƣng kết có nguồn gốc thực vật này “về cơ bản giống

nhƣ kháng nguyên”. Vì vậy ông đã sử dụng những protein này để minh họa

cho khái niệm tính đặc hiệu trong chƣơng mở đầu của cuốn sách kinh điển

“Tính đặc hiệu của các phản ứng huyết thanh” năm 1936.

Năm 1919, James B. Summer ở đại học Cornell (Ithaca, New York), là

ngƣời đầu tiên tinh sạch lectin từ đậu rựa (Canavalia ensiformis) và sau đó đặt

tên là concanavalin A. Vào những năm 1940, Boyd và Karl cũng đã mô tả về

tính đặc hiệu của lectin ở đậu lima (Phaseolus limensis) và đậu tằm (Vicia

cracca) với loại đƣờng khác nhau và đƣa ra bằng chứng về tính đặc hiệu với

hồng cầu các nhóm máu A, B và O của lectin và khẳng định sự hiện diện của

các phân tử đƣờng khác nhau trên bề mặt hồng cầu.

16

Khả năng phân biệt hồng cầu giữa các nhóm máu khác nhau của các

agglutinin từ thực vật đã đƣa đến đề xuất cho chúng một cái tên là lectin, từ

tiếng Latin legere, có nghĩa là chọn lọc [25]. Thuật ngữ này đƣợc tổng quát

hóa để bao gồm tất cả các agglutinin đặc hiệu với các phân tử đƣờng không

có nguồn gốc miễn dịch, bất kể chúng có nguồn gốc từ đâu hoặc đặc hiệu với

các nhóm máu nhƣ thế nào.

Lectin thực vật đƣợc nghiên cứu rộng rãi theo hƣớng điều tra và thăm

dò tính đặc hiệu cho đến những năm đầu của thập kỷ 70. Ở thời điểm đó

ngƣời ta đã nghiên cứu rất nhiều lectin, chủ yếu tập trung ở họ đậu. Các lectin

động vật ít thu hút sự chú ý và chỉ có một số nghiên cứu về lectin ở chạch, sên

và cua móng ngựa là đƣợc nghiên cứu kỹ. Lectin quan trọng nhất ở động vật

đƣợc khám phá chính là thụ thể asialoglycoprotein trong gan động vật có vú,

mà nó đặc hiệu với galactose [26]. Thụ thể này tham gia vào quá trình nhận

diện và loại bỏ các glycoprotein lão hóa trong máu, qua đó kiểm soát chu

trình sống của các glycoprotein trong máu.

Cấu trúc của lectin đƣợc bắt đầu nghiên cứu vào những năm của thập

kỷ 70 nhƣng phát triển chậm cho đến khi kỹ thuật tái tổ hợp ra đời. Ngày nay

ngƣời ta có thể tiến hành giải trình tự của lectin rồi giải đoán cấu trúc bậc ba

của nó dựa trên tính tƣơng đồng của các lectin cùng họ. Tuy nhiên nhiều

lectin đã đƣợc giải cấu trúc bậc ba mà không cần thông qua trình tự bậc một

nhờ vào kỹ thuật chụp ảnh tinh thể tia X. Hiện nay đã có tới hơn 200 lectin

đƣợc giải đoán cấu trúc [27].

1.2.2. Sự phân bố ectin trong sinh giới

Lectin đƣợc tìm thấy ở hầu hết các sinh vật ở mọi cấp bậc phân loại, từ

virus đến vi khuẩn, từ thực vật đến động vật.

17

Bảng 1.1. Sự phân bố của lectin trong sinh giới

Phân bố Lectin Tài iệu tham khảo

Động vật Lớp Cá xƣơng (Osteichthye), lớp

Lƣỡng cƣ (Amphibia), lớp Bò sát

(Reptila), lớp Chim (Aves) và lớp

Thú (Mammalia), huyết tƣơng cá

chình (Anguilla rastiata), trứng cá

vƣợc (Perca piuviatitis), trong cơ

thể ngƣời.

[28]

Ngành ruột khoang ở vùng biển

Khánh Hòa.

[29]

Thực vật Dâu tằm (Moraceae), Mít, Sakê chi

Artocarpus (Artocarpus incia).

[30]

Rong (Algae) [31]

Họ Lan (Orchidaceae), họ Trinh nữ

(Mimosaceae), họ Thủy tiên

(Amaryllidaceae) và họ Hòa thảo

(Poceae).

[32]

Lectin từ các loại hạt (họ đậu, họ đại

kích), quả và củ (họ cà, họ hành), rễ

(họ bầu bí, họ đậu), ở chồi và lá (họ

xƣơng rồng và họ lan)

[32]

Virus Virus cúm [33]

Vi khuẩn Actinomyces naeslundii,

Escherichia coli

[34]

18

1.2.3. Vai trò sinh học của ectin

Vai trò nổi bật nhất của lectin ở các sinh vật chính là chức năng nhận

diện các gốc đƣờng. Vai trò này thể hiện trong chức năng của lectin trong

miễn dịch tự nhiên, trong quá trình loại bỏ các glycoprotein trong máu ở gan

của động vật có xƣơng sống (sialoglycoprotein). Có nhiều bằng chứng cho

thấy lectin đóng vai trò nhƣ các protein hỗ trợ (chaperone) trong việc điều

phối sự vận chuyển glycoprotein nội bào.

Ở động vật: lectin có nhiều chức năng sinh học quan trọng nhƣ: quyết

định độ bám dính của tế bào, tham gia vào quá trình tổng hợp glycoprotein,

điều chỉnh lƣợng protein trong máu. Lectin có thể liên kết đƣợc với các

glycoprotein nội và ngoại bào. Một số lectin liên kết đặc hiệu với đƣờng

galactose cũng đƣợc tìm thấy trên bề mặt tế bào gan của động vật có vú.

Những lectin này đóng vai trò nhƣ những thụ thể bề mặt tế bào và có khả

năng loại bỏ một số glycoprotein nhất định trong hệ tuần hoàn. Thêm vào đó,

lectin cũng giữ một vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch của động vật.

Ở thực vật: có hai giả thuyết về vai trò của lectin. Một giả thuyết cho

rằng giúp thực vật chống lại vi khuẩn gây bệnh và động vật gây hại cho nó.

Giả thuyết này đƣợc đƣa ra dựa trên quan sát của Rehovot cho thấy lectin ức

chế quá trình tạo bào tử nấm. Ngoài ra, một quan sát của Lierner về sự chết

của ấu trùng bọ cánh cứng khi ăn thức ăn có lectin đậu đen [35]. Giả thuyết

thứ hai là sự kết hợp đặc hiệu của một giống đậu nào đó với một số vi khuẩn

cố định đạm nhất định. Thành phần đƣờng của các polysaccharide hoặc

lipopolysaccharide trên màng tế bào các loài vi khuẩn là khác nhau, và khả

năng liên kết của lectin của các họ đậu khác nhau với các gốc đƣờng này cũng

có sự khác biệt [36].

19

1.3. LECTIN TỪ RONG BIỂN

1.3.1. Tình hình nghi n cứu ectin từ rong biển tr n thế giới

Lần đầu tiên Boyd (1966) đã khảo sát sự có mặt của agglutinin (lectin)

từ rong biển. Sau đó nhiều nghiên cứu về lectin đã đƣợc công bố với số lƣợng

trên 500 loài rong có chứa lectin, nhƣ ở Anh [37, 38, 39], ở Nhật [40, 41], ở

Tây Ban Nha [42, 43], ở Trung Quốc [44], ở Hoa Kỳ [45, 46], ở Brazil [47,

48, 49], ở Pakistan [50], ở Ấn độ [51], Việt Nam [13, 16] và ở Nam cực [52].

Trong số đó, lectin đã đƣợc cô lập chủ yếu là từ rong đỏ và đã đƣợc nghiên

cứu tính chất hóa-lý và hóa sinh chi tiết, nhƣ các lectin từ rong Agardhiella

tenera [53], Carpopeltis flabellata, Hypnea japonica [54, 55], Cystoclonium

purpureum [56], Gracilaria bursa –pastoris [57], Gracilaria tikvahiae [58],

Gracilaria verrucosa [59], Griffithsia flosculosa [60], Monospora sp [61],

Plumaria elegans, Ptilota serrata [62], Palmaria palmata [63, 61], Ptilota

plumosa [64, 65], Serraticardia maxima [66], Solieria chordalis [67] và

Solieria robusta [68].

1.3.1.1. Các phương pháp tinh chế lectin từ rong biển

Các lectin từ rong đỏ có thể đƣợc tinh chế bằng nhiều kỹ thuật sắc kí

khác nhau: sắc kí kỵ nƣớc, sắc kí trao đổi ion, sắc kí lọc gel, sắc kí pha đảo -

HPLC hoặc sắc kí ái lực. Do tính đặc hiệu carbohydrate của các lectin, chúng

hầu nhƣ đƣợc tinh chế bằng sắc kí ái lực.

Bảng 1.2. Một số phƣơng pháp tinh chế lectin từ rong biển.

Rong biển Phƣơng pháp tinh chế Khối lƣợng phân

tử/khối lƣợng các

mảnh.

Tài liệu tham

khảo

Agardhiella

tenera

Sắc ký lọc gel Sephadex Monomer 13 kDa [53]

Aglaothamnion

callophyllidicola

Sắc ký ái lực Fetuin-

agarose

Dimer, 50 và 14 kDa [69]

Bryothamnion

seaforthii

Sắc ký DEAE-cellulose Monomer 4.5 kDa [70]

Cystoclonium Sắc ký lọc gel, sắc ký cột Dimer, 6,2 kDa [56]

20

purpureum DEAE-Sephadex

Eucheuma

amakusaensis

Sắc ký lọc gel Superdex và

sắc ký trao đổi ion DEAE-

Toyopearl

Monomer 29 kDa [71]

E. cottonii



Toyopearl

Monomer 29 kDa [71]

E. serra Sắc ký lọc gel Superdex và


Toyopearl

Monomer 29 kDa [6]

E.denticulatum Sắc ký lọc gel Superdex và


Toyopearl

Monomer 28 kDa [17]

Gracilaria

cornea

Sắc ký kỵ nƣớcPhenyl-

Sepharose CL-4B và sắc

ký ái lực

Monomer 60 kDa [72]

G. ornata

Sắc ký trao đổi ionDEAE-

cellulose và sắc ký ái lực

mucin-Sepharose 4B

Monomer 17 kDa [73]

G. verrucosa Sắc ký trao đổi ion DEAE-

Toyopearl và sắc ký lọc

gel

71 kDa [74]

Griffithsia sp

Sắc ký kỵ nƣớc, sắc ký

trao đổi ion và sắc ký ái

lực

Monomer 13 kDa [75]

Hypnea

cervicornis

Sắc ký trao đổi ion và sắc

ký pha đảo HPLC

Monomer, 9 kDa [76]

H. japonica Sắc ký lọc gel Toyopearl

và sắc ký pha đảo HPLC

Monomer,

8.5–9.5 kDa

[77]

H. musciformis Sắc ký trao đổi ion DEAE-

Cellulose và sắc ký pha

đảo HPLC

Monomer, 9.3 kDa [78]

Kappaphycus

alvarezii



Toyopearl

Monomer, 28 kD [14]

K. striatum Sắc ký lọc gel Superdex và


Monomer, 28 kDa [15]

21

Toyopearl

Ptilota filicina Sắc ký ái lực Trimer, 19,3 kDa [79]

Soliera filiformis Sắc ký trao đổi ion DEAE-

Sephacel

Monomer, 28 kDa [80]

Tichocarpus

crinitus

Sắc ký kỵ nƣớc Phenyl-

Sepharose và sắc ký lọc

gel Superdex

Monomer, 41 kD [81]

1.3.1.2. Đặc tính liên kết carbohydrate của lectin

Tùy thuộc vào nguồn gốc của các loài rong biển, hoạt tính ngƣng kết

hồng cầu của các mẫu lectin từ rong biển bị ức chế mạnh mẽ bởi các

glycoprotein và glycopeptide khác nhau mà có thể nhận ra các phức

carbohydrate. Do đó, dựa trên các ƣu tiên liên kết của chúng đối với

glycoprotein, các lectin từ rong biển có thể đƣợc phân thành 3 loại: loại đặc

hiệu N-glycan dạng phức, đặc hiệu N-glycan dạng high-mannose hoặc đặc

hiệu cả 2 dạng. Tuy nhiên, lectin từ rong biển cũng cho thấy sự đặc hiệu với

các đƣờng đơn và các dẫn xuất của chúng [82].

* Đặc hiệu phức carbohydrate

Một số lectin thể hiện tính đặc hiệu các chuỗi đƣờng của các loại N-

glycan [54], trong khi một số ít thì đặc hiệu với O-glycan [14]. Lectin từ rong

E. duperreyi [83], Ptilota filicina [79], Pterocladiella capillacea [84], G.

ornata [73] và G. cornea [72] đã bị ức chế mạnh bởi porcine stomach mucin

(PSM), PSM là một glycoprotein liên kết O-glycan có chứa các gốc cuối cùng

N-acetylgalactosamine, galactose và fucose [85]. Dịch chiết protein thô của

rong Gracilaria fisheri (GFE) có tính đặc hiệu với porcine stomach mucin,

fetuin và albumin bò với giá trị nồng độ ức chế nhỏ nhất (Cmin) là 1,56, 3,12

và 6,25 µg/mL (tƣơng ứng) [86]. Hoạt tính của lectin từ rong Gracilaria

veruscosa cho thấy có tính đặc hiệu với glycoprotein dạng phức (asialofetuin,

fetuin và thyroglobulin), có ái lực cao nhất với chuỗi oligosaccharide của

asialofetuin [74]. Hoạt tính của lectin từ rong Hypnea cervicornis bị ức chế

22

mạnh chỉ với glycoprotein porcine stomach mucin [76]. Hoạt tính của các

lectin từ rong Tichocarpus crinitus [81] và Georgiella confluens [52] bị ức

chế bởi glycoprotein fetuin và porcine stomach mucin. Hoạt tính của lectin từ

rong A. callophyllidicola bị ức chế bởi fetuin và asialofetuin với nồng độ ức

chế nhỏ nhất lần lƣợt là 19 và 62 µg/mL [69].

Hoạt tính của lectin từ rong Hypnea japonica không bị ức chế bởi N-

glycan dạng high-mannose, nhƣng bị ức chế với một vài glycoprotein N-

glycan dạng phức nhƣ: transferrin, fetuin hoặc O-glycan và dẫn xuất asialo

của chúng [77]. Lectin đồng phân (hypnin A-3) từ rong H. japonica liên kết

với gốc fucose ở vị trí (α1-6) của N-glycan [87]. Lectin từ rong Hypnea

valentiae, H. boergesenii, H. nidulans và Graccilaria salicornia đặc hiệu với

O-glycan vì hoạt tính của chúng bị ức chế bởi asialofetuin chứa cả N-glycan

dạng phức và O-glycan cũng nhƣ bovine submaxillary mucin và dẫn xuất

asialo của chúng [14].

* Đặc hiệu với high-mannose

Rong đỏ, carrageenophyte, là một nguồn lectin có giá trị cao, nhƣ lectin

ESA-2 từ rong Eucheuma serra có khả năng liên kết với các oligosacchride

dạng high-mannose [8]. Các nghiên cứu về sự ức chế carbohydrate đã cho

thấy rằng lectin từ rong Kappaphycus alvarezii (trƣớc đây đƣợc gọi là E.

cottonii) và Eucheuma denticulatum là đặc hiệu với N-glycan dạng high-

mannose [17]. Tƣơng tự, các lectin từ rong Kappaphycus striatum [15] và

Kappaphycus alvarezii [14] có ái lực với N-glycan vì hoạt tính của chúng đã

bị ức chế mạnh bởi yeast mannan, porcine và bovine thyroglobulin mang

dạng N-glycan high-mannose. Lectin SfL-1 và SfL-2 từ Solieria filiformis

liên kết đặc hiệu với 3α, 6α pentamannose oligosaccharide, do đó cho thấy

đặc hiệu với oligosacchride high-mannose [88].

23

* Đặc hiệu với cả hai high-mannose và glycoprotein dạng phức

Lectin từ rong Carpopeltis flabellata [54, 55] và Solieria robusta [89]

liên kết cả N-glycan dạng high-mannose và N-glycan dạng phức. Lectin từ

các rong đỏ nhƣ Eucheuma serra (ESA-1 và ESA-2), Eucheuma

amakusaensis (EAA-1, EAA-2 và EAA-3) và Eucheuma cottonii (ECA-1 và

ECA-2) đặc hiệu với glycan dạng phức nhƣng đặc hiệu ƣu tiên với

glycoprotein chứa N-glycan dạng high-mannose nhƣ là thyrogloblin và yeast

mannan [6, 71].

* Những lectin đặc hiệu với đường đơn

Hầu hết các lectin từ rong biển đặc hiệu với các glycoprotein. Tuy

nhiên, một vài lectin từ rong biển lại đặc hiệu với các đƣờng đơn khác nhau

nhƣ: hoạt tính của lectin từ rong Carpopeltis flabellata đã bị ức chế bởi L-

rhamnose [54]; hoạt tính của lectin từ rong Ptilota serrata (PSL) [85], Ptilota

filicina (PFL) [79] và Vidalia obtusiloba [90] bị ức chế mạnh bởi đƣờng đơn

(galactose) và dẫn xuất của chúng; hoạt tính của lectin từ rong Enantiocladia

duperreyi cũng bị ức chế bởi các đƣờng đơn (glucose và fucose) và dẫn xuất

của chúng [83]; hoạt tính của các lectin từ rong Enantiocladia duperreyi [83],

Ptilota filicina [79] và Ptilota serrata [85] bị ức chế bởi nitrophenyl-

galactoside mạnh hơn methyl-D-galactoside; vì vậy, những lectin này có vùng

kị nƣớc ở gần vị trí liên kết với carbohydrate [91]. Hoạt tính của của lectin từ

rong Graccilaria tikvahiae cũng bị ức chế bởi axit N-acetylneuraminic, N-

acetylneuraminic axit (2 3) lactose [58].

1.3.1.3. Điểm đẳng điện và hàm lượng acid amin của lectin từ rong

biển.

Lectin từ rong biển có điểm đẳng điện thấp, thƣờng trong khoảng từ 4 –

6, nhƣ lectin từ rong Hypnea japonica có pHI = 4,3 [57, 92], Agardhiella

tenera có pHI = 6,1 [53], Graccilaria verrucosa có pHI = 4,8 [59]. Lectin từ

24

rong biển thƣờng chứa lƣợng lớn gốc axit (của axit aspartic và axit glutamic)

và nhóm hydroxyl (của serine và threonine) và chứa ít các acid amin cơ bản

nhƣ arginine, histidine và lysine [92, 93, 85]. Lectin từ rong biển chứa hàm

lƣợng lớn các acid amin có tính axit nên pHI của chúng nghiêng về tính axit,

nhƣ các lectin từ rong Solieria filiformis [94] và rong Vidalia obtusiloba [90].

Lectin từ rong Tichocarpus crinitus có chứa lƣợng lớn proline với nhiều

nhóm axit và hydroxyl [81].

Thành phần acid amin trong lectin từ rong Hypnea cervicornis có chứa

nhiều cysteine và ít serine, tƣơng tự với lectin từ rong Hypnea musciformis

[76]. Tuy nhiên, lectin từ rong Hypnea japonica và Bryothamnion triquetrum

chứa ít cysteine hơn và nhiều serine hơn [77, 95].

1.3.1.4. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính của lectin từ rong

biển.

Hoạt tính của lectin từ rong biển nhƣ Kappaphycus alvarezii [14],

Agardhiella tenera [53], Cystoclonium purpureum [56] và Gracilaria

verrucosa [59] ổn định trên một phạm vi rộng của pH. Hoạt tính của lectin từ

rong Eucheuma serra cũng cho thấy ổn định trên khoảng pH từ 2,5 – 10,5 [6].

Lectin từ một vài mẫu rong đỏ nhƣ Ptilota serrata [85], Gracilaria bursa-

pastoris [54], Tichocarpus crinitus [81] và Acrocystis nana [96] cho thấy hoạt

tính chỉ ổn định trong khoảng pH trung tính (6 - 8) và bị mất đi hoạt tính nếu

pH nằm dƣới hoặc trên khoảng này.

Hoạt tính của lectin từ các rong Pterocladiella capillacea [84],

Gracilaria ornata [73], Kappaphycus alvarezii [14] và Gracilaria fisheri [86]

ổn định nhiệt đến 50 oC. Lectin từ rong Carpopeltis flabellata [54, 92] và

Acrocystis nana [96] chỉ ổn định đến 30 oC. Lectin từ một vài mẫu rong đỏ

nhƣ: Agardhiella tenera, Cystoclonium purpureum, Vidalia obtusiloba và

Pterocladiella capillacea thì nhạy với nhiệt, hoạt tính bị mất khi nhiệt độ tăng

lên 60 oC [53, 56, 43, 90]. Tuy nhiên, một vài lectin từ rong đỏ ổn định ở

25

nhiệt độ cao nhƣ: lectin từ rong Bryothamnion seaforthii, B. triquetrum (90

oC) [70], Gracilaria verrucosa

d, G. verrucosa

c (

c High molecular weight G.

verrucosa haemagglutinin – HGVH, d Low molecular weight G. verrucosa

haemagglutinin – LGVH, 100 oC) [97, 74], Ptilota serrrata (80

oC) [85] và

Georgiella confluens (80 oC) [52].

1.3.1.5. Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của lectin rong biển

Hầu hết hoạt tính sinh học của lectin từ rong biển không phụ thuộc vào

cation hóa trị hai; tuy nhiên, một vài lectin nhƣ là Plumaria elegans, P.

serrata [62], P. filicina [79], Enantiocladia duperreyi [83] và V. obtusiloba

[90], A. nana [96] thì phụ thuộc vào ion kim loại nhƣ là Ca2+

, Mn2+

và Mg2+

.

Tuy nhiên, sự phụ thuộc vào cation hóa trị hai cho hoạt tính sinh học không

phải là đặc tính chung của lectin từ rong biển [98].

1.3.1.6. Hàm lượng carbohydrate trong lectin từ rong biển.

Một vài lectin từ rong biển là glycoprotein chứa hàm lƣợng

carbohydrate khác nhau, nhƣ lectin từ rong C. purpureum [56], G. bursa-

pastoris [93], E. duperreyi [83], G. ornata [73] và T. crinitus [81] là

glycoprotein. Hàm lƣợng carbohydrate của lectin từ rong biển có thể thấp nhƣ

2,7 % trong lectin của rong A. tenera [53] hay 2,9 % trong lectin của rong G.

ornata [73] hoặc cao nhƣ 43 % trong lectin của rong V. obtusiloba [90] hay

52,5 % trong lectin của rong G. cornea [72].

1.3.1.7. Trọng lượng phân tử của lectin từ rong biển.

Lectin từ rong biển thƣờng có khối lƣợng phân tử thấp và tồn tại ở dạng

monomer, nhƣ lectin từ các rong C. flabellata, S. robusta [92], B. seaforthii,

B. triquetrum [70], P. capillacea [84], H. musciforms [78], G. ornata [73],

G.cornea [72], Griffithsia sp. [75, 99, 100], K. alvarezii [14], T. crinitus [81]

và K. striatum [15]. Tuy nhiên, một vài lectin từ rong biển có cấu trúc dimer,

nhƣ lectin từ các rong P. palmata [60] và V. obtusiloba [90]; cấu trúc trimer

nhƣ lectin từ rong P. filicia [79], P. serrata [85], Ptilota plumosa và Ptilota

gunneri [101]; cấu trúc tetramer nhƣ lectin từ rong G. verrucosa [58]. Lectin

26

từ rong Aglaothamnion callophyllidicola có cấu trúc dimer bao gồm hai nhóm

nhỏ có khối lƣợng phân tử khác nhau: 50 và 14 kDa [69]. Các đồng phân

lectin SfL-1 và SfL-2 từ rong S. filiformis có khối lƣợng phân tử là 27.552 và

27.985 kDa (tƣơng ứng) [88]. Trên cơ sở đặc tính hóa sinh cơ bản, Rogers và

Hori (1993) đã phân chia lectin từ rong biển thành 3 loại: (a) lectin liên kết

với glycoprotein có khối lƣợng phân tử thấp, (b) lectin liên kết với đƣờng đơn

có khối lƣợng phân tử trung gian, (c) lectin có khối lƣợng phân tử lớn liên kết

với đƣờng đơn (MW > 64.000). Trong số tất cả lectin từ rong biển đã công bố

cho đến hiện nay, lectin từ rong Bryothamnion seaforthii và B. triquetrum có

khối lƣợng nhỏ nhất là 3500 và 4500 Da (tƣơng ứng) [70].

1.3.1.8. Cấu trúc của lectin từ rong biển.

Phân tích cấu trúc của lectin giúp khám phá các ứng dụng tiềm năng

của chúng trong các lĩnh vực khác nhau. Trong tất cả các lectin từ rong biển,

cấu trúc bậc 1 của lectin từ B. triquetum (BTL) đã đƣợc xác định [95]. Đặc

tính cấu trúc của lectin từ rong B. triquetum đã chứng minh sự tƣơng tác của

lectin với octasaccharide [102]. Cấu trúc tinh thể của lectin griffithsin đã đƣợc

nghiên cứu chi tiết và nó là một dimer đồng nhất với mỗi đơn vị nhỏ chứa 121

amino axit [103, 104, 105]. Cấu trúc tinh thể lectin từ rong Griffithsia sp. và

sự tƣơng tác của nó với những phân tử glycan riêng biệt nhƣ là mannose, N-

acetylglucosamine, 1 6 mannobiose và maltose đã cũng đƣợc xác định

[103, 104, 105]. Phân tích phức GRFT-glycan cho thấy gần nhƣ ba vị trí liên

kết carbohydrate giống nhau (cách nhau khoảng 15Ao) đƣợc tìm thấy trên mỗi

monomer của GRFT và nhƣ vậy có sáu vị trí chính đƣợc tìm thấy trong dimer

[103]. Các nghiên cứu tƣơng tác GRFT-glucose [103] và GRFT-mannose

[104] cho thấy sự khác biệt trong định hƣớng của nguyên tử O1. Sự tƣơng tác

nhiệt đối với glucose (giảm 1,5 lần) và N-acetylglucosamine (giảm 2 lần) khi

đƣợc so sánh với mannose đƣợc chỉ rõ bởi các thí nghiệm chuẩn độ nhiệt

đẳng điện với GRFT [104, 105]. Tuy nhiên, sự bão hòa của liên kết không

xảy ra trong trƣờng hợp GRFT-glucose và GRFT-N-acetylglucosamine [105].

Vào năm 2010, Moulaei và các cộng sự đã tạo nên một biến thể

monomer của GRFT (mGRFT), và các nghiên cứu về phức Man9-GRFT đã

27

chứng minh rằng lectin GRFT đã liên kết với các gốc đƣờng mannose cuối

cùng của nhánh D1 và D2 (Hình 1.2)

Cấu trúc bậc một của lectin từ rong Eucheuma sera [8], E. denticulatum

[17], K. striatum [18], K. alvarezii [11] và S. filiformis [80] đã cho thấy có

bốn miền lặp lại kế tiếp nhau, mỗi vùng chứa từ 67 đến 68 axit amin. Các

lectin này bao gồm hai thùng β (β-barrel), mỗi thùng chứa 2 tấm β, mỗi tấm β

chứa 5 dải β [106] (Hình 1.1).

*** * ***

EDA-1 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAGLWILGSRGNQNVIAIDVSSSDVGANLKGTMTYSGEGPIGFKGVRRGD 67

EDA-2 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAGLCILGSRGNQNVIAVDVTSSDGGANLGGTMTYSGEGPIGFKGARRGE 67

ESA-2 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAGLWILGSRGNQNVMAVDVNSSDGGANLNGTMTYSGEGPIGFKGARRGE 67

KSA-1 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAGLWILGSRGNQNVMAIDVNSSDGGANLNGTMTYSGEGPIGFKGARRGE 67

KSA-2 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAGLWILGSRGNQNVMAIDVNSSDGGANLNGTMTYSGEGPIGFKGARRGE 67

KAA-1 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAGLWILGSRSNQNVMAIDVNSSDGGANLNGTMTYSGEGPIGFKGARRGE 67

KAA-2 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAGLWILGSRGNQNVMAIDVNSSDGGANLNGTMTYSGEGPIGFKGARRGD 67

SfL-1 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAGLWLLGSRANQNVMDVSVTSSDGGATLTGTMTYSGEGPIGFKGTRRGD 67

SfL-2 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAGVFVLGGRANQNVMAIDVSSSDGGKTLTGTMTYSGEGPIGFKGTRRGE 67

*** * ***

EDA-1 SNVYEVENQWGGSSAPWHPGGDFVIGSRAGQGVTEVKISSSDGGKTMTGTMTYEGEGPIGFKGSKSG 134

EDA-2 SNVYDVENQWGGSSAPWHAGGQFVIGSRSGQGVTALSVTSSDGGKTLTGTMTYEREGPIGFKGTQSG 134

ESA-2 SNVYDVENQWGGSSAPWHAGGQFVIGSRSGQGVLAVNITSSDGGKTLTGTMTYEREGPIGFKGTQSG 134

KSA-1 SNVYDVENQWGGSSAPWHAGGQFVIGSRSGQGVLAVNITSSDGGKTLTGTMTYEREGPIGFKGTQSG 134

KSA-2 SNVYDVENQWGGSSAPWHAGGQFVIGSRSGQGVLAVNITSSDGGKTLTGTMTYEREGPIGFKGTQSG 134

KAA-1 SNVYDVENQWGGSSAPWHAGGQFVIGSRSGQGVLAVNITSSDGGKTLTGTMTYEREGPIGFKGTQSG 134

KAA-2 SNVYDVENQWGGSSAPWHAGGQFVIGSRSGQGVLAVNITSSDGGKTLTGTMTYEREGPIGFKGTQSG 134

SfL-1 SNNYDVENQWGGSSAPWHAGGTFVIGSRSGQGVVAVDVNSSDGGKTLTGTMTYANEGPIGFKGTQSG 134

SfL-2 SNNYEVENQWGGSSAPWHPAGTFVIGSRSGQAVVAMNVTSHDGGKTLSGHMTYENEGPIGFKGTQAE 134

*** * ***

EDA-1 GDSYNVKNQWGGSSAPWNKAGIWALGDRSGQGVVSIDVTSSDGGKTLEGTMQYTGEGPIGFRGRLGD 201

EDA-2 GDTYNVENQWGGSSAPWNKAGIWALGDRNGQAMIAMDVSSSDGGQTLEGTMQYKGEGPIGFRGKLSG 201

ESA-2 GDTYNVENQWGGSSAPWNKAGIWALGDRSGQAMIAMDVSSSDGGKTLEGTMQYKGEGPIGFRGKLSG 201

KSA-1 GDTYNVENQWGGSSAPWNKAGIWALGDRSGQAMIAMDVSSSDGGKTLEGTMQYKGEGPIGFRGKLSG 201

KSA-2 GDTYNVENQWGGSSAPWNKAGIWALGDRSGQAMIAMDVSSSDGGKTLEGTMQYKGEGPIGFRGKLSG 201

KAA-1 GDTYNVENQWGGSSAPWNKAGIWALGDRSGQAMIAMDVSSSDGGKTLEGTMQYKGEGPIGFRGKLSG 201

KAA-2 GDTYNVENQWGGSSAPWNKAGIWALGDRSGQAMIAMDVSSSDGGKTLEGTMQYKGEGPIGFRGKLSG 201

SfL-1 GDSYNVENQWGGSSAPWNKAGAWALGDRDGQGVIGVDVTSSDGGKTLTGTMQYQNEGPIGFKGTSTG 201

SfL-2 GDTYNVENQWGGSSAPWNKAGVWALGSRASQGVVKLDVSSSDGGKTLTGTMQYQNEGPIGFRGTLTG 201

*** * ***

EDA-1 ANNYTVENQWGGSSAPWNKAGNWLIGDRYNQNIIAVKISSSDNGKNMDGTCTYANEGPIGFKGAAV- 267

EDA-2 ANNYAVENQWGGSSAPWNKAGDWLIGDRYNQNITAVKVSSDNDGKNLDGTCTYEREGPIGFKGVATS 268

ESA-2 ANNYSVENQWGGSSAPWNAAGDWLIGDRHNQNITAVKVSSDNDGKNLDGTCTYEREGPIGFKGVATS 268

KSA-1 ANNYSVENQWGGSSAPWNKAGDWLIGDRHNQNITAVKVSSDNDGKNLDGTCTYESEGAIGFKGVAS- 267

KSA-2 ANNYSVENQWGGSSAPWNKAGDWLIGDRHNQNITAVKVSSDNDGKNLDGTCTYEREGPIGFKGVATS 268

KAA-1 ANNYSVENQWGGSSAPWNKAGDWLIGDRHNQNITAVKVSSDNDGKNLDGTCTYESEGPIGFKGVAS- 267

KAA-2 ANNYSVENQWGGSSAPWNKAGDWLIGDRHNQNITAVKVSSDNDGKNLDGTCTYEREGPIGFKGVATS 268

SfL-1 GSNYKVENQWGGSSAPWNPAGNWLIGDRHNQNIVAVKVTSSDNGKTLGGTCTYEREGPIGFKGTAI- 267

SfL-2 ANNYKAENQWGGSSGAWNPAGLWLIGDRHNQNIIGVKVTSDDNGKTLEGTCTYYREGPIGFKGVAN- 267

Hình 1.1. Cấu trúc bậc 1 của các lectin từ rong đỏ EDA-1 và EDA-2 từ rong

Eucheuma denticulatum [17]; ESA-2 từ rong Eucheuma serra [8]; KSA-1 và

28

KSA-2 từ rong Kappaphycus striatum [17, 107], KAA-1 và KAA-2 từ rong

Kappaphycus alvarezii [11], SfL-1 và SfL-2 từ rong Solieria filiformis [80].

Các axit amin giống nhau đƣợc tô màu xám nhạt. Các gốc đƣợc đánh dấu sao

là các acid amin (E: glutamic acid, W: Tryptophan, G: Glycine, R: Arginine,

P: Proline) tƣơng tác với các cấu trúc oligomannose trong Man9GlcNAc2 trên

lớp vỏ của virus HIV và virus cúm [108, 106].

liªn kÕt (

liªn kÕt (

liªn kÕt (

Hình 1.2. Cấu trúc Man9GlcNAc2. Man: mannose; GlcNAc: N-acetyl-D-

glucosamine

Hình 1.3. Cấu trúc lõi của Man3GlcNAc2 đƣợc thể hiện trong khung. Man:

mannose, GlcNAc: N-acetyl-D-glucosamine

29

Hình 1.4. Cấu trúc của lectin từ rong đỏ, carrageenophytes. I, II, III và IV thể

hiện các vị trí liên kết với cấu trúc oligomannose [80, 106].

1.3.1.9. Ứng dụng của lectin từ rong biển

Lectin đƣợc cô lập từ rong biển rất đa dạng và phong phú. Do có đặc

tính là khối lƣợng phân tử nhỏ và sự có mặt của các kiên kết disunlphide,

lectin rong biển có tính ổn định cao. Hơn nữa, với cấu trúc nhỏ làm cho chúng

trở nên thích hợp hơn khi sử dụng nhƣ các đầu dò chẩn đoán các cấu trúc

carbohydrate trên bề mặt tế bào và nhắm đến mục đích dƣợc phẩm [76]. Gần

đây, lectin trong rong biển đã nhận đƣợc sự quan tâm đáng kể do có liên kết

đặc hiệu với oligosaccharide [87]. Các kết quả nghiên cứu liên quan đến sự

phát triển của các công cụ để nghiên cứu ung thƣ, HIV và các bệnh khác. Mục

tiêu cuối cùng là phát triển các loại thuốc kháng vi khuẩn, ngăn cản virus tấn

công vào tế bào chủ [109]. Dựa trên đặc điểm liên kết carbohydrate, lectin đã

đƣợc sử dụng trong các liệu pháp khác nhau, nhƣ chẩn đoán ung thƣ, dấu hiệu

bệnh lý của bệnh, nhận biết glycan và kiểm soát nhiều loại bệnh.

30

Các ứng dụng của lectin từ rong biển có thể tóm tắt theo biểu đồ sau:

Hình 1.5. Biểu đồ thể hiện ứng dụng y sinh của lectin từ rong biển [110].

+ Khả năng kháng đau của lectin:

Tác dụng kháng đau của lectin từ rong biển Amansia multifida,

Bryothamnion seaforthii và Bryothamnion triquetrum đã đƣợc thông báo ở

hệ thần kinh trung ƣơng và ngoại vi [111, 112]. Lectin từ Amansia multifida

(Amansin/LEC) cũng đã đƣợc chỉ ra nhƣ thuốc giảm đau tiềm năng [111].

Lectin từ rong Hypnea cervicornis (HCA) có hiệu ứng kháng đau thông qua

sự tƣơng tác giữa carbohydrate và lectin. Lectin từ rong lục Caulerpa

cupressoides cho kết quả kháng đau và kháng viêm trong các mô hình kháng

đau và kháng viêm ở chuột [113].

+ Khả năng kháng vi m của lectin:

Lectin HCA cô lập từ rong Hypnea cervicornis bao gồm khả năng

kháng viêm hiệu quả trong kiểu phù nề chân và chứng viêm màng bụng.

Kháng viêm hiệu quả cũng thể hiện ở lectin từ các rong Caulerpa

cupressoides, Chlorella stigmatophora, Phaeodactylum tricornutum và

Amansia multifida [110].

31

+ Khả năng chống ung thƣ của lectin:

Lectin trong chống ung thƣ có thể dùng nhƣ là đầu dò chẩn đoán.

Nhiều lectin trong rong đã đƣợc báo cáo là có khả năng chống khối u, chống

lại tế bào ung thƣ ở ngƣời [114]. Chẳng hạn, lecin ESA từ rong Eucheuma

serra (ESA) gây chết tế bào ung thƣ đại tràng Colo 201 và tế bào ung thƣ cổ

tử cung Hela, có hoạt tính kích thích sự phân bào tế bào lympho của ngƣời và

chuột và làm giảm đáng kể khả năng tồn tại của tế bào ung thƣ Colo 201

trong điều kiện thí nghiệm, trong khi các tế bào bình thƣờng vẫn không bị ảnh

hƣởng [7]. Lectin BSL từ rong Bryothamnion seaforthii và BTL từ rong

Bryothamnion triquetrum có khả năng phân biệt các biến thể tế bào ung thƣ

đại tràng ở ngƣời [115]. Ngoài ra lectin từ một số loài rong khác cũng có khả

năng kháng ung thƣ nhƣ: Acrocystis nana [116], Halosaccion glandiforme

[117], Hypnea cervicornis [87], Solieria filiformis [88].

+ Khả năng kháng virus của lectin:

Lectin có nguồn gốc từ rong biển là một nguồn hợp chất kháng virus

[118]. Hoạt tính kháng virus phụ thuộc vào khả năng liên kết các

oligosacharide chứa manose có trên bề mặt của lớp vỏ virus. Lectin từ vi

khuẩn lam và các loại rong biển khác nhau đặc hiệu với dạng giàu mannose,

làm cho chúng trở thành ứng cử viên đầy hứa hẹn trong phòng ngừa sự lan

truyền khác nhau của màng virus nhƣ: sự suy giảm miễn dịch ở ngƣời (HIV),

siêu vi khuẩn cúm, siêu vi viêm gan C (HCV), virus Ebola và hội chứng hô

hấp cấp tính nặng (SARS) [103].

Lectin BCA từ rong lục Boodlea coacta có hoạt tính ức chế virus HIV

và virus cúm và cho thấy hoạt tính mạnh kháng hầu hết các chủng virus cúm,

bao gồm chủng cô lập của cúm H1N1 [10]. Lectin từ rong Kappaphycus

alvarezii (KAA-2) có hoạt tính mạnh kháng hầu hết các chủng virus cúm bao

gồm virus cúm H1N1 có nguồn gốc từ lợn [10].

32

Lectin CV-N đƣợc cô lập từ vi tảo lục lam Nostoc ellipsosporum cho

thấy một loạt các hoạt tính kháng virus cho cúm (A và B), virus Ebola, virus

herpes 6 ở ngƣời, HCV và virus sởi [119]. Lectin CV-N cũng là chất ức chế

tiềm năng của các chủng HIV-1, HIV-2 và virus suy giảm miễn dịch lâm sàng

[120, 121].

Griffithsin (GRFT) – một lectin đƣợc cô lập từ rong đỏ Griffithsia cũng

cho thấy có hoạt tính chống HIV mạnh, với nồng độ hiệu quả (EC50) là 0,043

– 0,63 µM [75].

1.3.2. Tình hình nghi n cứu ectin từ rong biển trong nƣớc

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về lectin trong rong chủ yếu là các nghiên

cứu của TS Lê Đình Hùng và cộng sự tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng

Công nghệ Nha Trang, bao gồm các kết quả sàng lọc lectin từ 88 mẫu rong

biển [13, 16], tinh chế và mô tả đặc tính của lectin từ rong đỏ Kappaphycus

alvarezii, Kappaphycus striatum, Eucheuma denticulatum, Gracilaria

salicornia, Hydropuntia eucheumatoides và từ bọt biển Stylissa flexibilis [14,

15, 17, 122, 123, 124], các dòng cDNA mã hóa lectin từ rong K. striatum và

E. denticulatum [17, 18, 107] và sự thay đổi theo mùa trong hàm lƣợng lectin

từ các rong đỏ đang nuôi trồng K. alvarezii và K. striatus [125].

Những nghiên cứu về đặc tính lectin cho thấy rằng: lectin từ rong biển

khác với lectin từ thực vật bậc cao ở một số tính chất: nhiều lectin từ rong

biển thƣờng tồn tại dạng monomer và có khối lƣợng phân tử nhỏ hơn lectin từ

thực vật bậc cao, hoạt tính ngƣng kết của chúng bền trong một khoảng rộng

của nhiệt độ và pH, không phụ thuộc vào cation hóa trị 2. Lectin từ rong biển

hầu hết không có ái lực với đƣờng đơn nhƣng có đặc tính liên kết

carbohydrate với các glycoprotein (liên kết dạng O-glycan hay N-glycan)

[98]. Chính vì vậy khả năng ứng dụng lectin từ rong biển trong y học ngày

càng đƣợc chú ý.

Dựa trên kết quả sàng lọc hemagglutinin từ rong biển Việt Nam [13]

cho thấy rằng: đặc tính liên kết carbohydrate của chi rong Gracilaria có nhiều

điểm khác so với các chi rong khác, chúng đặc hiệu với các glycoprotein dạng

33

dạng O-glycan. Rong đỏ H. eucheumatoides trƣớc đây là loài rong thuộc chi

Gracilaria, từ năm 2004 chi Gracilaria đƣợc đổi tên thành chi Hydropuntia

[126]. Rong H. eucheumatoides dùng để sản xuất agar ở Việt Nam và thế

giới. Trên thế giới, rong phân bố nhiều trên quần đảo Palau (Tây Thái Bình

Dƣơng), quần đảo Montebello (Tây Úc),...; ở nƣớc ta rong có trữ lƣợng lớn ở

vùng biển Nha Trang và Ninh Thuận. Đây chính là những điều kiện thuận lợi

giúp chúng tôi nghiên cứu, phân tích những đặc tính của lectin từ loài rong

này, từ đó có những định hƣớng để sử dụng lectin từ rong H. eucheumatoides

trong tƣơng lai.

1.4. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TINH CHẾ LECTIN

1.4.1. Sắc ký trao đổi ion

Lectin có bản chất protein nên phân tử của nó mang điện tích. Tùy

thuộc vào pH của môi trƣờng mà lectin mang điện tích dƣơng hoặc âm. Lợi

dụng tính chất này ngƣời ta đã sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tinh chế

lectin. Các chất nhựa gắn các nhóm chứa ion tích điện dƣơng nhƣ DEAE-

sephadex, DEAE-xenluloza, DEAE-trisacryl…đƣợc sử dụng làm chất trao đổi

anion. Các chất nhựa gắn các nhóm chức ion tích điện âm nhƣ CM-sephadex,

CM-xenluloza, CM-trisacryl…đƣợc sử dụng làm chất trao đổi cation. Mỗi

chất trao đổi ion đều có khả năng trao đổi một lƣợng ion nhất định gọi là dung

lƣợng trao đổi. Ngƣời ta có thể sử dụng hai loại chất trao đổi ion ở trên để

tinh chế lectin dựa vào bản chất ion hóa và khả năng trao đổi ion của phân tử

lectin trong những điều kiện môi trƣờng pH nhất định.

1.4.2. Sắc ký ọc ge

Đây là phƣơng pháp tách lectin ra khỏi hỗn hợp protein dựa vào kích

thƣớc phân tử. Chất nhựa thƣờng đƣợc sử dụng là Sephadex. Mỗi hạt

Sephadex có bản chất là polysaccharide chứa nhiều liên kết ngang tạo thành

hệ thống lỗ lƣới xốp. Có nhiều loại Sephadex, trong đó mỗi loại có mức độ

liên kết khác nhau tạo nên kích thƣớc của lỗ xốp khác nhau. Chính mức độ

liên kết này quyết định khả năng phân tách các chất có kích thƣớc phân tử

34

khác nhau. Để tinh chế lectin, ngƣời ta thƣờng dùng loại Sephadex G-75 và

Sephadex G-100.

Phƣơng pháp sắc ký lọc gel còn đƣợc dùng để xác định khối lƣợng

phân tử của chất cần tách.

1.4.3. Sắc ký ái ực

Nguyên tắc của phƣơng pháp sắc ký ái lực là dựa trên ái lực kết hợp

đặc hiệu của lectin với một phân tử khác gọi là phối tử (ligand) đƣợc gắn vào

một chất nền tạo nên pha tĩnh của cột sắc ký. Chất nhựa đƣợc sử dụng nhiều

nhất là một số loại gel: Sephadex, Sepharose, Sephacryl, Ultrogel….Quá trình

thực hiện sắc ký ái lực đƣợc tiến hành qua 3 giai đoạn: giai đoạn 1 là tạo cột

ái lực với lectin, giai đoạn 2 là gắn hay hấp phụ lectin vào cột ái lực và giai

đoạn 3 là phản hấp phụ lectin khỏi cột ái lực.

+ Giai đoạn 1: Thiết kế cột ái lực lectin: việc lựa chọn chất kết hợp có

ái lực đặc hiệu với lectin cần tách có ý nghĩa rất quan trọng. Vì vậy, cần phải

dựa vào tính chất của lectin cần tách, đặc tính lý hóa của chất kết hợp và đặc

biệt là khả năng liên kết đặc hiệu giữa lectin và chất kết hợp. Trong các thí

nghiệm tinh chế lectin ngƣời ta thƣờng lựa chọn các chất đƣờng, glycoprotein

hoặc chất cộng hợp đƣờng có ái lực hóa học với một lectin nhất định.

+ Giai đoạn 2: Hấp phụ lectin vào cột và loại bỏ các chất không có ái

lực với cột: Các lectin có ái lực với cột cần đƣợc tạo điều kiện tốt cho quá

trình hấp phụ (pH, nhiệt độ, quá trình hấp phụ nhiều lần), ở giai đoạn này các

protein không có ái lực với ligand và các protein hay lectin thừa sẽ bị đẩy ra

khỏi cột.

+ Giai đoạn 3: Giải hay phản hấp phụ lectin ra khỏi cột: Cần phải dùng

một dung dịch giải hấp phụ có ái lực thích hợp để phản hấp phụ lectin ra khỏi

cột.

Quá trình thực hiện sắc ký phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: dung dịch

giải hấp phụ, tốc độ dòng chảy.

35

1.5. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ PROTEIN

DỰA VÀO PHỔ KHỐI LƢỢNG

Phƣơng pháp khối phổ hay phƣơng pháp phổ khối lƣợng (Mass

spectrometry – MS) là một kỹ thuật dùng để xác định tỉ lệ khối lƣợng/điện

tích (m/z). Phƣơng pháp phổ khối lƣợng đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực

khác nhau, ví dụ trong hóa học phƣơng pháp này có nhiều ứng dụng quan

trọng nhƣ: xác định phân tử khối khối phổ, nhận biết các chất cùng với công

thức cấu trúc của chúng, xác định công thức cấu trúc của phân tử. Phƣơng

pháp này có khả năng phát hiện ra các hợp chất với độ nhậy cực cao từ 10-12

đến 10-6

gam.

1.5.1. Nguy n tắc chung

Khi cho các phân tử ở trạng thái khí va chạm với một dòng electron có

năng lƣợng cao thì từ các phân tử sẽ bật ra 1 hay 2 electron, khi đó nó trở

thành các ion mang điện tích : +1, +2 (trong đó ion có điện tích +1 chiếm tỉ lệ

lớn).

ABC + e

ABC+ + 2e (1)

(2)ABC+2 + 3e

Ion (1) đƣợc gọi là ion gốc hay ion phân tử.

Nếu các ion phân tử tiếp tục va chạm với dòng electron có năng lƣợng

cao thì chúng sẽ bị phá vỡ thành nhiều mảnh ion, tạo nên các gốc hoặc các

phân tử trung hòa khác nhau. Quá trình này đƣợc gọi là quá trình phân mảnh

(fragmentation).

ABC+ A+ + BC

ABC+ AB+ + C

A+ + B

Năng lƣợng của quá trình phân mảnh chỉ vào khoảng 30 – 100 eV, cao

hơn năng lƣợng ion hóa phân tử (8 – 15 eV).

36

Các ion có khối lƣợng m và điện tích e. Tỉ số m/e đƣợc gọi là số khối z.

Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định

đƣợc xác suất có mặt của chúng. Tiến hành vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ

giữa xác suất có mặt (hay cƣờng độ I) và số khối z, đồ thị thu đƣợc chính là

phổ khối lƣợng [127]

Từ vị trí của các peak phân tử đọc đƣợc trên phổ khối lƣợng ta sẽ biết

đƣợc số khối của phân tử hay còn gọi là phân tử khối khối phổ.

1.5.2. Phƣơng pháp xác định phân t khối của protein

Lectin có bản chất là protein hoặc glycoprotein, chúng là các polyme

đƣợc tạo thành từ sự kết hợp của 20 loại α-amino axit thông qua các liên kết

peptide. Dƣới tác dụng của các tác nhân, lectin sẽ bị phân cắt thành các chuỗi

peptide ngắn hơn. Ví dụ: xian bromua (BrCN) có khả năng phân cắt mạch

peptit sau gốc Methionin (Met); hoặc enzyme Tripsin có khả năng phân cắt

liên kết sau gốc Lysin (Lys) và Arginin (Arg), emzyme Chimotripsin có khả

năng phân cắt liên kết sau gốc Phenylalanin (Phe), Tyrosin (Tyr), Leuxin

(Leu), Axit aspactic (Asp), Axit glutamic (Glu) và Trytophan (Trp),.... Sau khi

các chuỗi peptide đƣợc tinh chế, tiến hành cho mẫu vào máy phân tích khối

phổ, thu khối phổ đồ. Từ đó xác định phân tử khối của protein.

1.6. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ AXIT AMIN TRONG

LECTIN

Trình tự các axit amin trong protein nói chung cũng nhƣ lectin nói

riêng đƣợc xác định theo phƣơng pháp thoái biến Edman [128], phƣơng pháp

này đƣợc phát triển bởi Pehr Edman, đây là một phƣơng pháp xác định trình

tự các axit amin trong chuỗi peptide. Trong phƣơng pháp này, gốc axit amin

đầu cuối (đầu N) đƣợc đánh dấu và tách khỏi peptide mà không làm phá vỡ

liên kết peptide giữa các gốc axit amin khác.

37

Cơ chế của phản ứng:

Phenyl isothiocyanate phản ứng với nhóm –NH2 của axit amin đầu N

không mang điện tích, trong môi trƣờng kiềm nhẹ tạo thành dẫn xuất

phenylthiocarbamoyl. Tiếp đến, trong môi trƣờng axit, dẫn xuất này bị phân

cắt thành dẫn xuất thiazolinone. Sau đó, axit amin thiazolinone đƣợc chiết với

dung môi hữu cơ thích hợp và đƣợc xử lý bằng axit để tạo thành

phenylthiohydantoin (PTH) ổn định hơn – dẫn xuất axit amin có thể đƣợc xác

định bằng phƣơng pháp sắc ký hoặc điện di. Quá trình này đƣợc lặp lại một

lần nữa để xác định axit amin tiếp theo. Chiều dài chuỗi peptide bị hạn chế do

quá trình tạo dẫn xuất không phải lúc nào cũng hình thành hoàn chỉnh. Vấn đề

tạo dẫn xuất có thể đƣợc giải quyết bằng cách tách các peptide lớn thành các

peptide nhỏ hơn trƣớc khi tiến hành phản ứng. Phƣơng pháp này có khả năng

sắp xếp chính xác đến 30 axit amin. Ƣu điểm lớn của phƣơng pháp suy thoái

Edman là phản ứng chỉ cần sử dụng 10 – 100 pico-mol peptide cho quá trình

xác định trình tự chuỗi peptide.

Hạn chế của phương pháp suy thoái Edman:

Vì sự thoái biến Edman bắt nguồn từ đầu N của protein nên nó sẽ

không hoạt động nếu đầu N đã bị biến đổi hóa học (ví dụ nhóm –NH2 bị

acetyl hóa hoặc hình thành axit pyroglutamic). Trình tự sẽ dừng lại nếu gặp

phải một axit không phải là axit amin (ví dụ axit isoaspartic), vì chất trung

https://en.wikipedia.org/wiki/File:EdmanDegradation.png

38

gian vòng năm cạnh bền không thể đƣợc hình thành. Phƣơng pháp thoái biến

Edman thƣờng không hữu ích để xác định vị trí của cầu disulfide. Nó cũng

cần một lƣợng peptide từ 1 pico-mol trở lên để có kết quả rõ rệt.

39

2CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Vật liệu nghiên cứu: Rong đỏ Hydropuntia eucheumatoides thu ở vùng

biển Ninh Thuận.

Hình 2.1. Hình ảnh rong Hydropuntia eucheumatoides

Rong H. eucheumatoides phát triển ở phía Nam miền Trung Việt Nam

trong vùng triều ở độ sâu 1,5 - 3 m, nó đƣợc thu từ tháng 3 đến tháng 9 và

đƣợc sử dụng để nấu kẹo. Trữ lƣợng của rong nhỏ, nhƣng có giá trị cao trên

thị trƣờng.

Rong H. eucheumatoides trƣớc đây có tên gọi là Gracilaria

eucheumatoides (Harvey). Nguyên nhân là do trƣớc năm 2004, các loài rong

câu ở Việt Nam vẫn đƣợc xếp trong một chi Gracilaria thuộc bộ Gigartinales;

nhƣng hiện nay, theo các nghiên cứu mới nhất về hình thái giải phẫu hình thái

https://translate.googleusercontent.com/translate_c?depth=1&hl=vi&prev=search&rurl=translate.google.com&sl=en&sp=nmt4&u=http://www.algaebase.org/search/species/detail/%3Fspecies_id%3D1900&xid=17259,1500001,15700023,15700186,15700190,15700256,15700259&usg=ALkJrhjUII8N7JQhaHpx6prh_NCPyLqIsA

https://translate.googleusercontent.com/translate_c?depth=1&hl=vi&prev=search&rurl=translate.google.com&sl=en&sp=nmt4&u=http://www.algaebase.org/search/species/detail/%3Fspecies_id%3D1900&xid=17259,1500001,15700023,15700186,15700190,15700256,15700259&usg=ALkJrhjUII8N7JQhaHpx6prh_NCPyLqIsA

40

cơ quan sinh sản đực và phân tích DNA, các tác giả đã thống nhất sắp xếp

chúng vào 3 chi: Gracilaria, Gracilariopsis và Hydropuntia thuộc bộ

Gracilariales nên rong Gracilaria eucheumatoides đã đƣợc cập nhật với tên

khoa học mới là Hydropuntia eucheumatoides [126, 129].

Rong H. Eucheumatoides đƣợc định danh theo khóa phân loạ nhƣ sau:

Giới Plantae

Ngành Rhodophyta

Lớp Florideophyceae

Bộ Gracilariales

Họ Gracilariaceae

Chi Hydropuntia

Loài Hyropuntia eucheumatoides

Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha

Trang, Thành phố Nha Trang, Tỉnh Khánh Hòa.

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 06/2018 đến tháng 09/2018.

2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.2.1. Nguy n vật iệu

Rong đỏ H. Eucheumatoides đƣợc thu ở biển Ninh Thuận vào tháng

4/2018. Sau khi thu, rong đƣợc rửa sạch bằng nƣớc biển, giữ lạnh và chuyển

về phòng thí nghiệm. Rong đƣợc xay nhuyễn trong nitơ lỏng, cho vào các túi

nilon và cất giữ lạnh ở - 20 oC cho đến khi dùng.

Hồng cầu của máu thỏ, cừu và gà do Viện Vắc Xin và Sinh Phẩm Y Tế

Nha Trang, Tỉnh Khánh Hòa cung cấp. Hồng cầu thuộc các nhóm máu A, B,

O ở ngƣời đƣợc lấy từ Bệnh viện Đa khoa Tỉnh Khánh Hòa.

2.2.2. Hóa chất

- Các loại đƣờng và glycoprotein: D-glucose, D-mannose, D-galactose,

D-xylose, D-glucosamine, D-gluconic acid, p-nitrophenyl-D-galactoside, p-

nitrophenyl-D-glucoside, p-nitrophenyl-D-mannoside, laminaran, transferrin,

http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=1






41

fetuin, porcine thyroglobulin và procine stomach mucin; Yeast mannan mua

từ hãng Merck (Đức).

- Nhựa sắc kí lọc gel Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsala – Thụy

điển).

- Nhựa sắc kí trao đổi ion DEAE-sepharose Fast Flow (Pharmacia,

Uppsala – Thụy điển)

- Enzyme trypsine, papain (Sigma – Mỹ).

- Thuốc thử Folin (Merck – Đức)

- BSA (Bovine serume albumin – Đức).

- Hóa chất phân tích các loại: NaH2PO4, Na2HPO4, NaCl, CuSO4,

NaOH, Na2CO3, H2SO4, CH3COOH, glyxerol.

Tất cả các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều đạt hạng phân tích.

2.2.3. Thiết bị s dụng trong nghi n cứu

Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu gồm:

Bảng 2.1. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm

STT Thiết bị Model máy Xuất sứ

1 Máy đo quang phổ UV-Vis 6405UV/VIS Jenway-Anh

2 Máy ly tâm Z36HK Hermel-Đức

3 Máy ly tâm eppendorf 5417R Eppendorf – Đức

4 Máy đo pH 827pH Lab Metrohm-Thụy Sỹ

5 Bể ổn nhiệt B12 Heraeus-Đức

6 Bể siêu âm UTRASONIC Hàn quốc

7 Hệ thống sắc ký lọc gel GPC-2414 Waters-Mỹ

42

8 Thiết bị điện di đứng AJ-6530 Atto-Japan

9 Tủ ấm ON-11E Gallenkamp

10 Máy lắc (kiểu tròn) 3017 GFL – Đức

11 Cân phân tích CP224S Satorius – Đức

12 Bộ siêu lọc Toya-Roshi, UHP43 Nhật

13 Máy đo quang Spectro UV 2505/24RS Labomed

14 Cột sắc kí ion 1,6x20 (cm) GE Healthcare –

Thụy điển

15 Các loại Micropipet 2 20 ;20 200 ;...l l Nichiryo – Nhật

16 Khay 96 giếng đáy chữ V Polystyrene Greiner – Đức

17 Hệ thống bơm và thu phân

đoạn

Frac-920 GE Healthcare –

Thụy điển

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Chuẩn bị huyền phù hồng cầu máu 2 % (hồng cầu máu thỏ,

cừu, gà và các nhóm máu ngƣời A, B, O) :

Mỗi mẫu máu đƣợc rửa từ 3 đến 5 lần với 50 thể tích dung dịch NaCl

0,15 M. Sau khi rửa, huyền phù hồng cầu máu 2 % (v/v) đƣợc chuẩn bị bằng

cách thêm dung dịch đệm photphat 0,02 M có chứa NaCl 0,15 M,

pH = 7,2 và đƣợc dùng nhƣ hồng cầu tự nhiên [13].

Hồng cầu các mẫu máu đƣợc xử lý enzyme tripsin hay papain đƣợc

chuẩn bị nhƣ sau: 1

10 thể tích của dung dịch trypsin hay papain 0,5 % (w/v)

đƣợc thêm vào huyền phù các mẫu máu tự nhiên 2% (v/v), trộn đều và đƣợc ủ

ở 37 oC trong 60 phút. Sau khi ủ, hồng cầu các mẫu máu đƣợc rửa từ 3 đến 5

lần với dung dịch muối và hòa lại bằng dung dịch đệm photphat 0,02 M có

43

chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2. Ta thu đƣợc huyền phù hồng cầu các mẫu máu

2 % đã xử lý enzyme trypsin hay papain [13].

2.3.2. Phân tích hoạt tính ectin bằng phƣơng pháp ngƣng kết hồng

cầu (hồng cầu máu thỏ, cừu, gà và các nhóm máu ngƣời A, B, O).

Hoạt tính của lectin đƣợc xác định dựa trên phƣơng pháp ngƣng kết

hồng cầu [13].

Các thí nghiệm phân tích hoạt tính của lectin đƣợc thực hiện trong đĩa

96 giếng đáy chữ V. Đầu tiên, cho 25 µL dung dịch đệm photphat 0,02 M có

chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2 vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đáy chữ V. Tiếp

đến cho 25 µL mẫu dịch chiết lectin cần phân tích hoạt tính ngƣng kết hồng

cầu vào giếng đầu tiên, trộn đều, pha loãng sang các giếng tiếp theo với tỷ lệ

pha loãng là n

1

2 (n: số lần pha loãng) và giữ ở nhiệt độ phòng trong khoảng

thời gian 1 giờ. Sau đó, tiếp tục thêm 25 µL hồng cầu 2 % vào tất cả các

giếng, lắc nhẹ nhàng hỗn hợp và giữ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Đọc kết

quả.

Kết quả dƣơng tính đƣợc thể hiện khi hình thành một lớp chất keo đồng

nhất trên bề mặt giếng. Kết quả thử nghiệm là âm tính khi tất cả hồng cầu

lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ.

Hoạt tính của lectin (HU/mL) đƣợc thể hiện nhƣ là một tiêu chuẩn, và

là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng lớn nhất mà dịch chiết lectin còn có khả

năng làm ngƣng kết hồng cầu cho vào phản ứng.

Thí nghiệm đƣợc thực hiện 3 lần đối với mỗi loại hồng cầu đƣợc thử

nghiệm.

Hoạt tính lectin: đƣợc xác định theo 2 chỉ số:

- Hoạt tính tổng (Utổng): là tổng số đơn vị hoạt tính có trong một thể tích nhất

định. Đơn vị: HU

Utổng = V. 2n

Trong đó: V: tổng thể tích (mL)

n: số lần pha loãng

- Hoạt tính riêng (Uriêng): là số đơn vị hoạt tính lectin có trong 1mg protein.

44

Đơn vị: HU/mg

Pr

toång

rieâng

toång

U

U

otein

Trong đó: Utổng: tổng số đơn vị hoạt tính.

Proteintổng: tổng hàm lƣợng protein.

MAC (minimum agglutination concentration): là nồng độ protein nhỏ nhất có

khả năng gây ngƣng kết hồng cầu đã đƣợc xử lý enzyme. Đơn vị : µg/mL

Haøm löôïng protein

MAC

HA

2.3.3. Xác định hàm ƣợng protein.

Xác định hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp của Lowry và cộng sự

[130], dùng albumin huyết thanh bò (BSA – Bovine serium albumin) làm chất

chuẩn.

* Nguyên tắc

Trong môi trƣờng kiềm, ion Cu2+

tạo thành phức chất với các liên kết

peptide trong protein, khi đó nó bị khử thành ion Cu+. Ion Cu

+ và các gốc của

Tyrosine, Tryptophan và Cysteine phản ứng với thuốc thử Folin để tạo ra một

sản phẩm không bền rồi bị khử thành molipden/vonfram xanh. Cƣờng độ màu

tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định.

Đo cƣờng độ màu bằng thiết bị đo màu quang điện ở bƣớc sóng 750nm.

Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định đƣợc hàm lƣợng

protein ở nồng độ vài chục µg.

* Hóa chất

- Dung dịch A: 4 gam NaOH (0,1 M) và 20 gam Na2CO3 2 % pha trong 1000

mL nƣớc cất.

- Dung dịch B: 0,5 gam CuSO4.5H2O 0,5 % pha trong dung dịch Natri Xitrat

(1 %) hoặc trong dung dịch Natri – Kali Tactrat 1 %.

- Dung dịch C: hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (v/v), pha

trƣớc khi sử dụng.

45

Ghi chú: Thuốc thử Folin, pha loãng 2 lần với nƣớc cất trƣớc khi sử dụng.

- Dung dịch gốc: Albumin huyết thanh bò (BSA) 1mg/mL.

* Các bƣớc tiến hành

- Cân 10 mg BSA hòa tan trong 10 mL nƣớc cất, thu đƣợc dung dịch gốc có

nồng độ 1 mg/mL.

- Sau đó, pha loãng dung dịch gốc bằng nƣớc cất thành các nồng độ 20, 40,

60, 80, 100 và 120 µg/mL để tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn.

- Lấy chính xác 0,5 mL dịch chứa protein với các nồng độ khác nhau cho vào

ống nghiệm, thêm vào đó 2,5 mL dung dịch C, lắc đều để yên trong 20 phút.

- Sau đó, thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25 mL thuốc thử Folin đã pha

loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 60 phút.

- Đem so màu của hỗn hợp trên máy so màu quang điện ở bƣớc sóng 750nm.

Thực hiện thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng

đƣờng hồi quy. Kết quả đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê thông thƣờng.

Mẫu thí nghiệm cũng đƣợc chuẩn bị tƣơng tự nhƣ đã nêu trên. Sau đó,

đem so màu ở bƣớc sóng 750nm, đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA (Phụ lục 1)

để tính hàm lƣợng protein trong các mẫu.

46

2.3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thực nghiệm:

Rong H.

eucheumatoides

Xử lý

Chiết

Lọc, ly tâm thu dịch

chịchie61t

Kết tủa dịch chiết

Ly tâm, thu tủa

Hòa tan tủa, thẩm tách

Ly tâm, thu dịch trong

Sắc ký trao đổi ion

Thu các phân đoạn có lectin

cô đặc

Sắc ký lọc gel

Sephacryl S - 200

Điện di SDS - PAGE

Lectin

Bã

Dịch

Xác định:

- Đặc tính liên kết cacbohiđrat

- Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính

Lectin: pH, nhiệt độ, …

- Khả năng gây ngƣng kết hồng cầu.

- Điện di SDS-Page, xác định:

+ Độ tinh sạch của lectin thu nhận

đƣợc

+Trọng lƣợng phân tử của Lectin

thu đƣợc

Cặn

Khảo sát điều kiện chiết:

- Dung môi chiết.

- Tỷ lệ nguyên liệu: dung môi

chiết (w/v).

- Thời gian chiết (giờ).

Khảo sát:

Nồng độ ethanol C2H5OH (%).

47

Mô tả sơ đồ:

Rong đỏ H. eucheumatoides sau khi thu về đƣợc rửa sạch, tiến hành

xay rong thành bột mịn bằng cối xay inox có bổ sung nitơ lỏng. Cho rong đã

xay vào túi nilon và bảo quản trong tủ đông -20 oC để chuẩn bị cho các thí

nghiệm sau này.

Quá trình chiết lectin đƣợc thực hiện trong các điều kiện tối ƣu nhƣ: tỷ

lệ nguyên liệu:dung môi, nồng độ dung môi, thời gian chiết. Dịch chiết thô

đƣợc lọc bằng túi vải, tiến hành ly tâm 6.000 vòng/phút trong 15 phút để loại

bỏ cặn bã.

Thêm ethanol với nồng độ thích hợp vào dịch chiết để kết tủa lectin.

Sau khi tủa, tiến hành ly tâm dịch tủa ở 6.000 vòng/phút trong 30 phút. Loại

bỏ dịch trong. Dùng lƣợng đệm ít nhất để hòa tan kết tủa. Dịch tủa sau đó

đƣợc thẩm tách, rồi tiến hành ly tâm ở 6.000 vòng/phút trong 30 phút, thu

phần dịch trong. Đây chính là chế phẩm của lectin.

Tiến hành tinh sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-sepharose,

thu các phân đoạn có hoạt tính ngƣng kết hồng cầu, cô đặc dịch trong bằng

màng siêu lọc kích thƣớc 10 kDa. Thẩm tách để loại muối. Tiếp tục tinh chế

lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S-200, thu các phân đoạn có hoạt tính, cô

đặc, thẩm tách trong nƣớc cất để tiến hành các thí nghiệm sau.

Lectin thu đƣợc sau sắc ký lọc gel đƣợc dùng để khảo sát một số tính

chất lý hóa nhƣ: ảnh hƣởng của nhiệt độ, ảnh hƣởng của pH, ảnh hƣởng của

cation hóa trị 2 hay EDTA, đặc tính liên kết cacbohidrat; cũng nhƣ dùng để

đánh giá độ tinh sạch, xác định khối lƣợng phân tử của lectin bằng phƣơng

pháp điện di.

2.3.5. Phân tích các điều kiện tối ƣu để chiết ectin từ rong đỏ H.

Eucheumatoides

Nguyên tắc chung:

Khi tiến hành phân tích một yếu tố nhất định trong quá trình tách chiết

nhƣ: tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết, nồng độ dung môi, thời gian

48

chiết,…thì khi đó sẽ cố định các yếu tố khác và tiến hành thay đổi yếu tố

chúng ta đang phân tích. Yếu tố nào phân tích xong thì sẽ đƣợc cố định ở giá

trị tối ƣu để tiếp tục phân tích ảnh hƣởng của các yếu tố còn lại. Với mỗi yếu

tố phân tích, khi giá trị hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của lectin đạt giá

trị cực đại thì đó là điều kiện tối ƣu đối với yếu tố chúng ta đang phân tích.

2.3.5.1. Phân tích tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết

Cân khoảng 5 gam rong đã xay cho vào các ống Falcon, tiếp tục cho

vào dung dịch ethanol 20 % với các tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v): 1:2,

1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, giữ ở 4 oC trong 6 giờ. Sau đó lọc thô qua túi vải

rồi ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết thô (mỗi

mẫu đƣợc tiến hành 3 lần lặp lại).

Xác định hàm lƣợng protein, hoạt tính tổng số, hoạt tính riêng của từng

dịch chiết thô. Phân tích, so sánh và chọn ra tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết

(w/v) thích hợp nhất.

2.3.5.2. Phân tích nồng độ ethanol chiết

Cân khoảng 5 gam rong đã xay cho vào các ống Falcon, thêm tiếp dung

môi etanol với các nồng độ khác nhau 10 %; 20 %; 30 %; 40 %, với tỷ lệ

nguyên liệu:dung môi (w/v) thích hợp, giữ các ống này ở 4 oC trong 6 giờ.

Sau đó lọc thô qua túi vải rồi ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút,

thu dịch chiết thô (mỗi mẫu đƣợc tiến hành 3 lần lặp lại).

Xác định hàm lƣợng protein, hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của

từng dịch chiết thô. Phân tích, so sánh và chọn ra nồng độ dung môi chiết

thích hợp.

2.3.5.3. Phân tích thời gian chiết

Cho vào các ống Falcon rong đã xay với tỷ lệ nguyên liệu:dung môi tối

ƣu, thêm tiếp dung môi ethanol có nồng độ tối ƣu, giữ ở 4 oC và trong các

khoảng thời gian khác nhau: 2, 4, 6, 8, 10, 12 (giờ). Sau từng khoảng thời

gian 2, 4, 6,…(giờ), tiến hành lọc sản phẩm qua túi vải rồi ly tâm với tốc độ

49

6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết thô (mỗi mẫu đƣợc tiến hành 3

lần lặp lại).

Xác định hàm lƣợng protein, hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của

từng dịch chiết. Phân tích, so sánh và chọn ra thời gian chiết thích hợp.

2.3.6. Phân tích nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa ectin từ dịch

chiết.

Tiến hành phân tích khả năng tủa lectin từ dịch chiết thô bằng tác nhân

tủa là ethanol ở các nồng độ khác nhau.

Trƣớc hết cần xác định thể tích dịch chiết thô của lectin, sau đó tính toán

theo công thức (*) để xác định thể tích ethanol tuyệt đối (đƣợc giữ lạnh ở -20 oC) cần thêm vào dịch chiết để sau khi trộn nồng độ của ethanol có các giá trị

khoảng 50%, 60%, 70%, 80%. Tiến hành trộn và giữ lạnh ở 4 oC qua đêm.

Phần kết tủa sẽ đƣợc thu lấy và ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong

20 phút ở 4 oC. Kết tủa đƣợc rửa 3 lần với cồn tuyệt đối (giữ lạnh ở -20

oC) và

ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 oC

(Các thí nghiệm đƣợc tiến hành 3 lần và lấy giá trị trung bình).

Công thức xác định nồng độ ethanol dùng để kết tủa lectin ứng với thể

tích 1,0 lít:

1000(y x)

y (mL)(100 x)

[131]

Trong đó: x: nồng độ ethanol trong dịch chiết thô.

y: nồng độ ethanol thu đƣợc sau khi trộn.

100: nồng độ ethanol tuyệt đối (thực tế nồng độ ethanol

tuyệt đối chỉ đạt 96o)

Kết tủa lectin thu đƣợc đƣợc hòa với dung dịch đệm photphat 0,02 M

không muối, pH= 7,5 (lƣợng ít nhất) để đƣa về cùng thể tích. Sau đó, tiến

hành xác định hoạt tính tổng số, hoạt tính riêng, từ đó chọn ra nồng độ tủa

thích hợp.

50

2.3.7. Tinh sạch ectin bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion

DEAE-Sepharose

* Nguyên tắc: Nhựa DEAE – Sepharose là nhựa trao đổi anion yếu.

Hỗn hợp mẫu qua cột sắc ký chứa nhiều loại protein với khả năng tích điện

tích âm khác nhau, do đó, khả năng liên kết với nhựa cũng sẽ khác nhau.

Trong quá trình rửa giải, khi thay đổi nồng độ muối, những protein nào liên

kết yếu với cột sẽ bị đẩy ra trƣớc, còn những protein liên kết chặt hơn sẽ bị

đẩy ra ở nồng độ muối cao hơn.

* Quy trình chạy sắc ký trao đổi ion: Lectin từ dịch chiết sau khi kết

tủa đƣợc thẩm tách trong dung dịch đệm cacbonat 0,02 M, pH = 9,0. Phần

dịch trong đƣợc tiến hành chạy qua cột sắc ký trao đổi ion, dùng pha động là

dung dịch đệm cacbonat 0,02 M, pH = 9,0 (loại khí) để rửa giải các protein

không liên kết và các chất màu, đến khi đo đƣợc A280nm gần bằng 0. Lectin sẽ

đƣợc rửa giải bằng dung dịch đệm cacbonat 0,02 M có chứa NaCl 0,5 M, pH

= 9,0, thu các phân đoạn. Tiến hành đo A280nm, xác định hoạt tính ngƣng kết

hồng cầu của các phân đoạn, từ đó thu nhận các phân đoạn có hoạt tính và

tiến hành cô đặc nồng độ bằng màng siêu lọc kích cỡ 10 kDa. Vẽ đồ thị biểu

diễn sự tƣơng quan giá trị A280 nm, hoạt tính ngƣng kết hồng cầu và thứ tự các

phân đoạn.

Các thông số đƣợc thiết lập trong quá trình chạy sắc ký trao đổi ion

DEAE – Sepharose:

- Nhựa trao đổi ion DEAE – Sepharose

- Kích thƣớc cột: 1,6 x 20 cm

- Pha động: dung dịch đệm cacbonat 0,02 M; pH = 9,0 (loại khí);

dung dịch đệm cacbonat 0,02 M, có chứa NaCl 0,5 M,

pH = 9,0 (loại khí).

- Thể tích mẫu: 10 mL

- Tốc độ dòng: 10 mL/phút

- Thể tích mỗi phân đoạn: 5 mL/phân đoạn

- Số lƣợng phân đoạn: 54 phân đoạn.

- Tổng thể tích dung dịch đệm rửa giải: 270 mL.

51

2.3.8. Tinh sạch ectin bằng phƣơng pháp sắc ký ọc ge Sephacry

S – 200 .

* Nguyên tắc: Sephacryl S-200 là gel agarose có khả năng phân tách

những protein có kích thƣớc từ 5,0.103 – 2,5.10

5 Da. Do đó, khi cho dịch

chiết chứa protein qua cột, những chất có kích thƣớc lớn đi len lõi ở bên ngoài

các hạt gel, di chuyển nhanh và ra ngoài trƣớc; trong khi đó những phân tử có

kích thƣớc nhỏ thì bị hấp thụ vào bên trong lỗ gel nên di chuyển chậm, ra

khỏi cột sau.

* Quy trình chạy sắc ký lọc gel: Dịch thu đƣợc sau khi chạy sắc ký

trao đổi ion DEAE-sepharose có hoạt tính ngƣng kết hồng cầu đƣợc cô đặc

bằng màng siêu lọc có kích thƣớc cỡ 10 kDa, sau đó tiến hành thẩm tách

trong đệm photphat 0,05M có chứa NaCl 0,15M, pH = 7,0 ở 4 oC (để qua

đêm) để cân bằng nồng độ muối và pH.

Tiến hành tinh sạch lectin bằng cách bơm mẫu vào cột sắc ký, sử dụng

pha động là dung dịch đệm photphat 0,05M có chứa NaCl 0,15M, pH = 7,0

(loại khí), rửa giải một thể tích cột, thu các phân đoạn. Sau đó đo A280nm và

xác định hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của từng phân đoạn. Thu nhận các

phân đoạn có hoạt tính và cô đặc nồng độ dịch thu đƣợc bằng màng siêu lọc

kích cỡ 10 kDa.

Vẽ đồ thị biểu diễn sự tƣơng quan giá trị A280nm, hoạt tính ngƣng kết

hồng cầu và thứ tự các phân đoạn.

* Các thông số kỹ thuật đƣợc thiết lập khi tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel:

- Gel: Sephacryl S – 200

- Kích thƣớc cột: 1x30cm

- Pha động: dung dịch đệm photphat 0,05M có chứa NaCl 0,15M,

pH = 7,0 (loại khí)

- Thể tích mẫu: 1,0 mL

- Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút

- Thể tích mỗi phân đoạn: 2,5 mL/phân đoạn

- Số lƣợng phân đoạn: 52 phân đoạn.

- Tổng thể tích dung dịch đệm rửa giải: 130 mL.

52

2.3.9. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối ƣợng phân t ectin

bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE [132]

Nguyên tắc: Điện di là sự di chuyển các chất mang điện tích trong điện

trƣờng, tốc độ di chuyển phụ thuộc vào điện tích, hình dạng và kích thƣớc của

chất đó.

SDS – PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel

electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện

diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử

protein. Trong kỹ thuật này protein đƣợc xử lý với SDS và tác nhân khử cầu

nối disulfite là 2-mercapto ethanol (HS-CH2-CH2-OH). Với tác nhân này,

protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 đƣợc biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1)

và tất cả các protein đều đƣợc tích điện âm.

Ví dụ:

cysS-Scys + 2 HOCH2CH2SH → 2 cysSH + HOCH2CH2S-SCH2CH2OH

Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc

vào kích thƣớc, những phân tử có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn

những phân tử có kích thƣớc nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thƣớc nhất

định. Dƣới tác dụng của điện trƣờng các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về

cực dƣơng của điện trƣờng. Để xác định phân tử lƣợng của một protein, ngƣời

ta thƣờng so sánh với một thang phân tử lƣợng chuẩn, là một hỗn hợp các

protein có trọng lƣợng phân tử khác nhau đã biết.

https://vi.wikipedia.org/wiki/Cystine

https://vi.wikipedia.org/wiki/Cystein

https://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BA%ADp_tin:Disulfide-bond-cleavage-by-2-mercaptoethanol-2D-skeletal.svg

https://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BA%ADp_tin:Disulfide-bond-cleavage-by-2-mercaptoethanol-2D-skeletal.svg

53

* Thực hiện:

+ Chuẩn bị mẫu:

Mẫu Khối ƣợng

protein cần dùng

Protein thô 100 g

Protein kết tủa 50 g

Protein sau sắc ký trao đổi ion 20 g

Protein sau sắc ký lọc gel 10 g

Tất cả các mẫu đƣợc thẩm tách trong nƣớc cất để loại bỏ sự ảnh hƣởng

của muối, sau đó cho mẫu vào các ống eppendorf (1,5 hay 2,0 mL) và cô chân

không lạnh hoặc sấy 40 oC đến khô.

Thêm vào mỗi ống 15 L dung dịch đệm mẫu, trộn đều đến tan hoàn

toàn.

Đun các ống mẫu ở 100 oC trong 5 phút của trƣờng hợp có và không có

chất khử 2-mercapto ethanol. Sau 5 phút tiến hành làm lạnh các ống.

+ Chuẩn bị dung dịch monome:

Cân 46,5 gam acrylamide và 3,0 gam biacrylamide, tất cả hòa tan trong

nƣớc cất thành 100 mL, lọc và giữ ở 4 oC.

+ Dung dịch đệm gel (Tris HCl 3,0 M, SDS 0,8%, pH = 8,8)

Cân 72,7 gam Tris [tris(hydroxymethyl)aminomethane] hòa tan trong

nƣớc cất thành 200 mL, dùng axit HCl đậm đặc chuẩn về pH = 8,8, thêm 1,6

gam SDS khuấy cho tan, giữ ở nhiệt độ phòng.

+ Dung dịch đệm cathode 10x (upper buffer) (Tris-HCl 0,25 M, glycine

1,92 M, SDS 1,0%, pH = 8,3).

54

Cân 15,1 gam Tris, hòa tan trong nƣớc cất, thêm 72,0 glycine, thêm

nƣớc cất thành 500 mL, dùng axit HCl đậm đặc chuẩn về pH = 8,3, thêm 5,0

gam SDS hòa tan và giữ ở nhiệt độ phòng.

+ Dung dịch đệm anode 10x (lower buffer) (Tris HCl 2,0 M, pH = 8,9).

Cân 121,1 gam Tris hòa tan trong 300 mL nƣớc cất, dùng axit HCl đậm

đặc chuẩn về pH = 8,9, thêm nƣớc cất đến 500 mL (10x) và giữ ở nhiệt độ

phòng.

+ Dung dịch đệm mẫu (Tris HCl 50 mM, pH = 6,8, SDS 4 %, glyxerol

12 % (v/v), Bromophenol blue (BPB) 0,02 %)

Cân 0,6 gam Tris hòa tan trong 25 mL nƣớc cất, thêm 4,0 gam SDS,

12,0 mL glycine, khuấy đều; thêm 0,02 gam Bromophenol blue, khuấy tan;

dùng axit HCl đậm đặc chuẩn về pH = 6,8, thêm nƣớc cất đến 100 mL và giữ

ở nhiệt độ phòng.

+ Dung dịch nhuộm Coomassie Blue R-250 (0,25%)

Cân 2,5 gam Coomassie brilliant blue R-250, lấy 500 mL ethanol và

100 mL axit axetic, thêm nƣớc cất đến 1 lít và khuấy đều. Giữ ở nhiệt độ

phòng.

+ Dung dịch giải nhuộm I: gồm 400 mL methanol, 70 mL axit axetic,

rồi thêm nƣớc cất đến 1 lít. Khuấy đều và giữ ở nhiệt độ phòng.

+ Dung dịch giải nhuộm II: gồm 50 mL methanol và 70 mL axit axetic,

thêm nƣớc cất đến 1 lít. Khuấy đều và giữ ở nhiệt độ phòng.

+ Đổ gel:

a. % (Separating gel)

Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 25 mL sạch:

Acrylamide/Bis (biacrylamide) (15,5/1) : 3,0 mL

Tris – HCl 3M; pH 8,8; 0,8 % SDS : 5,0 mL

Glycerine : 2,0 gam (1,45 mL)

Nƣớc cất : 5,0 mL

55

APS (amonium persulfate) 10% : 50,0 µL

TEMED : 5,0 µL

Sau khi cho TEMED (N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine) vào,

khuấy nhẹ, tiến hành đổ gel (tránh tạo bọt khí). Sau đó cho thật cẩn thận một

lớp nƣớc cất lên trên lớp mặt gel để mặt gel đƣợc phẳng và không bị khô. Chờ

gel đông (khoảng 2 giờ).

b. Gel chồng (g ược) (Stacking gel)

Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 25 mL sạch khác:

Acrylamide/Bis (biacrylamide) (15,5/1) : 1,0 mL

Tris – HCl 3M; pH 6,8; 0,8 % SDS : 3,1 mL

Nƣớc cất : 8,4 mL

APS 10% : 100,0 µL

TEMED : 10,0 µL

Sau khi gel phân tách đã trùng ngƣng hoàn toàn, đổ hết nƣớc bên trên.

Tiến hành đổ lớp gel gom bằng cách dùng pipetteman bơm dung dịch gel gom

vào khuôn. Đồng thời đƣa lƣợc vào khuôn để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt

khí trong khuôn gel). Sau khi gel trùng ngƣng, tháo lƣợc, lắp đĩa gel vào bộ

phận điện di, cho dung dịch điện di vào buồng điện di.

Tiến hành chạy điện di

Cho vào buồng 300 mL dung dịch đệm anode (pha loãng 10 lần), tránh

tạo bọt khí.

Lắp đặt thiết bị điện di, cho vào buồng 80 mL dung dịch đệm cathode

(pha loãng 10 lần), tránh tạo bọt khí.

Tiến hành tiêm khoảng 7 µL mẫu chuẩn và các mẫu phân tích (từ 15 –

20 µL) vào các giếng.

56

Tiến hành chạy điện di với dòng điện ổn định có hiệu điện thế 100V.

Quá trình điện di kết thúc dựa vào sự dịch chuyển của vạch màu xanh

(bromophenol) khi cách đáy gel khoảng 1 cm.

Sau khi kết thúc điện di, cho gel vào khay, cho 20 – 25 mL dung dịch

nhuộm Coomassie Brilliant Blue R-250, đặt lên máy lắc trong 2 giờ, sau đó

đổ bỏ dung dịch nhuộm. Tiến hành tẩy màu bằng cách ngâm gel trong dung

dịch giải nhuộm (hỗn hợp methanol: acid acetic). Protein sẽ đƣợc phát hiện

nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt.

Xác định trọng ƣợng phân t của protein

Tiến hành đo khoảng cách di chuyển của các dải protein từ gel phân tách

tới các dải protein và khoảng cách từ gel phân tách tới vạch màu bromophenol

(vạch màu cuối cùng).

Tính giá trị Rf

Rf =

Trọng lƣợng phân tử của các vạch protein có thể xác định thông qua giá

trị Rf trên, nhờ phƣơng pháp nội suy theo đồ thị.

Dựa vào thang chuẩn trên gel điện di, tiến hành xác định giá trị Rf của

từng vạch protein. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng phụ lục 2. Từ đó, xây

dựng phƣơng trình hồi quy tuyến tính giữa giá trị Rf và lgM (lg trọng lƣợng

phân tử) của các protein trong thang chuẩn bằng phần mềm Excel.

2.3.10. Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng các đặc tính ý, hóa đến

ectin từ rong đỏ H. eucheumatoides

* Nguy n tắc: Khi tiến hành phân tích các yếu tố ảnh hƣởng đến đặc

tính lý, hóa của lectin (nhiệt độ, pH, cation hóa trị 2), nếu hoạt tính ngƣng kết

hồng cầu của lectin không đổi so với hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin

thu đƣợc sau sắc ký lọc gel thì chứng tỏ phạm vi yếu tố đang phân tích không

Khoảng cách di chuyển của protein lectin

Khoảng cách từ gel phân tách đến dung môi (vạch màu Brommophenol)

blue

57

ảnh hƣởng đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu, ngƣợc lại, nếu có sự thay đổi thì

chứng tỏ phạm vi yếu tố đang phân tích đã ảnh hƣởng đến hoạt tính ngƣng kết

hồng cầu của lectin.

2.3.10.1. Phương pháp phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính

ngưng kết hồng cầu [13]

Để tiến hành phân tích ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính của lectin từ

rong đỏ H. eucheumatoides, ta lấy mỗi 0,5 mL dung dịch chứa lectin thu đƣợc

sau sắc ký lọc gel cho vào mỗi ống nghiệm, tiến hành đun nóng ở các nhiệt độ

khác nhau: 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 oC trong 30 phút. Sau đó làm lạnh

nhanh bằng nƣớc đá và kiểm tra lại hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của các mẫu

bằng hồng cầu máu thỏ 2 % đã xử lý trypsin, so sánh với hoạt tính ngƣng kết

hồng cầu của lectin sau sắc ký lọc gel. Các thí nghiệm đƣợc tiến hành lặp lại 3

lần.

2.3.10.2. Phương pháp phân tích ảnh hưởng của pH đến hoạt tính

ngưng kết hồng cầu [13]

Để tiến hành phân tích ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính của lectin từ

rong đỏ H. eucheumatoides, ta lấy 0,5 mL mỗi dung dịch chứa lectin thu đƣợc

sau sắc ký lọc gel thẩm tách qua đêm trong các dung dịch đệm có pH khác

nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ở 4 oC. Sau đó, tiến hành thẩm tách ngƣợc lại với

dung dịch NaCl 0,15 M trong 4 giờ để loại bỏ ảnh hƣởng của pH, lấy phần

dịch này đem ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Thu lấy phần

dịch trong và tiến hành kiểm tra hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của các mẫu

bằng hồng cầu máu thỏ 2 % đã xử lý trypsin, so sánh với hoạt tính ngƣng kết

hồng cầu của lectin sau sắc ký lọc gel.

Các thí nghiệm đƣợc tiến hành lặp lại 3 lần.

Các dung dịch đệm đƣợc sử dụng:

+ Đệm axetat pH: 3, 4 và 5 axit axetic/natri axetat

+ Đệm photphat pH: 6 và 7 Na2HPO4.12H2O/NaH2PO4.2H2O

+ Đệm Tris HCl pH: 8 Tris/HCl

+ Đệm cacbonat pH: 9 và 10 Na2CO3/NaHCO3

58

2.3.10.3. Phương pháp phân tích ảnh hưởng của cation hóa trị 2,

EDTA đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu [13]

Để phân tích sự ảnh hƣởng của các ion kim loại đến hoạt tính của lectin

từ rong đỏ H. eucheumatoides, ta tiến hành lấy 1,0 mL dịch lectin sau sắc ký

lọc gel cho tƣơng tác với muối của các ion kim loại hóa trị hai nhƣ: Ca2+

,

Mg2+

ở nồng độ 50 mM. Sau 2 giờ, các mẫu thí nghiệm đƣợc xác định hoạt

tính ngƣng kết hồng cầu và so sánh với mẫu đối chứng (không tƣơng tác với

cation hóa trị II và EDTA). Xác định hoạt tính ngƣng kết hồng cầu tƣơng đối

(%) để đánh giá sự ảnh hƣởng của cation hóa trị II và EDTA đến hoạt độ

NKHC của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides.

Các thí nghiệm đƣợc tiến hành lặp lại 3 lần.

2.3.10.4. Phương pháp phân tích đặc tính liên kết carbohydrate của

lectin [13]

Tiến hành phân tích khả năng liên kết carbohydrate của lectin với một số

loại đƣờng đơn (monosaccarit) và glycoprotein đƣợc liệt kê trong Bảng 2.2.

59

Bảng 2.2. Các loại đƣờng đơn và glycoprotein sử dụng để khảo sát đặc tính

liên kết carbohydrate của lectin

Monosaccarit (100 mM) Glycoprotein (2000µg/mL)

Glucose

N-acetyl-D-glucosamine

p-nitrophenyl glucopyranoside

D-glucosamine

D-galactose

D-galactosamine

N-acetyl-D- galactosamine

p-nitrophenyl galactopyranoside

D-Mannose

D-manosamine

N-acetyl-D-manosamine

p-nitrophenyl manopyranoside

Xylose

N-acetyl neuraminic acid

Transferrin

Asialo-Transferrin

Fetuin

Asialo-Fetuin

Yeast mannan

Porcine thyroglobulin

Porcine stomach mucin

Asialo-porcine stomach mucin

Trypsin treated porcine stomach mucin

Cách tiến hành:

Sử dụng đĩa 96 giếng đáy chữ V. Cho 25 µL dung dịch đệm photphat

0,02M có chứa NaCl 0,15M, pH = 7 vào từ giếng thứ 2.

Cho 25 µL dung dịch đƣờng hoặc glycoprotein vào giếng số 1 và số 2,

rồi pha loãng 2 lần theo từng hàng bắt đầu từ giếng số 2.

Cho 25 µL dung dịch lectin có hoạt tính ngƣng kết hồng cầu 22 vào mỗi

giếng. Lắc nhẹ và giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.

Sau 1 giờ, cho 25 µL huyền phù hồng cầu thỏ đã xử lý trypsin vào mỗi

giếng.

Lắc nhẹ, giữ ở nhiệt độ phòng. Sau 1 giờ, đọc kết quả.

60

Đọc kết quả:

Nếu hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin không thay đổi: Lectin

không có khả năng liên kết với đƣờng hoặc glycoprotein đƣợc kiểm tra.

Nếu hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin giảm: Lectin đã liên kết với

đƣờng hoặc glycoprotein đƣợc kiểm tra. Nồng độ nhỏ nhất của đƣờng (mM)

hoặc glycoprotein (µg/mL) mà tại đó hiện tƣợng ngƣng kết hồng cầu do lectin

gây ra bị ức chế hoàn toàn (nghĩa là lectin đã liên kết với đƣờng hoặc

glycoprotein kiểm tra), đƣợc tính theo công thức:

Trong đó:

Cmin: Nồng độ phản ứng nhỏ nhất của đƣờng (mM) hoặc glycoprotein

(µg/mL) mà tại đó hiện tƣợng ngƣng kết hồng cầu do lectin gây ra bị ức chế

hoàn toàn.

C: Nồng độ của đƣờng và glycoprotein (Nồng độ đƣờng: 100 mM;

nồng độ glycoprotein: 2000 µg/mL).

HI: Giá trị nồng độ pha loãng mà tại đó hoạt tính ngƣng kết hồng cầu

vẫn còn bị ức chế, sau khi lectin đã liên kết với đƣờng hoặc glycoprotein.

2.3.11. Điều chế porcine stomach mucin đƣợc x ý enzyme trypsin

Hòa tan 10 mg porcine stomach mucin trong 5 mL dung dịch đệm

photphat 0,02 M có chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2. Thêm 5 mg trypsin vào mẫu

và ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Sau khi ủ, hỗn hợp đƣợc đun nóng ở 100

oC trong

30 phút để loại bỏ ảnh hƣởng hoạt tính của enzyme, hỗn hợp đƣợc làm lạnh,

hiệu chỉnh đến thể tích cuối cùng là 10 mL và đƣợc dùng nhƣ là chất ức chế

(nồng độ cuối cùng 2 mg/mL) [132].

61

3CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH NGƢNG KẾT HỒNG CẦU THỎ, CỪU, GÀ

VÀ CÁC NHÓM MÁU NGƢỜI A, B, O VỚI DỊCH CHIẾT TỪ RONG ĐỎ

H. eucheumatoides

Dịch chiết thô từ rong đỏ H. eucheumatoides đã ngƣng kết mạnh với

các hồng cầu thỏ, cừu và gà đã đƣợc xử lý với enzyme trypsin và papain,

nhƣng không cho thấy sự ngƣng kết với các dạng hồng cầu máu ngƣời A, B

và O, ngay cả khi hồng cầu đƣợc xử lý enzyme (Bảng 3.1).

Bảng 3.1. Phân tích hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của dịch chiết thô từ rong

đỏ H. eucheumatoides với các dạng hồng cầu khác nhau

Sự chuẩn độ ngƣng kết hồng cầu với các dạng hồng cầu

Thỏ

Cừu Gà Nhóm máu A Nhóm máu B Nhóm máu O

Na T

b P

c N T P N T P N T P N T P N T P

- 128 1024 - 512 512 - 128 128 -d - - - - - - - -

a Hồng cầu tự nhiên;

b Hồng cầu đƣợc xử lý enzyme trypsin;

c Hồng cầu đƣợc xử lý

enzyme papain; d Không có sự ngƣng kết hồng cầu.

Kết quả nghiên cứu này phù hợp với các kết quả nghiên cứu đã đƣợc

công bố về sự ngƣng kết với hồng cầu động vật ƣu tiên hơn hồng cầu ngƣời

của các dịch chiết lectin từ rong biển [45, 41, 92, 48, 49, 13, 16].

Hồng cầu máu thỏ xử lý enzyme trysin đƣợc chọn trong các thí nghiệm

về phân tích hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin trong phần thực nghiệm

của luận văn.

3.2. PHÂN TÍCH CÁC ĐIỀU KIỆN ĐỂ CHIẾT LECTIN TỪ RONG H.

eucheumatoides

3.2.1. Tỷ ệ nguy n iệu và dung môi chiết

Kết quả phân tích ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết

(w/v) đến hoạt tính của lectin đƣợc trình bày ở bảng phụ lục 3 và hình 3.1.

62

Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của tỷ lệ dung môi chiết:nguyên liệu

đến hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của lectin.

Từ kết quả thí nghiệm có thể nhận thấy thể tích dung môi dùng để tách

chiết lectin có ảnh hƣởng đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của dịch chiết từ

rong đỏ H. eucheumatoides.

Khi tỷ lệ nguyên liệu:dung môi ethanol tăng dần từ 1:2 đến 1:4 thì hoạt

tính tổng số tăng từ 11.264 HU lên 31.744 HU và hoạt tính riêng cũng tăng từ

819,2 HU/mg lên 1.600,0 HU/mg. Tuy nhiên, khi tăng thể tích ethanol (tỷ lệ

nguyên liệu:dung môi là 1:5, 1:6, 1:7, 1:8) thì hoạt tính tổng số và hoạt tính

riêng giảm.

Ở những tỷ lệ nguyên liệu:dung môi thấp (1:2, 1:3), hoạt tính tổng số

và hoạt tính riêng có giá trị không cao vì dung môi ethanol chƣa đủ để ngập

hết nguyên liệu, lectin trong rong chƣa tan hết vào dung môi. Khi tỷ lệ

nguyên liệu:dung môi là 1:4, lƣợng dung môi ethanol đã đủ ngập hết rong và

lectin đã hòa tan tốt trong dung môi, khi này hoạt tính tổng số và hoạt tính

riêng đạt cực đại. Khi tiếp tục tăng tỷ lệ dung môi lên, lúc này cùng với quá

trình lectin đƣợc hòa tan trong ethanol thì cũng sẽ có một lƣợng protein không

có hoạt tính ngƣng kết hồng cầu cũng đƣợc khuếch tán vào dung môi; thêm

63

nữa, khi tăng thể tích dung môi thì thể tích dịch chiết sẽ tăng trong khi lƣợng

lectin lại không thay đổi, điều này làm cho hàm lƣợng lectin trong dịch sau

chiết bị giảm. Và tất cả những yếu tố này đã làm ảnh hƣởng đến hoạt tính

tổng số cũng nhƣ hoạt tính riêng của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides.

Nhƣ vậy, từ kết quả thu đƣợc ta nhận thấy với tỷ lệ nguyên liệu:dung

môi (w/v) là 1:4 thì hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng có giá trị cực đại

(31.744 HU và 1.600 HU/mg). Do đó tỷ lệ nguyên liệu:dung môi này đƣợc

chọn cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo.

3.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ ethano đến quá trình chiết

Kết quả phân tích ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hoạt tính của

lectin đƣợc trình bày ở bảng phụ lục 4 và hình 3.2.

Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hoạt tính tổng

số và hoạt tính riêng của quá trình chiết lectin.

Từ kết quả thu đƣợc cho thấy: khi nồng độ ethanol tăng dần từ 0 % đến

20 %, hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin vẫn ổn định (1024 HU/mL),

hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng tăng dần; tại nồng độ ethanol 20 %, hoạt

tính tổng số đạt giá trị cực đại (1200,29 HU/mg); khi tiếp tục tăng nồng độ

ethanol lên 30 %, 40 % thì cả 3 yếu tố: hoạt tính ngƣng kết hồng cầu, hoạt

64

tính tổng số và hoạt tính riêng đều giảm. Do đó, để chiết lectin đạt hiệu quả

tốt, ta nên dùng nồng độ ethanol 20 % để tiến hành khảo sát các thí nghiệm

tiếp theo. Khi chiết protein bằng ethanol, một số protein và carbohydrate có

khối lƣợng phân tử lớn hơn khối lƣợng phân tử của lectin cần chiết sẽ bị giữ

lại trong rong, dẫn đến quá trình tinh chế sau này dễ dàng hơn.

3.2.3. Ảnh hƣởng của thời gian chiết

Kết quả phân tích ảnh hƣởng của thời gian chiết (giờ) đến hoạt tính

tổng số và hoạt tính riêng của lectin đƣợc trình bày ở bảng phụ lục 5 và hình

3.3.

Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của thời gian chiết (giờ) đến hoạt tính

tổng số và hoạt tính riêng của lectin.

Từ kết quả thu đƣợc cho thấy: với thời gian chiết là 6 giờ, hoạt tính

ngƣng kết hồng cầu của lectin đạt giá trị cao (1024 HU/mL), hoạt tính tổng số

cũng nhƣ hoạt tính riêng của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides đạt giá trị

cực đại (20480 HU, 822,49 HU/mg); với thời gian chiết ít hơn 6 giờ thì hoạt

tính tổng số và hoạt tính riêng của lectin đạt giá trị không cao, vì thời gian

chiết còn ít, lectin chƣa thể hòa tan hết vào dung môi; với thời gian chiết

nhiều hơn 6 giờ, lectin hòa tan tốt vào dung môi, tuy nhiên có một số protein

cũng nhƣ các chất không có hoạt tính ngƣng kết hồng cầu cũng hòa tan theo,

65

điều này làm giảm hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin, gây ảnh hƣởng

đến giá trị hoạt tính riêng của lectin.

Để chiết lectin đạt kết quả tốt và thời gian chiết hợp lý, ta nên chọn thời

gian chiết là 6 giờ để tiến hành khảo sát các thí nghiệm tiếp theo.

* Nhƣ vậy, sau khi phân tích một số yếu tố cơ bản ảnh hƣởng đến quá

trình chiết lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides, chúng tôi nhận thấy: quá

trình chiết lectin đạt hiệu quả tốt nhất với các điều kiện cụ thể nhƣ sau:

- Dung môi chiết: ethanol 20 %

- Tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v): 1:4

- Thời gian chiết: 6 giờ

- Nhiệt độ chiết: 4 oC

3.3. TINH CHẾ LECTIN

3.3.1. Phân tích nồng độ ethano thích hợp để kết tủa ectin

Kết quả phân tích ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến khả năng kết tủa

của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides đƣợc trình bày ở bảng phụ lục 6 và

hình 3.4.

Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến khả năng kết

tủa lectin.

66

Từ kết quả thu đƣợc nhận thấy: tại nồng độ ethanol khoảng 80 %, hoạt

tính ngƣng kết hồng cầu, hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của lectin đạt giá

trị cực đại (16384 HA, 16384 HU và 4995,12 HU/mg); với nồng độ ethanol

nhỏ hơn 80 %, các giá trị hoạt tính ngƣng kết hồng cầu, hoạt tính tổng số cũng

nhƣ hoạt tính riêng chƣa đạt giá trị cực đại.

Kết tủa lectin là kết tủa vô định hình, nên để kết tủa đƣợc, các trung

tâm kết tinh sẽ liên kết yếu với nhau thành những tập hợp nhỏ, và những tập

hợp này lại kết hợp với nhau thành những tập hợp lớn hơn và cuối cùng tạo

thành kết tủa. Ở nồng độ ethanol thấp, số tiểu phân ethanol ít nên không đủ

khả năng làm cho các trung tâm kết tinh của lectin liên kết lại với nhau để tạo

kết tủa; mặt khác, khối lƣợng phân tử lectin trong rong thƣờng thấp nên cần

tiến hành kết tủa lectin ở nồng độ ethanol tƣơng đối cao.

Nhƣ vậy, để kết tủa lectin từ dịch chiết thô đạt hiệu quả tối ƣu, ta nên

dùng nồng độ ethanol khoảng 80 %.

67

3.3.2. Tinh sạch ectin bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose

Kết quả tinh sạch lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides bằng Sắc ký trao

đổi ion.

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự tƣơng quan giữa giá trị A280nm và hoạt tính

ngƣng kết hồng cầu theo thứ tự các phân đoạn trong quá trình sắc ký trao đổi

ion DEAE – Sepharose

Từ hình 3.5 chúng ta nhận thấy chỉ có 1 peak có giá trị A280 nm cao nhất

tƣơng ứng với các phân đoạn có chứa protein (nằm ở các phân đoạn từ 36 đến

40) và ứng với các phân đoạn này hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của protein

đƣợc thể hiện rõ ràng nhất, đặc biệt tại phân đoạn 37 protein có hoạt tính

ngƣng kết hồng cầu của lectin đạt giá trị cao nhất (2048 HA).

Nhƣ vậy, tại peak có giá trị A280 nm cao nhất này có chứa protein có hoạt

tính, tiến hành thu hồi các phân đoạn từ 36 đến 40, cô đặc và tiếp tục tinh sạch

lectin bằng sắc ký lọc gel.

68

3.3.3. Tinh sạch ectin bằng sắc ký ọc ge Sephacry S – 200

Kết quả tinh sạch lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides bằng Sắc ký lọc

gel Sephacryl S-200.

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn A280nm và hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của các

phân đoạn trong quá trình sắc ký lọc gel Sephacryl S-200

Từ kết quả thu đƣợc trên hình 3.6, chúng ta nhận thấy có 2 peak có giá

trị A280 nm cao, trong đó hàm lƣợng protein tập trung chủ yếu ở peak II. Nhƣ

vậy, có thể dự đoán hỗn hợp protein qua sắc ký lọc gel chủ yếu gồm 2 dạng

protein có khối lƣợng phân tử khác nhau.

Cũng dựa vào kết quả sắc ký đồ chúng ta nhận thấy: hàm lƣợng protein

đƣợc phân bố ở 2 peak, nhƣng chỉ có ở peak số II protein mới thể hiện hoạt

tính ngƣng kết hồng cầu (từ phân đoạn 22 đến 42), tuy nhiên các phân đoạn

mà ở đó protein thể hiện hoạt tính ngƣng kết hồng cầu rõ ràng nhất là từ phân

đoạn 25 đến 35; còn ở peak I protein không thể hiện hoạt tính ngƣng kết hồng

cầu. Điều này cho thấy, protein chứa lectin cần tinh sạch chứa chủ yếu trong

các phân đoạn từ 25 đến 35. Tiến hành thu hồi các phân đoạn từ 25 đến 35 để

làm các thí nghiệm tiếp theo.

69

3.3.4. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định trọng ƣợng phân t ectin

bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE

Tiến hành chạy điện di các dịch protein thu đƣợc qua từng bƣớc tinh

sạch trên gel polyacrylamide nồng độ 10,0 % với dòng điện ổn định có hiệu

điện thế 100V. Thang protein chuẩn là những protein có trọng lƣợng phân tử

từ 11000 đến 75000 Da. Các bƣớc tiến hành chạy điện di đƣợc trình bày ở

mục 2.3.9. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:

Hình 3.7. Kết quả điện di lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides, dùng gel

polyacrylamide 10,0%. Các dải protein đƣợc nhuộm màu bởi Coomassie

Brilliant blue R-250. Lane 1: thang protein chuẩn (New England BioLabs

Inc). Lane 2: dịch chiết thô. Lane 3: dịch tủa trong cồn 80 %. Lane 4: dịch

trong có hoạt tính thu đƣợc sau sắc ký trao đổi ion. Lane 5: dịch trong có hoạt

tính thu đƣợc từ quá trình sắc ký lọc gel trong điều kiện không có chất khử.

Lane 6: dịch trong có hoạt tính thu đƣợc từ quá trình sắc ký lọc gel trong điều

kiện có chất khử 2-mercapto ethanol.

Kết quả điện di từ hình 3.7 cho ta thấy: sau mỗi bƣớc tinh sạch, các

protein tạp chất trong dịch chiết đã đƣợc loại bỏ một cách đáng kể. So với

Lane số 2, các dải protein ở Lane số 3 có màu đậm hơn và chỉ xuất hiện 2 dải,

trong đó dải ở vị trí có khối lƣợng phân tử khoảng 17 kDa thể hiện rõ hơn.

70

Kết quả này cũng phù hợp với kết quả sắc ký đồ của sắc ký lọc gel Sephacryl

S-200 khi ở đây xuất hiện 2 peak chứa protein, trong đó peak II có hàm lƣợng

protein nhiều hơn.

Ở Lane số 4, hầu nhƣ chỉ nhận thấy sự có mặt của 1 dải ở vị trí có khối

lƣợng phân tử khoảng 17 kDa.

Ở Lane số 5 và 6 lần lƣợt là kết quả điện di của các phân đoạn có hoạt

tính sau sắc ký lọc gel trong điều kiện không có và có chất khử 2-mercapto

ethanol. Tuy nhiên, kết quả cho thấy ở cả 2 Lane này đều chỉ xuất hiện 1 dải

duy nhất ở cùng một vị trí có khối lƣợng phân tử khoảng 17 kDa.

Có thể kết luận: lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides đã đƣợc tinh sạch,

có khối lƣợng phân tử khoảng 17 kDa trong cả hai điều kiện không có và có

chất khử 2-mercapto ethanol, chứng minh rằng lectin từ rong đỏ H.

eucheumatoides thuộc dạng monomer.

Với kết quả thực nghiệm mà chúng tôi thu đƣợc đã cho thấy có sự phù

hợp với nghiên cứu của Rogers và cộng sự, đó là: lectin từ rong biển thƣờng

có khối lƣợng phân tử thấp, khoảng từ 12 – 43 kDa và phân tử có dạng

monomer.

Trong chi Gracilaria, một số lectin có khối lƣợng phân tử tƣơng tự đã

đƣợc công bố nhƣ: Granin-BP từ rong Gracilaria bursa-pastoris [93], GCL từ

rong G. cornea [72] và GOL từ rong G. ornata [73], tất cả những lectin này là

monomer và cho thấy sự giống nhau giữa các lectin thuộc chi Gracilaria. Tuy

nhiên, lectin đƣợc cô lập từ rong G. salicornia cho thấy sự khác biệt so với

các rong cùng thuộc chi Gracilaria, nó gồm một dải đơn với khối lƣợng phân

tử khoảng 45.000 Da trong điều kiện chạy điện di không có chất khử, ngƣợc

lại, trong điều kiện chạy điện di có chất khử 2-mecaptoethanol nó cho một dải

đơn có khối lƣợng 22.500 Da, nhƣ vậy cho thấy rằng lectin này là một dimer

bao gồm 2 nhóm nhỏ giống nhau có khối lƣợng phân tử 22.500 D, chúng

đƣợc liên kết với nhau qua cầu nối disulfide [122].

71

3.3.5. Kết quả tổng hợp quá trình tinh sạch ectin từ rong đỏ H.

eucheumatoides

Bảng 3.2. Kết quả tinh sạch lectin từ 300 gam rong thô H. eucheumatoides

Thể

tích

(mL)

Protein

(µg/mL) Protein

tổng (µg)

HA

(HU/

mL)

HTTS

(HU)

HTR

(HU/mg)

MAC (µg/mL)

Độ

tinh

sạch

(lần)

Dịch

thô

1290 707,5 912.675 512 660.480 723,67 1,38

1

Dịch

trƣớc

SKTĐ

ION

240 631,25 151.500 2048

491.520 3.244,36 0,31 4,48

SKTĐ

ION

1900 65,59 124.621 256 486.400 3.903,03 0,26 5,39

SKL

GEL

800 27,38 21.904 128 102.400 4.674,95 0,21 6,46

*MAC (minimum agglutination concentration): nồng độ nhỏ nhất gây ngƣng kết hồng cầu.

(SKTĐ ION: Sắc ký trao đổi ion, SKL GEL: Sắc ký lọc Gel)

( )Hoaït tínhrieângcuûadòch lectin sautinhsaïch

Ñoä tinh saïch laàn

Hoaït tínhrieângcuûadòchchieát thoâ

Qua quá trình tinh sạch cho thấy: hàm lƣợng protein tổng và hoạt tính

tổng số giảm đi đáng kể, từ 912.675 µg và 660.480 HU ở dịch chiết thô giảm

xuống còn 21.904 µg và 102.400 (tƣơng ứng) trong dịch thu đƣợc sau sắc ký

lọc gel. Nguyên nhân có thể là do trong quá trình tinh chế đã bị hao hụt và các

protein tạp chất đã đƣợc loại bỏ.

Ngoài ra có thể nhận thấy, từ thể tích dịch chiết thô ban đầu là 1290

mL, nhƣng sau khi kết tủa dịch trong thu đƣợc đƣợc cô đặc hơn (240 mL);

mặc dù hàm lƣợng protein tổng và hoạt tính tổng của protein bị giảm

(151.500 µg và 491.520 HU, tƣơng ứng) nhƣng hoạt tính ngƣng kết hồng cầu

của protein lại tăng lên đáng kể (từ 512 HU/mL lên 2048 HU/mL). Sau khi

72

tinh sạch qua sắc ký trao đổi ion, lƣợng mẫu cho qua cột đã bị pha loãng

nhiều lần trong pha động, điều này làm cho thể tích của dịch trong tăng lên

(1900 mL) kéo theo hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của protein cũng bị pha

loãng theo (từ 2048 HU/mL giảm xuống còn 256 HU/mL); mặt khác hàm

lƣợng protein tổng cũng bị giảm nên hoạt tính riêng của protein lại tăng lên

(từ 3.244,36 HU/mg tăng lên 3.903,03 HU/mg), điều đó chứng tỏ những

protein không có hoạt tính ngƣng kết hồng cầu đã bị loại bỏ dần sau sắc ký

trao đổi ion.

Các phân đoạn thu đƣợc sau sắc ký trao đổi ion đƣợc cô đặc bằng màng

siêu lọc có kích thƣớc khoảng 10 kDa để giảm thể tích trƣớc khi cho mẫu tiếp

tục tinh sạch bằng sắc ký lọc gel.

Sau khi tinh sạch qua sắc ký lọc gel, vì một lƣợng lớn protein không có

hoạt tính ngƣng kết hồng cầu tiếp tục bị loại bỏ làm cho giá trị protein tổng

giảm xuống còn 21.904 µg nên hoạt tính riêng của protein lại tăng lên đáng kể

(4.674,95 HU/mg). Từ bảng kết quả 3.2 cũng cho thấy nồng độ nhỏ nhất gây

ngƣng kết hồng cầu của protein (MAC) cũng giảm dần qua các bƣớc tinh sạch

(từ 1,38 µg/mL trong dịch chiết thô xuống còn 0,21 µg/mL trong dịch thu

đƣợc sau sắc ký lọc gel).

Có thể nhận thấy sau các bƣớc của quá trình tinh sạch: hoạt tính riêng

và độ tinh sạch của lectin đạt giá trị khá cao (4.674,95 HU/mg và 6,46 lần,

tƣơng ứng), điều này đƣợc thể hiện qua kết quả điện di đồ.

3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH LÝ, HÓA CỦA LECTIN TỪ

RONG ĐỎ H. eucheumatoides

3.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu

của ectin từ rong đỏ H. eucheumatoides.

Kết quả phân tích ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính ngƣng kết hồng

cầu của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides đƣợc trình bày trong bảng phụ

lục 9 và hình 3.8.

73

Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin

từ rong đỏ H. eucheumatoides.

Lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides không bị mất hoạt tính khi nhiệt độ

lên đến 60 oC trong vòng 30 phút; khi nhiệt độ tiếp tục tăng, hoạt tính của

lectin giảm dần và mất hẳn ở 80 oC. Một số lectin đƣợc tinh chế từ các loài

rong Eucheuma serra [6], Palmaria palmata [61], Kappaphycus striatum

[15], Pterocladiella capillacea [84] cũng có khả năng chịu nhiệt lên đến 60 oC

tƣơng tự lectin từ rong H. eucheumatoides, ngoài ra còn có một số lectin vẫn

giữ đƣợc hoạt tính ở nhiệt độ rất cao nhƣ: Bryothamnion seaforthii và B.

triquetrum [70] ở 90 oC, Gracilaria verrucosa

c [97] và Gracilaria verrucosa

d

[74] ở 100 oC. Đây là đặc tính quý hiếm của lectin từ các loài rong trên. Tuy

nhiên, cũng có một số lectin có hoạt tính ổn định trong khoảng nhiệt độ thấp

nhƣ: Carpopeltis flabellata [54] chỉ ổn định ở 30 oC, Gracilaria verrucosa

[59] và Solieria robusta [68, 92] ổn định ở 40 oC.

74

3.4.2. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của

lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides.

Kết quả phân tích ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính ngƣng kết hồng

cầu của lectin từ rong H. eucheumatoides đƣợc trình bày trong bảng phụ lục

10 và hình 3.9.

Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ

rong đỏ H. eucheumatoides.

Hoạt tính của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides ổn định trong khoảng

pH khá rộng từ pH = 3 – 10, ngay cả trong môi trƣờng axit và bazơ khá mạnh

hoạt tính của lectin vẫn không bị ảnh hƣởng. Ngoài ra, khả năng ổn định hoạt

tính trong khoảng pH từ 3 đến 10 còn đƣợc tìm thấy ở lectin từ các rong

Kappaphycus alvarezii [14], Kappaphycus striatum [15] hay lectin từ các

rong Agardhiella tenera [53], Cystoclonium purpureum [56] cũng có khả

năng ổn định hoạt tính trong khoảng pH rộng từ 4 – 10. Tuy nhiên có một số

lectin có hoạt tính bền trong phạm vi pH hẹp, nhƣ lectin từ rong Tichocarpus

crinitus [81] chỉ ổn định trong khoảng pH trung tính (7 – 8), Gracilaria

bursa-pastoris chỉ ổn định ở pH = 7 [54], Carpopeltis flabellata [54] ổn định

75

trong khoảng pH 7 – 9. Do vậy, với khả năng ổn định hoạt tính trong khoảng

pH rộng là một đặc tính quý báu của lectin từ rong H. eucheumatoides, nó tạo

điều kiện cho các nghiên cứu ứng dụng y sinh trong tƣơng lai.

3.4.3. Ảnh hƣởng của ion kim oại đến hoạt tính ngƣng kết hồng

cầu của ectin từ rong đỏ H. eucheumatoides.

Bảng 3.3. Kết quả thí nghiệm ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt tính ngƣng

kết hồng cầu của lectin từ rong H. eucheumatoide

Mẫu

Hoạt tính ngƣng

kết hồng cầu

(HU/mL)

Hoạt tính ngƣng kết hồng

cầu (%)

Mẫu không kim loại 128

100

Ca2+

128 100

Mg2+

128 100

EDTA 128 100

Hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ rong H. eucheumatoides

không bị ảnh hƣởng bởi các cation hóa trị hai: Ca2+

, Mg2+

và EDTA. Mặc dù

khảo sát trên đây chỉ với hai cation kim loại Ca2+

và Mg2+

nhƣng cũng đã thể

hiện đƣợc tính chất thƣờng gặp của hầu hết lectin từ rong biển: sự có mặt của

các ion kim loại không làm ảnh hƣởng đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của

lectin [73]. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy, lectin từ một số loài

rong có hoạt tính ngƣng kết hồng cầu bị ảnh hƣởng bởi ion kim loại hóa trị

hai nhƣ rong đỏ Enantiocladia duperreyi [83], Acrocystis nana [96], Ptilota

filicina [79], Vidalia obtusiloba [90] hay rong xanh Ulva lactuca [73].

76

3.4.4. Phân tích khả năng i n kết carbohydrate của ectin từ rong

đỏ H. eucheumatoides.

O-GalNAc Glycan [134]

Trong các glycoprotein, O-glycan đƣợc liên kết cộng hóa trị thông qua

liên kết giữa nhóm –OH của N-acetylgalactosamine (GalNAc) với –OH của

serine hoặc threonine bằng liên kết O-glycozit và các cấu trúc này đƣợc đặt

tên là mucin O-glycan hoặc O-GalNAc glycan.

Cấu trúc của O-Glycan đơn giản:

O-GalNAc glycan phổ biến nhất là Galβ1-3GalNAc-, nó đƣợc tìm thấy

trong nhiều glycoprotein và mucin. Các glycoprotein dạng mucin có mặt khắp

nơi trong dịch nhầy trên bề mặt tế bào và trong dịch cơ thể. Nó đƣợc gọi là

cấu trúc lõi 1 O-GalNAc và có thể mở rộng bởi gắn thêm nhiều gốc đƣờng

khác (Hình 3.10). Nó là kháng nguyên và cũng đƣợc đặt tên là kháng nguyên

T. Cả hai kháng nguyên Tn và T có thể đƣợc thế bằng axit sialic để tạo thành

kháng nguyên sialylated-Tn hoặc –T, tƣơng ứng.

77

Hình 3.10. Các dạng cấu trúc lõi mở rộng của O-glycan. Galactose ( ), N-

acetylglucosamine GlcNAc ( ), N-acetylneuraminic acid ( ), Fucose ( ),

N-acetylgalactosamine ( ).

Tất cả bốn cấu trúc lõi (trong “hộp”) có thể đƣợc mở rộng, phân nhánh

và kết thúc bởi galactose, fucose hoặc axit sialic.

N-Glycan [135]

N-glycan đƣợc liên kết hóa trị bởi nhóm –NH2 của gốc asparagine

(Asn) và nhóm –OH của N-acetylglucosamine (GlcNAcβ1-Asn). Các loại

đƣờng đầu cuối xác định phần lớn sự đa dạng của N-glycan.

78

Cấu trúc của N-glycan

Tất cả N-glycan đều có chung một cấu trúc lõi: Manα1-6 (Manα1-3)

Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-Asn-X-Ser/Thr và đƣợc phân loại thành ba

dạng: (1) dạng oligomannose, (2) dạng phức và (3) dạng lai hóa (Hình 3.11).

Hình 3.11. Các dạng cấu trúc N-glycan: oligomannose, phức hợp và lai

hóa. Mỗi N-glycan chứa lõi chung Man3GlcNAc2Asn. Galactose ( ), N-

acetylglucosamine GlcNAc ( ), Mannose ( ), N-acetylneuraminic acid ( ),

Fucose ( ). Cấu trúc lõi của N-glycan đƣợc biểu thị trong hình chữ nhật.

79

Kết quả phân tích khả năng liên kết carbohydrate của lectin từ rong đỏ H.

eucheumatoides đƣợc thể hiện trong bảng 3.4.

Bảng 3.4. Nồng độ đƣờng và glycoprotein nhỏ nhất có khả năng ức chế hoạt

tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ rong H. eucheumatoides

Mẫu

Cmin

(mM),

(µg/mL)

Đƣờng

(100mM)

Glucose -

N-acetyl D-glucosamine 12,50

p-nitrophenyl glucopyranoside -

D-glucosamine 50,00

D-galactose -

D-galactosamine 12,50

N-acetyl-D-galactosamine 6,25

p-nitrophenyl galactopyranoside -

D-mannose -

D-mannosamine -

N-acetyl-D-mannosamine -

p-nitrophenyl mannopyranoside -

Xylose -

N-acetyl neuraminic acid 12,50

80

Glycoprotein

(2000µg/mL)

Transferrin -

Asialo – Transferrin 250,00

Fetuin -

Asialo-Fetuin 1000,00

Yeast mannan -

Porcine thyroglobulin 15,60

Porcine stomach mucin 0,49

Asialo-porcine stomach mucin 0,49

Trypsin treated porcine stomach

mucin 7,81

“-“: Đƣờng 100mM hay glycoprotein 2000 µg/mL không có khả năng gây ức chế hoạt tính

ngƣng kết hồng cầu của lectin.

“Cmin”: nồng độ nhỏ nhất của đƣờng (mM) hoặc glycoprotein (µg/mL) có khả năng gây ức

chế hoạt tính ngƣng kết hồng cầu.

Hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides

không bị ức chế bởi các đƣờng đơn nhƣ: D-glucose, D-mannose, D-galactose,

D-xylose, N-acetyl-D-mannosamine (do ảnh hƣởng của nhóm acetamido ở vị

trí liên kết trục (axial) C2), p-nitrophenyl glucopyranoside, p-nitrophenyl

galactopyranoside, p-nitrophenyl mannopyranoside (do ảnh hƣởng không

gian của nhóm p-nitrophenyl); và các glycoprotein nhƣ: transferin, fetuin và

yeast mannan. Tuy nhiên chúng lại bị ức chế mạnh bởi các đƣờng đơn chứa

nhóm acetamido ở vị trí liên kết xiên C2 của vòng pyranose nhƣ: N-acetyl

galactosamine, N-acetyl glucosamine, axit N-acetyl neraminic (Hình 3.12) và

81

các glycoprotein, đặc biệt porcine stomach mucin và dẫn xuất asialo của nó

chứa dạng O-glycan. Kết quả cho thấy lectin HEL đặc hiệu cho O-glycan.

82

Hình 3.12. Cấu trúc của một số đƣờng đơn.

Transferrin và fetuin (Hình 3.13) không bị ức chế, do transferrin chỉ chứa

dạng phức N-glycan, còn fetuin chứa cả hai dạng phức N-glycan và O-glycan.

Tuy nhiên, sự khử gốc axit sialic của những glycoprotein này làm tăng khả

năng ức chế tiềm năng của các họ glycoprotein.

Hình 3.13. Cấu trúc của Fetuin và Asialofetuin. Galactose ( ), N-

acetylglucosamine GlcNAc ( ), N-acetylneuraminic acid ( ),N-

acetylgalactosamine ( ),Mannose ( ).

Yeast mannan mang N-glycan dạng high-mannose với liên kết ( 1 6)

trong cấu trúc lõi của nó và liên kết ( 1 3) trong chuỗi đã cho thấy không có

bất kì hoạt động ức chế nào tại nồng độ 2 mg/mL, điều đó chứng tỏ rằng HEL

không thể nhận diện đƣợc liên kết ( 1 6) và ( 1 3) của gốc mannose trong

83

cấu trúc của yeast mannan. Porcine thyroglobulin cho thấy hoạt tính ức chế

mạnh; glycoprotein này gồm các chuỗi oligosaccharides chứa cả dạng high

mannose (nhóm dạng A) và dạng phức (nhóm dạng B); trong số các nhóm

dạng A của porcine thyroglobulin, cấu trúc chung của dạng N-glycan high

mannose là Man5GlcNAc2Asn với các gốc Man(α1-6) và Man(α1-3) bị phân

nhánh tại vị trí Man(α1-6) của lõi pentasaccharide [136]; trong số các nhóm

dạng B, dạng chính của N-glycan chứa ít nhất 9 cấu trúc khác nhau, bao gồm

các gốc monosialyl, disialyl đƣợc gắn ở vị trí (α1–6) trong gốc fucose và kết

thúc bằng các gốc acid sialic liên kết ở vị trí (α2–3) hoặc (α2–6) [137], do đó

HEL có thể nhận diện những gốc cuối chứa axit sialic ở liên kết (α2–3) hoặc

(α2–6) trong cấu trúc của porcine thyroglobulin.

Hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin HEL đã bị ức chế mạnh bởi

porcine stomach mucin và dẫn xuất asialo của nó. Mucin chứa dạng O-glycan

với 8 cấu trúc. Sự thay đổi cấu trúc của O-glycan trong mucin bắt đầu ở cấu

trúc lõi. Tất cả dựa trên gốc lõi GalNAcα1- mà có thể bị thay thế tại C3, C6

hoặc cả hai vị trí của monosaccharide β-Gal tại C3, β-GlcNAc tại C3 và/hoặc

C6, và α-GalNAc tại C3 hoặc C6 [138]. Liên kết O-glycan của mucin có trong

nhóm máu A và H của ngƣời, Tn antigen GalNAcα1-, Sialyl-Tn antigen

Siaα2-6GalNAcα1-, lõi 1 Galβ1-3GalNAcα1-, lõi 2 GlcNAcβ1-6(Galβ1-

3)GalNAcα1-, lõi 3 GlcNAcβ1-3GalNAcα1-, lõi 4 GlcNAcβ1-6(GlcNAcβ1-

3)GalNAcα1-, lõi 5 GalNAcα1-3GalNAcα1-, lõi 6 GlcNAcβ1-6GalNAcα1-,

lõi 7 GalNAcα1-6GalNAcα1- và lõi 8 Galα1-3GalNAcα1- [139, 140] (Hình

3.14). Kết quả chỉ ra rằng lectin HEL ƣu tiên nhận ra những gốc cuối

GalNAcα1- và GlcNAcβ1- trong porcine stomach mucin (Hình 3.14) Sự ức

chế bởi porcine stomach mucin mà nó liên quan đến đặc tính liên kết với

GalNAc/GluNAc đã đƣợc công bố trong nhiều lectin từ rong đỏ nhƣ: GTA từ

rong G. tikvahiae [58], GCL từ rong G. cornea [72], GOL từ rong G. ornata

[73], HCA từ rong Hypnea cervicornis và HML từ rong H. musciformis [141].

Đặc tính liên kết của lectin HAC và HML với GalNAc/Gal thông qua liên kết

1-3, 1-4 hay 1-2 trong dạng O-glycan của mucin, nhƣng không cho thấy có sự

phân biệt trong liên kết hay . Các kết quả cho thấy rằng, lectin HEL đặc

84

hiệu O-glycan và có thể nhận biết các trình tự GalNAcαSer/Thr, GalNAc(α1-

3)[Fuc(α1-2)]Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)GalNAc- và GluNAc(α1-4)Gal- qua sự

tƣơng tác với nhóm acetamido ở vị trí C2 (equatorial) của các gốc đƣờng cuối

cùng trong cấu trúc oligosaccharide của O-glycan.

N-glycans

O-GalNAc Glycan

Hình 3.14. Cấu trúc của yeast mannan, porcine thyroglobulin và porcine

stomach mucin. Man: Mannose; Gal: Galactose; Fuc: Fucose; GlcNAc: N-

acetyl-D-glucosamine; GalNAc: N-acetyl-D-galactosamine; Asn: Asparagine;

Ser/Thr: Serine/Threonine.

85

So sánh khả năng ức chế đƣờng và glycoprotein của lectin từ rong đỏ H.

eucheumatoides với các loài rong khác:

Bảng 3.5. Khả năng ức chế đƣờng và glycoprotein của lectin từ rong đỏ và

rong lục [13].

Lectin từ rong GlcNAc GalNAc T A-T F A-F YM PTG BSM A-

BSM

Rong đỏ

Acanthophora

spicifera

-a - - - 500,0 500,0 500,0 500,0 250,0 125,0

Hypnea

valentiae

- - - 62,5 500,0 125,0 - 125,0 31,2 31,2

H. boergesenii - - 1.000,0 125,0 62,5 31,2 - 125,0 31,2 31,2

H. nidulans - - 500,0 31,2 31,2 31,2 - 23,4 31,2 31,2

Kappaphycus

alvarezii

- - 2.000,0 62,5 31,2 31,2 7,8 31,2 31,2 31,2

Eucheuma

denticulatum

- - 2.000,0 125,0 62,5 31,2 7,8 31,2 31,2 31,2

Gracilaria

eucheumatoides

50.0 50.0 500,0 125,0 125,0 15,6 - 62,5 250,0 250,0

G. salicornia - - - 125,0 62,5 62,5 - 62,5 15,6 15,6

Rong lục

Anadyomene

plicata

- - 500,0 125,0 125,0 62,5 31,2 750,0 250,0 250,0

Boodlea

struveoides

- - - 500,0 250,0 62,5 15,6 125,0 62,5 62,5

Codium

arabicum

100.0 6.2 31,2 31,2 1,9 1,0 31,2 500,0 < 0,5 < 0,5

86

Avrainvillea

erecta

- - 500,0 7,8 250,0 31,2 - 62,5 62,5 125,0

Halimeda

opuntia

- - 500,0 31,2 31,2 7,8 31,2 62,5 15,6 15,6

H. opuntia

f.triloba

- - - 125,0 125,0 7,8 62,5 500,0 125,0 125,0

Caulerpa

sertularioides

- - 12,5 15,6 62,5 31,2 125,0 250,0 31,2 31,2

GlcNAc: N-acetyl-D-glucosamine, GalNAc: N-acetyl-D-galactosamine, T: transferrin,

A-T: asialo-transferrin, F: Fetuin, A-F: asialo-fetuin, YM: yeast mannan, PTG: porcine

stomach thyroglobulin, BSM: bovine submaxillary mucin, A-BSM: asialo- bovine

submaxillary mucin

a không bị ức chế tại nồng độ 100 mM đối với đƣờng và 2.000 µg/mL đối với

glycoprotein.

Từ kết quả ở bảng 3.5 cho thấy hầu hết lectin từ rong đỏ và rong lục

không có khả năng ức chế đƣờng đơn, tuy nhiên chỉ có vài lectin từ các rong:

Gracilaria eucheumatoides, H. eucheumatoides và Codium arabicum có khả

năng ức chế đƣờng đơn GlcNAc và GalNAc. Đối với các glycoprotein: hầu

hết các hoạt tính của lectin từ rong đỏ và rong lục đều có khả năng bị ức chế ở

những nồng độ khác nhau, nhƣ: hoạt tính của lectin từ rong đỏ H.

eucheumatoides đã bị ức chế mạnh bởi Porcine stomach mucin và Asialo-

porcine stomach mucin ở nồng độ rất thấp (0,49 µg/mL) hay porcine stomach

mucin đã đƣợc xử lý trypsin ở nồng độ 7,81 (µg/mL), hoạt tính của lectin từ

rong đỏ Kappaphycus alvarezii, Eucheuma denticulatum đã bị ức chế bởi

yeast mannan ở nồng độ (7,8 µg/mL) hay hoạt tính của lectin từ các rong

Hypnea valentiae, H. boergesenii, H. nidulans, Kappaphycus alvarezii,

Eucheuma denticulatum đã bị ức chế bởi bovine submaxillary mucin ở nồng

độ 31,2 µg/mL; hoạt tính của lectin từ rong lục Codium arabicum đã bị ức chế

bởi asialo-fetuin ở nồng độ 1,0 µg/mL và đã bị ức chế bởi bovine

87

submaxillary mucin, asialo- bovine submaxillary mucin ở nồng độ < 0,5

µg/mL. Với những tính chất đặc biệt này, lectin từ rong biển hứa hẹn là nguồn

nguyên liệu quý giá cho những ứng dụng y sinh trong tƣơng lai.

88

4CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Từ những kết quả thu đƣợc qua các thí nghiệm của đề tài, chúng tôi xin

rút ra kết luận cho quy trình tách chiết, tinh sạch và phân tích một số tính chất

của lectin từ rong H. eucheumatoides nhƣ sau:

1. Đã phân tích đƣợc các điều kiện thích hợp để chiết lectin từ rong đỏ H.

eucheumatoides:

Tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v): 1:4

Nồng độ ethanol chiết lectin: 20%

Thời gian chiết: 6 giờ

Nhiệt độ chiết: 4 oC

2. Lectin thu đƣợc từ rong H. eucheumatoides đã tinh sạch (độ tinh sạch 6,46

lần).

3. Đã phân tích đƣợc một số đặc tính của lectin từ rong đỏ H.

eucheumatoides: khối lƣợng phân tử khoảng 17 kDa và tồn tại ở dạng

monomer. Lectin bền nhiệt trong khoảng nhiệt độ khá rộng từ 30 đến 60 oC.

Hoạt tính ngƣng kết hồng cầu không bị ảnh hƣởng trong phạm vi từ pH 3 đến

10 và không phụ thuộc vào cation hóa trị hai.

4. Hoạt tính của lectin đã bị ức chế mạnh bởi các đƣờng đơn có chứa nhóm

acetamido tại vị trí liên kết xiên C2 nhƣ: N-acetyl galactosamine, N-acetyl

glucosamine, axit N-acetyl neraminic và các glycoprotein: porcine stomach

mucin và dẫn xuất asialo mang liên kết O-glycan.

4.2. KIẾN NGHỊ

Xác định cấu trúc và đánh giá một số hoạt tính sinh học của lectin, bao

gồm hoạt tính kháng ung thƣ, kháng vi khuẩn và kháng côn trùng gây hại cho

cây trồng, hƣớng đến sử dụng lectin trong y sinh, nông nghiệp và các lĩnh vực

khác.

89

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Sze Kwan Lam and Tzi Bun Ng, 2011, Lectins: production and

pratical Applications. Applied Microbiology and biotechnology, Vol.

89, No. 1, pp. 45-55.

2. Sharon N., 2007, Lectins: carbohydrate-specific reagents and

biological recognition molecules. J Bio Chem 282(5):2753-64

3. Vo T.S., Kim S.K., 2010, Potential anti-HIV agents from marine

resources: an overview. Marine Drugs 8: 2871-2892.

4. Smith V.J., Desbois A.P & Dyrynda E.A., 2010, Conventional and

unconventional antimicrobials from fish, marine invertebrates and

micro-algae, Mar Drugs, vol.8, pp. 1213-1262.

5. Ogawa, 2011, Diversified carbohydrate-binding lectins from marine

resources. J. Amino Acids, Article ID 838914.

DOI:10.4061/2011/838914.

6. Kawakubo A., Makino H., Ohnishi J., Hirohara H., Kanji H., 1997,

The marine alga Eucheuma serra J. Agardh, a high yielding source of

two isolectins. J. Appl. Phycol 9: 331- 338.

7. Sugahara T., Ohama Y., Fukuda A., Hayashi M., Kawakubo A., Kato

K., 2001, The cytotoxic effect of Eucheuma serra agglutinin (ESA)

on cancer cells and its applications to moleculer probe for drug

delivery system using lipid vescicles. Cytotechnology 36: 93-99.

8. Hori K., Sato Y., Ito K., Fujiwara Y., Iwamoto Y., Makino H.,

Kawakubo A., 2007, Strict specificity for high manose-type N-

glycans and primary structure of a red alga Eucheuma serra lectin.

Glycobiology 17: 479-491

9. Sato Y., Morimoto K., Kubo T., Sakaguchi T., Nishizono A.,

Hirayama M., Hori K., 2015, Entry inhibition of influenza viruses

90

with high mannose binding lectin ESA-2 from red alga Eucheuma

serra through the recognition of viral hemagglutinin. Mar Drugs

13:3454-3465

10. Sato Y., Morimoto K., Hirayama M., Hori K., 2011a, High mannose-

specific lectin (KAA-2) from the red alga Kappaphycus alvarezii

potently inhibits influenza virus infection in a strain-independent

manner. Biochem Biophys Res Commun 405: 291-296.

11. Hirayama M., Shibata H., Imamura K., Takemasa Sakaguchi T., Hori

K., 2016, High-mannose specific lectin and its recombinants from a

carrageenophyta Kappaphycus alvarezii represent a potent anti-

HIV activity through high- affinity binding to the viral envelope

glycoprotein gp 120. Mar. Biotechnol 18: 144-160.

12. Sato Y., Hirayama M., Morimoto K., 2011b, High mannose-binding

lectin with preference for the cluster of 1 2mannose from green

alga Boodlea coacta is a potent entry inhibitor of HIV-1 and

influenza viruses. J. Boil. Chem. 286: 19446-58.

13. Le Dinh Hung, Hori K., Huynh Quang Nang, 2009a, Screening and

preliminary characterization of hemagglutinins in Vietnamese

marine algae. J. Appl. Phycol 21: 89-97.

14. Le Dinh Hung, Sato Y., Shibata H., Hori K., 2009b Biochemical

comparison of lectins among three different color strains of the red

alga Kappaphycus alvarezii. Fish. Sci. 75: 723-730.

15. Le Dinh Hung, Sato Y., Hori K., 2011, High-mannose N-glycan-

specific lectin from the red alga Kappaphycus striatum

(Carrageenophyte). Phytochemistry 72: 855-861.

16. Le Dinh Hung, Bui Minh Ly, Vo Thị Dieu Trang, Ngo Thi Duy

Ngoc, Le Thi Hoa, Phan Thi Hoai Trinh, 2012, A new screening for

91

hemagglutinins from Vietnamese marine Macroalgae. Journal of

Applied Phycology 24: 227- 235.

17. Le Dinh Hung, Hirayama M., Ly B.M., Hori K., 2015a, Purification,

primary structure, and biological activity of the high-mannose N-

glycan-specific lectin from cultivated Eucheuma denticulatum. J.

Appl. Phycol 27: 265-272.

18. Le Dinh Hung, Hirayama M., Bui Minh Ly, Hori K., 2015b

Biological activity, cDNA cloning and primary structure of lectin

KSA-2 from the cultivated red alga Kappaphycus striatum (Schmitz)

Doty ex Silva. Phytochemistry Letters 14: 99–105.

19. Báo điện tử dân trí, Rong biển – Dƣợc phẩm quý giá, ngày 5 tháng 9

năm 2006

20.

Masaaki Nakai, Norihiko Kageyama, Koichi Nakahara, Wataru Miki,

2006, “Phlorotannins as Radical Scavengers from the Extract of

Sargassum ringgoldianum”, Marine Biotechnology, 8(4), pp. 409-

414.

21.

Trần Đình Toại, Phạm Hồng Hải, Nguyễn Văn Thiết, 2013, “Nghiên

cứu ứng dụng carrageenan oligosaccharide từ rong biển có hoạt tính

sinh học trong chế biến và bảo quản thực phẩm”, Tuyển tập Hội nghị

Khoa học toàn quốc về sinh học biển và phát triển bền vững, tr 677-

683.

22. Phạm Hồng Hải, Nguyễn Xuân Nguyên, Nguyễn Bích Thủy, Trần

Đình Toại, 2007, Một số ứng dụng của carrageenan và khả năng sử

dụng carragenan từ rong biển Việt Nam trong bảo quản chế biến thực

phẩm, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 45(4), tr. 87-93.

23 Judd W.J., 1980, The role of lectin in blood group serology, CRCCrit.

Rev. Clin. Lab. Sci., 12, pp. 171-214.

24. https://tusach.thuvienkhoahoc.com

https://tusach.thuvienkhoahoc.com/

92

25. Boyd W.C. and Shapleigh E., 1954, Specific Precipitating Activity of

Plant Agglutinins (Lectins). Science, 119, 419.

https://doi.org/10.1126/science.119.3091.

26. Ashwel G., Morell A.G, 1974 The role of surface carbohydrates in

the hepatic recognition and transport of circulating glycoproteins.

Advan Enzymol . 44:99-128.

27. https://voer.edu.vn

28. Barondes S.H., Cooper D.N., Gitt M.A., Leffler H., 1994, Galectin:

Structure and function of a large family of animal lectin, J. Biol.

Chem., 269, 20807-10.

29. Đặng Thị Thu, Tô Kim Anh, Lê Quang Hòa, Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn

Thị Xuân Sâm, Lê Ngọc Tú, Đỗ Hoa Viên, 2009, Cơ sở công nghệ

sinh học – Tập 2: Công nghệ hóa sinh, NXB Giáo dục Việt Nam, Đà

Nẵng.

30. Đỗ Ngọc Liên, Trần Tuấn Quỳnh, 1991, Tách tinh chế và một số tính

chất của lectin từ hạt chay A. tonkinensis, Tạp chí khoa học, 13(2),

pp. 20-27.

31. Boyd W.C., Almodavar L.R., Boyld L.G., 1966, Agglutinins in

marine algae for human erythrocytes, Transfusion (Philadelphia), 6,

pp.82-83.

32. Balzarini J., Schols D., Neyts J., Van Damme E., Peumans W., De

Clercq E., 1991, Alpha-(1-3)- and alpha –(1-6)-D-mannose-specific

plant lectins are markedly inhibitory to human immunodeficiency

virus and cytomegalovirus infections in vitro, Antimicrob Agents

Chemother, 35(3), pp.410-6.

33. Varki A., Cummings R.D., Esko J.D., Freeze H.H., Stanley P.,

Bertozzi C.R., 2009, Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor

(NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press.

https://doi.org/10.1126/science.119.3091

https://voer.edu.vn/

93

34. David Mirelman, 1986, Microbial Lectins and Agglutinins, Properties

and Biological Activity, Wiley Series in Ecological and Applied

Microbiology, Page 4-12

35. Janzen D.H., Juster H.B. & Liener I.E., 1976, Insecticidal action of

the phytohemagglutinin in black beans on a bruchid beetle, Science,

vol. 192, pp. 795-796.

36. Sharon N. & Lis H., 2004, History of lectin: from hemagglutinins to

biological recognition molecules, Glycobiology, vol. 14(11), pp. 53R-

62R.

37. Blunden G., Rogers D.J., Farnham W.F., 1975, Survey of British

seaweeds for hemagglutinins. Lloydia 38:162-168.

38. Blunden G., Rogers D.J. & Farnham W.F., 1978, Hemagglutinins in

British marine algae and their possible taxonomic value. In D. E.

Irvine & J.H. Price (eds), Modern Approaches to the Taxonomy of

Red and Brown Algae. Academic Press, London: 21-45.

39. Rogers D.J. and Topliss J.A., 1980, Purification and Characterisation

of an Anti-Sialic Acid Agglutinin from the Red Alga Solieria

chordalis (C. Ag.) J. Ag. Botanica Marina. Vol. XXVI, pp. 301-305.

40. Hori K., Miyazawa K., Ito K., 1981, Hemagglutinins in marine algae.

Bull Jpn Soc Sci Fish 47:793-798.

41. Hori K., Oiwa C., Miyazawa K. and Ito K., 1988, Evidence for wide

distribution of Agglutinins in Marine Algae, Botanica Marina, 31,

pp. 133-138.

42. Fábregas J., Liovo J., Mũnoz A., 1985, Hemagglutinins in red

seaweeds. Bot Mar 28:517-520.

94

43. Fabregas J., Lopez A., llovo J., Munoz A., 1992, A comparative study

of seafish erythrocytes and agglutinins from seaweeds, Comp.

Biochem. Physiol., Vol 103A, No. 2, pp. 307-313.

44. Zheng Y., Lai-Sheng L., 2002, Screening of agglutinins in marine

algae from Fujian coast of China. Chin J Oceanol Limnol 20:256-260

45. Chiles T.C., Bird K.T., 1989, A comparative study of animal

erythrocyte agglutinins from marine algae. Comp Biochem Physiol

94:107-111.

46. Bird K.T., Chiles T.C., Longley R.E., Kendrick A.F., Kinkema M.D.,

1993, Agglutinins from marine macroalgae of the south eastern

United States. J Appl Phycol 5:213-218.

47. Ainouz I,L., Sampaio H., 1991, Screening of Brazilian marine algae

for hemagglutinins. Bot Marina 34:211-214.

48. Ainouz I.L., Sampaio A.H., Benevides N.M.B., Feritas A.L.P., Costa

F.H.F., Carvalbo M.R., Pinheiro-Joventino F., 1992, Agglutination of

enzyme treated erythrocytes by Brazalian marine algal extract. Bot

Mar 35:475-479.

49. Freitas A.L.P., Teixeira D.I.A., Costa F.H.F., Farias W.R.L., Lobato

A.S.C., Sampaio A.H. and Benevides N.M.B., 1997, A new survey of

Brazilian marine algae for agglutinins, Journal of Applied Phycology,

9, pp. 495-501.

50. Alam M,T,, Usmanghani K., 1994, Studies on marine algae for

haemagglutinic activity. Pak J Pharm Sci 7:1–15

51. Kumar S., Barros U., 2010, Human erythrocyte agglutinins from

marine. J Nat Pharm 1:51–54

52. Souza B.W.S., Andrade F.K., Texeira D.I.A., Mansilla A., Freitas

A.L.P., 2010, Haemagglutinin of the Antartic seaweed Georgiella

95

confluens (Reinsch) Kylin: isolation and partial characterization.

Polar Biol 33:1311-1318.

53. Shiomi K., Kamiya H., Shimizu Y., 1979, Purification and

characterization of an agglutinin in the red alga Agardhiella tenera.

Biochim Biophys Acta 576:118-127.

54. Hori K., Keisuke Miyazawa K. and Ito K., 1986a, Preliminary

characterization of Agglutinins from seven marine algal species,

Bulletin of the Japanese Society of Scientific, Vol. 52, No. 2, pp. 323-

331.

55. Hori K., Miyazawa K., Ito K., 1987, A mitogenic agglutinin from the

red alga Carpopeltis flabellata. Phytochemistry 26:1335–1338

56. Kamiya H., Shiomi K., Shimizu Y., 1980, Marine biopolymers with

cell specificity-III in the red algae Cystoclonium purpureum: isolation

and characterization, J Nat Prod 43:136–139

57. Hori K., Miyazawa K. and Ito K., 1986b, Isolation and

Characterization of Glyco conjugate-specific Isoagglutinins from a

Marine Green Alga Boodlea coacta (Dickie) Murray et De Toni,

Botanica Marina, Vol. 29, pp. 323-328.

58. Chiles T.C., Bird K.T., 1990, Gracilaria tikvahiae agglutinin. Partial

purification and preliminary characterization of its carbohydrate

specificity. Carbohydr Res 207:319-326.

59. Shiomi K., Yamanaka H., Kikuchi T., 1981, Purification and

physiochemical properties of a hemagglutinin (GVA-1) in the red

alga Gracilaria verrucosa. Nippon Suisan Gakkaishi 47:1079–1084

60. Rogers D.J., Loveless R.W., Balding P., 1986, Isolation and

characterization of the lectins from sub-species of Codium fragile. In:

BØg-Hansen TC, Van Driessche E (eds) Lectins, vol V. Gruyter,

Berlin, pp 154-160.

96

61. Kamiya H., Ogata K., Hori K., 1982, Isolation and characterization of

a new agglutinin of the red alga Palmaria palmata(L) O Kuntze. Bot

Mar 25:537–540

62. Rogers D.J., Fish B., Barwell C.J., 1990, Isolation and properties of

lectins from two red marine algae: Plumaria elegans and Ptilota

serrata. In: BogHansen TC, Freed DLJ (eds) Lectins: biology,

biochemistry, clinical biochemistry. St. Louis, Sigma Chemical

Company, pp 49–52

63. Kamiya H., Ogata K. & Hori K., 1982, Isolation and characterization

of a new agglutinin in the red alga Palmaria palmata (L.) O. Kuntze.

Bot. Mar. 25:537-540.

64. Rogers D.J., Blunden G., Evans P.R., 1977, Ptilota plumosa, a new

source of blood group B specific lectin. Med Lab Sci 34:193-200.

65. Rogers D.J., Blunden G., Topliss J.A., Guiry M.D., 1980, A survey of

some marine organisms for haemagglutinins. Bot Mar 23: 569–577.

66. Shiomi K., Yamanaka H., Takeaki K., 1980, Biochemical properties

of hemagglutinins in the red alga Serraticardia maxima. Bull J Soc

Sci Fish 46:1369-1373.

67. Rogers D.J., Topliss J.A., 1983, Purification and characterisation of

an antisialic acid agglutinin from the red alga Solieria chordalis (C.

Ag.) J. Ag. Bot Mar 16:301-305.

68. Hori K., Oiwa C., Miyazawa K. and Ito K., 1988, Evidence for wide

distribution of Agglutinins in Marine Algae, Botanica Marina, 31,

pp. 133-138.

69. Shim E., Shim J., Klochkova T.A., Han J.W., Hoon G., 2012,

Purification of a sex-specific lectin involved in gamete binding of

Algaothamnion callophyllidiola (Rhodophyta). J Phycol 48:916-924.

97

70. Ainouz I.L., Sampaio A.H., Freitas A.L.P., Benevides N.M.B.B.,

Mapurunga S., 1995, Comparative study on hemagglutinins from the

red algae Bryothamnion seaforthii and Bryothamnion triquetrum. R

Bras Fisiol Veg 7:15–19

71. Kawakubo A., Makino H., Ohnishi J., 1999, Occurrence of highly

yielded lectins homologous within genus Eucheuma. J Appl Phycol

11:149–56.

72. Lima M.E., Carneiro M.E., Nascimento A.E., Grangeiro T.B.,

Holanda M.L., Amorim R.C. and Benevides N.M., 2005, Purification

of a lectin from the marine red alga Gracilaria cornea and its effects

on the cattle tick Boophilus microolus (Acari: Ixodidae), J. Agric.

Food. Chem, 53, pp. 6414-6419

73. Leite Marques Y.F.M., Silva Melo L.M.C., Amorim Neves R.C.,

Freire E.A., Jorge D.M., Grangeiro T.B., Benevides N.M.B., 2005,

Purification of a lectin fro the marine red alga Gracilaria ornata and

its effect on the development of the cowpea weevil Callosobruchus

maculatus (Coleoptera: Bruchidae), Biochimica et Biophysica Acta,

pp. 137-145.

74. Kakita H., Fukuoka S., Obika H., Kamishima H., 1999, Isolation and

characterisation of a fourth hemagglutinin from the red alga,

Gracilaria verrucosa, from Japan. J Appl Phycol 11:49–56

75. Mori T., O’Keefe B.R., Sowder R.C., Bringans S., Gardella R., Berg

S., Cochran P., Turpin J.A., Buckheit R.W., McMahon J.B., Boyd

M.R., 2005, Isolation and characterization of griffithsin, a novel HIV

in activating protein, from the red alga Griffithsia spp. J Biol Chem

280:9345–9353

76. Nascimento K.S., Nagano C.S., Nunes E.V., Rodrigues G.V.,

Calvete J.J., Saker S., Sampaio W.R.L., Farias S.A.H., 2006,

98

Isolation and characterization of a new agglutinin from red marine

alga Hypnea cervicornis J Agardh. Biochem Cell Biol 84:49–54

77. Hori K., Matsubara K., Miyazawa K., 2000, Primary structure of two

hemagglutinins from the marine red alga, Hypnea japonica. Biochim

Biophys Acta 1474:226-236.

78. Nagano C.S., Moreno F.B.M.B., Bloch C., Prates M.V., Calvete J.J.,

Sampaio S.S., Farias W.R.L., Tavares T.D., Nascimento K.S.,

Grangeiro T.B., Cavada B.S., Sampaio A.H., 2002, Purification and

characterization of a new lectin from red marine alga Hypnea

musciformis. Protein Pept Lett 9:159–165

79. Sampaio A.H., Rogers D.J., Barwell C.J., 1998, A galactose-specific

lectin from the red alga Ptilota filicina. Phytochemistry 48:765–769

80. Chaves R.P., da Silva S.R., Neto L.G.N., Carneiro R.F., da Silva

A.L.C., Sampaio A.H., de Sousa B.L., Cabral M.G., Videira P.A.,

Teixeira E.H., Nagano C.S., 2018, Structural characterization of two

isolectins from the marine red alga Solieria filiformis (Kützing) P.W.

Gabrielson and their anticancer effect on MCF-7 breast cancer cells.

Int J Biol Macromol 107: 1320-1329.

81. Molchanova V., Chernikov O., Chikalovets I., Lukyanov P. , 2010,

Purification and partial characterization of the lectin from the marine

alga Tichocarpus crinitus (Gmelin) Rupr. (Rhodophyta). Bot Mar 53:

69–78.

82. Singh R.S., 2017, Lectins from red algae and their biomedical

potential. Journal of Applied Phycology.

83. Benevides N.M.B., Holanda M.L., Melo F.R., Freitas A.L.P. and

Sampaio A.H., 1998, Purification and Partial Characterisation of the

Lectin from the Marine red alga Enantiocladia duperreyi (C. Agardh)

Falkenberg, Botanica Marina, vol 41, pp. 521-525.

99

84. Oliveira S.R.M, Nascimento A.E., Lima M.E.P., Leite Y.F.M.M.,

Benevides N.M.B., 2002, Purification and characterisation of a lectin

from the red marine alga Pterocladiella capillacea (SG Gmel) Santel

& Hommers. Rev Brasil Bot 25:397–403

85. Sampaio A.H., Rogers D.J., Barwell C.J., Saker-Sampaio S., Costa

F.H.F., Ramos M.V., 1999, A new isolation procedure and further

characterisation of the lectin from the red marine alga Ptilota serrata.

J Appl Phycol 10:539–546

86. Boonsri N., Rudtanatip T., Withyachumnarnkul B., Wongprasert K.,

2017, Protein extract from red seaweed Gracilaria fisheri prevents

acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) infection in

shrimp. J Appl Phycol 29:1597–1608 Boyd WC, Almodovar LR,

Boyd LG (1966) Agglutinins in marine algae for human erythrocytes.

Transfusion (Philadelphia) 6: 82–83.

87. Okuyama S., Nakamura-Tsuruta S., Tateno H., Hirabayashi J.,

Matsubara K., Hori K., 2009, Strict binding specificity of small-sized

lectins from the red marine alga Hypnea japonica for core (α-1, 6)

fucosylated N-glycans. Biosci Biotechnol Biochem 73:912–920

88. Chaves R.P., da Silva S.R., Nascimento Neto L.G., Carneiro R.F.,

Coelho da Silva A.L., Sampaio A.H., lopes de Sousa B., Cabral M.G.,

Videira P.A., Teixeira E.H., Nagano C.S., 2017, Structural

charactrization of two isolectins from the marine red alga Solieria

filiformis (Kutzing) P.W. Gabrielson and their anticancer effect on

MCF-7 breast cancer cells. Int J Biol Macromol.

http://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.09.116.

89. Hori K., Ikegam S., Miyazawa K., Ito K., 1988a, Mitogenic and

antineoplastic isoagglutinins from the red alga Soleria robusta.

Phytochemistry 27:2063-2067.

http://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.09.116

100

90. Melo F.R., Norma M.B., Benevides N.M.B., Pereira M.G., Holanda

M.L., Mendes F.N.P., Oliveira S.R.M., Freitas L.P., Silva L.M.C.M.,

2004, Purification and partial characterisation of a lectin from the red

marine alga Vidalia obtusiloba C Agardh. Rev Bras Bot 27:263–269

91. Mo H., Goldstein I.J., 1994, Isolation and characterization of a

Forssman antigen-binding lectin from velvet bean (Mucuna

derrigiana) seeds. Glycoconj J 11:424-431

92. Hori K., Miyazawa K., Ito K., 1990, Some common properties of

lectins from marine algae. Hydrobiologia 204-205:561–566

93. Okamoto R., Hori K., Miyazawa K., Ito K., 1990, Isolation and

characterization of a new hemagglutinin from the red alga Gracilaria

bursapastoris. Experientia 46:975–977

94. Benevides N.M.B., Leite A.M., Freitas A.L.P., 1996, Atividade

hemagglutinante na alga vermelha Solieria filiformis. R Bras Fisiol

Veg 8:117-122.

95. Calvete J.J., Costa F.H.F., Saker-Sampio S., Murciano M.P.M.,

Nagano C.S., Cavada B.S., Grangeiro T.B., Ramos M.V., Jr C.B.,

Silveira S.B., Freitas B.T., Sampio A.H., 2000, The amino acid

sequence of the agglutinin isolated from the red marine algae

Bryothamnion triquetrum defines a novel lectin structure. Cell Mol

Life Sci 57:343-350.

96. Anam C., Praseptiangga D., Nugraheni M.A., Nurhayati T.,

Fajarningsih N.D., Zilda D.S., Chasanah E., Yunus A., 2017a,

Preliminary characterization of crude lectin fraction of the red alga.

Acrocystis nana from wediombo beach of the southern coast of Java

island, Gunung kidul, Yogyakarta, Indonesia. IOP Conf Ser: Mater

Sci Eng 193:012016

101

97. Kakita H., Fukuoka S., Obika H., Li Z.R., Kamishima H., 1997,

Purification and properties of a high molecular weight hemagglutinin

from the red alga. Gracilaria verrucosa. Bot Mar 40:241-247.

98. Rogers D.J., Hori K., 1993, Marine algal lectins: new developments.

Hydrobiologia 260/261:589–593

99. Moulaei T., Shenoy S.R., Giomarelli B., Thomas C., McMahon J.B.,

Dauter Z., O’Keefe B.R., Wlodawer A., 2010, Monomerization

ofviral entry inhibitor griffithsin elucidates the relationship between

multivalent binding to carbohydrates and anti-HIVactivity. Structure

18:1104– 1115

100. Moulaei T., Alexandre K.B., Shenoy S.R., Meyerson J.R., Krumpe

L.R., Constantine B., Wilson J., Buckheit R.W.Jr, McMahon J.B.,

Subramaniam S., Wlodawer A., O’Keefe B.R., 2015, Griffithsin

tandemers: flexible and potent lectin inhibitors of the human

immunodeficiency virus. Retrovirology 12:6

101. Sampaio A.H., Rogers D.J., Barwell C.J., Saker-Sampaio S.,

Nascimento K.S., Nagano C.S., Farias W.R.L., 2002, New affinity

procedure for the isolation and further characterization of the blood

group B specific lectin from the red marine alga Ptilota phumosa. J

Appl Phycol 14 :489-495.

102. Nascimento A.S.F., Serena S., Beloqui A., Arda A., Sampaio A.H.,

Walcher J., Ott.D., Unverzagt G., Reichardt N.C., Jimenez-Barbero

J., Nascimento K.S., Imberty A., Cavada B.S., Varrot A., 2015, Algal

lectin binding to core (α1-6) fucosylated N-glycans: structural basis

for specificity and production of recombinant protein. Glycobiol

6:607–616

103. Ziolkowska N.E., Keefe B.R., Mori T., Zhu C., Giomarelli B.,

Vojdani F., Palmer K.E., McMhon J., Wlodawer A., 2006, Domain-

swapped structure of the potent antiviral protein griffithsin and its

102

mode of carbohydrate binding. Structure 14:1127-1135.

104. Ziolkowska N.E., Shenoy S.R., O’keefe B.R., Wlodawer A., 2007a,

Crystallographic studies of the complexes of antiviral protein

griffithsin with glucose and N-acetylglucosamine. Prot Sci 16:1485–

1489

105. Ziolkowska N.E., Shenoy S.R., O’Keefe B.R., McMohan J.B.,

Palmer K.E., Dwek R.A., Wormald M.R., Wlodawer A., 2007b,

Crystallographic, thermodyanamic, and molecular modelling studies

of the mode of binding of oligosaccharides to the potent antiviral

protein griffithsin. Proteins: Struct Funct Bioinf 67:661–670

106. Barre A., Simplicien M., Benoist H., Van Damme Els.J.M., Rougé P.,

2019, Mannose-specific lectins from marine algae: Diverse structure

scaffolds associated to common virucidal and anti-cancer properties.

107. Le Dinh Hung, Hirayama M., Hori K., 2016, Cloning and

characterizing cDNA sequences coding high-mannose N-glycan

binding lectins from cultivated red algae Eucheuma denticulatum and

Kappaphycus striatum. Vietnam J Biotechnol 14: 327-336.

108. Whitley M.J., Furey W., Kollipara S., Gronenborn A.M., 2013,

Burkholderia oklahomensis agglutinin is a canonical two-domain

OAA-family lectin: structure, carbohydrate binding, and anti-HIV

activity. FEBSJ. 280, 2056-2067.

109. Huskens D., Schols D., 2012, Algal lectins as potential HIV

microbicide candidates. Mar Drugs 10: 1476-97.

110. Parveen Bansal, 2013, Algal lectins as promising biomolecules for

biomedical research.

111. Neves S.A., Freitas A.L.P., Souza B.W.S., 2007, Antinociceptive

properties in mice of a lectin isolated from the marine alga Amansia

multifida Lamouroux. Braz. J. Med. Biol. Res 40:127- 34.

103

112. Viana G.S.B., Freitas A.L.P., Lima M.M.L., 2002, Antinociceptive

activity of sulfated carbohydrates from the algae Bryothamnion

seafortii (Turner) Kutz. And B. Triquetrum (S.G. Gmel) M. Howe.

Braz J Med Biol Res 35: 713-22.

113. Vanderlei E.S.O., Patoilo K.K.N.R., Lima NA., 2010,

Antinociceptive and anti-inflamatory activities of lectin from the

marine green alga Caulerpa cupressoides. Int Immunopharmacol

10:1113-8.

114. Karasaki Y., Tsukamoto S., Mizusaki K., 2001, Agarlic lectin exerted

an antitumor activity and induced apoptosis in human tumor cells.

Food Res Int 34:7-13

115. Pinto V.P.T., Debray H., Dus D., Teixeira E.H., de Oliveira T.M.,

Carneiro V.A., Teixeira A.H., Filho G.C., Nagano C.S., Nascimento

K.N., Alexandre H., Sampaio A.H., Cavada B.S., 2009, Lectins from

the red marine algal species Bryothamnion seaforthii and

Bryothamnion triquetrum as tools to differentiate human colon

carcinoma cells. Adv Pharmacol Sci 2009: 862162.

116 Anam C., Chasanah E., Perdhana B.P., Fajarningsih N.D., Yusro

N.F., Sari A.M., Nursiwi A., Praseptiangga D., Yunus A., 2017b,

Cytotoxicity of crude lectins from red macro algae from the southern

coast of Java island, Gunung Kidul Regency, Yogyakarta, Indonesia.

IOP Conf Ser: Mater Sci Eng 193:012017

117. Perdhana B.P., 2017, Cytotoxicity and antibacterial effects of crude

lectin fraction bioactive compound of red macroalgae from the

Southern Coast of Java island, Gunungkidul regency. Dissertation,

Sebelas Maret University, Surakarta, Yogyakarta

118. Triveleka L.A., Vagias C., Roussis V., 2003, Natural products with

anti-HIV activity from marine organism. Curr Top Med 3:1512-35.

104

119. Barrientos L.G., O’Keefe B.R., Bray M., 2003, Cyanovirin-N binds

to the several glycoprotein gp (1, 2) and inhibits infectivity of Ebola

virus. Antivir Res 58:47-56.

120. Bewley C.A., Gustafson K.R., Boy M.R., 1998, Solution structure of

cyanovirin-N, a potent HIV-inactivating protein. Nature 15:571-8

121. Dey B., Lerner D.L., Lusso P., 2000, Multipe antiviral activities of

cianovirin-N: Blocking of human immunodeficiency virus type 1 gp

120 interaction with CD4 and coreceptor and inhibition of diverse

enveloped viruses. J Virol 74:4562-9

122. Le Dinh Hung, Ngo Thi Duy Ngoc, Kanji Hori (2013) Isolation and

characterization of novel lectins from the red alga Gracilaria

salicornia. Vietnam J Biotechnol 11(4): 743 – 753.

123. Le Dinh Hung, Tran Thi Hai Yen, Dinh Thanh Trung, 2018a,

Characterization of O-glycan binding lectin from the red alga

Hydropuntia eucheumatoides. Vietnam J Biotechnol 16(4): 687-696.

124. Le Dinh Hung, Bui Minh Ly, Vo Thi Hao, Dinh Thanh Trung, Vo

Thi Dieu Trang, Phan Thi Hoai Trinh, Ngo Thi Duy Ngoc, Thai Minh

Quang, 2018b, Purifcation, characterization and biological effect of

lectin from the marine sponge Stylissa flexibilis (Lévi, 1961). Com

Biochem Physiol Part B 216: 32 – 38.

125. Le Dinh Hung, Le Thi Hoa, Le Nhu Hau, Dinh Thanh Trung, 2019,

The lectin accumulation, growth rate, carrageenan yield, and quality

from the red alga Kappaphycus striatus cultivated at Camranh Bay,

Vietnam. J Appl Phycol 31: 1991 – 1998.

126. Terada R., Lewmanomont K., Chirapart A., Kawaguchi S., 2004,

Gracilaria and related Genera (Gracilariales, Rhodophyta) from the

Gulf of Thailand and Adjacent Waters. Proc Sem Coast Oceanogr,

1st: 144-159.

105

127. Nguyễn Đình Triệu, 2006, Các phƣơng pháp vật lý ứng dụng trong

hóa học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, tr.124-149.

128. Edman P., Högfeldt Erik, Sillén Lars Gunnar, Kinell Per-Olof, 1950,

Method for determination of the amino acid sequence in

peptides. Acta Chem. Scand. 4: 283–

293. doi:10.3891/acta.chem.scand.04-0283.

129. Lê Nhƣ Hậu, 2007, Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Quốc gia "Biển

Đông-2007", Nha Trang, tr. 527-534.

130. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J., 1951, Protein

measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 193:

265–275.

131. Robert K. Scopes, 1982, Protein Purification, Springer-Verlag, New

York Heidelberg Berlin, page 58.

132. LaemmLi U.K., 1970, Cleavage of structural proteins during the

assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680–685.

133. Xiong C., Li W., Liu H., Zhang W., Dou J., Bai X., Du Y., Ma X.,

2006, A normal mucin binding lectin from the sponge Craniella

australiensis. Comp. Biochem. Physiol. C 143, 9–16.

134. Pamela Stanley, Naoyuki Taniguchi and Markus Aebi, 2017,

Essentials of Glycobiology. Chapter 8O-Glycans

135. Pamela Stanley, Naoyuki Taniguchi and Markus Aebi, 2017,

Essentials of Glycobiology. Chapter 9N-Glycans

136. Tsuji T., Yamamoto K., Irimura T., Osawa T., 1981, Structure of

carbohydrate unit A of porcine thyroglobulin. J Biochem 195: 691-

699.

137. Yamamoto K., Tsuji T., Irimura T., Osawa T., 1981, The structure of

carbohydrate unit B of porcine thyroglobulin. J Biochem 195: 70-713.

https://en.wikipedia.org/wiki/Digital_object_identifier

https://doi.org/10.3891%2Facta.chem.scand.04-0283

106

138. Wopereis S., Lefeber D.J., Morava E., Wevers R.A., 2006,

Mechanisms in protein O-glycan biosynthesis and clinical and

molecular aspects of protein O-glycan biosynthesis.

139. Van Halbeek H., Dorland L., Vliegenthart J.F.G., Kochetkov K.,

Arbatsky N.P., Derevitskaya V.A., 1982, Characterization of the

primary structure and the microheterogeneity of the carbohydrate

chains of porcine blood-goup H substance by 500-MHz 1H-NMR

spectroscopy. Eur J Biochem 127:21-29.

140. Karlsson N.G., Nordman H., Karlsson H., Carlstedt I., Hansson G.C.,

1997, Glycosylation differences between pig gastric mucin

populations: A comparative study of the neutral oligosaccharides

using mass spectrometry. J Biochem 326: 911-917.

141. Nagano C.S., del Sol F.G., Cavada B.S., Nascimento K.S.D., Nunes

E.V., Sampaio A.H., Calvetea J.J., 2005, Crystallization and

preliminary X-ray diffraction analysis of HML, a lectin from the red

marine alga Hynea musciformis. Acta Cryst F 61:997-999.

PHỤ LỤC

Bảng Phụ lục 1: Giá trị mật độ quang OD tƣơng ứng với

nồng độ BSA (µg/mL)

Nồng độ BSA (µg/mL) OD750 nm

20 0.053

40 0.112

80 0.209

120 0.309

160 0.401

200 0.478

Đƣờng chuẩn protein theo phƣơng pháp của Lowry

Bảng Phụ lục 2: Giá trị Rf và lgM của protein trong thang chuẩn

Khối lƣợng

phân tử M (Da)

Khoảng cách di

chuyển

của vạch Protein

(cm)

Rf Lg M

66000 0.7 0.12 4.82

45000 1.0 0.17 4.65

36000 1.3 0.22 4.56

29000 1.7 0.28 4.46

24000 2.0 0.33 4.38

20100 2.5 0.42 4.30

14200 3.3 0.55 4.15

Đồ thị tƣơng quan giữa lgM và Rf của protein trong thang chuẩn

Bảng Phụ lục 3: Kết quả phân tích ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu:dung môi

chiết (w/v) đến hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của lectin từ rong đỏ

H. eucheumatoides

Tỷ ệ HA

(HU/mL)

Protein

tổng (mg)

HTTS

(HU)

HTR

(HU/mg)

1:2 1024 13,75 11264 819,20

1:3 1024 18,69 21504 1150,56

1:4 1024 19,84 31744 1600,00

1:5 512 25,01 20992 839,34

1:6 512 27,03 20480 757,68

1:7 256 26,23 15616 595,35

1:8 128 30,53 9088 297,67

Bảng Phụ lục 4: Kết quả phân tích ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hoạt

tính tổng số và hoạt tính riêng của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides.

Nồng độ

ethanol

(%)

HA

(HU/mL)

HTTS

(HU)

Protein

tổng (mg)

HTR

(HU/mg)

0 1024 6451,2 6,00 1075,20

10 1024 6860,8 6,21 1104,79

20 1024 6553,6 5,46 1200,29

30 512 3174,4 4,14 767,76

40 256 1664,0 3,79 439,05

Bảng Phụ lục 5: Kết quả phân tích ảnh hƣởng thời gian chiết (giờ) đến hoạt

tính tổng số, hoạt tính riêng của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides.

Thời gian

(giờ)

HA

(HU/mL

Protein

tổng (mg)

HTTS

(HU)

HTR

(HU/mg)

2 256 14,2 5120 360,56

4 512 15,2 10240 673,68

6 1024 24,9 20480 822,49

8 1024 25,8 20480 793,80

10 1024 28,1 20480 728,83

12 1024 29,9 20480 684,95

Bảng Phụ lục 6: Kết quả phân tích nồng độ ethanol đến khả năng kết tủa

của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides.

Nồng độ

ethanol (%)

HA

(HU/mL

Protein

tổng (mg)

HTTS

(HU)

HTR

(HU/mg)

50 1024 0,89 1024 1150,56

60 2048 1,13 2048 1812,39

70 8192 1,72 8192 4662,79

80 16384 3,28 16384 4995,12

Bảng Phụ lục 7: Kết quả đo A280 nm và hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của các

phân đoạn sau sắc ký trao đổi ion DEAE-sepharose.

Thứ tự các

phân đoạn A280nm

Hoạt

tính

ngƣng

kết hồng

cầu

Thứ tự

các phân

đoạn

A280nm

Hoạt

tính

ngƣng

kết hồng

cầu

1 0 0 28 0.011 0

2 0.003 0 29 0.008 0

3 0.048 0 30 0.008 0

4 0.062 0 31 0.009 0

5 0.064 0 32 0.01 0

6 0.062 0 33 0.003 0

7 0.054 0 34 0.016 0

8 0.045 0 35 0.02 0

9 0.036 0 36 0.094 256

10 0.03 0 37 0.834 2048

11 0.024 0 38 0.407 1024

12 0.02 0 39 0.141 128

13 0.019 0 40 0.063 16

14 0.018 0 41 0.037 8

15 0.018 0 42 0.029 4

16 0.019 0 43 0.024 2

17 0.019 0 44 0.022 0

18 0.018 0 45 0.018 0

19 0.017 0 46 0.016 0

20 0.1017 0 47 0.014 0

21 0.016 0 48 0.016 0

22 0.014 0 49 0.016 0

23 0.012 0 50 0.014 0

24 0.011 0 51 0.014 0

25 0.013 0 52 0.014 0

26 0.015 0 53 0.013 0

27 0.013 0 54 0.01 0

Bảng Phụ lục 8: Kết quả đo A280 nm và hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của các

phân đoạn sau sắc ký lọc gel Sephacryl S-200.

Thứ tự

các phân

đoạn

A280nm

Hoạt tính

ngƣng

kết hồng

cầu

Thứ tự

các phân

đoạn

A280nm

Hoạt tính

ngƣng

kết hồng

cầu

1 0.016 0 27 0.007 256

2 0.003 0 28 0.012 256

3 0 0 29 0.026 512

4 0 0 30 0.034 512

5 0 0 31 0.038 512

6 0 0 32 0.04 512

7 0 0 33 0.038 256

8 0 0 34 0.028 128

9 0 0 35 0.018 32

10 0 0 36 0.012 8

11 0 0 37 0.012 4

12 0 0 38 0.011 4

13 0 0 39 0.012 4

14 0 0 40 0.011 2

15 0 0 41 0.009 2

16 0 0 42 0.008 2

17 0 0 43 0.004 0

18 0 0 44 0.002 0

19 0 0 45 0.003 0

20 0.009 0 46 0.001 0

21 0.033 0 47 0.001 0

22 0.027 2 48 0.001 0

23 0.025 4 49 0.002 0

24 0.026 16 50 0.003 0

25 0.019 64 51 0.002 0

26 0.012 128 52 0.004 0

Bảng Phụ lục 9: Kết quả xét ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính ngƣng kết

hồng cầu của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides

Nhiệt độ (oC) Hoạt tính ngƣng kết hồng cầu

(HU/mL)

30 27

40 27

50 27

60 27

70 23

80 2o

90 2o

100 2o

Bảng Phụ lục 10: Kết quả xét ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính ngƣng kết

hồng cầu của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides

pH Hoạt tính ngƣng kết hồng cầu

(HU/mL)

3 27

4 27

5 27

6 27

7 27

8 27

9 27

10 27

lỜi cẢm Ơn Ứ - gust.edu.vngust.edu.vn/media/27/uftai-ve-tai-day27326.pdf · trƣớc hết,...

Documents