lý thuyết realtime
TRANSCRIPT
TS. BS. Đỗ Thị Thanh Thủy
Realtime PCR
Nguyên tắc và ứng dụng
PCR
PCR VÀ GIỚI HẠN CỦA PCR
PCR và phát hiện sản phẩm bằng
điện di trên gel agarose
1. Phát hiện điểm cuối
(End-Point Detection)
2. Độ đặc hiệu kém
3. Độ nhạy thấp
4. Độ phân giải kém
4. Chỉ phân biệt dựa trên kích thước sản phẩm PCR
5. Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm
6. Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung thư)
REALTIME PCR
→ Real-time PCR là phản ứng PCR mà quá trình
nhân bản DNA được theo dõi trực tiếp trên máy
luân nhiệt theo từng chu kỳ nhiệt.
Kiểm soát tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi
chu kỳ phản ứng (tỉ lệ với lượng sản phẩm PCR
tạo thành trong từng chu kỳ nhiệt - Real time).
Phát hiện và định lượng nồng độ sản phẩm sau
mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên cường độ phát huỳnh
quang.
REALTIME PCR
HOẠT ĐỘNG CỦA MÁY REALTIME PCR
Kính lọc kích thích Kính lọc phát sáng
Nguồn: laser, LED, đèn tungsten-halogen
Detector: CCD (charge coupled device), PMT (photomultiplier tube)
1 10 102 103 104 105 106 1 10 102 103 104 105 106
Cycle 15
Cycle 19
Cycle 23
Cycle 26
Cycle 29
Cycle 31
Cycle 33
Cycle 34
Cycle 36
Cycle 39
Cycle 41
Cycle 13
Cycle 11
1 10 102 103 104 105 106
Cycle 15
Cycle 19
Cycle 23
Cycle 26
Cycle 29
Cycle 31
Cycle 33
Cycle 34
Cycle 36
Cycle 39
Cycle 41
Cycle 13
Cycle 11
1 10 102 103 104 105 106
C.41
C.39
C.36
C.33
C.31
C.29
C.34
Mẫu chưa biết [C]
Standard curve
PHƯƠNG TRÌNH TÍNH SỐ COPY/MẪU
Threshold: điểm bắt đầu quan sát được tín hiệu huỳnh
quang phát ra, tại thời điểm này tín hiệu do sản phẩm
PCR > tín hiệu nền.
- Ct (Threshold cycle):
là số chu kỳ mà tại đó
tín hiệu huỳnh quang
của sản phẩm khuếch
đại vượt qua ngưỡng.
-Động học RealtimePCR
Phân tích tiến trình phản
ứng trong mỗi chu kỳ
nhiệt nhờ computer
THỜI ĐIỂM PHÁT HIỆN TÍN HIỆU
REALTIME PCR
REALTIME PCR
Rael time PCR định
lượng số copies trong
giai đoạn tăng lũy thừa
Log view
Primers
Taq polymerase
dNTP
PCR buffer
MgCl2
Real-time
PCR MIX
Target DNA (Template)
Real-time PCR mix
Chất phát huỳnh quang
1. Chất nhuộm khi chèn vào sợi
đôi DNA sẽ phát huỳnh quang:
♦ Ethidium bromide
♦ SYBR green 1
2. Probe đặc hiệu có gắn chất
phát huỳnh quang
♦ Taqman probe.
♦ Molecular Beacon
♦ Hybridization probe…
TÍN HIỆU HUỲNH QUANG TRONG
REAL TIME PCR
SYBR GREEN I
không
SYBR
GREEN I
Không phát
huỳnh quang
SYBR
GREEN I
Huỳnh quang
SYBR GREEN I
DNA caàn tìm
DNA khoâng
caàn tìm
Khoâng phaân bieät ñöôïc saûn phaåm ñaëc hieäu hay khoâng ñaëc hieäu
Tính đặc hiệu không cao. Tầm soát sản phẩm trước khi sử dụng probe đặc hiệu Thực hiện khi PCR đã được tối ưu hóa, không có primer dimer, không có amplicon không đặc hiệu
SYBR GREEN I
PHÂN BIỆT SẢN PHẨM ĐẶC HIỆU (Melting Curve)
Mục đích: phân tích tính đặc hiệu của sản phẩm sau khuếch đại
Melting temperature (Tm) của dsDNA:
–To tại đó ½ pt DNA ở dạng sợi đôi, ½ sợi đơn
–Phụ thuộc chiều dài và thành phần nucleotide
Thực hiện: tăng To, DNA tách nhau ra,
Đưa To về 55oC. Tăng dần
nhiệt độ, chụp hình tín hiệu
huỳnh quang mỗi 0,5oC.
Melting Curve
PHÂN BIỆT
SẢN PHẨM ĐẶC HIỆU (Melting Curve)
REAL TIME PCR SỬ DỤNG TAQMAN PROBE
1. ƯU ĐIỂM
Probe đặc hiệu
Multiplex PCR
2. NHƯỢC ĐIỂM
Giá thành cao
NGUYÊN TẮC
HOẠT ĐỘNG
Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease
5’
5’
3’
3’
dNTPs
DNA Polymerase
beàn nhieät
Primers
Tube phản ứng
R Q
Probe
1. Biến tính 94oC
2. Bắt cặp và kéo dài 60oC
Taq
l R Q
NGUYÊN TẮC
HOẠT ĐỘNG
5’ 3’
R Q
5’ 3’
Q
Taq
R
5’ 2. Phân cắt
3. Hoàn tất tổng hợp 5’ 3’
Taq
R
5’
4. Phát hiện 5’ 3’
Taq
R
5’
5’ 3’
1. Kéo dài mạch Taq
R
R Q
Primers có nhiệt độ bắt cặp ở 60oC và Taqman probe ở 70oC
F
DNA probe
C G C
A A
A
G
T A
T C A T C
C
C
T
C
C A
G G
G
C
G
G
C
C
A
A T
T
Q
DNA đích
F
G C A A A G T A T C A T C C C T C C A G
Q
C G T T T C A T A G T A G G G A G G T A
Stem
Loop
Reporter Dye
REALTIME PCR SỬ DỤNG BEACON PROBE
Giai đoạn biến tính
NGUYÊN TẮC
HOẠT ĐỘNG
Giai đoạn bắt cặp
NGUYÊN TẮC
HOẠT ĐỘNG
Giai đoạn kéo dài
NGUYÊN TẮC
HOẠT ĐỘNG
1) Reaction efficiency (PCR efficiency): E%,
sử dụng đường cong chuẩn (standard
curve). Tối ưu E 100% thì E=2
2) Reproducibility/linearity (R=Corelation
coefficiency) sử dụng giá trị R hay R2 =1
đánh giá độ chính xác trong thao tác
3) Specificity sử dụng Melting Curve
4) Contamination sử dụng NC
ĐỌC KẾT QUẢ REALTIME PCR
E%=PCR efficiency (90%-105%)
R=Corelation coefficiency (>0.990)
ĐỌC KẾT QUẢ REALTIME PCR
E = 10-1/slope E% = (E-1) x 100%
E=10-1/slope
= 10 -1/-3.425
= 1.959 E% =(1.959 - 1) x 100% = 95,9
E%=PCR efficiency (90%-105%)
R=Corelation coefficiency (>0.990)
ĐỌC KẾT QUẢ REALTIME PCR
Y= ax+b → Y = a.(log10Sq) + b
Y: Ct
X: log10Sq Sq: Starting quantity
Sq= 10 [(Ct-b)/a]
ỨNG DỤNG CỦA REALTIME PCR
TRONG CHẨN ĐOÁN
VÀ NGHIÊN CỨU
Đơn giản, nhanh chóng, dễ phân tích kết quả.
Tránh được ngoại nhiễm vì không cần phân tích sau PCR.
Có thể định lượng trong phạm vi lớn (log 7 đến log 8)
Độ nhạy cao hơn so với PCR.
Độ đặc hiệu cao hơn so với PCR
Realtime PCR là công cụ phát hiện tác nhân
gây bệnh tốt nhất trong mẫu bệnh phẩm
(vi sinh, ký sinh lâm sàng, vi sinh thực phẩm)
Độ nhạy tốt
Không ngoại nhiễm
Thích hợp cho lâm sàng
Độ đặc hiệu tốt
Công cụ tốt nhất
• Xác định số lượng virus
(HIV, HBV, HCV...) Theo dõi điều trị
• Xác định số lượng khởi
đầu của các tác nhân gây
bệnh khẩn cấp trong mẫu
bệnh (Sốt xuất huyết,
H5N1, H1N1..)
Tiên đoán mức độ
nghiêm trọng và tiên
đoán kết quả
Realtime PCR là công cụ định lượng tác nhân
gây bệnh tốt nhất trong mẫu bệnh phẩm
Tình trạng nhiễm khuẩn thực phẩm:
Samonella, Campyllobacter….
Realtime PCR ứng dụng
trong ung thư học lâm sàng
Phát hiện sự tồn lưu ác tính trong bệnh ung thư
-Trong bệnh bạch cầu mạn dòng tủy (CML) và bệnh
bạch cầu cấp dòng Lympho (ALL), dùng realtime
PCR định lượng 2 tổ hợp gen khác nhau gây bệnh là
p190 và p210.
So sánh kết quả định lượng trước và sau điều trị giúp
đánh giá mức độ tồn lưu ác tính của bệnh.
Realtime PCR
trong nghiên cứu biểu hiện gen
Ứng dụng rất rộng rãi trong việc đánh giá mức độ
biểu hiện gen.
VD: Sau khi tế bào được xử lý với kháng nguyên
hay hóa chất, tìm hiểu sự đáp ứng của TB trong
mức độ biểu hiện của gen đích.
Các ứng dụng khác của Real-Time PCR
Phát hiện GMO (genetically modified
organism) hay GEO (genetically engineered
organism): sinh vật biến đổi gene.
Phát hiện SNP (single nucleotide
polymorphism) (genotypic/allelic
discrimination)