mỞ ĐẦu thao... · 2016-11-29 · - phương pháp thiết kế mồi sử dụng các phần...

1

MỞ ĐẦU

Công nghệ phân tích ADN trong sử dụng các locus STR hiện

nay đã trở thành công cụ đắc lực trong phân tích nhận dạng cá thể

người và giám định huyết thống ở rất nhiều quốc gia khác nhau trên

thế giới. Tại Việt Nam từ năm 1998 trở lại đây đã có sự phát triển

mạnh mẽ và nhanh chóng về trình độ cũng như khả năng ứng dụng

kỹ thuật phân tích ADN sử dụng hệ các locus STR. Đã có nhiều

nghiên cứu về hệ các locus STR trên nhiễm sắc thể thường cũng như

NST giới tính. Nhiều bộ KIT chuẩn sử dụng các locus STR được ứng

dụng, các bộ KIT có thể sử dụng phù hợp với từng công nghệ khác

nhau tuỳ thuộc vào điều kiện cụ thể của từng PTN.

Để chủ động trong công nghệ phân tích và phù hợp với điều kiện

PTN tại Việt Nam, từ năm 2001 đến nay, Viện Kỹ thuật Hoá-Sinh và

Tài liệu nghiệp vụ, Tổng cục Hậu cần - Kỹ thuật - Bộ Công an đã

nghiên cứu chế tạo thành công KIT phân tích đa gen sử dụng 9 locus

đa hình STR. Các kết quả nghiên cứu hiện nay đã và đang được ứng

dụng tốt trong trong phân tích gen hình sự tại một số cơ sở giám định

công an các địa phương như: Hà Nội, Hải Phòng, Thanh Hóa, Cần

Thơ, Khánh Hòa...

Tuy nhiên, nếu chỉ dừng lại ở phân tích 9 gen thì thực tế cho thấy

trong nhiều trường hợp giám định cụ thể, đặc biệt là đối với những

ca giám định phức tạp (trường hợp giám định huyết thống xác định

tội phạm tình dục có nghi can nhiều người mà những người này lại

có quan hệ huyết thống, họ hàng...) vẫn chưa cho kết quả đáng tin

cậy.

Do vậy, chúng tôi xác định việc mở rộng nghiên cứu để tăng số

lượng locus là yêu cầu cần thiết, đồng thời cần có sự đánh giá tổng

2

thể về tần suất phân bố của các locus STR ở quần thể người Việt để

đưa ra được hướng ứng dụng phù hợp. Đề tài luận án “Nghiên cứu

một số locus đa hình STR ở người Việt Nam nhằm sử dụng trong

khoa học hình sự, nhận dạng cá thể và xác định huyết thống” được

tiến hành với các mục tiêu sau:

1. Thiết kế được các cặp mồi đặc hiệu để có thể nhân bản và

phân tích được tính đa hình một số locus STR chọn lọc bổ

sung (F13A01; D8S1179 và HPRTB).

2. Xây dựng thang alen chuẩn cho các locus F13A01; D8S1179

và HPRTB.

3. Điều tra, khảo sát tính đa hình và xác định được tần số phân

bố các alen thuộc 15 locus STR của người Việt (D5S1358,

D7S820, D13S317, CSF1PO, TH01, TPOX, D16S539,

D3S1358, vWA, F13B, FES/FPS, LPL, F13A01; D8S1179

và HPRTB)

4. Đánh giá và đề xuất được các locus STR định hướng ứng

dụng trong nhận dạng cá thể và xác định huyết thống phù

hợp với người Việt Nam.

Ý NGHĨA THỰC TIỄN VÀ

ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Nghiên cứu xây dựng được điều kiện tối ưu để phân tích tổ

hợp 4 locus đa hình mới F13A01, D8S1179, HPRTB và

Amelogenin có thể nhân bội đồng thời trong cùng một phản

ứng. Bổ sung cho các tổ hợp locus đã nghiên cứu, góp phần

3

làm tăng độ chính xác trong phân tích nhận dạng cá thể

người và giám định huyết thống phù hợp với điều kiện PTN

tại Việt Nam.

- Bổ sung số liệu khảo sát tần suất alen 15 locus đa hình người

Việt, trong đó đã khảo sát mới 07 alen của locus F13A01 và

07 alen của locus HPRTB, phát hiện thêm được các alen mới

ở quần thể người Việt là alen số 8 của locus CSF1PO; alen

số 13 của locus vWA và alen số 15 của locus FES/FPS.

- Đánh giá được khả năng ứng dụng của 15 locus STR đối với

quần thể người Việt qua tính toán các chỉ số thống kê.

BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN

Luận án gồm 121 trang và 6 trang phụ lục, được bố cục như sau:

mở đầu 4 trang; tồng quan 27 trang; vật liệu và phương pháp nghiên

cứu 13 trang; kết quả và thảo luận 69 trang; kết luận, kiến nghị 2

trang; danh mục các công trình khoa học đã công bố 1 trang.

4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. CÁC PHƢƠNG PHÁP NHẬN DẠNG CÁ THỂ NGƢỜI

Các phương pháp giám định nhận dạng cá thể người được nghiên

cứu từ trước tới nay bao gồm:

- Phương pháp hình thái học

- Nhận dạng cá thể bằng các yếu tố có bản chất protein (Xác

định nhóm máu, xác định một số nhóm protein và nhóm

enzym)

- Nhận dạng cá thể người qua phân tích ADN nhân và ADN

ty thể.

Việc sử dụng các phương pháp trong nhận dạng cá thể tuỳ thuộc

vào loại mẫu, số lượng và chất lượng mẫu (bao gồm cả mẫu giám

định nhận dạng và mẫu so sánh), số lượng cá thể cần nhận dạng,

trang thiết bị của cơ sở giám định và trình độ chuyên môn của giám

định viên.

Hiện nay, với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật

và công nghệ, đặc biệt sau khi phát minh về phản ứng PCR ra đời,

việc nhận dạng cá thể người bằng phương pháp phân tích ADN nhân

trở thành công cụ đắc lực trong giám định bởi những ưu việt nổi bật

của nó, đặc biệt phương pháp trở nên hữu dụng trong hình sự, khi mà

các dấu vết thu được ở hiện trường còn lại rất ít hoặc đã bị biến tính,

không thể tiến hành bằng các phương pháp nhận dạng truyền thống.

1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH ADN

ỨNG DỤNG TRONG NHẬN DẠNG CÁ THỂ NGƢỜI

Việc phân tích ADN trong nhận dạng hiện nay được tiến hành

dựa trên một nguyên lý chung: ADN được tách ra khỏi tế bào (có

trong mẫu sinh học thu được), sau đó các đoạn ADN được nhân lên

5

bởi các cặp mồi đặc hiệu và sản phẩm nhân bội được phân tích bằng

kỹ thuật điện di hay giải trình tự. Kết quả điện di sẽ được hiển thị

nhờ hệ thống thiết bị phù hợp, cho biết kiểu gen cá thể cần phân tích.

Các kỹ thuật được ứng dụng hiện nay bao gồm:

- Kỹ thuật PCR

- Kỹ thuật điện di

- Kỹ thuật giải trình tự

1.3. CÁC LOCUS STR TRONG HỆ GEN NGƢỜI VÀ ỨNG

DỤNG CỦA CHÚNG TRONG NHẬN DẠNG CÁ THỂ

Các đoạn ADN có cấu trúc lặp lại từ 2 – 6 bp được gọi là các

đoạn lặp lại ngắn (STR). Các cấu trúc STR mang tính bảo thủ cao,

được di truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cá thể . Các

STR có thể được khuếch đại bằng phản ứng PCR.

Trong số các dạng lặp khác nhau của hệ STR, các đoạn lặp 4

nucleotit được sử dụng phổ biến hơn các đoạn lặp 2 hoặc 3 nucleotit

vì:

- Khoảng kích thước giữa các alen nhỏ vừa phải phù hợp cho phản

ứng PCR phức.

- Khoảng kích thước giữa các alen nhỏ vừa phải làm giảm khả

năng mất alen đối với các alen có kích thước nhỏ hơn.

- Khả năng tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước nhỏ thuận lợi

cho việc phân tích các mẫu ADN đã biến tính.

- Việc giảm các sản phẩm “stutter” (băng giả) so với các

dinucleotit thuận lợi cho việc đọc kiểu gen đối với các mẫu lẫn.

6

CHƢƠNG 2.

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1. Mẫu sinh phẩm

250 mẫu máu của các cá thể người Việt khỏe mạnh, không có

cùng quan hệ họ hàng (bao gồm 48 nữ và 202 nam) được thu tại

Hải Phòng và bảo quản trên thẻ bảo quản mẫu có tẩm hóa chất và

lưu giữ tại -20oC.

2.1.2. Các locus gen đa hình STR

Đề tài lựa chọn 15 locus gen đa hình STR bao gồm: locus

D5S818, D7S820, D13S317; CSF1PO, TPOX, TH01; D3S1358,

D16S539, vWA; F13A01, D8S1179; HPRTB; F13B; FES/FPS;

LPL và 01 locus xác định giới tính Amelogenin .

2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phương pháp thiết kế mồi sử dụng các phần mềm thiết kế mồi

Primer Premier để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho các locus

STR F13A01, D8S1179 và HPRTB.

- Phương pháp tách chiết ADN sử dụng Chelex.

- Phương pháp PCR .

- Phương pháp điện di và phân tích sản phẩm PCR trên gel

agarose và trên gel PA biến tính có ure.

- Phương pháp chế tạo thang alen gồm các bước sau:

+ Khảo sát, tìm kiếm các alen của locus nghiên cứu.

+ Lựa chọn và tiến hành phản ứng PCR các kiểu gen có chứa các

alen cần thiết cho việc tạo thang alen của locus cần nghiên cứu.

+ Tinh sạch alen.

+ Xác định (định danh) alen theo quy ước quốc tế.

7

+ Tạo thang alen bằng phương pháp PCR.

- Phương pháp PCR nhiều cấp (multi-generation amplification) để

tạo thang alen:

+ Đối với mỗi locus, sau khi tinh sạch các alen, chúng tôi tiến

hành phối trộn các alen theo tỷ lệ thể tích như nhau và thực

hiện PCR sử dụng mồi đặc hiệu của locus đó theo chu trình

nhiệt đã tối ưu. Đây là thang alen thế hệ I.

+ Sử dụng thang alen thế hệ I pha loãng thành các nồng độ

1/1.000; 1/5.000 và 1/10.000. Tiếp tục PCR sử dụng 1 l sản

phẩm pha loãng làm khuôn, thu được thang alen thế hệ II.

+ Sử dụng thang alen thế hệ II tương ứng với khuôn pha loãng

1/10.000 để pha loãng thành các nồng độ tương tự trên và

thực hiện PCR, thu được thang alen thế hệ III.

- Phương pháp xác định trình tự các nucletotide

- Phương pháp khảo sát tần suất alen và xử lý số liệu bằng các chỉ

số thống kê

8

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1.THIÕT KÕ MåI Vµ Tèi u PCR phøc 4 locus

F13A01, D8S1179, Amelogenin, HPRTB (FDAH)

3.1.1. Kết quả thiết kế mồi :

Sử dụng phần mềm Primer Premier chúng tôi đã thiết kế được

các cặp mồi đặc hiệu để sử dụng nhân bội đồng thời 4 locus :

F13A01, D8S1179, Amelogenin và HPRTB (bảng 3.1)

B¶ng 3.1. Tr×nh tù vµ th«ng sè c¸c cÆp måi

cña 4 locus F13A01, D8S1179, HPRTB vµ Amelogenin

Locus Loại

mồi Trình tự mồi

Tm

(0C)

Kích thước sản

phẩm

PCR (bp)

F13A01

F 5’ - AGC CCC AAG GAA GAT GAG T- 3’ 55.8 279 - 335

(alen 3 -

17) R 5’ - GGC ATG CAC CTG TAG TTC CA- 3’ 59.0

D8S1179

F 5’ - GCC AGA AAC CTC TGT AGC CA- 3’ 57.7 227 - 271

(alen 9 -

20) R 5’ - ATC GTA TCC CAT TGC GTG AA- 3’ 58.7

Amelogenin F 5'- ACC TCA TCC TGG GCA CCC TGG-3'

212- 218 R 5'- AGG CTT GAG GCC AAC CAT CAG -3'

HPRTB

F 5’ - TTC CAT CTC TGT CTC CAT CTT TG - 3’ 58.6 159 - 203

(alen 7 -

18) R 5’ - ACA CAT CCC CAT TCC TGC C - 3’ 59.9

Sản phẩm PCR nhân bội của mỗi cặp mồi đã được kiểm tra kích

thước phù hợp và tính đặc hiệu qua kết quả điện di trên gel agarose

(hình 3.1)

9

(M50: marker 50bp; Giếng 1, 2: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi locus F13A01;

Giếng 3, 4: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi locus D8S1179; Giếng 5, 6: Sản phẩm

PCR sử dụng cặp mồi locus Amelogenin; Giếng 7, 8: Sản phẩm PCR sử dụng cặp

mồi locus HPRTB; ĐC(-):mẫu đối chứng âm)

Hình 3.1. Kết quả PCR kiểm tra cặp mồi 4 locus F13A01, D8S1179,

Amelogenin và HPRTB

3.1.2. Kết quả tối ƣu phản ứng PCR phức 4 locus:

Các cặp mồi đã được sử dụng để tối ưu phản ứng PCR phức

(multiplex PCR) và sản phẩm PCR được điện di trên gel

polyacrylamide biến tính. Kết quả thu được như sau:

* KÕt qu¶ tèi u thµnh phÇn PCR cho phøc 4 locus FDAH

dNTP: 400 M; MgCl2 : 2 mM; §Öm ph¶n øng: 2X; ADN khu«n:

2 ng; Taq ADN-polymerase : 2 U; Nång ®é måi F13A01 : D8S1179 :

AME : HPRTB là 0,8M : 0,8M : 0,4M : 0,8M

* KÕt qu¶ tèi u chu tr×nh nhiÖt cho ph¶n øng PCR phøc 4

locus FDAH: 95oC - 5 phót (1 chu kú); 94oC- 1 phót; 60oC - 1 phót;

72oC - 1 phót (35 chu kú); 72oC - 10 phót (1 chu kú).

3.2. ChÕ t¹o thang alen 4 locus F13A01, D8S1179,

Amelogenin, HPRTB (FDAH)

3.2.1. KÕt qu¶ chÕ t¹o thang alen locus F13A01

1 2 M50 3 4 M50 ĐC

(-)

5 6 M50 7 8 M50 ĐC

(-)

250bp 200bp

10

Chóng t«i ®· lùa chän ®îc 6 alen : ®ã lµ alen sè 3.2; 4; 5; 6; 7

vµ 8. Kích thước và số đoạn lặp của các alen được xác định căn cứ

vào mẫu K562 có kiểu gen dị hợp tử 4-5 và kết quả giải trình tự của

03 alen 3.2; 4 và 8. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tr×nh tù cña chóng t«i phï hîp

víi çc tµi liÖu ®· c«ng bè.

6 alen ®· lùa chän tõ locus F13A01 ®îc tinh s¹ch vµ kÕt hîp

nh©n béi trong cïngph¶n øng PCR.

KÕt qu¶ nh©n béi (h×nh 3.2) cho thÊy: Thang alen çc thÕ hÖ

(nh©n béi ë çc nång ®é pha lo·ng kh¸c nhau) ®Òu cã chÊt lîng nh

nhau, thÓ hiÖn ë çc b¨ng ph©n t¸ch râ trªn b¶n gel ®iÖn di.

H×nh 3.2. KÕt qu¶ chÕ t¹o thang alen cho locus F13A01

(Giếng 1: Thang alen thế hệ I; Giếng 2, 3, 4: Thang alen thế hệ II;

Giếng 5 6, 7: Thang alen thế hệ III . ĐC (-): mẫu đối chứng âm PCR.

M20: marker 20bp)

3.2.2. KÕt qu¶ chÕ t¹o thang alen locus D8S1179

Chóng t«i ®· lùa chän ®îc 10 alen : ®ã lµ alen sè 9; 10; 11; 12;

13; 14; 15; 16; 17; 18. Kích thước và số đoạn lặp của các alen được

xác định căn cứ vào mẫu K562 có kiểu gen đồng hợp tử 12-12 và kết

quả giải trình tự của 02 alen : alen số 9 và alen số 13. KÕt qu¶ x¸c

®Þnh tr×nh tù cña chóng t«i phï hîp víi çc tµi liÖu ®· c«ng bè.

Alen 5

Alen 4

300bp

280bp

M20 1 ĐC 2 3 4 ĐC 5 6 7 ĐC K562

(-) (-) (-)

11

10 alen ®· lùa chän cña locus D8S1179 ®îc tinh s¹ch vµ kÕt hîp

nh©n béi trong cïngph¶n øng PCR.






M20: marker 20bp)

H×nh 3.3. KÕt qu¶ chÕ t¹o thang alen cho locus D8S1179

3.2.3. KÕt qu¶ chÕ t¹o thang alen locus Amelogenin

Amelogenin lµ locus gen n»m trªn nhiÔm s¾c thÓ giíi tÝnh. ë

nam giíi locus nµy cã 02 alen kh¸c nhau víi kÝch thíc lµ 212bp

(trªn X) vµ 218bp (trªn Y) vµ n÷ giíi chØ cã 01 alen kÝch thíc 212bp

(trªn X). Chóng t«i ®· lùa chän ®îc 2 alen nµy ®Ó chÕ t¹o thang alen

cho locus Amelogein.

2 alen ®· lùa chän cña locus Amelogenin ®îc tinh s¹ch vµ kÕt

hîp nh©n béi ®ång thêi trong cïng ph¶n øng PCR.




260bp

240bp

M20 1 ĐC 2 3 4 ĐC 5 6 7 ĐC K562

(-) (-) (-)

Alen12

12



M20: marker 20bp)

H×nh 3.4. KÕt qu¶ chÕ t¹o thang alen cho locus Amelogenin

3.2.4. KÕt qu¶ chÕ t¹o thang alen locus HPRTB

3.2.4.1. KÕt qu¶ lùa chän alencho locus HPRTB

Chúng tôi đã chọn được 6 alen, đó là các alen số 11, 12, 13,14,

15 và 16.

Kích thước và số đoạn lặp của các alen được xác định căn cứ vào

mẫu K562 có kiểu gen đồng hợp tử 13-13 và kết quả giải trình tự của

02 alen : alen số 11 và alen số 12. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tr×nh tù cña

chóng t«i phï hîp víi çc tµi liÖu ®· c«ng bè.

06 alen ®· lùa chän cña locus HPRTB ®îc tinh s¹ch vµ kÕt hîp

nh©n béi trong cïng ph¶n øng PCR ®Ó t¹o thang alen ®a thÕ hÖ. KÕt

qu¶ nh©n béi (h×nh 3.5) cho thÊy: Thang alen çc thÕ hÖ (nh©n béi ë

çc nång ®é pha lo·ng kh¸c nhau) ®Òu cã chÊt lîng nh nhau, thÓ

hiÖn ë çc b¨ng ph©n t¸ch râ trªn b¶n gel ®iÖn di.

M20 1 ĐC 2 3 4 ĐC 5 6 7 ĐC K562

(-) (-) (-)

220bp

Alen XX

13



M20: marker 20bp)

H×nh 3.5. KÕt qu¶ chÕ t¹o thang alen cho locus HPRTB

3.3.1. KÕt qu¶ kh¶o s¸t tÇn suÊt alen 15 locus STR

Sử dụng thang alen chế tạo được ở nghiên cứu này và các

nghiên cứu trước, chúng tôi đã tiến hành khảo sát tần suất alen cho

15 locus đa hình: D5S1358, D7S820, D13S317, CSF1PO, TH01,

TPOX, D16S539, D3S1358, vWA, F13B, FES/FPS, LPL, F13A01;

D8S1179 và HPRTB trên 250 cá thể người Việt.

Chúng tôi đã sử dụng tiêu chuẩn để kiểm tra sự phù hợp giữa

tần suất phân bố thực tế với tần suất phân bố trên lý thuyết theo tiêu

chuẩn phù hợp 2.

Kết quả khảo sát được so sánh với kết quả khảo sát của đại diện

một số quần thể : Châu Á (Trung Quốc), châu Âu (Ba Lan) và châu

Mỹ (Mỹ) để đánh giá tính đặc trưng quần thể.

Kết quả khảo sát ở quần thể người Việt thu được như sau:

M20 1 ĐC 2 3 4 ĐC 5 6 7 ĐC K562

(-) (-) (-)

200bp

180bp

Alen 13

14

3.3.1.2. KÕt qu¶ kh¶o s¸t tÇn suÊt alen locus D5S818

Sè alen kh¶o s¸t ®îc: 7 alen (7; 9; 10; 11; 12; 13; 14), trong ®ã

alen cã tÇn suÊt cao nhÊt lµ alen sè 11 (chiÕm 27,4%); alen cã tÇn

suÊt thÊp nhÊt lµ alen sè 7 (chiÕm 5,6%).

3.3.1.2. Kết quả khảo sát tần suất alen locus D7S820

Sè alen kh¶o s¸t ®îc: 8 alen (alen sè 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14).

Alen cã tÇn suÊt cao nhÊt lµ alen sè 11 (chiÕm 40%); alen cã tÇn suÊt

thÊp nhÊt lµ alen sè 14 (chiÕm 0,2%).


Sè alen kh¶o s¸t ®îc: 7 alen (alen sè 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14).

Alen cã tÇn suÊt cao nhÊt lµ alen sè 8 (chiÕm 29,8%); alen cã tÇn suÊt

thÊp nhÊt lµ alen sè 14 (chiÕm 0,8%).

3.3.1.4. KÕt qu¶ kh¶o s¸t tÇn suÊt alen locus CSF1PO

Sè alen kh¶o s¸t ®îc: 8 alen (alen sè 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14).

Alen cã tÇn suÊt cao nhÊt lµ alen sè 12 (chiÕm 39,6%); alen cã tÇn

suÊt thÊp nhÊt lµ alen sè 8 (chiÕm 0,2%).

3.3.1.5. KÕt qu¶ kh¶o s¸t tÇn suÊt alen locus TPOX

Sè alen kh¶o s¸t ®îc: 6 alen (alen sè 7; 8; 9; 10; 11; 12). §iÒu

kh¸c biÖt cña locus TPOX so víi çc locus STR kh¸c lµ cã sù xuÊt

hiÖn víi tÇn suÊt cao çc ç thÓ mang alen sè 8 (chiÕm 57,8%).

3.3.1.6. KÕt qu¶ kh¶o s¸t tÇn suÊt alen locus TH01

Sè alen kh¶o s¸t ®îc: 5 alen (alen sè 6; 7; 8; 9; 10). Alen cã tÇn

suÊt cao nhÊt lµ alen sè 7 vµ alen sè 9 (chiÕm 34,2% vµ 33,8%); alen

cã tÇn suÊt thÊp nhÊt lµ alen sè 8 (chiÕm 6,8%).


Sè alen kh¶o s¸t ®îc: 8 alen (alen sè 8; 9; 10; 11; 12; 13;14;

15). Alen cã tÇn suÊt cao nhÊt lµ alen sè 11 (chiÕm 30,8%). Alen cã

15

tÇn suÊt thÊp nhÊt lµ alen sè 8 vµ alen sè 15 (chiÕm 0,2% mçi alen).


Sè alen kh¶o s¸t ®îc: 7 alen (alen sè 13; 14;15; 16; 17; 18;19).

Alen cã tÇn suÊt cao nhÊt lµ alen sè 15 vµ alen sè 16 (chiÕm 35,6% vµ

33,2%). C¸c alen hiÕm cã tÇn suÊt thÊp nhÊt lµ alen sè 13 (chiÕm tû

lÖ 0,4%) vµ alen sè 19 (chiÕm tû lÖ 0,4%).

3.3.1.9. KÕt qu¶ kh¶o s¸t tÇn suÊt alen locus vWA

Sè alen kh¶o s¸t ®îc: 8 alen (alen sè 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19;

20). Alen cã tÇn suÊt cao nhÊt lµ alen sè 14 (chiÕm 29,6%). Trong

quÇn thÓ kh¶o s¸t cña chóng t«i, ®· cã sù xuÊt hiÖn cña alen sè 13

víi tÇn suÊt 0,4%.

3.3.1.10. KÕt qu¶ kh¶o s¸t tÇn suÊt alen cho locus F13B

So víi c¸c locus ®· kh¶o s¸t ë trªn, locus F13B cã tÝnh ®a h×nh

thÊp h¬n do sè lîng alen xuÊt hiÖn Ýt (4 alen: 7; 8; 9;10). H¬n n÷a,

tû lÖ ph©n bè tËp trung qu¸ nhiÒu ë alen sè 10 (chiÕm 69,6%). Alen

cã tÇn suÊt thÊp nhÊt lµ alen sè 7 (0,2%).

3.3.1.11. KÕt qu¶ kh¶o s¸t tÇn suÊt alen locus FES/FPS

Locus FES/FPS cã sè lîng alen nhiÒu (8 alen). Tuy nhiªn, tû lÖ

ph©n bè cao l¹i tËp trung nhiÒu ë alen sè 11 (chiÕm 45,8%) do ®ã

¶nh hëng tíi møc ®é ®a h×nh cña locus. Alen cã tÇn suÊt thÊp nhÊt

lµ alen sè 15 (chiÕm 0,2%).

3.3.1.12. KÕt qu¶ kh¶o s¸t tÇn suÊt alen locus LPL

Locus LPL cã møc ®é ®a h×nh kh«ng cao (PD = 0,71) do sè

lîng alen Ýt. H¬n n÷a, tÇn suÊt ph©n bè l¹i tËp trung rÊt cao ë alen

sè 10 (64,8%). Alen cã tÇn suÊt thÊp nhÊt lµ alen sè 9 (chiÕm 0,2%).

3.3.1.13. KÕt qu¶ kh¶o s¸t tÇn suÊt alen locus F13A01

Sè alen kh¶o s¸t ®îc: 7 alen (alen sè 3.2, 4, 5, 6,7, 8 vµ 13). Tû

16

lÖ ph©n bè cao tËp trung nhiÒu ë alen sè 3,2 (chiÕm 40,2%) vµ alen

sè 6 (chiÕm 34,2%) do ®ã ¶nh hëng tíi møc ®é ®a h×nh cña locus.

Alen cã tÇn suÊt thÊp nhÊt lµ alen sè 8 (chiÕm 0,2%) vµ alen sè 13

(chiÕm 0,2%).


Sè alen kh¶o s¸t ®îc: 10 alen lµ alen sè 8; 10; 11; 12; 13;

14;15; 16;17 vµ18. Alen cã tÇn suÊt cao nhÊt lµ alen sè 13 (chiÕm

18,2%). Alen cã tÇn suÊt thÊp nhÊt lµ alen sè 8 (chiÕm tû lÖ 0,2%).

3.3.1.15. KÕt qu¶ kh¶o s¸t tÇn suÊt alen locus HPRTB

Sè alen kh¶o s¸t ®îc: 07 alen (alen sè 10; 11; 12; 13; 14;15 vµ

16. Alen cã tÇn suÊt cao nhÊt lµ alen sè 13 (chiÕm 40,1%). Çc alen

hiÕm cã tÇn suÊt thÊp ë locus nµy lµ alen sè 11 (0,5%) vµ alen sè 15

(0,5%).

3.3.1.16. TÝnh ®Æc trng quÇn thÓ thÓ hiÖn ë 15 locus STR

KÕt qu¶ kh¶o s¸t tÇn suÊt alen cña 15 locus ®a h×nh ë ngêi ViÖt

(khu vùc H¶i Phßng) ®îc chóng t«i tiÕn hµnh so s¸nh víi kÕt qu¶

kh¶o s¸t cña çc t¸c gi¶ kh¸c ë 4 quÇn thÓ kh¸c nhau bao gåm :

- KÕt qu¶ kh¶o s¸t quÇn thÓ ngêi ViÖt (khu vùc Hµ Néi).

- KÕt qu¶ kh¶o s¸t ë çc nhãm quÇn thÓ ®¹i diÖn thuéc ch©u ¸

(Trung Quèc); ch©u ¢u (Ba Lan) vµ ch©u Mü (Mü).

Nh×n mét çch tæng qu¸t kÕt qu¶ so s¸nh, chóng t«i rót ra mét sè

nhËn xÐt sau:

- ViÖc kh¶o s¸t sè lîng cµng nhiÒu ç thÓ cµng gióp cho chóng ta

ph¸t hiÖn thªm çc alen míi ®Æc biÖt lµ nh÷ng alen hiÕm, ®ang lµ

nh÷ng alen cã ý nghÜa quan träng trong nhËn d¹ng ç thÓ. VÝ dô :

Alen sè 8 cña locus D5S818 ®îc ph¸t hiÖn ë quÇn thÓ cña ngêi

Mü (gèc Capca) vµ ngêi Trung Quèc (B¾c Kinh) nhng cha

17

thÊy cã ë quÇn thÓ ngêi ViÖt theo kh¶o s¸t cña chóng t«i vµ cña

Shimada.

- Mçi quÇn thÓ ë çc ch©u lôc kh¸c nhau cã tÝnh chÊt ®Æc trng

riªng vÒ ph©n bè alen, vÝ dô alen sè 11 cña locus D7S820 cã tÇn

suÊt cao nhÊt ë quÇn thÓ ngêi ViÖt (theo nghiªn cøu cña chóng

t«i vµ cña Shimada) vµ ngêi Trung Quèc (B¾c Kinh) nhng ë

quÇn thÓ ngêi Ba Lan vµ ngêi Mü (Çpca) th× l¹i cã sù kh¸c

biÖt, thÓ hiÖn tÇn suÊt cao nhÊt l¹i lµ alen sè 10.

Nh vËy viÖc kh¶o s¸t tÇn suÊt alen ®Æc trng cho tõng quÇn thÓ

lµ rÊt cÇn thiÕt.

3.3.2. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ®é tin cËy (kh¶ n¨ng ph©n biÖt) ç thÓ

cña 15 locus STR ë quÇn thÓ ngêi ViÖt

Tõ kÕt qu¶ thu ®îc vÒ kh¶ n¨ng ph©n biÖt cña tõng locus, cã thÓ

tÝnh ®îc ®é tin cËy ®èi víi mçi tæ hîp locus nh sau:

B¶ng 3.2. Kh¶ n¨ng ph©n biÖt

cña çc tæ hîp locus STR quÇn thÓ ngêi ViÖt Tæ hîp Locus Kh¶ n¨ng

ph©n biÖt

3 locus D5S818 - D7S820 - D13S317 1/1764

CSF1PO - TPOX - TH01 1/320

D3S1358 - D16S539 - vWA 1/924

6 locus D5S818 - D7S820 - D13S317 CSF1PO - TPOX - TH01 1/564.480

9 locus D5S818 - D7S820 - D13S317 CSF1PO - TPOX - TH01

D3S1358 - D16S539 - vWA

1/521.579.520

15 locus D5S818 - D7S820 - D13S317 CSF1PO - TPOX - TH01

D3S1358 - D16S539 - vWA F13B - FES/FPS - LPL

F13A01- D8S1179 - Amel. - HPRTB

1/1,9 x 1013

Tõ kÕt qu¶ trªn, chóng ta thÊy khi sö dông phèi hîp cµng nhiÒu

locus kh¸c nhau kh¶ n¨ng ph©n biÖt ç thÓ cµng cao. KÕt qu¶ thu

18

®îc ë b¶ng 3.2 cho thÊy hoµn toµn cã thÓ øng dông kÕt qu¶ trªn

trong viÖc tÝnh to¸n tÇn suÊt cho nhËn d¹ng ç thÓ ngêi (®èi víi

quÇn thÓ ngêi ViÖt) bao gåm truy nguyªn ç thÓ vµ x¸c ®Þnh quan

hÖ huyÕt thèng.

3.3.3. §Ò xuÊt híng øng dông çc locus STR trong nhËn

d¹ng ç thÓ vµ x©y dùng tµng th an ninh ë ViÖt Nam

HiÖn nay t¹i ViÖt Nam, viÖc øng dông çc locus STR trong nhËn

d¹ng ç thÓ ®îc thùc hiÖn dùa trªn 2 c«ng nghÖ: c«ng nghÖ ®iÖn di

nhuém b¹c vµ c«ng nghÖ ®iÖn di mao qu¶n tïy thuéc vµo ®iÒu kiÖn

cô thÓ cña tõng phßng thÝ nghiÖm.

C«ng nghÖ ®iÖn di nhuém b¹c ®· ®îc ph¸t triÓn øng dông t¹i

ViÖt Nam tõ n¨m 2001. Cho ®Õn nay, tÊt c¶ çc phßng thÝ nghiÖm

ph©n tÝch ADN ®Òu cã kh¶ n¨ng trang bÞ çc thiÕt bÞ ®Ó thùc hiÖn

c«ng nghÖ nµy bëi viÖc trang bÞ kh«ng tèn kÐm nhiÒu vµ cã thÓ chñ

®éng vÒ c«ng nghÖ. HiÖn t¹i ë ViÖt Nam, ®· cã 07 c¬ së c«ng an çc

®Þa ph¬ng bao gåm Hµ Néi, H¶i Phßng, Thanh Hãa, NghÖ An, CÇn

Th¬, Kh¸nh Hßa, thµnh phè Hå ChÝ Minh ®îc trang bÞ vµ chuyÓn

giao c«ng nghÖ nµy. Riªng H¶i Phßng hiÖn ®ang tiÕn hµnh x©y dùng

tµng th ADN nhËn d¹ng ç thÓ ngêi sö dông c«ng nghÖ ®iÖn di

nhuém b¹c víi sè lîng mÉu khëi ®Çu lµ 1000 mÉu cho 9 locus. §Æc

trng cña c«ng nghÖ ®iÖn di nhuém b¹c lµ cÇn lùa chän nh÷ng locus

cã sè lîng alen phï hîp (8- 10 alen) vµ kh«ng cã hoÆc mang Ýt alen

lÎ ®Ó cã thÓ ph©n t¸ch tèt trªn b¶n gel ®iÖn di. Çc locus mµ chóng t«i

lùa chän ®Òu ®¸p øng ®îc yªu cÇu nµy.

Nh ®· ph©n tÝch ë trªn, viÖc x©y dùng tµng th ®Ó phôc vô truy

nguyªn ç thÓ ®èi víi quÇn thÓ ngêi ViÖt Nam chØ cÇn thùc hiÖn víi

9 locus lµ cã thÓ cho phÐp truy nguyªn ç thÓ víi ®é chÝnh x¸c cao

19

(1/5,6.108). Tµng th ë hÇu hÕt çc níc còng ®Òu sö dông tõ 6 -13

locus. ë Anh, tµng th khëi ®Çu sö dông 6 locus STR vµ 1 locus giíi

tÝnh, cho kh¶ n¨ng ph©n biÖt 1/50.106, sau ®ã ph¸t triÓn lªn 10 locus

STR vµ 1 locus giíi tÝnh, cho kh¶ n¨ng ph©n biÖt 1/3.1012. T¹i Mü,

tµng th ®îc x©y dùng víi 13 locus STR vµ 1 locus giíi tÝnh cho

kh¶ n¨ng ph©n biÖt lµ 1/109.

ViÖc lùa chän locus nµo lµ tïy thuéc vµo nhiÒu yÕu tè : c«ng

nghÖ sö dông, kh¶ n¨ng ph©n biÖt cña locus, hÖ locus ®ã trong quÇn

thÓ. Do vËy, sù lùa chän locus cho viÖc x©y dùng tµng th ADN kh¸c

nhau ë mçi quèc gia. Tuy nhiªn, cã thÓ nhËn thÊy rÊt nhiÒu locus

cïng ®îc lùa chän. VÝ dô cã tÊt c¶ 8 locus ®îc lùa chän gièng nhau

gi÷a ch©u ¢u vµ Mü ®Ó sö dông cho viÖc x©y dùng tµng th, ®ã lµ çc

locus FGA, TH01, vWA, D3S1358, D8S1179, D16S1359, D8S51 vµ

D21S11. §©y cã thÓ lµ nh÷ng locus cã tÝnh ®a h×nh cao vµ tû lÖ ®ét

biÕn thÊp trong quÇn thÓ.

Khi so s¸nh 16 locus STR chóng t«i kh¶o s¸t víi çc locus ®îc

lùa chän cña FBI (Mỹ) hệ CODIS th× sè locus ®îc lùa chän gièng

nhau lµ 10 locus bao gåm çc locus CSF1PO, TH01, TPOX, vWA,

D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317 vµ D16S539. §©y lµ

nh÷ng locus ®îc nhiÒu quèc gia lùa chän sö dông cho viÖc x©y dùng

tµng th vµ ph©n tÝch x¸c ®Þnh ç thÓ, x¸c ®Þnh huyÕt thèng. MÆc dï

trong sè nh÷ng locus nµy, ®a sè cã tÝnh ®a h×nh cao, tuy nhiªn cã

locus tÝnh ®a h×nh kh«ng cao nh TPOX (alen sè 8 lu«n chiÕm tû lÖ >

50% trong nhiÒu quÇn thÓ kh¶o s¸t) nhng vÉn ®îc nhiÒu níc lùa

chän. ViÖc lùa chän cã thÓ do chóng cã tÝnh æn ®Þnh cao trong quÇn

thÓ (Ýt ®ét biÕn), ®ång thêi dÔ phèi hîp víi nhau trong cïng ph¶n øng

PCR phøc vµ phï hîp víi c«ng nghÖ sö dông.

20

Tuy nhiªn, bªn c¹nh viÖc x©y dùng tµng th, ph©n tÝch gi¸m ®Þnh

huyÕt thèng còng lµ mét trong nh÷ng yªu cÇu thêng xuyªn trong

d©n sù vµ h×nh sù. Trong ph©n tÝch x¸c ®Þnh huyÕt thèng viÖc t¨ng sè

lîng locus lµ cÇn thiÕt. Sè locus cÇn thiÕt sö dông Ýt nhÊt lµ 16 locus

(bao gåm c¶ locus x¸c ®Þnh giíi tÝnh). Do vËy çc locus F13A01,

D8S1179, HPRTB vµ Amelogenin mµ chóng t«i lùa chän bæ sung

trong nghiªn cøu nµy nh»m phèi hîp víi çc bé locus kh¸c ®· nghiªn

cøu ®Ó gióp t¨ng ®é chÝnh x¸c trong gi¸m ®Þnh, ®Æc biÖt lµ gi¸m ®Þnh

huyÕt thèng.

TÇn suÊt alen 16 locus mµ chóng t«i ®· kh¶o s¸t hoµn toµn cã thÓ

sö dông cho viÖc tÝnh to¸n ®é tin cËy trong truy nguyªn ç thÓ vµ

gi¸m ®Þnh huyÕt thèng ®èi víi quÇn thÓ ngêi ViÖt (Kinh). TÇn suÊt

®¶m b¶o ®é tin cËy ®· kiÓm tra b»ng tiªu chuÈn 2 vµ ®¶m b¶o phï

hîp víi ph©n bè lý thuyÕt theo ®Þnh luËt Hardy Weinberg.

21

KÕt luËn

1. §· nghiªn cøu x©y dùng ®îc tæ hîp 4 locus ®a h×nh STR míi

bao gåm F13A01, D8S1179, HPRTB và Amelogenin, cô thÓ :

- §· thiÕt kÕ ®îc çc cÆp måi cho phÐp nh©n b¶n ®Æc hiÖu çc

locus ®a h×nh F13A01, D8S1179 vµ HPRTB vµ Amelogenin

trong cïng mét ph¶n øng PCR.

- §· tèi u hãa thµnh phÇn vµ ®iÒu kiÖn PCR phøc hîp 4 locus

F13A01, D8S1179, HPRTB vµ Amelogenin : Nång ®é dNTP

400 M; nång ®é MgCl2 2mM ; ®Öm ph¶n øng 2X ; ADN

khu«n 2ng trong tæng thÓ tÝch 25l ; Taq ADN-polymerase

2U ; tû lÖ måi 4 locus F13A01 : D8S1179 : AME : HPRTB lµ

0,8M : 0,8M : 0,4M : 0,8M ; nhiÖt ®é g¾n måi lµ 60oC.

2. §· x©y dùng thang alen chØ thÞ chuÈn cho 4 locus. Thang alen chØ

thÞ cña locus F13A01 bao gåm 7 alen, ®îc ký hiÖu tõ alen sè

3,2; 4 ®Õn 8 vµ alen sè 13. Thang alen chØ thÞ cña locus D8S1179

bao gåm 10 alen, ®îc ký hiÖu tõ 8; 10 ®Õn 18. Thang alen chØ

thÞ cña locus Amelogenin bao gåm 02 alen kÝch thíc t¬ng øng

212bp vµ 218bp. Thang alen chØ thÞ cña locus HPRTB bao gåm 7

alen, ®îc ký hiÖu tõ alen sè 10 ®Õn alen sè 16.

3. Đã điều tra, khảo sát để bổ sung số liệu về TSAL 15 locus đa

hình người Việt, trong đó đó khảo sát mới 07 alen của locus

F13A01, 10 alen của locus D8S1179 và 07 alen của locus

HPRTB, phát hiện thêm được các alen mới ở quần thể người

Việt là alen số 8 ở locus CSF1PO; alen số 13 ở locus vWA và

alen số 15 ở locus FES/FPS.

4. §· ®¸nh gi¸ vµ ®Ò xuÊt ®îc çc locus STR sö dông trong nhËn

d¹ng ç thÓ vµ x¸c ®Þnh huyÕt thèng phï hîp víi ngêi ViÖt

Nam.

22

- Trong nhËn d¹ng c¸ thÓ hoÆc x©y dùng tµng th ADN: sö

dông 9 locus D5S818, D7S820, D13S317 - CSF1PO, TPOX,

TH01 - D16S539, D3S1358, vWA.

- Trong ph©n tÝch gi¸m ®Þnh huyÕt thèng: Sö dông 16 locus

D5S818, D7S820, D13S317 - CSF1PO, TPOX, TH01 -

D16S539, D3S1358, vWA - F13B, FES/FPS, LPL - F13A01,

D8S1179, Amel. vµ HPRTB.

KIẾN NGHỊ

1. Nghiên cứu và khảo sát bổ sung các locus ADN đa hình ở

các nhóm người thuộc các dân tộc khác nhau trên lãnh thổ

Việt Nam để xây dựng được bảng phân bố tần suất các alen

phục vụ giám định, nhận dạng cá thể.

2. Xây dựng cơ sở dữ liệu nhận dạng ADN (tàng thư) cho các

đối tượng khác nhau như: tội phạm, các đối tượng làm trong

các ngành nghề đặc thù có nguy cơ cao (phi công, tiếp viên

hàng không, ngư dân, thợ mỏ…), người mất tích, chết vô

tung tích… để phục vụ công tác quản lý và công tác giám

định.

23

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Lê Thị Bích Trâm, Lƣơng Thị Yến, Trần Minh Đôn, Nguyễn

Thanh Hà, Đinh Đoàn Long, Trịnh Đình Đạt (2011), “Nghiên

cứu thiết kế mồi, tối ưu điều kiện phản ứng PCR phức ba locus :

F13A01 - D8S1179 - HPRTB và locus giới tính Amelogenin”.

Tạp chí phân tích Hóa-Lý và Sinh học. T-16 - Số 2/2011, trang

39-43.

2. Lê Thị Bích Trâm, Trần Tr ng H i, B i Nguyên Hải,

Nguyễn V n Hà, Đinh Đoàn Long, Trịnh Đình Đạt 2 11 ,

“Kết quả nghiên cứu chế tạo thang alen chỉ thị các locus đa hình

F13A01, D8S1179 và HPRTB ở người Việt”. Tạp chí phân tích

Hóa-Lý và Sinh học. T-16 - Số 1/2011, trang 10-14.

3. Lê Thị Bích Trâm, Lƣơng Thị Yến, Trần Minh Đôn, Nguyễn

Thị Thu Hoài, Đinh Đoàn Long, Trịnh Đình Đạt 2 11 ,

“Nghiên cứu khảo sát tần suất phân bố alen các locus đa hình

F13A01, D8S1179 và HPRTB ở quần thể người Việt”. Tạp chí

phân tích Hóa-Lý và Sinh học. T-16 - Số 3/2011. Trang 71-74.

mỞ ĐẦu thao... · 2016-11-29 · - phương pháp thiết kế mồi sử dụng các phần...

Documents