Malattie da singolo gene non ereditate in modo mendeliano

(Mitocondriali)

E' stato stimato che ogni cellula puo’ contenere da un centinaio a qualche migliaio di mitocondri, e che ogni mitocondrio contiene approssimativamente cinque molecole di DNA mitocondriale. Delle oltre 900 proteine mitocondriali, solo 13 sono codificate dal genoma mitocondriale (fosforilazione ossidativa), 22tRNA e 2rRNA. E’ privo di istoni, ha una scarsa capacita’ di riparazione (mutazioni 10 volte superiori a quello nucleare), e’ esposto a ROS.

Solo per queste non si seguono le leggi di Mendel

ETEROPLASMIA

Ci sono centinaia di molecole di DNA mitocondriale in ogni cellula, e in generale le mutazioni patogenetiche sono presenti in alcuni ma non in tutti questi genomi. Come conseguenza, le cellule e i tessuti del futuro nascituro avranno sia DNA mitocondriale normale che mutato, una situazione conosciuta come eteroplasmia.

EFFETTO SOGLIA Nei soggetti con eteroplasmia, prima che compaiano disfunzioni fisiologiche e sintomi clinici e’ necessario che il rapporto tra DNA mitocondriale mutato e il normale superi un valore soglia, che e’ tanto piu’ basso quanto piu’ il tessuto o l'organo ha un elevato fabbisogno energetico.

Trasmissione dei mitocondri mutati dalla madre ai figli. Quindi una madre con mutazioni del DNA mitocondriale le trasferisce a tutta la sua progenie in modo variabile PERCHE’ IL DNA MITOCONDRIALE SEGREGA IN MODO CASUALE. Solo le figlie potranno a loro volta trasferire la mutazione

Caratteristiche peculiari delle malattie dovute a mutazioni nel DNA mitocondriale sono: - l'ereditarieta’ materna (mitocondri solo da parte materna) - l'eteroplasmia - l’effetto soglia

Principali organi e tessuti colpiti dalle malattie mitocondriali. I mitocondri sono ubiquitari, quindi potenzialmente ogni tessuto dell'organismo puo’ essere colpito dalla presenza di mutazioni nel DNA mitocondriale. Questo e’ uno dei motivi per cui spesso le patologie mitocondriali sono multisistemiche. Nei soggetti con eteroplasmia, prima che compaiano disfunzioni fisiologiche e sintomi clinici e’ necessario che il rapporto tra DNA mitocondriale mutato e il normale superi un valore soglia, che e’ tanto piu’ basso quanto piu’ il tessuto o l'organo ha elevato fabbisogno energetico. Questo e’ anche il motivo per cui le patologie mitocondriali colpiscono soprattutto il sistema nervoso, il muscolo scheletrico e il cuore (tutti organi e tessuti ad elevato fabbisogno energetico).

Pedigree della Malattia di Leber Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON)

Malattie Mitocondriali (III)

Degenerazione fotoreccetori della retina. Spesso tra i 18 e i 30 anni è descritta una perdita della visione centrale improvvisa, indolore, acuta o subacuta. Frequenza 1/25000. Rapporto maschio/femmina: 4/1 Interessa entrambi gli occhi simultaneamente o sequenzialmente con perdita della vista nel secondo occhio dopo alcune settimane-mesi. La perdita della vista in genere si manifesta in maniera subacuta (nell'arco di diverse settimane) per poi stabilizzarsi.

Pedigree della Malattia di Leber Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON)

Malattie Mitocondriali (III)

Da 1,25 a 3 casi ogni 100.000 bambini all'anno

Progressiva degenerazione dei fotorecettori della retina Mutazioni nelle posizioni 11778 G to A, 3460 G to A and 14484 T to C, nelle subunità ND4, ND1 and ND6 del complesso I della catena della fosforilazione ossidativa

• Molti aspetti della sindrome LHON rimangono da

chiarire, quali l'estrema specificità tissutale delle lesioni

cliniche, la prevalenza nel sesso maschile, e le

conseguenze biochimiche di ciascuna mutazione.

• ROS: important for disease (studies with reducing

agents) idebenone

L'idebenone (che ha ottenuto la designazione di farmaco orfano per questa malattia nel 2007), un analogo sintetico del coenzima Q10, ha migliorato la vista dei pazienti dopo un anno di terapia.

Malattie da Espansione di Triplette

Replication Slippage

Replication Slippage

http://www.dnatube.com/video/607/Tri-Nucleotide-Repeat

Gene codificante FMR-1 (fragile X mental retardation 1 ) Necessario per lo Sviluppo neuronale

Le ripetizioni inducono Metilazione e repressione

X-Fragile Syndrome (penetranza ridotta)

Strozzatura

Loss of FMRP expression in patient-derived neurons leads to deregulated production and membrane insertion of neurotrans-mitter receptors and ion channels

•Associata a ritardo mentale

• Non tutti I maschi portatori sono affetti

dalla malattia (affetti 80%)

• Il 50% delle femmine portatrici é affetto

dalla malattia

• Anticipazione: il fenotipo peggiora ad ogni generazione

X-Fragile Syndrome (II)

• Ripetizione di CGG nella regione 5’ UTR del gene FMR-1 • Individui: Normali: 6-46 ripetizioni Portatori sani: 50-230 (premutazione) Malati: 230-4000 (Full mutation) • I maschi trasmettono la mutazione senza grandi alterazioni nel numero di triplette • Le femmine amplificano le triplette (amplificazione durante la gametogenesi)

X-Fragile Syndrome (III)

Pedigree della sindrome dell’X fragile

Lyonization? Non e’ chiaro. ?

FXS mouse model neither harbors the accurate genetic context nor fully recapitulates the phenotypes of FXS patients

Dioxygenase that catalyzes the conversion of the modified genomic base 5-methylcytosine (5mC) into 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) and plays a key role in active DNA demethylation

Selection with Nanog, a gene that is functionally important in ESCs. By using this different strategy, the researchers created iPSCs that were functionally identical to ESCs.

Oct4, Sox2, Klf4, and cMyc

Induced pluripotent stem cells (IPSCs)

A scheme of the generation of induced pluripotent stem (IPS) cells. (1) Isolate and culture donor cells. (2) Transduce stem cell-associated genes into the cells by viral vectors. Red cells indicate the cells expressing the exogenous genes. (3) Harvest and culture the cells according to ES cell culture, using mitotically inactivated feeder cells (lightgray). (4) A small subset of the transfected cells become iPS cells and generate ES-like colonies.

Shinya Yamanaka, Kyoto University 2006 2012 Nobel Prize

Huntington Disease

• Corea di Huntington (còrea dal greco, danza) • George Huntington 1872 • Gene presente sul cromosoma 4p16

Caratteristiche cliniche • Trasmissione autosomica dominante penetranza quasi 100% • Fenomeno dell’ anticipazione

• Insorgenza tardiva (inizio a 30-40 anni);

• Sintomi: perdita del controllo motorio (corea), cambi della personalitá, amnesia, diminuite capacitá intellettive (demenza); la morte sopraggiunge 15-20 anni dopo l’inizio dei sintomi,

• Progressiva atrofia dello striato

Degeneration of Striatum (pianificazione e modulazione dei movimenti): • caudate nucleus • putamen

HD Sano

Età di esordio vs numero di ripetizioni

Qual e’ la funzione della proteina wt?

Huntingtin • Espansione di una tripletta -CAG- presente nel 1 esone • Da11 a 34 Q nella popolazione • da 40-100 nei malati di HD (correlazione:espansione, insorgenza,

severita’ fenotipo) • L’espansione avviene durante la spermatogenesi • La proteina naturale é essenziale per la neurogenesi (topi) • La proteina wild-type é citoplasmica, quella mutata trasloca nel

nucleo • La proteina e’ grande (348kd, 3144aa) e solubile • Anche la perdita della proteina wt causa alcune manifestazioni

tipiche della malattia • Importanza della funzione della proteina wt (RNA interference and

farmaci selettivi per la proteina mutata, NON DEVONO ridurre la wt)

Apoptosi

Apoptosi

Toxicity by NMDA

Apoptosi

Huntingtin Protein

Flessibilità strutturale: • Differenti epitopi della proteina sono accessibili in differenti compartimenti cellulari (alterazione causata da polyQ)

Quali sono i meccanismi responsabili della perdita

progressiva di funzionalità e morte neuronale in un

intervallo di tempo di 20 anni?

La Deregolazione Trascrizionale

è un meccanismo Centrale

nella Patogenesi della Corea di Huntington

RE1/NRSE

REST= Repressor Element-1 Silencing Trascription factor RE1 o NRSE=Neuron Restrictive Silencer Element (e’ la sequenza)

Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) (Neurotropina per le cellule dello striato)

Wild-type huntingtin inhibits the silencing activity of NRSE, increasing transcription of BDNF. This effect occurs through cytoplasmic sequestering of repressor element-1 transcription factor/neuron restrictive silencer factor (REST/NRSF), the transcription factor that binds to NRSE

Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) is a survival factor for the striatal neurons that die in the disease.

Mutant Huntingnit Interagisce con fattori nucleari

a, PC12 cells induced to express 25QP-GFP or 103QP-GFP show a reduction in the level of acetylation of both histones H3 and H4. b, A second strain of stably transfected PC12 cells, grown in the absence of butyrate but induced to express F103QP-EGFP, show a reduction in the level of acetylation of H4, which can be reversed by butyrate treatment. Equivalent levels of histones are shown by Coomassie blue staining (a and b) or with anti-histone H3 (a).

Ac

Ac Ac

Ac

Histone acetylation/deacetylation regulates nucleosomal conformation

and transcription

Hypo-acetylated chromatin

Hyper-acetylated histones

Transcriptional Repression

Transcriptional activation

HDAC s

HAT s

Hypo-acetylated Histones

Diagnosi Malattie Genetiche

MALATTIE GENETICHE

La maggior parte delle malattie possono considerarsi come originate almeno in parte da

“disordini” genetici

Perche’ si Effettua un Test Genetico?

• Identificazione portatori sani (eterozigoti recessivi)

• Diagnosi Genetica Preimpianto

• Diagnosi prenatale (amniocentesi, villocentesi)

• Diagnosi presintomatica per predire l’insorgenza di malattie a sviluppo tardivo (nell’eta’ adulta come la Corea di Huntington) • Diagnosi presintomatica per valutare il fattore di rischio nello sviluppo di malattie come tumore al seno/ovaio • Diagnosi di conferma di individui sintomatici

Quando viene fatta PGD

Coppie ad alto rischio per trasmissione di malattie ereditarie (autosomiche dominanti, recessive, X-linked) Screening di aneuploidie per le coppie che utilizzano IVF per aumentare la probabilita’ di impianto e di successo della gravidanza Le tecniche utilizzate normalmente per la diagnosi sono PCR (malattie monogeniche) e la FISH (per anomalie cromosomiche)

Esempi di tumori ereditari diagnosticabili mediante PGD (Pre-implantation genetic diagnosis)

• Familial breast/ovarian cancer (BRCA1/BRCA2) tumor suppressor • Retinoblastoma (RB1) tumor suppressor • Familial melanoma (p16)

• Li-Fraumeni sindrome (p53) tumor suppressor • Familial adenomatous polyposis (APC) tumor suppressor

• Neurofibromatosis (NF1/NF2) tumor suppressor • Von Hippel Lindau sindrome (VHL) (Kidney cancer) tumor suppressor • Multiple endocrine neoplasia (MEN1-MEN2-FMCT) • Tuberous sclerosis (TSC1-TSC-2) • Hereditary colon cancer (MSH2/MLH1)

• La legge 40/2004 disciplina, in Italia, l’accesso e l’uso delle tecniche di PMA (procreazione medicalmente assistita), imponendo severe restrizioni per i pazienti e gli operatori del settore • La legge in questione limita a 3 il numero di ovociti che possono essere fertilizzati durante ciascun ciclo di IVF ed obbliga il trasferimento simultaneo in utero di tutti e tre i possibili embrioni • La crioconservazione di zigoti ed embrioni e’ vietata, mentre quella degli ovociti e’ permessa • La legge 40, inoltre, vieta qualsiasi forma di diagnosi genetica sull’embrione; quindi in Italia non sarebbe possibile eseguire la diagnos preimpianto • La legge italiana sulla IVG (Interruzione Volontaria della Gravidanza) è la Legge n.194 del 22 maggio 1978

Legislazione in Italia

La legge 40/2004 Modificazioni

• In 11 anni la legge 40 che regola la procreazione medicalmente assistita in Italia ha già visto per almeno 28 volte l'intervento dei tribunali

• Divieto di produzione di più di tre embrioni, • Obbligo di impianto contemporaneo di tutti gli embrioni prodotti • Divieto di diagnosi pre-impianto • Divieto di fecondazione eterologa

La legge 40/2004 Modificazioni

• Possibilità di ricorrere alle tecniche di PMA viene estesa anche alla coppia in cui l’uomo o la donna siano portatori di malattie virali sessualmente trasmissibili, e in particolare del virus HIV e di quelli delle Epatiti B e C

• L’eliminazione dei commi delle precedenti linee guida che limitavano la possibilità di indagine a quella di tipo osservazionale ha introdotto la possibilità di effettuare la diagnosi genetica preimpianto anche per le coppie portatrici di malattie geneticamente trasmissibili

• Facoltà di creare un numero variabile di embrioni (in base alle singole problematiche delle coppie – es. età della donna) con possibilità di crioconservare quelli non impiantati in utero

• Possibilita’ di di procreazione medicalmente assistita di tipo eterologo (aprile 2015)

• Resta vietata la soppressione degli embrioni frutto di fecondazione assistita

In funzione dell’estensione della mutazione posso essere suddivise in: 1) Mutazioni genomiche (ANEUPLOIDIA): perdita o acquisto di interi

cromosomi (ex. Sindrome di Down)

2) Mutazioni cromosomiche (riarrangiamento di materiale genomico, ex. traslocazioni)

Definite anche come: Aberrazioni Cromosomiche 3) Mutazioni Geniche

Malattie Genetiche

Analisi Citogenetica (Cariotipo)

Colchicina

Down’s Syndrome or Trisomy 21

FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION

Mutazioni Cromosomiche (Traslocazioni)

CITOGENETICA MOLECOLARE

SKY: Spectral Karyotyping

Mutazioni Geniche Possono verificarsi nelle regioni codificanti, regolatorie (ex promotori) e nei siti di splicing • Mutazioni puntiformi: sostituzione di aa, stop codon • Frame-shift: delezione o inserzione di nucleotidi • Inserzione/delezione di triplette: aggiunta o eliminazione di aa • Espansione di triplette: caratterizzate dall’essere dinamiche (perchè aumentano durante la gametogenesi, fenomeno dell’ anticipazione )

La loro identificazione richiede metodiche diagnostiche fini: • PCR (Polymerase chain reaction) • RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) • Sequenziamento

Easy tests : Single gene - common mutations

Difficult tests :

multiple mutations - Private mutations

Easy tests

Disease Gene Mutation Fragile X FMR1 Repeat

FRAXE FMR2 Repeat

Friedreich ataxia FRDA Repeat

Haw River DRPLA Repeat

Huntington type 1 HD Repeat

Kennedy AR Repeat

Myotonic dystrophy type 1 DMPK Repeat

Spinocerebellar ataxia SCA1,2, 3, 6, 7, 8,10, 12,17 Repeat

Alpha 1 antitrypsin PI 2 common mutations

Charcot-Marie-Tooth Type 1A PMP22 1 common mutation

Cystic fibrosis CFTR Common mutations

Deafness GJB2 1 common mutation

Hemochromatosis type1 HFE 2 common mutations

Hereditary neuropathy (HNPP) PMP22 1 common mutation

Sickle cell anemia HBB 1 common mutation

Spinal muscular atrophy SMN1 1 common mutation

Beta thalassemia HBB 1 exon

Direct Detection of Mutations RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

• Alcune mutazioni distruggono un sito di restrizione (ex. Fattore V) Fattore per la coagulazione. La mutazione predispone alle trombosi Questa mutazione rende insensibile e resistente il fattore V verso il proprio antagonista, la proteina C attivata (APC).

Cosa ci aspettiamo?

Direct Detection of Mutations

• Alcune mutazioni distruggono un sito di restrizione (ex. Fattore V) Fattore per la coagulazione. La mutazione predispone alle trombosi

Esone 10

Corea di Huntington: espansione di una tripletta in una sequenza codificante

http://www.youtube.com/watch?v=HMC7c2T8fVk&feature=related

PCR

Mutazioni che interessano la lunghezza del gene PCR

(ex. Corea di Huntington) 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Perche’ ci sono 2 bande?

Difficult tests

Disease Gene Mutation

Breast cancer BRCA1 Private

BRCA2 Private

Colon cancer MLH1 Private

MSH2 Private

MSH6 Private

• BRCA1 : 23 exons, 1863 AA, 6.200 bp22 • BRCA2 : 28 exons, 3418 AA, 10.300 bp • Total : > 17.000 bp sequence

• 1600 mutazioni in BRCA1 • 1800 mutazioni in BRCA2

BRCA testing

Una donna su dieci nel mondo occidentale è candidata ad

ammalarsi di tale malattia entro gli 85 anni di età, con una

mortalità pari al circa 25% delle donne affette

Soltanto il 5% dei tumori della mammella sono ereditari e

solo l'80% di essi possono essere ricondotti a mutazioni a carico di

due geni: BRCA1 e BRCA2

Test genetici specifici per BRCA1 e BRCA2 hanno valore

predittivo. Assegnano un fattore di rischio al portatore della

mutazione.

I test per questi geni si trovano ormai in protocolli internazionali

particolarmente attenti anche agli aspetti di natura etica

The haploid human genome occupies a total of just over 3 billion DNA base pairs

DNA Sequencing

1980-1990 1990-2005 > 2005 Radio - gel Fluorescent - capillary Next generation Thousand bp / day Million bp / day Billion bp / day

DNA SEQUENCING SANGER’S METHOD

http://www.youtube.com/watch?v=UT9wqaVCH5s

DNA SEQUENCING ILLUMINA

http://www.youtube.com/watch?v=77r5p8IBwJk

• A single nucleotide polymorphism (SNP),is a DNA sequence variation occurring when a single nucleotide, in the genome, differs between members of a species

• Variations in the DNA sequences of humans can affect how humans develop diseases and respond to pathogens, chemicals, drugs, vaccines and other agents

Single Nucleotide Polymorphism (SNP)