“ANALISA JENIS DAN KADAR VITAMIN E SECARA HPLC”

MAKALAHDisusun untuk memenuhi tugas mata kuliah Analisa Pangan

Dosen Pengampu : Dr. Ir. Joni Kusnadi, M. Si.

Disusun Oleh:Kelompok 5 (Lima)

Yoga Setiawan 115100800111027Arni Ardila Sari 115100501111001Catur Setya Budi R. 115100800111009Fintya Maulida 115100501111013Retno Ade Pujiastuti 115100813111001Maslia Fahrun Nisa’ 115100513111005Made Monisa A 115100500111027Karlita Meirza FH 115100501111003Austriena N. Putri 115100507111005

JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

2013

BAB IPENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan

perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen – komponennya

akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak Anonim,(1996). Fase diam

akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen

campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan

komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat (Gritter, dkk. 1991).

Sekarang ini, kromatografi sangat diperlukan dalam memisahkan suatu campuran senyawa.

HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai fase diam yang

terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi ukuranya sempit ( kolom ) dan fase

gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan memakai tekanan tinggi

sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan waktu yang relative singkat. HPLC

atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian

senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi; lingkungan;

bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan.

Bila dibandingkan dengan kromatografi gas - cair/ gas – liquid Chromatography (GLC) maka

HPLC lebih bermanfaat untuk isolasi zat tidak mudah menguap, demikian juga zat yang secara

termal tidak stabil. Akan tetapi ditinjau dari kecepatan dan kesederhanaan, GLC lebih baik.

Kedua teknik ini komplementer satu sama lainnya, keduanya efisien, sangat selektif hanya

memerlukan sampel berjumlah sedikit serta keduanya dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.

Akhir – akhir ini untuk pemurnian (misalnya untuk keperluan sintesis) senyawa organik skala

besar, HPLC (High Precision Liquid Chromatography) secara intensif digunakan. Bila zat terlarut

dengan pelarut yang cocok, zat tersebut dapat dianalisa. Ciri teknik ini adalah penggunaan

tekanan tinggi untuk mengirim fasa mobil kedalam kolom. Dengan memberikan tekanan tinggi,

laju dan efisiensi pemisahan dapat ditingkatkan. Dalam makalah ini akan prinsip dan analisa

vitamin E pada bahan pangan secara HPLC .

1.2 Rumusan Masalah

Berdasar latarbelakang diatas maka rumusan masalah yang akan dibahas ialah bagaimana

prinsip kerja HPLC sekaligus penentuan kadar dan jenis vitamin E pada produk pangan dengan

analisa HPLC?

1.3 Tujuan

Mengetahui prinsip dasar dan penentuan jenis sekaligus kadar dalam analisa vitamin E pada

bahan pangan secara HPLC.

BAB IIPEMBAHASAN

2.1 Pengertian HPLC (High Precision Liquid Chromatography)

HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Kerja HPLC pada prinsipnya

adalah pemisahan setiap komponen dalam sample (analit-analit) berdasarkan kepolarannya, untuk

selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing

komponen tersebut (kuantitatif). Alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan

tertentu sebagai fasa geraknya (Capuano, A ., 1981). Yang paling membedakan HPLC dengan

kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.

Fasa diam yang biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe2SiCl dimana

R adalah rantai alkana C-18 atau C-8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur

komposisinya (gradien elusi), misalnya air : asetonitril (80:20), dll, hal ini bergantung pada

kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya,

dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya

terpisah. Waktu retensi yaitu waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom

menuju detektor. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai

sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu (Institute of Medicine.

2000). Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.Untuk beberapa

senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)

kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada

ukuranpartikel)

komposisi yang tepat dari pelarut

temperatur pada kolom (Muniz, 1983.)

Ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut (fase

gerak) dan fase diam.

Fase normal HPLC

Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca tentang kromatografi lapis tipis

ataukromatografi kolom. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non

polarmisalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan

mungkin kurangdari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.Senyawa-senyawa polar

dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yangpolar dibanding degan

senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polarkemudian akan lebih cepat

melewati kolom.

Fase balik HPLC

 Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar

melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik

berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan

alkohol seperti metanol. Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan

molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara

rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam

larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk

bergerak bersama dengan pelarut.

2.2 Analisa Vitamin E secara HPLC

Senyawa aktif vitamin E adalah bagian dari sistem antioksidan menonaktifkan radikal

bebas dan mengambil bagian dalam stress oksidatif. Kandungan Kimia dari vitamin E relatif

kompleks dan mencakup dua kelompok molekul besar : tocopherol dan tocotrienol, masing-

masing termasuk 32 stereoisomers. Kelompok tocopherol mencakup empat zat: α-tokoferol, β-

tokoferol, γ-tokoferol, δ-tokoferol. Kelompok tokotrienol (sangat mirip dengan tokoferol)

mencakup empat zat yang berbeda juga ( Antalick, J .D . 1981).

Vitamin E komersial didistribusikan sebagai α-tokoferol, tetapi dalam bentuk esterifi

(asetat-tocopheroil) yang lebih stabil dan kurang teroksidasi (Gertz, C. 1982). Vitamin E

disintesis dalam tanaman, ganggang, jamur, tapi tidak di hewan. Produk sayuran adalah sumber

utama vitamin E. jumlah terbesar dari vitamin E ditemukan dalam sereal, (di mana umumnya

tocotrienol, kecuali untuk β dan γ tokoferol, seperti dalam kedelai) dan minyak sayur, jauh lebih

kaya bentuk α dan γ, terutama partikel minyak. Leguminosae menyajikan konten yang baik

vitamin E, terutama di daun dewasa. Pada jaringan hewan dan organ, α-tokoferol pada dasarnya

mewakili, tetapi dalam konsentrasi rendah.

Tokoferol dan tokotrienol, secara kolektif dikenal sebagai tocols, adalah senyawa

amphipathic dan larut lemak yang mudah teroksidasi ketika mengalami panas, cahaya dan

kondisi alkali. Terdiri dari cincin chromanol kutub dan rantai samping 16-karbon hidrofobik

menempel ke cincin melalui atom C-2 (Junsoo, L., 2000). Tokoferol rantai sampingnya phytyl

jenuh sementara tocotrienol memiliki rantai samping isoprenyl dengan tiga ikatan ganda. Kedua

tokoferol dan tokotrienol dibedakan menjadi empat vitamers (α, β-, γ-dan δ-) yang berbeda satu

sama lain dengan jumlah dan posisi kelompok-kelompok metil di cincin chromanol (Gambar 1).

Semua tocols alam 2R-stereoisomer, menunjukkan bahwa rantai samping yang terikat pada

cincin chromanol dengan stereokimia yang sama [2-4]. Tokoferol mengandung dua pusat

asimetris tambahan dalam rantai samping, yaitu C-4 'dan C-8', bahwa keduanya R-stereoisomer

di vitamers alami. Ikatan ganda dari 'rantai samping pada C-3' tocotrienol dan C-7 'memiliki

trans-konfigurasi (Bieri,. 1980).

Untuk menentukan konsentrasi vitamin E dapat dilakukan dengan beberapa metode,

tergantung pada tujuan analisis dan matriks. Dalam beberapa kasus, perlu mengukur α-tokoferol,

sedangkan dalam kasus lain perlu untuk mengukur tokoferol dan tokotrienol. Yang terpenting,

sampel harus diperlakukan dahulu untuk memecahkan struktur di mana vitamin E mengikat

(membran, lipoprotein, liposom), untuk menghilangkan gangguan yang ditentukan dengan

protein dan karbohidrat yang larut dalam fase organik, dan untuk menciptakan media di mana

vitamin E harus larut dan bisa bebas mengelusi (Antalick, J .D . 1981). Untuk tujuan ini, biasanya

etanol atau metanol digunakan. Dalam makanan dengan konsentrasi lemak rendah metode

langsung untuk ekstraksinya yaitu dengan dietil eter, dan dalam makanan berlemak tinggi maka

perlu menerapkan kation saponifi.

Recovery ini untuk memisahkan komponen saponifi (gliserol, lemak, garam asam) yang

dapat mengganggu Vitamin E, senyawa ini larut dalam air, sehingga dapat dihapus. Saponifi

kation dilakukan dengan memanfaatkan hidrat kalium terkait dengan antioksidan untuk

mencegah oksidasi. Setelah saponifi kation, komponen saponifi tidak ada lagi, seperti vitamin E,

yang diekstraksi dengan menambahkan pelarut organik polar (heksana, aseton, dietil eter) dan

campuran larutan asam lemak, gliserol dan zat yang tidak diinginkan lainnya tinggal di

fase air alkali dan tidak mengganggu ekstraksi Vitamin E. Perbandingan antara metode dengan

atau tanpa saponifi kation menunjukkan bahwa saponifi kation memungkinkan untuk mengukur

bentuk α, sedangkan bentuk δ terdegradasi. Metode tanpa saponifi kation untuk mengukur bentuk

γ dan δ.

Untuk menentukan vitamin E dengan analitia prosedur berbeda (TLC, GC, HPLC,

CEC) yang digunakan. Karena penerapannya lebih mudah, teknik HPLC lebih

sering digunakan. Untuk mengidentifikasi semua fraksi fase normal teknik HPLC (silica gel

Kolom HPLC) dengan detektor fluorescence yang digunakan. Teknik HPLC fase-balik

(Kolom ODS C18) menyajikan reproduktifitas baik, balancing lebih cepat dan kolom

sangat stabil tetapi tidak mampu memisahkan bentuk γ dan δ (Keller H.E. 1988). Detektor

elektrokimia sangat praktis, tapi itu hanya berlaku dengan teknik HPLC fase-balik,

fluorescence detektor praktis, spesifik dan berlaku dengan normal pada teknik fase-balik, tetapi

tidak menunjukkan bentuk esterifi. Detektor ultraviolet menunjukkan sensibilitas terendah.

Parameter diperhitungkan untuk memvalidasi metode yang ditentukan pada pernyataan protokol

internasional.

Preparasi Sampel1. Ekstraksi pelarut

Ekstraksi pelarut adalah prosedur sederhana untuk mengekstrak tokoferol dan tokotrienol

dari jaringan dan sampel biji minyak (Gentili, A. 2011). Ekstrak dapat digunakan secara langsung

setelah dilarutkan dalam fase gerak dan disaring, atau setelah langkah pemurnian tambahan.

Tidak ada pelarut ekstraksi universal yang akan menghasilkan dalam hasil yang optimal di semua

bahan. Sebaliknya, parameter ekstraksi harus dioptimalkan untuk masing-masing tujuan.

Misalnya, heksana dan campuran heksana dan etanol yang digunakan untuk mengekstrak tocols

dari makanan dan sampel makanan, campuran kloroform dan metanol dari biji labu, dan metanol

dari biji-bijian sereal. Persiapan etanol sebelum ekstraksi pelarut juga telah digunakan untuk

melepaskan tocols dari protein dalam jaringan basah. Ekstraksi juga dapat ditingkatkan misalnya

dengan vortexing, sonikasi atau menggunakan ultrasound, atau dengan menggunakan pelarut

beredar panas seperti di Soxhlet ekstraksi. Meskipun ekstraksi pelarut dilakukan dalam kondisi

yang relatif ringan, antioksidan telah ditambahkan ke pelarut untuk melindungi tocols dari

degradasi selama ekstraksi dan penyimpanan (Resources Science and Technology Agency,

2000).

2. Ekstraksi hidrolisis yang dibantu alkaline

Hidrolisis basa meningkatkan extractability dari tocols dari jaringan keras dan makanan

yang kompleks dengan memperlemah interaksi antara tocols dan matriks, dan dengan pelunakan

matriks. Misalnya, hidrolisis basa yang diperlukan untuk melepaskan kuantitatif tocols dari

margarin dan gulir lemak. Tocols alami tidak perlu dihidrolisis, karena terjadi terutama sebagai

senyawa bebas non-terkonjugasi, tapi makanan yang diperkaya dan pakan harus disaponifikasi,

karena tocols umumnya ditambahkan sebagai ester. Ketika menganalisis tocols oleh fase-normal

HPLC, co-extracting lipid netral tidak mengganggu pemisahan, namun ketika menganalisis tocols

oleh HPLC fase terbalik, hidrolisis basa dianjurkan untuk menghapus lipid saponifiable.

Karena tocols rentan terhadap dekomposisi pada kondisi basa, kerugian yang signifikan

dapat terjadi kecuali dicegah dari oksidasi. Untuk menghindari oksidasi, antioksidan seperti asam

askorbat atau pirogalol biasanya ditambahkan ke campuran penyabunan, dan oksigen akan

dihapus dengan membersihkan ruang udara dengan nitrogen. Setelah saponifikasi, tocols

biasanya diekstraksi dengan campuran pelarut seperti heksana dan etil asetat, heptana dan etil

asetat atau heksana dan etanol. Ekstrak lipid non-saponifiable yang dimurnikan dari kotoran larut

dalam air, dan akhirnya terkonsentrasi dan disaring sebelum analisis HPLC.

3. Pemisahan Tokoferol dan Tocotrienols dengan HPLC

HPLC adalah teknik yang paling banyak digunakan untuk menganalisis tocols, dan kedua

fase-normal (NP) dan fase terbalik (RP) kromatografi diterapkan. Tocols stabil di bawah kondisi

HPLC, mudah larut dalam pelarut yang sesuai, dan ada beberapa detektor yang dapat

dikombinasikan dengan HPLC untuk mendeteksi tocols. Deteksi fluoresensi (FLD) dan deteksi

ultraviolet (UV) yang paling sering digunakan dalam makanan dan analisis pakan. Kromatografi

gas (GC) juga bisa digunakan untuk menganalisis tocols, tapi itu akan membutuhkan derivatisasi

dari analit dan mungkin termasuk risiko dekomposisi karena suhu tinggi. Namun GC masih

kadang-kadang digunakan untuk analisis protocol. Ketika semua delapan tocols harus dipisahkan,

NP-HPLC umum diterapkan, tetapi ketika hanya beberapa vitamers yang dicari, RP-HPLC

mungkin juga dimanfaatkan. RP-HPLC juga digunakan ketika campuran vitamin yang larut

dalam lemak dan tocols bebas dan tocols harus diesterifikasi untuk dipisahkan (Renzi..dkk,2005).

Dalam NP-HPLC, para vitamers dilarutkan dalam pelarut organik non-polar relatif dan

dipisahkan oleh adsorpsi, yang dianggap paling efektif untuk memisahkan vitamers (misalnya

3,4). Polaritas tocols terutama dipengaruhi oleh jumlah kelompok metil di cincin chromanol, dan

pada tingkat lebih rendah oleh efek sterik kelompok metil dan sedikit meningkat polaritas rantai

samping jenuh tokotrienol dibandingkan dengan tokoferol. Senyawa yang paling sulit untuk

dipisahkan adalah β-dan γ-tocols, karena mereka memiliki tiga gugus metil dalam struktur cincin

mereka (misalnya 3,13).

Semua tocols dipisahkan oleh NP-HPLC menggunakan kolom silika (Tabel 1).

Selektivitas yang lebih baik dicapai dengan menggunakan heksana dengan pengubah kutub relatif

kuat 1,4-dioksan dalam fase mobile daripada dengan pengubah lemah seperti tert-butil metil eter.

Menggunakan 4-5% (v / v) dari 1,4-dioksan dalam heksana sebagai fase gerak dengan beberapa

kolom silika, tocols selalu dielusi dengan urutan sebagai berikut: α-tokoferol < α-tokotrienol < β-

tokoferol < γ-tokoferol < β-tocotrienol < γ-tokotrienol < δ-tokoferol < δ-tocotrienol, dan

pemisahan yang baik dicapai.

(Sumar, dkk. 1994)

RP-HPLC juga telah digunakan untuk menganalisis tocols. Memiliki keuntungan

menggunakan NP-HPLC fase gerak yang tidak berbahaya, misalnya metanol atau etanol, dapat

digunakan, tetapi persiapan sampel harus menyertakan penghapusan acyl lipid, yaitu penyabunan,

untuk menghindari kontaminasi dari kolom RP. Resolusi lengkap dari delapan tocols belum

diperoleh dengan kolom silika C18-berikat, karena mereka tidak dapat memisahkan β-dan γ-

vitamers dari satu sama lain [31,46]. Dalam banyak aplikasi, pemisahan tersebut tidak

diperlukan, dan dengan demikian C18-berikat kolom yang digunakan.

4. Deteksi Tocopherols and Tocotrienols

Tocol menyerap sinar UV pada λ = 290-300 nm, tetapi absorbansi maksimal sangat kecil

untuk penyerapan UV hanya dapat digunakan untuk mendeteksi dan mengukur tocols dalam

sampel yang kaya tocol seperti minyak sayur. Sensitivitas yang lebih baik dan selektivitas tinggi

dari analisis HPLC diperoleh dengan menggunakan FLD dan ini adalah teknik pilihan yang

paling bagus untuk sampel biologis. Eksitasi panjang gelombang 290-296 nm dan emisi panjang

gelombang 325-330 nm yang umum digunakan. Linearitas kurva kalibrasi tocols menggunakan

FLD harus dievaluasi untuk setiap metode analitis dan instrumen, karena ada perbedaan yang

signifikan dalam rentang linearitas, linier berkisar dari 0,1 sampai 5 mg / mL (r2> 0,992) dan dari

0,01 sampai 50 ug / g (r2> 0,995), atau dari 10 hingga 100 ng (r2> 0.99) dan 3-4 ng sampai 2000

ng (r2> 0.99). Spektrometri massa (MS) juga telah digunakan untuk mendeteksi tocols. Ion

negatif APCI (tekanan atmosfer ionisasi kimia) telah menemukan pilihan terbaik di antara positif

dan negatif ion elektrospray dan mode ionisasi APCI untuk mendeteksi dan mengukur tocopherol

(Khan, A., 2010.).

5. Identifikasi dan Kuantifikasi Tokoferol dan Tocotrienols

Standar otentik tokoferol tersedia secara komersial, sehingga relatif mudah untuk

mengidentifikasinya dari kromatogram yang diperoleh FLD atau respon UV. Elusi tokoferol yang

berbeda juga dapat dengan mudah ditemukan dalam literatur. Standar tocotrienol, tidak tersedia

sebagai senyawa murni, dan dengan demikian identifikasi mereka biasanya dilakukan dengan

menggunakan minyak kelapa atau ekstrak biji gandum yang diketahui mengandung tocotrienol.

LC-MS juga dapat digunakan untuk mengkonfirmasi identitas tocols. Misalnya, dengan

menggunakan massa APCI positif terhadap rasio muatan (m / z) dari [M + H] + ion adalah 431,

417, 417, dan 403 untuk α-, β-, δ-, dan δ-tokoferol, dan 425 , 411, 411, dan 397 untuk tocotrienol.

Ion fragmen Karakteristik adalah m / z 205 dan 165 untuk α-tocols, m / z 191 dan 151 untuk β-

dan γ-tocols, dan m / z 177 dan 137 untuk δ-tocols (Syvaoja E.L.,dkk 1985.).

Kurva kalibrasi tokoferol harus diukur secara berkala. Karena tocotrienol murni tidak

tersedia secara komersial, kuantifikasi umumnya dilakukan dengan menggunakan tocopherol.

Untungnya tocotrienol diketahui menunjukkan respon fluorencent mirip dengan tokoferol

masing-masing, dan dengan demikian tocotrienol dapat dihitung menggunakan standar tokoferol.

Dalam beberapa studi tocotrienol telah dimurnikan dari gandum atau biji-bijian serealia lain

dengan ekstraksi pelarut dan HPLC preparatif, dan digunakan sebagai standar. Penyerapan UV

tokoferol murni berguna dalam memeriksa konsentrasi tokoferol dalam larutan stok standar.

Tocols biasanya diukur menggunakan metode standar eksternal, karena sulit untuk menemukan

suatu senyawa yang tidak akan mengganggu analisis protocol. Contoh standar internal mungkin

termasuk 5,7-dimethyltocol yang dapat digunakan bila sampel tidak mengandung α-tokotrienol,

dan 2-metil-2-(4 ', 8', 12 ')-trimethyltridecyl kroman-6-ol yang dipisahkan dari tocols lain. Atau,

tocopherol yang tidak ada dalam sampel juga dapat digunakan sebagai standar internal.

6. Aspek kualitas

Validasi metode untuk menganalisis tocols dalam sampel biologis harus dilakukan

sebelum aplikasi metode baru dan jenis dari sampel diperkenalkan. Kinerja sistem kromatografi

untuk memisahkan dan mendeteksi tocols harus dievaluasi dan disajikan. Hal ini lebih sulit untuk

memvalidasi persiapan sampel, karena tidak ada bahan referensi bersertifikat (CRM) yang berisi

satu set tocols alami. Hanya beberapa bahan CRMs diperkaya dengan α-tokoferol atau esternya

yang tersedia, tetapi nilai kecil ketika sampel heterogen dan kompleks. Jadi validasi persiapan

sampel harus dilakukan secara tidak langsung (Muniz, J.F., 1983). Biasanya ini dilakukan dengan

mempelajari recovery dan presisi dari tocols, yang menjelaskan bagaimana analit ditambahkan

dipertahankan selama seluruh sampel diperiksaan dan dianalisis HPLC.

Prosedur analisis kandungan Vitamin E, yaitu sebagai berikut (Muniz, J.F., 1983) :

2.3 Metode HPLC Cepat Untuk Menentukan Konsentrasi Vitamin E Pada Susu Sapi

Dalam susu, Vitamin E mengikat lipid dan ditunjukkan terutama oleh α- tokoferol. Kadar

lemak dan komposisi susu tergantung pada beberapa faktor : pakan (tradisional atau TMR),

musim, tahap laktasi, kuantitas dan kualitas pakan, serta perlakuan termal oleh susu (Okano, T .,

1982). Prinsip kerja analisa vitamin E pada sampel susu diperlakukan dengan senyawa metanol

atau etanol untuk denaturasi lipoprotein. Saponifi kation dengan alkaline dari bahan akan

menghilangkan lemak dan membebaskan vitamin E dari bahan uji sebagai unsaponifi bahan

secara berturut-turut diekstraksi dengan petroleum eter. Ekstrak dikeringkan, dilarutkan dengan

metanol dan disuntikkan di HPLC (kolom C18, fase-balik). Penentuan kuantitatif vitamin E

dilakukan oleh detektor UV pada tetapan 294 nm (Zonta, F.1982).

- Bahan dan Metode

Alat

- Vortex

- Thermostatic multiple water-bath (GFL 1041) dilengkapi dengan putaran bawah

labu (100 ml) dilengkapi dengan sumbatan, kolom pendingin dan tabung gas

- Saluran pemisahkan (100 ml)

- Termos volumetrik (100 ml)

- Rotary evaporator (Buchi 461)

- Sentrifuge (ALC 4235 A)

- HPLC Shimadzu LC-10 AD

- Detector UV-Vis Shimadzu SPD-6AV

- Recorder Shimadzu C-R5A,

- Column CS Spherisorb C18, 250 mm ODS 10μ

- Hamilton syringe (50 µl )

-

Reagen

- Ekstra murni petroleum eter (J.T.Baker)

- 0,5% asam askorbat disiapkan setiap hari (Larutkan 0,5g murni kristal asam askorbat dalam

air suling 4ml, dicampur dengan etanol 20ml dan encerkan dengan metanol untuk 100ml).

- 50% kalium hidroksida (1Kg pelet kalium hidroksida dalam 1L air suling).

- Dl-α tokoferol murni(Supelco), untuk tujuan kalibrasi

- Metil alkohol (J.T.Baker)

- Gas nitrium atau helium (oksigen bebas)

Larutan standar

Larutan stok (1000 mg / l) diperoleh melarutkan 100 mg DL-α-tokoferol dalam 100 ml

metanol. Solusi kerja (0,3 ppm, 0,5 ppm, 0,75 ppm, 1 ppm dan 2 ppm) diperoleh secara progresif

larutan stok dalam metanol.

S ampel

Setelah homogenisasi, sampel susu dibagi dalam 10g aliquots, dilestarikan di dalam

tabung polietilen dan dibekukan pada -20 ° C sampai analisis.

Saponifika si

Sampel susu, pada suhu kamar, dicampur dan sebanyak 10g dimasukkan ke dalam

termos alas bulat, 10 ml larutan asam askorbat ditambahkan dan dimasukkan dalam water-bath

80 °C sambil membersihkan dengan gas helium. Pada titik didih (setelah sekitar dua puluh

menit) 2ml larutan KOH ditambahkan. Setelah 20 menit termos diangkat dari water-bath dan

disimpan dalam ruang gelap sampai dingin.

Ekstraksi

Setelah pendinginan, bahan uji dimasukkan ke dalam corong pisah, dibilas dua kali

dengan air 5ml dan berturut-turut dengan 30ml eter. Corong ditutup dan dicampur

beberapa kali. Fase berair direcoveri dalam labu bulat dan fase eter dimasukkan ke dalam labu.

Prosedur ekstraksi diulang 2 kali dengan 30ml eter. Fase eter digabungkan dan ditransfer dalam

corong pisah, dibilas 6 kali dengan 50ml air, dan selesai labu bulat. Corong pisah dibilas dengan

10 ml eter dalam labu bulat. Kemudian, bahan menguap sampai kering dalam rotary evapororasi

kondisi vakum parsial pada water-bath suhu 45oC (5 menit). Setelah pendinginan, bahan

diperoleh dengan 5ml metanol, baik dicampur dan ditransfer dalam tabung kaca, disentrifugasi

pada 4000 rpm selama 5 menit. Untuk mempersiapkan empat sampel yang diperlukan sekitar

empat jam.

Kondisi Kinerja Tinggi dari Chromatografy Cair

Kolom : baja steinless, panjang 25 cm, diameter 4,6 mm

Fase diam : ODS

Fase gerak : Metil alkohol

Laju alir : 1ml/min

Volume injeksi : 20 ml

Deteksi : UV (Shimadzu SPD-6AV)

Panjang gelombang : 294 nm

Waktu retensi : 5 menit

Suhu kolom : ambient

Hasil

Kurva kalibrasi dan linearitas

Kurva kalibrasi diperoleh dari menganalisis masing-masing lima kali, enam larutan

dengan konsentrasi berbeda yang diketahui analit termasuk antara 0,3 dan 2,0 ppm. Persamaan

kurva y = bx + m dihitung dengan metode regresi linier untuk menentukan Konsentrasi sampel.

Hal ini dimungkinkan untuk mengevaluasi efektivitas Model oleh Nilai R2 dan dengan hasil

antara konsentrasi diketahui dan konsentrasi dihitung pada kurva kalibrasi. Hasil dilaporkan

dalam Tabel n.1 dan Gambar n.1

Persamaan dari kurva dan nilai R2 (0,9995) menunjukkan linearitas yang baik dari

metode analisis di bawah pemeriksaan. Nilai-nilai koefisien variasi yang sangat rendah, kecuali

untuk jumlah terendah (5,3%). Garis antara konsentrasi dihitung dengan kurva regresi dan yang

aktual mencapai nilai maksimum sekitar 5%, hasilnya dianggap diterima.

Tabel n.1: Data diperoleh dari analisis injeksi standar vitamin E digunakan untuk kurva kalibrasi

petak

P engulangan

Pengulangan adalah kedekatan antara hasil independen diperoleh dengan metode yang

sama pada bahan uji identik, di bawah kondisi yang sama (operator yang sama, aparat yang sama,

laboratorium yang sama dan setelah interval waktu yang singkat). Dalam pengulangan percobaan

diukur berdasarkan 5 penetapan di 5 Aliquots dari masing-masing sampel susu yang diperoleh di

sebuah peternakan memproduksi keju parmisan. Hasil dicatat dalam Tabel n.2.

Tabel n. 2: Uji pengulangan Intra-analisi direalisasikan pada lima aliquot dari contoh susu yang sama

Pengulangan Intra-analisis pada 5 sampel yang sama menunjukkan a RSD % 4,1-8,8. Sebagai

nilai-nilai kurang dari 10%, mereka harus diterima

Recovery

Recovery diidentifikasi rasio antara kuantitas dari analit, eksperimental

ditentukan dalam materi yang diketahui konsentrasinya, dan nilai yang diharapkan. Dalam

percobaan, 5 aliquot dari sampel susu yang sama, penambahannya dibuat 5 berurutan. Pada Tabel

n.4 sarana 5 penentuan untuk setiap aliquot dicatat.

2.4 METODE HPLC UNTUK MENENTUKAN KONSENTRASI VITAMIN E PADA

DAGING (PERSIAPAN DAN EKSTRAKSI)

Contoh daging diiris-iris dan dikeringkan dengan kering beku selama 3 hari lalu digiling

halus berukuran 1 mm mengunakan blender dan disimpan pada suhu 4°C sampai siap dianalisis.

Vitamin yang larut dalam lemak bersifat peka terhadap cahaya, maka selama analisis cahaya

Iangsung dihindarkan dengan menggunakan wadah yang dilapisi kertas karbon atau aluminium

(Antalick, J .D . 1981). Contoh tersebut ditimbang 3 - 5 gr lalu diekstrak 3 kali dengan 30 ml

campuran chloroform : etanol (2 : 1) dengan blender selama masing-masing 3 menit. Larutan

disaring dengan corong Buchner menggunakan kertas saring Whatman 41, kemudian hasil

saringan diuapkan dengan vakum. Residu dicuci atau dilarutkan dengan 50 ml etanol absolut dan

dipindahkan ke dalam erlenmeyer bertutup teflon. Larutan residu dalam etanol ditambahkan 1,5

ml kalium hidroksida 15% (w/v) dan 0,5 gr vitamin C sambil dialiri gas N2 lalu ditutup dengan

cepat.

Campuran tersebut dikocok di dalam ultra sonik selama 30 menit, kemudian didiamkan

semalam pada suhu kamar lalu dikocok kembali selama 30 menit dengan ultra sonik. Campuran

tersebut diekstrak dengan 2 x 75 ml dietileter, lalu lapisan eter dicuci 2 kali dengan 40 ml larutan

dapar fosfat pH 7,4 dan akhirnya dengan air suling hingga bebas basa (uji kertas pH). Lapisan

eter dipisahkan dan diuapkan dengan vakum dan residunya dilarutkan kembali dengan 3 ml

metanol HPLC grade. Larutan disaring dengan kertas saring FGWP 0,22 μm. Larutan contoh 10

μl disuntikkan pada HPLC dan dielusi dengan larutan metanol 90% dan 95%. Begitu pula

kecepatan alir fasa gerak yaitu 1,5 ml dan 2,0 ml/menit pada 2 jenis kolom C18 dan C8.

Penentuan perlakuan optimal untuk analisis HPLC dilihat pada waktu retensi yang cepat

dan dapat memisahkan setiap komponen vitamin. Pada konsentrasi metanol 90% waktu retensi

yang diperlukan untuk vitamin E lebih lama dibandingkan konsentrasi metanol 95% . Begitupula

pada kolom C18 dengan konsentrasi metanol 90% tampak lebih lama . Dengan kecepatan alir 1,5

mI/menit waktu retensi yang diperlukan lebih lama dibandingkan dengan kecepatan alir 2

ml/menit (Capuano, A. 1981).

BAB IIIPENUTUP

3.1 Kesimpulan

Dari ulasan diatas, dapat disimpulkan bahwa kerja HPLC pada prinsipnya adalah

pemisahan setiap komponen dalam sample (analit-analit) berdasarkan kepolarannya, untuk

selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing

komponen tersebut (kuantitatif). Alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan

tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya

adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.

Dalam penentuan vitamin E pada bahan pangan secara HPLC secara garis besar

prinsipnya sama namun yang membedakan ialah ketika preparasi sampel dimana sampel cair

diencerkan dan dihomogenkan terlebih dahulu sedangkan sampel padat di perluas permukaannya

dengan cara dihancurkan lalu di encerkan dan dihomogenkan. Prinsip kerja analisa vitamin E

pada sampel susu diperlakukan dengan senyawa metanol atau etanol untuk denaturasi lipoprotein.

Saponifi kation dengan alkaline dari bahan akan menghilangkan lemak dan membebaskan

vitamin E dari bahan uji sebagai unsaponifi bahan secara berturut-turut diekstraksidengan

petroleum eter. Sama halnya dengan analisa vitamin E pada daging diperlakukan dengan senyawa

metanol untuk denaturasi senyawa lipid yang diikat vitamin E yaitu lipoprotein sehingga dapat

terpisah dan teranalisis. Jenis vitamin E ditentukan berdasarkan waktu retensi sampel pada kolom

sedangkan kuantitas vitamin E ditentukan berdasarkan luas kurva dan konsentrasinya.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim,(1996),” Pangan”, Media Komunikasi dan Informasi, No. 26 Vol. VII – 1996, Jakarta, hal. 49.

Antalick, J .D . 1981 . Determination of vitamin A, D and E by HPLC . Anal Abstracts, 40,3F15 .

Bieri, J.G., Tolliver T.J ., Catignani G .L. 1980 . Simultaneous determination ofalpha-tocopherol and retinol in plasma or red cells by HPLC . Anal Abstracts, 40,1 D208 .

Capuano, A ., Daghette A . 1981 . Direct HPLC determination of vitamin A, E and B6 (retinol, alpha-tocopherol and pyri doxibne respectively) present in dietetic oils .Anal Ab stract 40, 2F72 .

Clydesdale, Fergus M, (1988), “Minerals : Their Chemistry and Fate in Food in Trace Minerals in Foods”, Marcel Dekker, Inc, 1st Edition, New York, page 73.

Gentili, A. and Caretti, F. 2011.”Evaluation of a method based on liquid chromatography-diode array detector-tandem mass spectrometry for a rapid and comprehensive characterization of the fat-soluble vitamin and carotenoid profile of selected plant foods. Journal Chromatogr. A, 1218, 684-697

Gertz, C. dan Hermanu K. 1982, Determination of tocopherols and Tocotrienol in food . Anal abstract 43, 5F13 .

Gritter, Roy J, dkk. 1991. Pengantar Kromatografi Edisi Kedua. Bandung: ITB Bandung.Hendayana

Institute of Medicine. 2000,”Dietary Reference Intakes for vitamin C, vitamin E, Selenium, and Carotenoids”. Pages 506. National Academy Press, Washington, DC

Muniz, J.F., Wehr G .T., Wehr H .M. 1983. Reversed phase liquid chromatography Determination of vitamin D2 and D3 in milk . Anal Abstracts,44,1 F36 .

Junsoo, L., Lin, Y., Landen, W.O. and Eitenmiller, R.R. 2000 “Optimization of an extraction procedure for the quantification of vitamin E in tomato and broccoli using response surface methodology”. J. Food Comp. Anal., 13, 45-57

Keller H.E.: Analytical Methods fot Vitamins and Carotenoids in Feed. Hoffman-La Roche Inc., Basel, Switzerland 1988, p.120

Khan, A., Khan, M.I., Iqbal, Z., Shah, Y., Ahmad, L. and Watson, D. G. 2010. “An optimized and validated RP-HPLC/UV detection method for simultaneous determination of all-trans-retinol (vitamin A) and alpha-tocopherol (vitamin E) in human serum, Comparison of different particulate reversed-phase HPLC columns”. J. Chromatogr. B, 878, 2339-2347.

Okano, T ., Takeuchi A ., Kobayashi T . 1982 . Simplified assay of vitamin D2 in fortified dried milk by two stage HPLC.Anal Abstracts 43,5F28 .

Resources Council, Science and Technology Agency, (2000), “Standard Tables of Food Composition in Japan”, Fifth revised Edition, Japan.

Renzi.M.,Quatantellic C.dkk,2005 “Simplifi ed HPLC-UV method for determination of α-tocopherol in plasma. Ital.J .Sci., 4, 191, 2005

Sumar, dkk. 1994. Kimia Analitik Instrumen Edisi Kesatu. Semarang: IKIP Semarang Press.

Syvaoja E.L.,dkk 1985.“Tocopherols and tocotrienols in Finnish foods”: Dairy products and eggs.Milchwissenschaft, 40 (8), 467,

Zonta, F . dan Stancher B . 1982 . HPLC of fat soluble vitamin separa tion and indentification of vitamin D2 D3 and their iso mers in food samples in the presence of vitamin A .E and carotene . J . Chrom 246, 105 - 112.