Luminalt administrerat PGE2 saknar effekt på

duodenums paracellulära permeabilitet i råtta

av

Robin Razmi

Uppsala universitet Handledare: Markus SjöblomInstitutionen för NeurovetenskapEnheten för fysiologiLäkarprogrammetSjälvständigt projektarbete, 30 hsp

1

Innehållsförteckning

2 – Innehållsförteckning

3 – Introduktion

10 – Material och metod

14 – Resultat

17 – Diskussion

20 - Referenser

2

Introduktion

Crohn's sjukdom tillhör gruppen inflammatoriska tarmsjukdomar (inflammatory bowel

diseases, IBD) och kännetecknas av en icke-infektiös, transmukosal inflammation med

varierande utbredning i mag-tarmkanalen. Incidensen för Crohn's sjukdom i Sverige är 5-7

fall / 100000 invånare och sjukdomsspektrat varierar från lätta symtom härrörande från

isolerade delar av tarmen, till invalidiserande tillstånd med svåra komplikationer och hög

morbiditet [1]. Etiologin är okänd, men i flera studier har ett samband mellan Crohn's

sjukdom och en ökad permeabilitet hos tunntarmens mukosa kunnat påvisas [2], [3], [4]. Det

har föreslagits att Crohn's sjukdom på sikt kan komma att betraktas som en defekt i den

intestinala barriärfunktionen, vilken i kombination med individuella sårbarhetsfaktorer leder

till utveckling av det kliniska sjukdomstillståndet [5]. Här finns alltså förhoppningar om att en

djupare förståelse för regleringen av tunntarmens slemhinnebarriär kan bidra till utvecklingen

av kausal behandling för en patientgrupp som hittills varit hänvisad till symtomatisk

behandling.

Syftet med forskningsprojektet är att i sövda opererade råttor studera proximala

duodenums barriärfunktion vid basala betingelser, samt efter luminal tillförsel av

prostaglandin E2 (PGE2). Detta tarmsegment har valts då dess anatomiska läge nära ventrikeln

möjliggör en standardiserad, minimalinvasiv operationsprocedur. PGE2 har valts som studerad

faktor då det är ett ämne som visats påverka en mängd olika parametrar i

gastrointestinalmukosan. Några publicerade data angående PGE2:s effekter på slemhinnans

barriärfunktion finns i nuläget inte. Men med tanke på dess väl belagda effekter på

bikarbonatsekretion, slemproduktion, mukosalt blodflöde samt motorik [6] finns skäl att anta

att denna signalsubstans är involverad även i permeabilitetsregleringen.

I den djurmodell som används studeras permeabiliteten, tillsammans med två andra

parametrar som sammantaget ger en uppfattning om slemhinnans och försöksdjurets viabilitet.

Dessa parametrar är bikarbonatsekretion och tarmmotorik.

Prostaglandiner och COX-hämmare

Prostaglandiner är endogena signalsubstanser, tillhörande den större gruppen eicosanoider.

Till skillnad från många andra signalsubstanser finns ingen preformerad intracellulär depå av

prostaglandiner, utan syntesen – utgående från fosfolipidprekursorer (främst arachidonsyra) –

induceras vid behov. Denna syntes kan blockeras genom att inaktivera det enzym – cyklo-

3

oxygenas (COX) – som katalyserar omvandlingen av arachidonsyra till prostaglandiner. COX

förekommer i två isoformer: COX-1 som är konstitutivt aktivt i de flesta celler, samt COX-2

som vanligtvis är inaktivt men aktiveras vid inflammation [7].

COX-hämmare (Non-Steroid Anti-Inflammatory Drugs, NSAIDs) hör idag till

marknadens mest förskrivna och använda läkemedel [8]; detta då de har en bevisat god effekt

på inflammation samt inflammatorisk smärta, samtidigt som de tolereras väl av de flesta

patienter. De vanligaste rapporterade biverkningarna av NSAIDs är gastrointestinala besvär –

vanligast är banala besvär av dyspeptisk natur, men även allvarligare biverkningar

förekommer i form av gastroduodenala sår, blödningar och perforationer . Aktuell forskning

visar att prostaglandiner verkar skyddande på duodenalmukosan (effekter som således är

väsensskilda från den inflammatoriska verkan dessa substanser utövar i övrig vävnad), och att

lesioner kan uppstå om prostaglandinsyntesen supprimeras med COX-hämmare [9].

Utöver detta finns data som tyder på att en nedreglering av prostaglandinsyntesen med

NSAID-preparat kan inducera exacerbationer av Crohn's sjukdom [10]. Detta förhållande – att

ett antiinflammatorisk preparat kan förstärka en inflammatorisk process – kan tyckas

paradoxalt, och de bakomliggande mekanismerna är inte fullständigt klarlagda. En hypotes är

dock att suppresion av prostaglandinuttrycket resulterar i en ökning av tunntarmens

paracellulära permeabilitet [11]. Detta resulterar i ökad kontakt mellan chymus och

subepiteliala immunceller, med inflammation som följd (se avsnittet om permeabilitet nedan).

Takeuchi och medarbetare har i flera studier visat att PGE2 är den subtyp av

prostaglandin som spelar störst roll för upprätthållandet av duodenalmukosans integritet[6],

och att den gör detta genom inverkan på en rad faktorer (bikarbonatsekretion, slemproduktion,

mukosalt blodflöde, motorik) [6]. PGE2 har således valts ut för föreliggande forskningsprojekt

mot bakgrund av dess breda och väldokumenterade effekt på duodenalmukosan.

Tarmslemhinnans permeabilitet

Med en effektiv area på ca 200 m² utgör tunntarmens mukosa kroppens största kontaktyta mot

omvärlden [12]. Emedan chymus innehåller en mängd för organismen potentiellt skadliga

ämnen (irritativa nedbrytningsprodukter, infektiösa mikroorganismer, antigener mm) är det av

yttersta vikt att passagen över slemhinneepitelet sker under kontrollerade former. Samtidigt är

det i tunntarmen som absorption av nutrienter från födan äger rum. Av denna anledning är

ytepitelet i tunntarmens lumen – jämfört med övre delar av magtarmkanalen (munhåla,

esophagus och ventrikel) där ingen absorption sker – betydligt mer genomsläppligt [13]. I

allmänhet gäller att den transport som sker genom epitelceller (transcellulär transport) är

4

aktiv, medan transporten mellan epitelceller (paracellulär transport) sker passivt .

Paracellulär transport sker genom det så kallade intercellulärrummet, ett spatium som

uppskattats mäta någonstans mellan 10 och 15 Å. Storleken och laddningen begränsar vilka

partiklar som kan transporteras via denna rutt [14]. Den aktiva regleringen av paracellulär

permeabilitet sker med hjälp av tre sorters intercellulära strukturer, vilka även upprätthåller

kontakten mellan intilliggande celler; mest apikalt mot tarmlumen finns tight junctions (täta

fogar), basalt återfinns desmosomer, och emellan dessa finns adherens junctions (även kända

som intermediate junctions), se figur 1. Viktigast med avseende på den intestinala

barriärfunktionen är de apikala tight junctions, som avgränsar tarmlumen från

intercellulärrummet[15].

Figur 1: Tre typer av intercellulära strukturer upprätthåller den paracellulära barriären.

Länge antogs tight junctions utgöras av proteiner vars funktion var statisk, men senare studier

har visat på en association till cellskelettet. Cellskelettet är rörligt och står under inflytande av

flera olika intracellulära mediatorer (bland annat cAMP), vilket möjliggör snabba

förändringar i tight junctions struktur och tarmens paracellulära permeabilitet [16].

Många studier har påvisat en ökad duodenal permeabilitet vid Crohn's sjukdom [2], [3],

[4], [17]. Bakgrunden till detta samband tros vara att den rådande balansen mellan upptag och

lysosomal nedbrytningskapacitet är rubbad. Vanligtvis sker en kvantitativt blygsam transport

av antigener från tarmlumen – tillräckligt för att skapa en tolerans mot normalfloran, utan att

det uppstår ett inflammatoriskt svar mot densamma. Om den duodenala permeabiliteten ökar

kommer detta resultera i en låggradig aktivering av det enteriska immunsystemet, som på sikt

kan bli självförsörjande och utvecklas till en kronisk inflammation i tarmmukosan[18].

I sammanhanget kan nämnas att man även funnit en korrelation mellan störd

5

tarmbarriärfunktion och sjukdomar härrörande andra organsystem än tarmen, såsom

astma/allergi [19], diabetes mellitus typ-1 [20] och leversteatos [21]. Teorin är att den stora

mängden immunkompetenta celler i magtarmkanalen ger upphov till en systemisk

inflammatorisk uppreglering som kan resultera i autoimmuna angrepp på olika kroppsegna

vävnader [18].

Förhoppningen är således att ökade kunskaper om tarmens permeabilitetsreglering på

sikt kan ge en ökad förståelse för patogenesen bakom Crohn's sjukdom, men även för en rad

andra inflammatoriska sjukdomar med i nuläget oklar etiologi.

Duodenalslemhinnans bikarbonatsekretion

När den nedsvalda maten når magsäcken surgörs den av vätejoner som secerneras av

parietalceller i ventrikelslemhinnan. Detta skeende fungerar dels som en syraspärr mot

bakterier i födan, men även som ett led i en sur hydrolys av födoämnen och ett upprättande av

optimala förhållanden för pepsin att verka. Genom parietalcellernas syrasekretion pressas

ventrikelinnehållets pH ned till mellan 1 och 1,5 [1]. Små mängder av den sura magsaften

töms intermittent ner i duodenum där den snabbt neutraliseras av HCO3– från framförallt galla

och bukspott. Den kontinuerliga syrastressen i duodenum utgör emellertid en överhängande

risk för syrainducerad epitelskada. Duodenalmukosan har till skillnad från andra epitel i

magtarmkanalen en mycket hög sekretion av HCO3–. HCO3

– utsöndras i det tunna (hos

människa mellan 50 och 450 μm) slemskikt som ligger ovanpå epitelcellerna [22]. Över detta

slemskikt föreligger en skarp pH-gradient, så att tarmepitelcellerna upplever ett pH som är

neutralt eller nästan neutralt, trots tarminnehållets uttalade surhet [23]. pH-gradienten

upprätthålls genom kontinuerlig utsöndring av den höga HCO3–-sekretionen från

duodenalmukosans epitelceller.

Det viktigaste fysiologiska stimulit till en ökad duodenal bikarbonatsekretion är närvaro

av syra i duodenallumen. Trots det neutrala pH:t vid cellytan känner epitelcellerna av närvaro

av syra i lumen. Denna sensoriska mekanism erhålls genom att CO2 bildas då vätejoner från

det sura tarminnehållet möter luminalt HCO3–, enligt följande reaktion:

H+ + HCO3– → CO2 + H2O

6

Figur 2. Den karbanhydrasmedierade reaktionen varvid CO2 omvandlas till HCO3-. Kopierad med tillstånd från Endeward, 2003, Elsevier.

Koldioxiden som bildas kan sedan diffundera genom slemskiktet och vidare över

enterocyternas apikala cellmembran. I cellen kommer enzymet karbanhydras reversera

reaktionen som beskrivs ovan, varvid det intracellulära pH:t sjunker [24]. Genom detta system

kan en luminal pH-sänkning propageras till enterocyten, som då kan reagera på surgörningen

med en ökad bikarbonatsekretion, utan att slemskiktets pH-gradient påverkas (se Figur 2).

Studier har visat att HCO3– producerat intracellulärt av karbanhydraser står för

uppskattningsvis 15 %, medan resten tas upp från blodbanan över det basolaterala membranet

via den elektroneutrala Na+/HCO3–- kotransportören NBC [25]

HCO3–-sekretionen från enterocyterna i duodenum är viktig för att bevara ytepitelets integritet

och motverka ulceration. I enlighet med detta har man kunnat påvisa att patienter med

duodenalulcus har en lägre sekretion av HCO3– i proximala duodenum, jämfört med friska

försökspersoner [26]. Experiment utförda in vivo på råtta har kunnat påvisa att sekretionen är

beroende av COX-1, och att ulcerogeniteten hos icke-selektiva COX-hämmare sannolikt är en

effekt av deras nedreglering av prostaglandiner involverade i slemhinnans HCO3– sekretion

[27]. Studier utförda på människa har visat att luminal tillförsel av prostaglandiner typ E

resulterat i en signifikant ökning av HCO3–-sekretionen i duodenum [28]. Vidare har försök

med selektiva PG-receptor-agonister- och antagonister pekat på att PGE2 är den subtyp av

7

prostaglandiner som i störst utsträckning aktiverar slemhinnans bikarbonatsekretion, och att

denna effekt utövas via receptorerna EP3 [29] och EP4 [30].

Den duodenala sekretionen av HCO3– sker med två separata transmembrana

transportprocesser där Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR) utgör anjonskanal

och HCO3–/Cl– utbytaren utgör det andra transportproteinet (även benämnd ”anion

exchanger”, AE) [31]. Av dessa är den förra elektrogen (transporterar ut både HCO3– och Cl-)

medan den senare är elektroneutral (byter ut HCO3– mot Cl-) (se Figur 3).

Intestinal motorik

Människor, likväl som råttor och andra däggdjur, uppvisar vid fasta ett intestinalt

motorikmönster känt som migrerande motorkomplex (MMC) [32, 33] MMC-mönstret är

cykliskt och består av tre faser:

1. vilofas

2. oregelbunden motorisk aktivitet

3. koordinerade motorikkomplex

Den motoriska aktiviteten börjar i allmänhet i magsäcken, rör sig genom tunntarmen och

avslutas i distala ileum. Mönstret kan betraktas som ett sköljprogram för den fastande tarmen

8

[34]. Vid invasiva bukingrepp sätts dock detta system ur spel och den motoriska aktiviteten

avtar. Detta fenomen benämns postoperativ ileus, och är ett välkänt fenomen vid all

abdominell kirurgi.

Postoperativ ileus härrör från två skilda mekanismer. I initialskedet rör det sig om en

neural reflex, varvid intensiv nociception stimulerar afferenta neuron i det autonoma

nervsystemet och aktiverar centralnervösa inhibitoriska neuron. Denna effekt är dock

kortvarig, och det som på sikt uppehåller det paralytiska tillståndet är en generell uppreglering

av det inflammatoriska systemet i tarmen[35]. I detta senare skede tros COX spela en

framträdande roll i syntesen av inflammatoriska markörer. I råttmodeller har man kunnat visa

att så mycket riktigt är fallet, och att inhibition av COX-2 (den isoform av COX som främst är

associerad med inflammation) accelererar intestinal transit postoperativt [35].

Hos människa utövar COX-hämmare sin epiteldestruktiva effekt genom att nedreglera

uttrycket av prostaglandiner (främst PGE2), vilket i sin tur minskar sekretionen av HCO3– och

därigenom exponeras enterocyterna för skadlig syra. Hos råtta däremot har det visats att

behandling med den oselektiva COX-hämmaren indomethacin ökar den duodenala

bikarbonatsekretionen efter ett invasivt bukingrepp [36]. Den sannolika förklaringen till detta

förhållande är att hämning av COX-2 nedreglerar den postoperativa inflammatoriska

aktiviteten i tarmen och häver det postoperativa ileustillståndet. Motoriken stimulerar

myenteriska reflexer, vilket ger en uppreglering av aktiviteten hos sekretionsstimulerande

neuron [34].

Frågeställning

Mot bakgrund av ovanstående har jag valt att studera PGE2:s inverkan på duodenalmukosans

paracellulära permeabilitet, men även dess bikarbonatsekretion och tarmmotorik . Då det

tidigare är väl studerat och belagt att luminalt administrerat PGE2 ger en ökad sekretion av

bikarbonat används denna parameter som en positiv kontroll på slemhinnans viabilitet; en

tydlig sekretionsökning indikerar således en adekvat tillredd PGE2-beredning och ett viabelt

duodenalepitel.

Motoriken är att betrakta som en kontrollparameter för ingreppets invasivitet och

försöksdjurets allmänna välstånd, och utgör en grund för gruppering av djuren. Adekvata

migrerande motorkomplex tolkas som att djuret befinner sig så nära fysiologiska betingelser

som är möjligt i denna modell. Ett postoperativt ileustillstånd som inte går att häva med en

hög dos NSAID får å andra sidan tolkas som en kraftig uppreglering av inflammatorisk

aktivitet till följd av kirurgiskt trauma.

9

Material och metod

Alla experiment i denna studie är godkända av centrala försöksdjursnämnden i Uppsala.

Råttor av stammen Sprague-Dawley (SD), med en kroppsvikt mellan 250 g och 350 g och

fastade i ca 18 timmar före försöket sövs med en intraperitoneal injektion av barbituratet

Inactin (thiobutabarbital), 120 mg/kg kroppssvikt. Inactin är ett anestetikum som råttan är

oförmögen att metabolisera, vilket säkerställer ett jämnt anestesidjup under hela försökets

förlopp. Sövningen begränsar djurets förmåga att reglera kroppstemperatur, varför det första

momentet i försöket är att placera råttan på en värmeplatta – denna är kopplad till en termistor

som förs in rektalt, och utrustningens termostat ser till att upprätthålla en kroppstemperatur

mellan 37ºC och 38ºC under försöket.

Det kirurgiska ingreppet

Under barbituratanestesin sjunker försöksdjurets andningsfrekvens och andningsdjup. För att

säkerställa en fri luftväg och underlätta syresättningen sätts en tracheostomi. Härefter

exploreras råttans ljumske och a. och v. femoralis friläggs och kateteriseras. Katetern i a.

femoralis innehåller fysiologisk koksaltlösning med 12 IU/ml heparin och är kopplad till en

tryckgivare för övervakning och kontinuerlig monitorering av det arteriella blodtrycket samt

för blodprovtagning. Venkatetern används för administrering av läkemedel och

permeabilitetsmarkör, samt för kontinuerlig infusion av 1 ml fysiologisk koksaltlösning per

timme. Snitten i halsen och ljumsken sluts med ett vävnadslim.

I nästa moment utförs en laparotomi, varvid buken öppnas med ett fem cm långt snitt

längs linea alba. Med stor försiktighet lyfts magsäck och proximala duodenum upp ur

bukhålan. Då råttan saknar gallblåsa lokaliseras och kateteriseras gallgången. Detta görs

genom att identifiera dess inflöde i duodenum (ca 2 cm distalt om pylorus) och syftet är att

gall- och pankreassafterna ska kunna avledas till ett externt uppsamlingskärl (istället för att

kontinuerligt utsöndras till det tarmsegment som ska analyseras). Gallgångskatetern fästs med

en ligatur. En mjuk silikonslang förs sedan ned genom råttans esophagus, genom magsäcken

och ut i duodenum via pylorus. Denna sond fästs på plats med en ligatur kring

pylorussfinktern. Ca tre cm distalt om pylorus diatermeras tarmen (för att embolisera mindre

kärl och minimera blödning) och ett snitt görs med hjälp av kärlsax. En hård kateter införs i

lumen och fästs med en ligatur. Buken sluts sedan med tre intramuskulära stygn i m. rectus

abdominis och täcks med en bit plastfolie för att minimera förlust av värme och vätska.

10

Med detta ingrepp har således ett omkring tre cm långt segment av duodenum isolerats

med ett intakt blodflöde, mellan den mjuka sondens slut och den hårda kateterns början (se

Figur 4).

Sonden kopplas nu till en peristaltisk pump, och tarmsegmentet perfunderas kontinuerligt med

en fysiologisk koksaltlösning i ett flöde på fyra ml per tio minuter, se Figur 5. Efter avslutad

operation tillåts djuret återhämta sig i cirka en timme så att gastrointestinala, respiratoriska

och cirkulatoriska funktioner stabiliseras.

Figur 5: Schematisk bild av försöksdjur och utrustning under registreringen

11

Figur 4: Läget av sond och utflödeskateter efter bukingreppet

Försöksprotokoll

Mellan 30 och 60 minuter före försöksstart administrerades en bolusdos om ~75 μCi av den

radioaktivt märkta permeabilitetsmarkören 51Cr-EDTA, följt av en kontinuerlig infusion om

~50 μCi 51Cr-EDTA per timme fram till försökets slut. 10 minuter före försöket början togs ett

arteriellt blodprov om ~0,3 ml, följt av en kompensatorisk injektion av samma volym av 7 %-

ig albuminlösning. Från och med att bukingreppet färdigställts till och med försöksavslut

perfunderades tarmen kontinuerligt med en fysiologisk NaCl-lösning. 30 minuter in i försöket

byts lösningen ut mot fysiologisk NaCl-lösning med tillsatt PGE2 till en koncentration av 50

μM. Efter 20 minuters perfusion med PGE2 återinsattes den ordinarie fysiologisk NaCl-

lösning.

Försöksprotokollet delas in i tre huvudsakliga perioder enligt följande:

− Basalperiod: 30 min (t=0 till t=30 min)

− PGE2-period: 20 min (t=30 till t=50 min)

− Post-PGE2-period: 40 min (t=50 till t=90 min)

Under hela försöket samlas perfusatet upp i provrör, vilka byts var tionde minut. Efter 90

minuter tas ännu ett arteriellt blodprov och därefter avslutas försöket. Djuret avlivas med en

intravenös injektion med 1 ml mättad KCl-lösning. Sedan öppnas buken och det isolerade

tarmsegmentet tas ut för bestämning av längd och vikt.

Analyser och monitoreringar

Både artärkatetern och den övre tarmsonden är kopplade till varsin tryckgivare, varpå det

arteriella trycket och det intraluminala trycket i den proximala slangen till duodenum

kontinuerligt monitoreras (med hjälp av ett PowerLab-system med Labchart-programvara).

Blodtrycket monitoreras huvudsakligen som en markör för råttans cirkulatoriska tillstånd,

medan tarmmotoriken analyseras som arean under motorikkurvan.

Bikarbonatsekretionen mäts genom baktitrering av effluatet till pH 4,9 (ett pH där

jämvikten förmodas vara fullständigt förskjuten åt bikarbonathållet) med 10 mM HCl .

Titreringen sker under kontinuerlig bubbling med N2 för att åstadkomma en blandning av

perfusatet.51Cr-EDTA är en radioaktiv markör som uteslutande passerar mukosan via den

paracellulära vägen [37]. Således kan intestinal clearance – beräknat genom att mängden

markör i plasma jämförs med mängden i perfusatet – användas som ett mått på duodenums

barriärfunktion. Efter titreringen placeras provrören i en gammaräknare, tillsammans med 50

µl plasma från vart och ett av de två blodprov som tagits före och efter försöket. Clearance

12

beräknas sedan med följande formel [38]:

ggtarmviktmlcpmplasma

mlhastighetperfusionsmlcpmperfusatClearance 100)()/(

min)/()/( ×⋅×⋅

⋅×⋅=

Statistik

Alla värden presenteras som medelvärdet ± standaravvikelsen. Statistisk signifikans testades

genom variansanalys (ANOVA) med kontrast (Tukey's post hoc test). Värdena jämfördes dels

inom samma grupp – med värden innan, under och efter PGE2-behandling (upprepad

mätning) – och dels mellan de olika grupperna (icke upprepad mätning). Alla statistiska

analyser utfördes med hjälp av datorprogrammet GraphPad Prism 5.02, och ett P-värde på

0,05 sattes som den övre gränsen för statistisk signifikans.

13

Resultat

Totalt har 16 st djur inkluderats i studien. 11 st av dessa har behandlats postoperativt med en

intravenös injektion av den selektiva COX-2-hämmaren parecoxib (Dynastat®) i en dos av 10

mg/kg kroppsvikt. Syftet med denna NSAID-behandling har varit att häva det postoperativa

ileustillstånd som oundvikligen uppstår vid abdominell kirurgi av denna typ. Av de 11 st

parecoxib-behandlade djuren var det 7 st som återfick motorik (med detta menas att de

uppvisade motorisk aktivitet under majoriteten av försökets nio tiominutersperioder). Djuren

delades därefter in i tre grupper enligt följande:

− Ej parecoxibbehandlade djur (n = 5)

− Parecoxibbehandlade djur utan intestinal motorik (n = 4)

− Parecoxibbehandlade djur med intestinal motorik (n = 7)

Resultaten för de analyserade parametrarna; duodenalslemhinnans bikarbonatsekretion,

duodenalslemhinnans permeabilitet, duodenums motoriska aktivitet och duodenalslemhinnans

vätskeflux presenteras nedan. De tre grupperna kommer härefter att omnämnas grupp 1 (ej

parecoxibbehandlade djur), grupp 2 (parecoxibbehandlade djur utan tarmmotorik) och grupp 3

(parecoxibbehandlade djur med tarmmotorik).

14

Bikarbonatsekretion

Den basala bikarbonatsekretionen i grupp 1

låg stabilt på en sekretionshastighet på 3,2

± 0,4 µmol ml-1 h-1, figur 6a. Luminal

exponering av det duodenala segmentet

med PGE2 50 µM ökade

sekretionshastigheten till 4,1 ± 0,7 µmol

ml-1 h-1 men detta värde var inte signifikant

skiljt från basalperioden (p>0,05, n=5). I

grupp 2 var den basala sekretions-

hastigheten 2,6 ± 0,3 µmol ml-1 h-1, figur

6b. Luminalt PGE2 ökade sekretions-

hastigheten till ett toppvärde på 4,8 ± 0,5

µmol ml-1 h-1 ett värde som inte heller var

statistisk skiljt från basalperioden (p>0,05,

n=4). I grupp 3 var den basala

sekretionshastigheten statistiskt signifikant

högre än samma basalperiod i grupp 1 och

grupp 2 (p<0.05). Basalsekretionen i grupp

3 var stabil med ett värde på 5,9 ± 1,3

µmol ml-1 h-1, se Figur 6c. Luminalt PGE2

(50 µM) i grupp 3 inducerade en

sekretionsökning med ett toppvärde på

13,1 ± 2,8 µmol ml-1 h-1 (p<0,001, n=7),

figur 6c.

15

A

B

C

Figur 6: Sekretionen i grupperna 1 (6A), 2 (6B) resp. 3 (6C). Stjärnorna anger statistisk signifikans (* = p < 0,05, ** = p <0,01 och *** = p < 0,001)

Permeabilitet

Den basala permeabiliteten i grupp 1 låg

på en hastighet på 0,64 ± 0,16 ml min-1

100 g-1. Luminal exponering av det

duodenala segmentet med PGE2 50 µM

sänkte permeabiliteten till 0,63 ± 0,21 ml

min-1 100 g-1 men detta värde var inte

signifikant skiljt från basalperioden

(p>0,05, n=5). I grupp 2 var den basala

permeabiliteten 0,24 ± 0,08 ml min-1 100

g-1. Luminalt PGE2 minskade

permeabiliteten till 0,19 ± 0,10 ml min-1

100 g-1, ett värde som inte heller var

statistisk skiljt från basalperioden (p>0,05,

n=4). I grupp 3 var den basala

permeabiliteten 0,25 ± 0,06 ml min-1 100

g-1. Luminalt PGE2 minskade

permeabiliteten till 0,18 ± 0,06 ml min-1

100 g-1, ett värde som ej var signifikant

skilt från basalperioden ( p>0,05, n=7)

Basalpermeabiliteten i de olika grupperna

jämfördes också med varandra, och var

signifikant högre i parecoxib-obehandlade

djur jämfört med parecoxib-behandlade

djur (p<0,05).

16

B

A

Figur 7: Permeabiliteten i grupperna 1 (7A), 2 (7B) resp. 3 (7C)

Motorik

Motoriken mäts i detta försök

genom att arean under

motorikregistreringskurvan

beräknas. Den enda grupp där

denna parameter är av intresse är

grupp 3, då de andra grupperna

definierats utifrån en avsaknad av

motorik. Ett av djuren i grupp 2

uppvisade kortvariga

kontraktioner under försökets slut,

dock ej tillräckligt för att möta

inklusionskriterierna för grupp (se

material och metod ovan). I grupp 3 ses dock en tydlig och statistiskt säkerställd

motorikökning under PGE2-behandling, från ett basalvärde på 99,7 ± 53,4 AUC 10 min-1 till

ett toppvärde på 459,9 ± 129,2 AUC 10min-1.

Diskussion

Resultaten i den aktuella studien visar tydligt att luminalt PGE2 stimulerar den duodenala

bikarbonatsekretionen hos sövda råttor som har motorisk aktivitet (grupp 3). Resultaten

stämmer väl överens med tidigare studier [34]. Trots en relativt hög koncentration av PGE2

(50 µM luminalt) stimulerade inte PGE2 bikarbonatsekretionen i kontrolldjur (grupp 1) eller

parecoxib-behandlade djur utan motorik (grupp 2). De senare resultaten skiljer sig från

tidigare studier då det visats att PGE2 framförallt stimulerar bikarbonatsekretionen genom att

direkt verka på epitelcellens PG-receptorer som sedan stimulerar apikal bikarbonattransport.

Förklaringen till denna observerade skillnad går inte att förklara utifrån de erhållna resultaten,

men är intressant att gå vidare med.

Resultaten visar att basalsekretionen är högre hos råttor med motorik jämfört med råttor

utan motorik (både parecoxib-behandlade och obehandlade råttor). En sannolik förklaring till

denna skillnad är att när COX-hämningen häver den postoperativa ileusen aktiveras en

17

Figur 8: Motoriken som uppmätts i de olika grupperna

sekreto-motorisk reflex, vilket ökar nervmedierad stimulering av bikarbopnatsekretionen. Det

är således inte parecoxib-behandlingen i sig som ökar sekretionen, då djur som erhållit

parecoxib-behandling men ej fått någon effekt på den motoriska aktiviteten har samma

sekretionshastighet som obehandlade kontrolldjur (jämför grupp 1 med grupp 2).

Ett intressant fynd i den aktuella studien är att PGE2 inducerar/ökar motoriken i djur

som redan har motorik (grupp 3). Däremot har PGE2 ingen effekt på den motoriska aktiviteten

i paralytiska djur. Effekten av PGE2 på motorik är inte lika väl studerad som dess effekt på

bikarbonatsekretionen och denna observation är således intressant. Att PGE2 skulle diffundera

genom tarmepitelet ner till muskellagret förefaller osannolikt, och ett rimligt antagande är att

effekten medieras av receptorer i det apikala cellmembranet. Värt att påpeka är att substansen

uppenbarligen inte triggar igång motorik hos paralytiska djur, utan enbart förstärker aktivitet

som redan finns.

Permeabiliteten har i dessa försök inte visat sig påverkas av luminalt administrerat

PGE2. Trenden är mot minskning hos de djur som parecoxibbehandlats (med och utan

motorik), men förändringarna är för blygsamma och spridningarna för stora för att man ska

kunna tala om en statistiskt säkerställd minskning (P > 0,05). Resultaten från denna studie

talar således emot att PGE2 spelar en roll i regleringen av duodenums paracellulära

permeabilitet. Man skulle kunna anta att ett större antal försöksdjur kunde resultera i högre

statistisk signifikant och eventuellt säkerställa den observerade trenden till minskning, men

detta är vanskligt att spekulera om.

Mer signifikant är skillnaden i basalpermeabilitet mellan å ena sidan grupp A

(parecoxib-obehandlade djur) och å andra sidan grupp B och C (parecoxib-behandlade djur).

Som synes i figur 7 ovan leder postoperativ NSAID-administrering till en signifikant lägre

basalpermeabilitet jämfört med de djur som inte fått någon sådan behandling, vilket illustrerar

prostaglandinsystemets komplexa effekter in vivo. Oavsett vilken effekt luminalt PGE2 har

eller saknar på permeabiliteten, tyder värdena på att barriärfunktionen minskar väsentligt vid

den kraftfulla systemiska inflammation som oundvikligen induceras vid en laparotomi. COX-

hämningen får i denna situation främst betraktas som en ansats att normalisera fysiologiska

funktioner som försatts ur spel av ett stort kirurgiskt trauma. Påpekas bör också att detta rör

sig om en stor engångsdos parecoxib, 10 mg/kg kroppsvikt (att jämföras med den maximala

dygnsdosen för människa, 80 mg, motsvarande ungefär 1 mg/kg kroppsvikt [39], och således

skiljer sig från den kontinuerliga lågdosadministrering som kännetecknar långtida peroral

NSAID-behandling.

Sammanfattningsvis har denna studie ej kunnat påvisa någon effekt av PGE2 på

18

duodenums paracellulära permeabilitet hos råtta. Dessa resultat skulle dock behöva följas upp

i en större studie med fler försöksdjur. Associationen mellan bristande barriärfunktion och

uppkomsten av Crohn's sjukdom är stark, och förhoppningen är alltjämt att ökade kunskaper

inom detta område på sikt kan bidra till utvecklingen av kausal terapi för en ansenlig

patientgrupp.

19

Referenser

1. Berglund, G., et al., Internmedicin. Fjärde upplagan ed2006: Liber.2. Marin, M.L., et al., A freeze fracture study of Crohn's disease of the terminal ileum:

changes in epithelial tight junction organization. Am J Gastroenterol, 1983. 78(9): p. 537-47.

3. Meddings, J.B., Review article: Intestinal permeability in Crohn's disease. Aliment Pharmacol Ther, 1997. 11 Suppl 3: p. 47-53; discussion 53-6.

4. Xavier, R.J. and D.K. Podolsky, Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature, 2007. 448(7152): p. 427-34.

5. Hollander, D., Crohn's disease--a permeability disorder of the tight junction? Gut, 1988. 29(12): p. 1621-4.

6. Takeuchi, K., S. Kato, and K. Amagase, Prostaglandin EP receptors involved in modulating gastrointestinal mucosal integrity. J Pharmacol Sci, 2010. 114(3): p. 248-61.

7. Rang, H., et al., Rang and Dale's Pharmacology. Sixth Edition ed2007: Churchil Livingstone. 4.

8. LIF, d.f.l. Topplistor. 2011; Available from: http://www.lif.se/cs/default.asp?id=36436&ptid=.

9. Kunikata, T., et al., 16,16-Dimethyl prostaglandin E2 inhibits indomethacin-induced small intestinal lesions through EP3 and EP4 receptors. Dig Dis Sci, 2002. 47(4): p. 894-904.

10. Kefalakes, H., et al., Exacerbation of inflammatory bowel diseases associated with the use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs: myth or reality? Eur J Clin Pharmacol, 2009. 65(10): p. 963-70.

11. Thiéfin, G. and L. Beaugerie, Toxic effects of nonsteroidal antiinflammatory drugs on the small bowel, colon, and rectum. Joint Bone Spine, 2005. 72(4): p. 286-94.

12. Junquiera, L.C. and J. Carneiro, Basic Histology. 11th Edition ed2005: McGraw Hill.13. Flemström, G., Gastroduodenal mucosal secretion of bicarbonate and mucus.

Physiologic control and stimulation by prostaglandins. Am J Med, 1986. 81(2A): p. 18-22.

14. Fasano, A., Zonulin and its regulation of intestinal barrier function: the biological door to inflammation, autoimmunity, and cancer. Physiol Rev, 2011. 91(1): p. 151-75.

15. FARQUHAR, M.G. and G.E. PALADE, Junctional complexes in various epithelia. J Cell Biol, 1963. 17: p. 375-412.

16. Madara, J.L., Increases in guinea pig small intestinal transepithelial resistance induced by osmotic loads are accompanied by rapid alterations in absorptive-cell tight-junction structure. J Cell Biol, 1983. 97(1): p. 125-36.

17. Clayburgh, D.R., L. Shen, and J.R. Turner, A porous defense: the leaky epithelial barrier in intestinal disease. Lab Invest, 2004. 84(3): p. 282-91.

18. Fasano, A., Physiological, pathological, and therapeutic implications of zonulin-mediated intestinal barrier modulation: living life on the edge of the wall. Am J Pathol, 2008. 173(5): p. 1243-52.

19. Ramage, J.K., et al., Effect of immunologic reactions on rat intestinal epithelium. Correlation of increased permeability to chromium 51-labeled ethylenediaminetetraacetic acid and ovalbumin during acute inflammation and anaphylaxis. Gastroenterology, 1988. 94(6): p. 1368-75.

20. Visser, J.T., et al., Restoration of impaired intestinal barrier function by the hydrolysed casein diet contributes to the prevention of type 1 diabetes in the diabetes-prone BioBreeding rat. Diabetologia, 2010. 53(12): p. 2621-8.

20

21. Brun, P., et al., Increased intestinal permeability in obese mice: new evidence in the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2007. 292(2): p. G518-25.

22. Allen, A., et al., Gastroduodenal mucosal protection. Physiol Rev, 1993. 73(4): p. 823-57.

23. Flemström, G. and E. Kivilaakso, Demonstration of a pH gradient at the luminal surface of rat duodenum in vivo and its dependence on mucosal alkaline secretion. Gastroenterology, 1983. 84(4): p. 787-94.

24. Sjöblom, M., Duodenal epithelial sensing of luminal acid: role of carbonic anhydrases. Acta Physiol (Oxf), 2011. 201(1): p. 85-95.

25. Seidler, U., et al., Recent advances in the molecular and functional characterization of acid/base and electrolyte transporters in the basolateral membranes of gastric and duodenal epithelial cells. Acta Physiol (Oxf), 2011. 201(1): p. 3-20.

26. Isenberg, J.I., et al., Impaired proximal duodenal mucosal bicarbonate secretion in patients with duodenal ulcer. N Engl J Med, 1987. 316(7): p. 374-9.

27. Hirata, T., et al., Effects of selective cyclooxygenase-2 inhibitors on alkaline secretory and mucosal ulcerogenic responses in rat duodenum. Life Sci, 1997. 61(16): p. 1603-11.

28. Simson, J.N., A. Merhav, and W. Silen, Alkaline secretion by amphibian duodenum. III. Effect of DBcAMP, theophylline, and prostaglandins. Am J Physiol, 1981. 241(6): p. G528-36.

29. Takeuchi, K., et al., Role of prostaglandin E receptor subtypes in gastroduodenal HCO3- secretion. Med Chem, 2005. 1(4): p. 395-403.

30. Aoi, M., et al., Participation of prostaglandin E receptor EP4 subtype in duodenal bicarbonate secretion in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2004. 287(1): p. G96-103.

31. Flemström, G. and J.I. Isenberg, Gastroduodenal mucosal alkaline secretion and mucosal protection. News Physiol Sci, 2001. 16: p. 23-8.

32. Fleckenstein, P., Migrating electrical spike activity in the fasting human small intestine. Am J Dig Dis, 1978. 23(9): p. 769-75.

33. Szurszewski, J.H., A migrating electric complex of canine small intestine. Am J Physiol, 1969. 217(6): p. 1757-63.

34. Nylander, O., The impact of cyclooxygenase inhibition on duodenal motility and mucosal alkaline secretion in anaesthetized rats. Acta Physiol (Oxf), 2011. 201(1): p. 179-92.

35. Josephs, M.D., et al., Products of cyclooxygenase-2 catalysis regulate postoperative bowel motility. J Surg Res, 1999. 86(1): p. 50-4.

36. O, N., et al., Prostaglandins reduce hydrochloric acid-induced increase in duodenal mucosal permeability by a mechanism not related to stimulation of alkaline secretion. Acta Physiol Scand, 1995(Apr;153(4)): p. 365-74.

37. LIF, d.f.l. Dynastat. 2011; Available from http://www.fass.se/LIF/produktfakta/artikel_produkt.jsp?NplID=20020328000029&DocTypeID=3

38. Nylander, O., A. Hällgren, and L. Holm, Duodenal mucosal alkaline secretion, permeability, and blood flow. Am J Physiol, 1993. 265(6 Pt 1): p. G1029-38.

21