ว.วทย. มข. 44(2) 331-344 (2559) KKU Sci. J. 44(2) 331-344 (2016)

ความหลากหลายทางพนธกรรมของกงกามกรามในบอเลยงของเกษตรกรจงหวดกาฬสนธ โดยใชเทคนคอารเอพด-พซอาร

Genetic Diversity of Giant Freshwater Prawn (Macrobrachium rosenbergiide Man) on Farm in Kalasin

Province Using RAPD-PCR Technique

กรวชญ เพชรจล1* และ มณรตน ศรสวสด1 1สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ คณะเทคโนโลยอตสาหกรรมเกษตร มหาวทยาลยกาฬสนธ ตาบลกาฬสนธ

อาเภอเมอง จงหวดกาฬสนธ 46000 *Corresponding author, E-mail: pkeravit@yahoo.com

บทคดยอ การศกษาครงนมวตถประสงคเพอศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของกงกามกรามในบอเลยงของ

เกษตรกร จงหวดกาฬสนธ ดวยลายพมพดเอนเอโดยใชเทคนคอารเอพด-พซอาร (RAPD-PCR) พบกงกามกราม (Macrobrachium rosenbergii de Man) มทงหมด 3 ลกษณะ ไดแก กงกามกรามกามฟา (MrB) กงกามกรามกามทอง (MrG) และกงกามกรามจกโก (MrJ) สกดดเอนเอจากกลามเนอกงแตละตวดวยวธ phenol: chloroform proteinase K และคดเลอกไพรเมอรทเหมาะสมในการเพมปรมาณดเอนเอ โดยใชไพรเมอรทมขนาด 10-12 นวคลโอไทดจานวน 8 ชนด พบไพรเมอร 2 ชนด คอ OPA03 และ OPA07A สามารถเพมปรมาณดเอนเอได และผลการทา RAPD-PCR ดวยไพรเมอรทงสองชนดของกงกามกรามทง 3 ลกษณะพบแถบดเอนเอมจานวน 41 แถบ ทมขนาดอยในชวง 250-2000 คเบส โดยเปนแถบดเอนเอทแสดงความหลากหลาย (polymorphic band) จานวน 29 แถบ คดเปน 70.73 เปอรเซนต และพบแถบดเอนเอทไมแสดงความหลากหลาย (monomorphic band) จานวน 12 แถบ คดเปน 29.27 เปอรเซนต เมอนารปแบบ RAPD-PCR มาสราง UPGMA dendrogram โดยใชโปรแกรมสาเรจรป NTSYSpc version 2.11x พบวาสามารถแบงความสมพนธทางพนธกรรมไดเปน 2 กลมใหญ โดยกลมท 1 เปนกงฝอย (M. lanchesteri de Man) ซงเปนตวเปรยบเทยบทสามารถแยกออกจาก M. rosenbergii อยางชดเจน กลมท 2 เปนกงกามกรามทงหมด (M. rosenbergii; MrB, MrG และ MrJ) สามารถแยกไดสองกลมยอย กลมยอยท 1 ประกอบดวย MrJ เพยงลกษณะเดยวเทานนกลมยอยท 2 ประกอบดวย MrB และ MrG ซงทงสองกลมใหญและสองกลมยอยของกลมท 2 มคาสมประสทธความเหมอนเทากบ 52.00 และ 67.50 เปอรเซนต ตามลาดบ แสดง

332 KKU Science Journal Volume 44 Number 2 Research ใหเหนวากงกามกรามในบอเลยงของเกษตรกรจงหวดกาฬสนธทนามาศกษาในครงนมความแตกตางทางพนธกรรม ซงจากขอมลนจะเปนแนวทางนาไปสการคดเลอก การปรบปรงสายพนธ การอนรกษและการจดการพอแมพนธของกงกามกรามทจะใชในการเพาะเลยงเพอการคาตอไป

ABSTRACT The objective of this research was to investigate genetic diversity of giant freshwater

prawn (Macrobrachium rosenbergii de Man) on farm in Kalasin province using RAPD-PCR technique. M. rosenbergii was found 3 characteristics such as: giant freshwater prawn blue claws (MrB), giant freshwater prawn gold claws (MrG) and giant freshwater prawn dwarfism (MrJ). Genomic DNA was extracted from the muscle of each individual of specimens with phenol: chloroform proteinase K method and screened appropriate oligonucleotide primers for amplification using 8 oligonucleotide primers, 10-12 base nucleotide length. The results showed that primer OPA03 and OPA07A were able to amplify the DNA in RAPD-PCR reaction. For RAPD-PCR of these 2 primers of all M. rosenbergii showed 41 bands within sizes of 250-2000 bp. DNA fingerprints showed 29 polymorphic bands (70.73%) and 12 monomorphic bands (29.27%). The UPGMA dendrogram of RAPD-PCR pattern, constructed using NTSYSpc version 2.11x gave 2 groups of genetic relationships. Group 1 composed of (M. lanchesteri de Man) which separated clearly from group 2. Group 2 consisted of all M. rosenbergii (MrB, MrG and MrJ) which can be divided into 2 subgroups: subgroup 1 was only giant freshwater prawn dwarfism (MrJ) and subgroup 2 consisted of giant freshwater prawn blue claws (MrB) and giant freshwater prawn gold claws (MrG). The similarity coefficient between 2 groups and subgroups of group 2 exhibited approximately 52.00 and 67.50 percentages, respectively. This study showed different genetic diversity of M. rosenbergii farmed in Kalasin province. This information will benefit screening, breeding, conservation and broodstock management for desirable trait of commercial giant freshwater prawn in near future.

คาสาคญ: กงกามกราม ความหลากหลายทางพนธกรรม ดเอนเอ อารเอพด-พซอาร Keywords: Macrobrachium rosenbergii de Man, Giant freshwater prawn, Genetic diversity, DNA, Random Amplified Polymorphic DNA-Polymerase Chain Reaction (RAPD-PCR)

บทนา กงกามกรามจดเปนกงนาจดชนดหนงทมขนาด

ใหญทสด มชอสามญวา Giant freshwater prawn และมชอวทยาศาสตรวา Macrobrachium rosenbergii de

Man) จดอยชน (class) Malacostraca อนดบ (order) Decapada วงศ (family) Palaemonidae (Nandlal and Pickering, 2005) ลกษณะทวไปสวนหวและอกจะปกคลมดวยเปลอกชนเดยวกน ลาตวมลกษณะเปนปลอง

งานวจย วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 44 เลมท 2 333 จานวน 6 ปลอง กรมรปโคงขนมลกษณะหยกเปนฟนเลอย ดานบนมจานวน 13-16 ซ ดานลางมจานวน 10-14 ซ โคนกรกวางและหนา สวนบรเวณปรายกรยาวแหลมแผนฐานหนวดคท 2 เปลอกคลมหวมหนามเลกๆ ทวไป ใตตามหนามเลกๆ 2 อน มหนวดสองค หนวดคท 1 สวนของโคนหนวดหนา แบงออกเปน 3 ขอปลอง โดยปลองท 3 แยกออกเปนสองเสน หนวดค ท 2 ซงยาวกวาหนวดคท 1 สวนโคนหนวดแบงออกเปน 5 ขอปลอง แขนงอนนอกมลกษณะเปนแผนบางคลายรปสเหลยมผนผา เรยกวาแผนฐานหนวด (ประจวบ, 2525) ขาเดนม 5 ค ขาวายนา ม 5 ค สวนแพนหางมลกษณะแหลมตรงปลายดานขางแยกเปนแพนสองแพน ชวยในการวายนาควบคมทศทางในการเคลอนไหว กงกามกรามมลกษณะพเศษตามชอ คอ เพศผจะมขาเดนคท 2 ขนาดใหญและยาวกวาคอนๆ มาก ซงเรยกวา “กาม”กามยาวมสฟาหรอนาเงน ตลอดทงกามมปมตะปมตะปา มเปลอกสเขยวอมฟาหรอนาเงน กงกามกรามเปนกงนาจดแตวางไขในนาเคมหรอนากรอย เมอฟกเปนตวออนหรอลกกง จะตองอาศยอยในนากรอยระยะหนงตามธรรมชาต มชอเรยกทตางออกไปมากมาย เชน กงแห กงใหญ กงแมนา กงหลวง และกงกามเกลยง ขณะทกงตวเมยทมขนาดลาตวเลกกวา เรยกกงนาง กงชนดนมถนกาเนดอยในเอเชยใต ไดแก อนเดย บงคลาเทศ ไปจนถงเอเชยตะวนออกเฉยงใต ไดแก ไทย พมา เวยดนาม เขมร มาเลเซย อนโดนเซย ฟลปปนส ตลอดจนทางเหนอของหมเกาะโอเชยเนย และทางตะวนตกของหมเกาะแปซฟก แตในปจจบนได ถกนาไปเล ยงอยางแพรหลายในภมภาคอนทมภมอากาศแบบเขตรอน เชน ทศเหนอและใตของอเมรกา อเมรกนซามว ฮาวายหมเกาะตาฮต นวแคลโดเนย และแมกระทงนวซแลนด (Nandlal and Pickering, 2005) กงกามกรามเปนกงทนยมใชปรงเปนอาหารหลายอยางเชน ตมยา เผา หรอทอด มรสชาตดและเปนทนยมบรโภคของบคคลทวไปทงในและ

ตางประเทศ เนองจากเนอแนนและมปรมาณมาก ซงในปจจบนยงนยมเลยงเปนสตวนาสวยงามอกดวย และความตองการบรโภคกงกามกรามมแนวโนมเพมสงขนตามจานวนของประชากรทเพม จากปรมาณการสงออกกงของประเทศไทยในเดอนพฤษภาคม 2558 มากถง 11,585 ตน มลคา 3,877 ลานบาท (กลมวเคราะหการคาสนคาประมงระหวางประเทศ, 2558) และจากขอมลทางสถตป 2551-2555 ของกรมประมงพบวาปรมาณกงกรามกามทจบในแหลงนาธรรมชาตมแนวโนมลดลงอยางมาก (กลมงานวจยและวเคราะหสถตประมง, 2557) เนองจากหลายสาเหต เชน การสรางเขอนกนนาทาใหกงไมสามารถอพยพไปวางไขในบรเวณปากแมนาได การทาการประมงมากเกนกาลงผลตตามธรรมชาต ปญหามลภาวะเปนพษของสงแวดลอม เชน การเนาเสยของแมนาลาคลอง และการทาการประมงอยางไมถกวธ ปจจบนหนวยงานของกรมประมงและฟารมเอกชนสามารถเพาะพนธกงชนดนไดจงทาใหมผเลยงกงชนดนกนอยางแพรหลาย และยงสามารถเพาะพนธไดตลอดทงป จงเปนอาชพททารายไดดใหแกเกษตรกร แตการเพาะพนธกงกามกรามใหประสบผลสาเรจนนตองอาศยทกษะ ความร ความเขาใจและประสบการณ พรอมทงการดแลเอาใจใสใหผลผลตทไดมคณภาพด เทคนคการเพาะพนธของฟารมแตละแหงอาจแตกตางกน ทาใหเกษตรกรผ เลยงกงกามกรามจาเปนตองทราบลกษณะของพนธกงทมคณภาพดจากฟารมเพาะลกพนธเพอใหไดลกกงทมคณภาพดและเลยงใหผลผลตสงไดผลตอบแทนคมคา จงหวดกาฬสนธเปนอกจงหวดหนงในภาคอสานทเกษตรกรมการเลยงกงกามกรามเพอการคาจานวนมาก โดยสวนมากจะนยมเลยงกนในแถวอาเภอยางตลาดและอาเภอใกลเคยง มจานวนฟารมเลยงกงกามกรามประมาณ 1,295 ราย แบงเปนพนทการเลยง 6,220 ไร (สานกงานประมงจงหวดกาฬสนธ, 2556) เนองจากมแหลงนาทอดมสมบรณไดรบนาจาก

334 KKU Science Journal Volume 44 Number 2 Research เขอนลาปาว สภาพแวดลอมเหมาะสมตอการเลยงกงกามกราม อกทงแรงงานในจงหวดมจานวนมากสามารถหาไดงายและราคาคาจางแรงงานคอนขางถก สามารถผลตกงกามกรามปอนใหกบผบรโภคไดมากกวา 10,000 ตน/ป (สานกงานประมงจงหวดกาฬสนธ, 2556)

ปจจบนการเพาะเลยงกงกามกรามประสบปญหาผลผลตตา แม วาจะมการขยายตวของการเพาะเลยงอยางตอเนอง โดยคาดวานาจะเกดจากความเสอมโทรมของพนธกรรม และการผสมเลอดชดทาใหกงมอตราการเจรญเตบโตลดลง ขอมลดานพนธกรรมของกงกามกรามเปนดชนบงช ความหลากหลายของลกษณะทเกยวของกบการเจรญพนธ และการรอดตาย จงมความจาเปนในการคดเลอกพนธ ลกษณะทสาคญทางเศรษฐกจ เชนการเจรญเตบโต และความตานทานโรค (กณฑรยเจรญทว, 2550) เพอ นามาใชในการอนรกษปรบปรงพนธและการจดการพอแมพนธเพอใหไดลกกงทมคณภาพและปองกนการผสมเลอดชด (อทยรตน, 2543) ลายพมพดเอนเอเปนเครองหมายในการบงบอกความแตกตางของสงมชวต โดยสงมชวตแตละชนดแตละสายพนธมการจดเรยงตวของนวคลโอไทดในโมเลกลของดเอนเอทเปนเอกลกษณ จ งทาใหส ง มช วตมความแตกต างกน การศกษาทางดานดเอนเอของกงกามกรามนบวามความสาคญมาก โดยเฉพาะกงกามกรามทมลกษณะภายนอกคลายคลงกน อตราการเจรญเตบโตแตกตางกนซงยากตอการจดจาแนกดวยลกษณะภายนอก เทคนค RAPD-PCR เปนเทคนคทใชไพรเมอรทเปนโอลโกนวคลโอไทดทมลาดบเบสสายสนๆ เพยง 8-10 คเบสโดยใหจบกบสายดเอนเอแบบสม เปนเทคนคทสะดวกขนตอนในการทาการทดลองรวดเรวและงาย เสยคาใชจายนอย ไมจาเปนตองทราบลาดบเบสมากอน สามารถจาแนกความแตกตางของสงมชวตทมลกษณะคลายคลงกนได รวมทงใชในการตรวจสอบความหลากหลายทางพนธกรรมใน

ระดบสงของสงมชวต (อทยรตน, 2543) และใหผลดในการตรวจสอบความใกลชดของสายพนธกงกามกราม และเทคนคดงกลาวยงมการนามาศกษาความแตกตางของ ก ง ส ก ล Macrobrachium ห ล า ย ช น ด เ ช น M. amazonicum, M. jelskii และ M. brasiliense (Guerra et al., 2010) และศกษาในสกล Penaeus อาทเชน P. monodon, P. vannamei, P. stylirostris และ P. semisulcatus (Chatterjee et al., 2013; Sakaew et al., 2013; Aubert and Lightner, 2000; Niamaimadi et al., 2010) ดงนนเทคนค RAPD-PCR จงเหมาะสมทจะนามาศกษาความแตกตางทางพนธกรรมของกงกามกรามในบอเลยงของเกษตรกรในเขตพนทจงหวดกาฬสนธ เพอเปนประโยชนตอการคดเลอก การปรบปรงสายพนธการอนรกษ และการจดการพอแมพนธของกงกามกรามทจะใชในการเพาะเลยงใหไดสายพนธทเหมาะสมเพอการคาตอไป

วธการดาเนนการวจย 1. การเกบตวอยางและศกษาลกษณะสณฐานวทยาภายนอกของกงกามกราม

การเกบตวอยางกงกามกรามจากฟารมแบบสมในเขตพนท อาเภอยางตลาด จงหวดกาฬสนธ เกบตวอยางใสภาชนะหรอกลองโฟม แลวนาตวอยางทไดมาทาความสะอาด เพอศกษาลกษณะทางสณฐานวทยาภายนอกของกงกามกรามดดแปลงตามวธของประจวบ (ประจวบ, 2525) โดยทาการแยกเพศและศกษาจากลกษณะเดนทางสณฐานวทยาของกงกามกราม ไดแก ลกษณะของกร เปลอกหมตว หนวดคท 2 ขาเดน ลาตว หาง และแพนหาง (uropod) เกบเนอเยอกงใสหลอดไมโครเซนตฟวจและเกบทอณหภม -20 องศาเซลเซยสเพอนาไปสกดดเอนเอตอไป

งานวจย วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 44 เลมท 2 335 2. การสกดดเอนเอ (DNA extraction)

นาเนอเยอกงกามกรามมาสกดดเอนเอโดยทาการตดเนอเยอจากหลอดทเกบเนอเยอตวอยางไวแลว ประมาณ 1 cm3 เตม lysis buffer 500 μl แลวเตม proteinase K (10 mg/ml) 10 μl นาไป incubated ท 55 องศาเซลเซยส เปนเวลา 4 ชวโมง เตม RNase A (100 μg/μl) 5 μl incubated ท 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง จากนนนามาตกตะกอนโปรตนโดยเตม phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25 : 24 : 1) ปรมาตร 500 μl พลกหลอดกลบไปมาเปนเวลา 5-10 นาท นาไปปนเหวยงทอณหภม 4 องศาเซลเซยสความเรว 12,000 rpm เปนเวลา 10 นาท ดดของเหลวใสทอ ยชนบนใสหลอดใหม จากนนเตม chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1) ปรมาตร 500 μl กลบหลอดไปมาเปนเวลา 10 นาท นาไปปนเหวยงทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ความเรว 12,000 rpm เปนเวลา 10 นาท ดดเอาของเหลวใสทอยชนบนไปใสหลอดใหม จากนนนามาตกตะกอนดเอนเอโดยเตม 3M sodium acetate ปรมาตร 1 ใน 10 เทา และเตม absolute ethanol (ทเยน) ปรมาตร 2 เทาของปรมาตรรวม กลบหลอดไปมาใหผสมกนด นาตงทงไวในทเยนจดประมาณ 45-60 นาท แลวนาไปปนเหวยงทอณหภม 4 องศาเซลเซยสความเรว 12,000 rpm เปนเวลา 10 นาท จากนนลางตะกอนดเอนเอดวยเอทานอลความเขมขน 70 เปอรเซนต ปรมาตร 500 μl นาไปปนเหวยงทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ความเรว 12,000 rpm เปนเวลา 10 นาท จากนนดดของเหลวสวนบนทงหมดแลวลางซาดวยเอทานอลความเขมขน 70 เปอรเซนต ปรมาตร 500 μl อกครง นาไปปนเหวยงทอณหภม 4 องศาเซลเซยสความเรว 12,000 rpm เปนเวลา 10 นาท ดดของเหลวทงแลว

ปลอยใหตะกอนดเอนเอแหงโดยตงหลอดทงไว ทอณหภมหอง ทาการละลายตะกอนดเอนเอโดยเตม TE buffer ปรมาตร 50-100 μl หากตะกอนดเอนเอไมละลายใหนา DNA solution ไป incubated ท 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1-2 ชวโมง เพอใหตะกอนดเอนเอละลายไดดยงขน แลวทาการตรวจสอบคณภาพดเอนเอทสกดไดโดยวธ agarose gel electrophoresis แ ล ะ ว ด ค ว า ม เ ข ม ข น ข อ ง ด เ อ น เ อ ด ว ย UV spectrophotometry ทความยาวคลน 260 และ 280 นาโนเมตร 3. การตรวจสอบดเอนเอโดยเทคนค RAPD-PCR

นา genomic DNA ของกงกามกรามทไดมาคดเลอกไพรเมอรโดยใชไพรเมอรแบบสม 8 ชนด ไดแก UBC122, OPA01, OPA03, OPA04, OPA05, OPA07, OPA07A และ OPA10 (ตารางท 1) ปฏกรยาในปรมาตร 25 ไมโครลตร ทประกอบดวย distilled water, 1X buffer, 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.8 μM primer, 0.05 unit Taq DNA polymerase และ 50 ng/μl ของ genomic DNA โดยเครอง PCR (polymerase chain reaction, Biometra® รน TGRADIENT) โดยทาการเพมปรมาณดเอนเอโดยใชอณหภม initial denaturation ท 94 องศาเซลเซยส นาน 3 นาท ตามดวย 40 รอบของ denaturation ท 94 องศาเซลเซยส นาน 10 วนาท annealing ท 36 องศาเซลเซยส นาน 45 วนาท และ extension ท 72 องศาเซลเซยส นาน 90 วนาท และ final extension ท 72 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท นาผลผลตของปฏกรยา PCR มาทาการตรวจสอบขนาดดเอนเอโดยเทคนค agarose gel electrophoresis โดยใช agarose gel ทมความเขมขน 1.5 เปอรเซนต จากนนนาไพรเมอรทสามารถเพมปรมาณดเอนเอแบบสมไดไปทาการทดลองตอไป

33 ตาร

4. กNT

อานเลขเทาเดยเกดโดย2.1ana

ผล1. วท

ขอ(ปรควากงกกวากาม

ยาว

6

รางท 1 ชนดแล

การวเคราะหรปแTSYSpc version

เปรยบเทยนแถบดเอนเอทปขสญลกษณ 1 ากบการไมเกดแถยวกนนน วเคราะดแถบดเอนเอ เพอยวธ UPGMA ด1x เพอสรางเปนalysis

ลการวจยและอผลการเกบตว

ยาภายนอกของกจากการศก

ง กง กามกรามระจวบ, 2525) ามแตกตางดานขกามกรามมขอแตาเพศเมยมาก สมกรามไดทงหมด

1. กงกามกวสวนของหวและ

KKU Sc

ะลาดบเบสของไพPri

แบบโมเลกลดเอn 2.11x ยบความแตกตางทปรากฏแลวบนทกเทากบการเกดแบดเอนเอ หรอไมะหขอมลทเกยวกอหาความสมพนธดวยโปรแกรม NTน dendrogram ด

อภปรายผล วอยางและศกษกงกามกราม กษาลกษณะสณฐ ดดแปลงตามสามารถจาแน

ขนาดและสณฐานตกตางตรงท กงสามารถจดจาแน

3 ลกษณะ ดงน กรามกามฟา (Mrอกอยรวมกนมขน

cience Journ

พรเมอรทใชในการimers name UBC122 OPA01 OPA03 OPA04 OPA05 OPA07 OPA07A OPA10

นเอดวยโปรแกร

ทางพนธกรรม โดกขอมล โดยกาหนแถบดเอนเอ และ มมตาแหนงดเอนเกบการเกด หรอไธทางพนธกรรมโดTSYS-pc versioดวยการทา cluste

ษาลกษณะสณฐา

ฐานวทยาภายนอว ธของประจวกลกษณะเดนตานวทยา ขนาดขอเพศผมขนาดใหนกลกษณะของก

rB) ลกษณะเดน กนาดใหญมเปลอก

al Volume 4

รเพมปรมาณดเอนSequence

GTAGACCAGGCAGTCAAATCGAGGGGGAAACGGTGAGTGAT

รม

ดยนด

0 เอไมดยon er

าน

อกบ

ามองญกง

กรกส

เขยวอมฟากามมหนเจรญเตบโอาหารเกง

ร

2สวนของหวเงนอมเหลทงกามมหนงาย เจรญตลอดทงบอ

4 Number 2

นเอของกงกามกรe (5'→3') GAGAGC

CCCTTC AGCCAC GGCTG

GTCTTG GGGTG

ACGCAG TCGCAG

าหรอมวง กามยามแหลมเ รยงโตชา อตราการเจ(รปท 1)

ปท 1 กงกามก

2. กงกามกรามกวและอกอยรวมกลอง กามเลกปลานามแหลมเรยงกเตบโตเรว มอตรอ (รปท 2)

R

ราม

าวใหญมมวงเขมกระจดกระจาจรญเตบโตไมสม

กรามกามฟา (MrB

ามทอง (MrG) ลกนมขนาดเลกมเยกามมสเหลองท

กระจดกระจายลกราการเจรญเตบโต

Research

ม ตลอดทงยลกษณะาเสมอ กน

B)

ลกษณะเดน เปลอกสนาทอง ตลอดกษณะเลยงตสมาเสมอ

งานวจย

รปท 2

3. กงกแกรน ลกษณะเฟาหรอมวงกามแหลม เ รย งกรเจรญเตบโตชา สมาเสมอ (รปท

รปท

2. ผลการสกดด ดเอนเมอนามาตรวจelectrophoresiดเอนเอทไดมคและการแตกหกทนามาสกดมควมาก และ เ มอspectrophoto

กงกามกรามก

กามกรามจกโก เดน ลาตวขนาดเมเลกมสมวงเขม ระจ ดกระจายขนาดตวเลก อต3)

3 กงกามกราม

ดเอนเอ เอทสกดไดจากจคณภาพดวยวธis ความเขมขน 0ณภาพดมการปนกนอย เนองจากใชวามสดทาใหไดปอ ทา วดค า ดดกmeter อตราส

วารสารวทยาศ

ามทอง (MrG)

(MrJ) มลกษณะเลก มเปลอกสเขตลอดทงกามมห ล กษณะ เล ย ง

ตราการเจรญเตบ

มจกโก (MrJ)

เนอเยอกงกามธ agarose 0.8 เปอรเซนนเปอนของอารเชตวอยางกงกามปรมาณดเอนเอจล นแสง ดวย ว ธ

สวนระหวางคาดด

ศาสตร มข. ปท

แคระยวอมหนามง ง า ย บโตไม

กราม gel

ต พบ เอนเอมกรามานวนธ UV ดกลน

แสงท 1.5-1.83. ผลก เหมาะ8 ไพรOPA07รายงาปรมาOPA032008; พบวามดเอนเพนธกรอยในชการศกเทคนคเมอร M1122 การศก250-15เมอร เทงหมดจากกง26 แถ(61.5%MrB, Mแถบ ตและ 4เปอรเซดงน

ท 44 เลมท 2

OD260/OD280 nm8 แสดงถงปรมาณการวเคราะหดเอ

จากการคดเลสมจากไพรเมอรขเมอร พบวาม 2 7A ทสามารานการศกษาพบณดเ อนเอของ3 OPA04 OPA

Islam et al.,มไพรเมอรบางชนอได และเมอนารรมพบวามแถบดชวง 250-2000 กษาของบณฑตแลค RAPD-PCR ขMR พบทงหมด 3

bp ม polymoกษาของ See et500 bp และแเปนแถบดเอนเอด 29 แถบ คดเปนงกลาดาทศกษาทบ และพบทเปน

%) (Kumar et MrG และ MrJ มคตามลาดบ และม 4 แถบ คดเปน ซนต ตามลาดบ

m ดเอนเอทไดณโปรตนเพยงเลกอนเอโดยเทคนค ลอกหา RAPD นาด 10-12 นวคไพรเมอร ไดแก

รถเพมปรมาณดบวามไพรเมอรทก ง กามกรามไ

A09 และ OPA10, 2014) แตในกนดเทานนทสามามาวเคราะหควาดเอนทงหมด 41

bp (ตารางท 2)ละคณะ (2546)องกงกามกรามท32 แถบ มขนาดอorphic band al. (2008) มขถบดเอนเอทเกดทเปน polymorน 70.73 เปอรเซงหมด 9 ไพรเมpolymorphic bal., 2011) ซงใคาแถบทงหมด 3polymorphic 33.33 30.00 (ตารางท 3) ซง

337

ดมคาอยในชวง กนอย RAPD-PCR

ไพรเมอรทลโอไทด จานวน OPA03 และ เอนเอได แตมทสามารถเพมดคอ OPA01, 0 (See et al., การศกษาครงนารถเพมปรมาณามแตกตางทางแถบซงมขนาด) สอดคลองกบ) ทศกษาดวยทศกษาดวยไพรอยในชวง 362-28 แถบ และขนาดอยในชวง จากทง 2 ไพรrphic band นต ซงแตกตาง

มอร พบทงหมด band 16 แถบ ในงานวจยชนน 36, 30 และ 24 band 12, 9 และ 16.67

งมรายละเอยด

338 KKU Science Journal Volume 44 Number 2 Research

ไพรเมอร OPA03 พบ RAPD pattern ของกงกามกราม (MrB, MrG และ MrJ) ทเกดขน 18 แถบ มขนาดอยในชวง 460-2000 bp ซงมแถบดเอนเอทแสดง polymorphic band จานวน 14 แถบ คดเปน 77.78 เปอรเซนต (ตารางท 2) ไดแกแถบดเอนเอขนาด 500 620 680 760 890 900 950 1000 1100 1150 1190 1200 1350 และ 2000 bp ซงมจานวนนอยกวาการศกษากอนหนานทพบ 21 แถบ (Islam et al., 2014) และมแถบดเอนเอทแสดง monomorphic band จานวน 4 แถบ คดเปน 22.22 เปอรเซนต ไดแก แถบดเอนเอขนาด 460 580 760 และ 1700 bp โดยพบ RAPD pattern ทมขนาด 500 และ 680 bp ใน MrG และ MrJ เทานน และแถบทมขนาด 760 และ 1200 bp พบใน MrB และ MrG แถบขนาด 890 bp พบเฉพาะ MrJ และแถบขนาด 1350 bp พบเฉพาะ MrB เทานน (รปท 4 A)

ไพรเมอร OPA07A พบ RAPD pattern ของกงกามกราม (MrB, MrG และ MrJ) ทเกดขน 23 แถบ มขนาดอยในชวง 250-1750 bp ซงมแถบดเอนเอท

แสดง polymorphic band จานวน 15 แถบ คดเปน 65.22 เปอรเซนต (ตารางท 2) ไดแก แถบดเอนเอขนาด 250 350 390 450 520 550 590 610 720 780 800 1200 1300 1350 และ 1500 และมแถบดเอนเอทแสดง monomorphic band จานวน 8 แถบ คดเปน 34.78 เปอรเซนต ไดแก แถบดเอนเอขนาด 410 500 600 680 900 1000 1100 และ 1750 bp โดยพบ RAPD pattern ทมขนาด 520 bp ในเฉพาะ MrB เทานนและแถบขนาด 550 และ 780 bp พบใน MrB และ MrJ และพบแถบขนาด 610 และ 720 bp เฉพาะ MrG เทานน แถบ 1200 และ 1500 bp พบใน MrB และ MrG และแถบขนาด 1500 bp ยงพบใน MrJ เพศผอกดวย (รปท 4 B)

จากการวเคราะหความหลากหลายรปแบบ (polymorphism) ของดเอนเอของกงกามกรามในแตละลกษณะ MrB, MrG และ MrJ พบวาแถบดเอนทเกดขนทงหมด 12 9 และ 4 แถบ ซงเปน polymorphic band 33.33 30.00 และ 16.67 เปอรเซนต ตามลาดบ

รปท 4 แสดงขนาดและรปแบบของแถบดเอนของกงกามกรามและกงฝอย (Ml; out group) ทไดจากเทคนค

RAPD-PCR ดวยไพรเมอร OPA03 (A) และ OPA07A (B) Lane M = 100 bp DNA Ladder, Lane 1 = MrB (เพศเมย), Lane 2 = MrB (เพศผ), Lane 3 = MrG (เพศเมย), Lane 4 = MrG (เพศผ), Lane 5 = MrJ (เพศเมย), Lane 6 = MrJ (เพศผ), Lane 7 = Ml (เพศเมย), Lane 8= Ml (เพศผ)

งานวจย วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 44 เลมท 2 339 ตารางท 2 จานวนแถบดเอนเอของกงกามกรามทสงเคราะหได

Primer Size-range (bp) No. of RAPD

band Polymorphic bands

(%) Monomorphic band

(%) OPA03 460-2000 18 14(77.78%) 4(22.22%) OPA07A 250-1750 23 15(65.22%) 8(34.78%) Total 250-2000 41 29(70.73%) 12(29.27%)

4. การวเคราะหรปแบบโมเลกลดเอนเอดวยโปรแกรม NTSYSpc version 2.11x น าแถบด เ อน เอของ ก งก ามกราม ทง 3 ลกษณะ MrB, MrG และ MrJ และตวอยางเปรยบเทยบ (out group) ไดแก กงฝอย (Macrobrachium lanchesteri de Man; Ml) ทพบในแตละไพรเมอรมาวเคราะหความแปรปรวนและความสมพนธทางพนธกรรมดวยโปรแกรมสาเรจรป NTSYSpc version 2.11x จากนนนาคาทไดจากการเปรยบเทยบเขยนแผนภมสรางความสมพนธทางพนธกรรมในรปแบบ UPGMA dendrogram พบวาสามารถแบงความสมพนธทางพนธกรรมไดเปน 2 กลมใหญ โดยกลมท 1 กงฝอย (M. lanchesteri; Ml) ซงเปนตวอยางทใชเปรยบเทยบ (out group) สามารถแยกออกจากกงกามกราม (M. rosenbergii) ไดอยางชดเจน กลมท 2 กงกามกราม (M. rosenbergii; MrB, MrG และMrJ)สามารถแยกออกไดสองกลมยอย กลมยอยท 1 ประกอบดวย MrJ เพยงลกษณะเดยวเทานน กลมยอยท 2 เปน MrB และ MrG ซงทงสองกลมใหญและสองกลมยอยของกลมท 2 มคาสมประสทธความเ ห ม อน เ ท า ก บ 52.00 แล ะ 67.50 เ ป อ ร เ ซ น ต ตามลาดบ (รปท 5) ซงสอดคลองกบการศกษาความผนแปรทางพนธกรรมของกงกามกรามในประเทศไทยและพมา สามารถแบงประชากรจากบอเลยงออกได 2 กลมใหญ โดยมคาดชนความคลายคลงระหวางกลมเทากบ 0.65 คอ จากบอเลยงจงหวดสราษฎรธาน และ

ประชากรจากบอเลยงจงหวดสพรรณบร ระนอง และกาฬสนธ (จอมสดา, 2546) และจากการศกษาลกษณะทางพนธกรรมของกงกามกรามในประเทศมาเลเชยโดยเทคนค RAPD พบวากงกามกรามในแตละพนทแตกตางกนสามารถแยกได 3 กลมใหญ เมอศกษาความแปรปรวนทางพนธกรรมกงกามกรามโดยการวเคราะหขอมลจาก polymorphic banding pattern เบองตนชใหเหนวากงกามกรามทางทศตะวนตกและทศตะวนออกของประเทศมาเลเชยมความแตกตางกนบางสวนระหวางพนท (Bhassu et al., 2005: See et al., 2008) และเมอนามาเปรยบเทยบกบการศกษาของ Islam et al. (2014) ททาการศกษาความแปรผนของกงกามกรามโดยนาอตราสวนของพอแมพนธในบอเลยง 1 เพศผ : 1 เพศเมย 1 เพศผ : 2 เพศเมย และ 2 เพศผ : 1 เพศเมย ผลจาก dendrogram ทได พบวาสามารถแบงความสมพนธทางพนธกรรมได 2 กลมคอ 1 เพศผ : 1 เพศเมย และตวอยางควบคม และตวอยางกลมทเหลอจดอยในกลมสอง จากผลแสดงใหเหนวาอตราสวน 1 เพศผ : 1 เพศเมย เหมาะสมทจะนาไปใชเปนพอแมพนธตอไป จากผลดงกลาวจะเหนวากงกามกรามในแตพนทมลกษณะทางพนธกรรมทแตกตางกนการเลอกพอแมพนธ จงควรมการศกษาลกษณะเดนทางพนธกรรมกอนเพอปองกนการผสมเลอดชด นอกจากนยงมรายงานการศกษาลกษณะทางพนธกรรมของกงกามกรามดวยเทคนคอณพนธศาสตรอนๆ อาท เชน การศกษาดวยเทคนคไมโครแซทเทลไลท ซงใน

340 KKU Science Journal Volume 44 Number 2 Research ประเทศไทยพบวากลมกงกามกรามจากจงหวดสราษฎรธานมพนธกรรมแตกตางจากกลมกงกามกรามจากจงหวดขอนแกน และกลมทมพนธกรรมใกลชดกนมากทสดคอกลมกงกามกรามจากจงหวดอางทองกบจงหวดสมทรสงคราม (Charoenwattanasak et al., 2015) และยงมการศกษาในกลมประชากรกงกามกรามในประ เทศปาก สถาน พบวาก งก ามกราม มความแปรปรวนทางพนธกรรมปานกลาง (Khan et al.

2014) และมการศกษาดเอนเอบารโคดของกงกามกรามในตางประเทศทพบวาสามารถแยกลกษณะของกงกามกรามไดตามลกษณะทางภมประเทศและยงมการศกษาเพมเตมในกงอกหลายๆ ชนด เชน M. malcolmsonii, M. lamarrei, M. lamarrei lamarroids, Caridina gracilipes และ Penaeus monodon (Bruyn et al., 2004; Wilon and Sing, 2013; Udayasuriyan et al., 2015)

รปท 5 UPGMA dendrogram แสดงความสมพนธทางพนธกรรมของของกงกามกราม โดยเทคนค RAPD-PCR ดวยไพรเมอร OPA03 และ OPA07A ดวยโปรแกรม NTSYSpc version 2.11x MrBF = กงกามกรามกามฟา (เพศเมย), MrBM = กงกามกรามกามฟา (เพศผ), MrGF = กงกามกรามกามทอง (เพศเมย), MrGM = กงกามกรามกามทอง (เพศผ), MrJF = กงกามกรามจกโก (เพศเมย), MrJM = กงกามกรามจกโก (เพศผ), MlF = กงฝอย (เพศเมย), MlM = กงฝอย (เพศผ)

งานวจย วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 44 เลมท 2 341

ตารา

งท 3

จา

นวนแ

ถบแล

ะเปอร

เซนตP

olymo

rphic

band

และ

Mon

omorp

hic b

and

ทงหม

ดของ

ตวอย

างกงจ

ากกา

รวเคร

าะหโ

ดยใช

เทคน

ค

RAP

D-PC

R

M. la

nche

steri (

Ml) No

. of

Mono

mo

rphic

ba

nd

7 7 14

(87.50

%)

No. o

f Po

ly mo

rphic

ba

nds

1 1 2 (12

.50%)

No. o

f RA

PD

band

8 8 16

M. ro

senb

ergii (

MrJ) No

. of

Mono

mo

rphic

ba

nd

9 11

20

(83.33

%)

No. o

f Po

ly mo

rphic

ba

nds

1 3 4 (16

.67%)

No. o

f RA

PD

band

10

14

24

M. ro

senb

ergii (

MrG)

No. o

f Mo

no

morp

hic

band

8 13

21

(70.00

%)

No. o

f Po

ly mo

rphic

ba

nds

7 2 3 (30

.00%)

No. o

f RA

PD

band

15

15

30

M. ro

senb

ergii (

MrB) No

. of

Mono

mo

rphic

ba

nd

9 15 24

(66.67

%)

No. o

f Po

ly mo

rphic

ba

nds

6 6 12

(33.33

%)

No. o

f RA

PD

band

15

21

36

Prime

r

OPA0

3

OPA0

7A Total

342 KKU Science Journal Volume 44 Number 2 Research สรป

จากผลการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของกงกามกรามในบอเลยงของเกษตรกรในจงหวดกาฬสนธโดยใชลายพมพดเอนดวยเทคนค RAPD-PCR จานวน 8 ไพรเมอร พบวามไพรเมอร 2 ชนดทสามารถเพมปรมาณดเอนเอไดคอ OPA03 และ OPA 07A พบแถบดเอนเอทงหมด 41 แถบ อยในชวง 250-2000 bp แถบดเอนเอทเกดขนเปน polymorphic band จานวน 29 แถบ คดเปน 70.73 เปอรเซนต จากความแตกตางของแถบดเอนเอสามารถใชแยกกงกามกรามแตละลกษณะออกจากกนได และเมอนามาสราง UPGMA dendrogram สามารถแบงความแตกตางไดอยางชดเจนมากขน แสดงใหเหนวากงกามกรามในบอเลยงของเกษตรกรจงหวดกาฬสนธทนามาศกษาในครงนมความแตกตางทางดานพนธกรรม ซงจากขอมลทไดนจะเปนแนวทางนาไปสการคดเลอก การปรบปรงสายพนธการอนรกษและการจดการพอแมพนธของกงกามกรามทจะใชในการเพาะเลยงในพนทจงหวดกาฬสนธเพอการคาในระดบอตสาหกรรมตอไป

กตตกรรมประกาศ ผวจยขอขอบคณสานกงานคณะกรรมการ

วจยแหงชาต (วช.) ทไดสนบสนนทนวจยประจาปง บป ร ะม าณ 2558 และขอขอบคณส าข า ว ช าเทคโนโลยชวภาพ คณะเทคโนโลยอตสาหกรรมเกษตร มหาวทยาลยกาฬสนธ อาเภอเมอง จงหวดกาฬสนธ ทใหความอนเคราะหอปกรณ สถานทในการทาวจย และอานวยความสะดวกในทกๆ ดาน และขอขอบคณอาจารย และนกศกษาทกๆ คนทมสวนรวมในงานวจยครงนสาเรจไดดวยด

เอกสารอางอง กณฑรย เจรญทว. (2550). ความหลากหลายทางไมโคร แซทเทล

ไลทพนธกรรมในประชากรกงกามกรามจากโรงเพาะฟกและธรรมชาต. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต (เทคโนโลยชวภาพเกษตร), มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. กรงเทพฯ: 66 หนา

ก ล ม ว เ ค ร าะ หก า รค า ส นค าป ระม ง ระหว า งป ระ เทศ . (2558).การคาสนคาประมงของไทยเดอน พฤษภาคม 2558 .กองประมง ตา งประ เทศ กรมประมง , แหลงขอมล : http://www.fisheries.go.th/ foreign/images/pdf/0558.pdf. คนเมอวนท 8 กรกฏาคม 2558.

กลมวจยและวเคราะหสถตการประมง. (2557). หนงสอสถตการประมงแหงประเทศไทย พ.ศ. 2555.ศนยสารสนเทศ กรมประมงเอกสารฉบบท 9/2557, แหลงขอมล: http://www.fisheries.go.th/it-stat/yearbook/ data_2555/menu_2555.htm. ค น เ ม อ ว น ท 8 พฤษภาคม 2558.

จอมสดา ดวงวงษา. (2546). ความแปรผนทางพนธกรรมกงกามกราม (Macrobrachium Rosenbergii de Man) จากประเทศไทยและพมาโดยการตรวจลายพมพดเอนเอดวยเทคนค RAPD. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต, มหาวทยาลยขอนแกน. ขอนแกน: 1-68 หนา.

บณฑตย เตงเจรญกล คมกรช พมพภกด และอไร เตงเจรญกล. (2546). การศกษาการใชเทคนคพซอาร-อารเอพดในเ บ อ ง ต น ใ น ก ง ก า ม ก ร า ม . ว า ร ส า ร ว จ ยมหาวทยาลยขอนแกน. 8(2): 4-10.

ประจวบ หลาอบล. (2525). คมอปฏบตการวชากง ป. พมพครงท1. กรงเทพฯ: ภาควชาวทยาศาสตร ทางทะเลคณะประมง มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. หนา 1-107.

สานกงานประมงจงหวดกาฬสนธ. (2556). การเลยงกงกามกราม.แหลงขอมล: http://www.fisheries.go.th/ fpo-kalasin/main.html. คนเมอวนท1 พฤษภาคม 2558.

อทยรตน ณ นคร. (2543). พนธศาสตรสตวนา. พมพครงท 2. กรงเทพฯ: ภาควชาเพาะเลยงสตวนา คณะประมง มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. หนา 56-65.

งานวจย วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 44 เลมท 2 343 Aubert, H. and Lightner, D.V. (2000). Identification of

genetic populations of the Pacific blue shrimp Penaeus stylirostris of the gulf of California, Mexico. Marine Biology 137: 875-885.

Bhassul, S., Hassanl, R., Jamari, Z., Guan, T.S. (2005). Genetic variation among freshwater prawns (Macrobrachium Rosenbergii): A Rapd And Rahms Suruey. In: the 6th National Congress on Genetics 12-14 Mav 2005, Kuala Lumpur. 159-161.

Bruyn, M.d., Wilson, J.A., and Mather P.B. (2004). Huxley’s line demarcates extensive genetic divergence between eastern and western forms of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii. Molecular Phylogenetics and Evolution 30: 251–257.

Charoenwattanasak, S., Petkham, R., Srisathapom, A., Niamphithak, P. (2015). The development and application of genetic markers for giant freshwater prawns Macrobrachium Rosenbergii by microsatellites. Aquaculture Research and Development 6(1): 295.

Chatterjee, N. R., Chatterjee, P. and (Dutta) Roy, S. (2013). Population structure of Penaeus monodon from coastal west Bengal using RAPD fingerprining. American International Journal of Research in Formal. Applied and Natural Sciences 3(1): 30-36.

Guerra, A.L., Lima, A.V.B., Taddei, F.G. and Castiglioni, L. (2010). Genetic polymorphism, molecular characterization and relatedness of Macrobrachium species (Palaemonidae) based on RAPD-PCR. Genetics and Molecular Research 9(4): 2317-2327.

Islam, S.S., Shah, Md.S., Rahi, Md.L. (2014). Assessment of genetic variability of prawn (Macrobrachium rosenbergii) post larvae (PL)

from the broods stocked under different sex ratios. International Journal of Aquaculture 4(9): 55-63.

Khan, S.R., Akter, H., Sultana, N., Khan, M.G.Q., Md. Wahab, A. and Md. Alam, S. (2014). Genetic diversity in three river populations of the giant freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii) in Bangladesh assessed by microsatellite DNA markers. International Journal of Agriculture and Biology 16(1): 195-200.

Kumar, P., Sethi, S.N., Mahendran V., Nivas K. and Sundar, J. (2011). Tiger prawn (Penaeus monodon) brood stock of Andaman molecular characterisation by RAPD technique. Fishing Chimes 31(1): 24-27.

Nandlal, S. and Pickering, T. (2005). Freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii farming in Pacific Island countries. Vol 1. Noumea: Secretariat of the Pacific Community. pp. 5-38.

Niamaimandi, N., Arshad, A., Daud, S.K., Saed, R.C., Kiabi, B. (2010). Population structure of green tiger prawn, Penaeus semisulcatus (De Haan) in Bushehr waters,Persian Gulf. Iranian Journal of Fisheries Sciences 9(2): 337-341.

Sakaew, W., Pratoomthai, B., Pongtippatee, P., Flegel, T.W. and Withyachumnarnkul, B. (2013). Discovery and partial characterization of a non-LTR retrotransposon that may be associated with abdominal segment deformity disease (ASDD) in the whiteleg shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei. BioMed Central Veterinary Research 9: 189.

See, L.M., Hassan, R., Tan, S.G. and Bhassu, S. (2008). Genetic Characterization of wild stocks of prawns M. rosenbergii using random amplified polymorphic DNA Markers. Biotechnology 7(2): 338-342.

344 KKU Science Journal Volume 44 Number 2 Research Udayasuriyan, R., Saravana Bhavan, P., Vadivalagan, C.

and Rajkumar, G. (2015). Efficiency of different COI markers in DNA barcoding of freshwater prawn species. Journal of Entomology and Zoology Studies 3(3): 98-110.

Wilon, J.J. and Sing, K.W. (2013). DNA barcoding can successfully identify Penaeus monodon, associate life cycle stages, and generate hypotheses of unrecognised diversity. Sains Malaysiana 42(12): 1827-1829.