manual de ictiopatolog

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MANUAL de TÉCNICAS BÁSICAS de

DIAGNÓSTICO PATOLÓGICO en PECES

Versión: Junio 2005

V Curso de Ictiopatología Práctica para Piscicultores

Situación Sanitaria Actual del Cultivo de la Dorada y Lubina

Dr. Francesc Padrós Servicio de Diagnóstico Patológico en Peces Facultad de Veterinaria Universidad Autónoma de Barcelona Carlos Zarza Servicio de Patología de Peces SKRETTING

Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005

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Prólogo El presente manual es una guía básica sobre el diagnóstico patológico de las enfermedades de los peces dirigida a los responsables de salud de las granjas u otras personas interesadas en el tema . Para elaborar el texto, se ha recopilado información procedente de los manuales de los cursos previos y, además, se ha incluido el conocimiento práctico de campo, adquirido por los autores en el día a día en los últimos años, una información que muchas veces no se recoge los libros y que puede resultar muy útil. No se pretende que se sigan todos los protocolos al pie de la letra, sino que cada persona en cada situación concreta adapte paras sí las técnicas que crea conveniente y le resulten más eficaces. El diagnóstico de las enfermedades de los peces puede resultar complicado y enigmático en ocasiones, pero la clave está en el conocimiento y experiencia. Así que a practicar... 19 de junio 2005


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INDICE 1.- Bases Diagnósticas en Patología de Peces ........................................................ 4 1.1.- Conceptos generales ............................................................................................ 4

1.2.- Filosofía del diagnóstico ........................................................................................ 6

1.3.- El proceso de diagnóstico ..................................................................................... 9

1.4.- Fuentes de información ....................................................................................... 12

2.- Epidemiología en Sanidad Piscícola .................................................................. 15 2.1.- ¿Qué entendemos por epidemiología? ............................................................... 15

2.2.- Conceptos básicos de epidemiología .................................................................. 16

2.3.- Patrones de enfermedad ..................................................................................... 16

2.4.- Detección de enfermedad ................................................................................... 17

2.5.- Muestreos ............................................................................................................ 18

2.6.- Investigando las causas de enfermedad ............................................................. 23

3.- Protocolos de Diagnóstico .................................................................................. 24 3.1.- Información básica y situación epidemiológica general ..................................... 24

3.2.- Historia clínica y anamnesis ................................................................................ 24

3.3.- Examen in situ ..................................................................................................... 26

3.4.- Selección y envío de muestras .......................................................................... 33

3.5.- Análisis directo de los peces ............................................................................... 35

3.6.- Pruebas rápidas directas...................................................................................... 41

3.7.- Análisis complementarios..................................................................................... 44

3.8.- Diagnóstico e interpretación de los resultados..................................................... 57

4.- El Diagnóstico en Planta ..................................................................................... 58 4.1.- Niveles de diagnóstico en planta ........................................................................ 58

4.2.-“Telediagnóstico” ................................................................................................. 59 5.- Anexo I: Ejemplo de Historia Clínica ................................................................. 60 6.- Anexo II: Ejemplo de Ficha de identificación de Lesiones .............................. 62


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1.- BASES DIAGNÓSTICAS EN PATOLOGÍA DE PECES 1.1.- CONCEPTOS GENERALES ¿Qué entendemos como diagnóstico patológico en peces? El diagnóstico patológico en peces lo podemos definir como todas aquellas actuaciones que llevamos a cabo con el fin de identificar y si es posible comprender las causas de un determinado problema en una población de peces. Entre las causas de estos problemas podemos tener un abanico amplísimo que incluye desde agentes biológicos (virus, bacterias, parásitos, hongos) a agentes no infecciosos (neoplasias, malformaciones, manejo, agentes físico químicos, alimentación…) que pueden actuar solos o combinados entre sí (lo más habitual) provocando en muchos casos sinergias que son precisamente las causantes de los problemas. El diagnóstico como herramienta de prevención La gestión sanitaria de una explotación acuícola se debe basar fundamentalmente en la prevención de los procesos patológicos. “Prevenir es siempre mejor que curar”. De esta manera no sólo pretendemos evitar las mortalidades sino también, reducir costes en tratamientos (que también son muy limitados), pérdidas de rendimientos productivos (el pez enfermo no come), no aumentar nuestro coste de producción y por último evitar las pérdidas de valor comercial de nuestro producto. La prevención dentro del proceso de producción debe ser parte fundamental de la misma, es decir, una rutina más en el día a día. Junto con las herramientas de diagnóstico, otros elementos básicos que se deberán incluir en un programa de prevención serán las medidas higiénico-sanitarias, estrategias de inmunoprofilaxis mediante vacunación y empleo de inmunoestimulantes adecuadas a cada situación y riesgo, la aplicación correcta de los tratamientos terapéuticos y un manejo óptimo de las condiciones de cultivo y alimentación. Nunca debemos olvidar que cada una de las partes es igual de importante y, por lo tanto, el éxito en el control de las enfermedades en una explotación piscícola radicarás gestionar de forma eficaz todas y cada una de ellas. El diagnóstico entendido como medida de prevención debe realizarse de la forma más rápida y eficaz, antes de la expresión de la enfermedad, pues de su eficacia va a depender el éxito de las medidas de control que vamos a aplicar. Necesidades de diagnóstico: Urgencia / Con Previsión Los procesos de diagnóstico pueden realizarse de dos formas: De urgencia o improviso o con previsión.


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a) De Urgencia: Siempre vienen precedidos por alertas - Uno o varios parámetros zootécnicos se encuentran modificados con respecto a las previsiones teóricas: Aumento del consumo de oxigeno, reducción del índice de conversión, reducción de los crecimientos esperados… - Aumento anormal de la mortalidad - Cambios de comportamiento o de aspecto de los peces.

Resultado: Medidas urgentes y muchas veces precipitadas

b) Con previsión: A raíz de la implantación de un plan de control sanitario. - Detección precoz de problemas como resultado de la realización periódica de controles.

Resultado: Aplicación de medidas de control antes de la expresión de la patología

Evidentemente, la detección precoz de patógenos mediante los controles sanitarios es un mecanismo muy eficaz para identificar el desarrollo de una patología antes de que éste llegue a suponer problemas severos y nos permitirá actuar de una forma rápida y eficaz.

A B

Tiempo de reacción

Nivel de detección

tiempo

mortalidad

Plan de control


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En el ejemplo A, la detección de la patología tiene lugar a partir de que la mortalidad cruza el umbral del nivel de detección de la patología y como consecuencia de necesitar un cierto tiempo de reacción (debido a la logística a utilizar), los niveles de mortalidad pueden ser muy altos. En el ejemplo B, el establecimiento de un muestreo periódico permite detectar la patología antes de que ésta cruce el umbral del nivel de detección y por lo tanto, con un mismo tiempo de reacción, la patología puede ser controlada de forma efectiva, antes de que alcance niveles difícilmente controlables Por ello hemos de tener siempre en mente que el éxito o fracaso de la gestión sanitaria en nuestra instalación dependerá de esta tríada de actuaciones

PREVENCIÓN DETECCIÓN PRECOZ INTERVENCION RÁPIDA Diagnóstico en planta y diagnóstico en laboratorio especializado Si el tiempo de reacción desde que detectamos el problema hasta que se apliquen las medidas de control va a ser más o menos constante, muchas veces la efectividad de estas medidas radicará en detectar la causa del problema lo más rápido posible desde su aparición en la granja. Existen laboratorios especializados en enfermedades de peces donde podemos enviar una muestra para la realización del diagnóstico, pero muchas veces se puede perder un tiempo vital hasta que obtenemos el resultado definitivo. Por ello, siempre es recomendable realizar un primer diagnóstico presuntivo a pie de planta que nos permitirá aplicar unas primeras medidas terapéuticas. Esto es especialmente importante en las enfermedades bacterianas agudas, como la Pasteurelosis, de rápida progresión. El esperar varios días una confirmación puede hacer que los peces reduzcan considerablemente su apetito, con lo que resultará más difícil un tratamiento por vía oral. Siempre será recomendable enviar la muestra al laboratorio para la confirmación del diagnóstico, pero cuanto más podamos hacer en la granja, mejor. Más adelante revisaremos los protocolos de diagnóstico básicos, y gran parte de ellos se pueden realizar de forma sencilla a pie de granja. 1.2.- FILOSOFÍA DEL DIAGNÓSTICO ¿Cómo reconocer e identificar los problemas patológicos? En el proceso de identificación y reconocimiento de los problemas patológicos es importante recordar que: “Hemos de evitar que los árboles nos impidan ver el bosque”


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Es decir, que nunca un resultado de una prueba puede ser considerado un diagnóstico sin antes haber estado evaluado y a ser posible, acompañado por otras pruebas diagnósticas. Es demasiado frecuente encontrar que en el análisis de los problemas patológicos los resultados de los análisis son tomados como valores absolutos, sin tener en cuenta lo que pueden significar. “Nunca hay que confiarse” Por muy clara que veamos la solución a nuestro problema, siempre hay que realizar todo el proceso de diagnóstico, de forma sistemática y completa y hasta el final, sin olvidarnos ninguna prueba. Con la “emoción” del momento, es relativamente sencillo que se nos puedan pasar cosas por alto y confundirnos de diagnóstico. Y por tanto de tratamiento. Por ello recomendamos realizar un acercamiento mucho más cauto y prudente a los problemas. Frecuentemente los problemas patológicos en centros de acuicultura, núcleos zoológicos o en el medio natural suelen ser complejos, multifactoriales y de explicación compleja. Nuestra experiencia indica que es recomendable realizar los acercamientos a estos problemas mediante lo que podríamos decir un doble sistema de “entrada” (ANAMNESIS) y de “ salida” (INTERPRETACIÓN de resultados y DIAGNÓSTICO) Intentamos representar este proceso mediante varios círculos concéntricos que representan el proceso por el cual podemos obtener un diagnóstico final de forma más precisa. Cada uno de los círculos representa los contextos o planos sobre los cuales vamos a tener que analizar y procesar:

A: El contexto informativo general B: El contexto del sistema particular

C: El contexto de la población afectada D: El contexto del individuo / órganos y sistemas

A

B

D C

ENTRADA = ANAMNESIS

SALIDA = ANALISIS Y DIAGNÓSTICO


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Como esto puede sonar a filosofía “barata” y para entendernos, la descripción de este proceso la realizaremos a partir de un supuesto práctico: Supongamos el caso particular de una piscifactoría de engorde de trucha en la que se detectan mortalidades anormales durante el verano. Para adentrarnos en el problema, que debemos hacer?. Ir directamente a mirar peces muertos? NO!! GRAVE ERROR!! Por qué puede ser un grave error? Porque posteriormente la evaluación del problema la realizaremos prácticamente en base a solo lo que hayamos podido encontrar en esos peces. Evidentemente, es fácil que podamos encontrar algo anormal en esos peces e incluso identificar la presencia de agentes extraños en ellos (parásitos, lo más habitual). El problema posiblemente aparecerá cuando queramos atribuir la mortalidad a uno o varios de esos agentes. En este caso, ¿estaríamos haciendo un diagnóstico real o buscando una especie de “chivo expiatorio”? Desgraciadamente aún siguen realizándose diagnósticos erróneos de esta manera, con los graves problemas que esto comporta ya que posiblemente los tratamientos planteados con este diagnóstico equivocado no sean efectivos y a veces incluso contraproducentes. Por ello siempre es preciso abordar los problemas en patología de peces con una mentalidad abierta, sin juicios previos (aunque evidentemente podamos tener sospechas previas) e intentando primero de todo obtener información y analizar cada uno de los “contextos” que hemos indicado antes. A: El contexto informativo general Primero deberemos tener en cuenta lo que sería el contexto informativo general, es decir, es muy importante estar al día y obtener información reciente sobre la epidemiología de las enfermedades que afectan a cada tipo de cultivo, tanto en la zona geográfica concreta, cuenca del río, zona marítima, comunidad, país, etc. Evidentemente esto no lo podemos hacer de forma puntual, sino que entra dentro de lo que consideramos como formación / información continuada. Hay que recordar que “sólo podremos encontrar aquello que conocemos”, en este sentido es MUY importante y recomendable que los técnicos que tengan que realizar funciones de diagnóstico puedan disponer del tiempo y de los medios necesarios para “ponerse al día” de estos temas, sea leyendo libros y artículos especializados, acudiendo a seminarios, congresos, reuniones, a través de foros en internet y sobre todo manteniendo un contacto permanente y fluido con otros técnicos y especialistas en patología de peces. Asimismo es importante conocer datos recientes sobre la situación de los cauces fluviales o zonas marinas (disponibilidad y calidades de agua), situación meteorológica (lluvias torrenciales, vientos, sequía…), etc. Con todos estos datos y sin darnos cuenta nos iremos haciendo a la idea de ese contexto general y podremos tener ya algunas orientaciones sobre determinados parámetros que pueden (o no) modular el desarrollo del problema detectado.


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B: El contexto del sistema en particular El paso siguiente es considerar el contexto del sistema en particular, es decir, el centro de producción. En este paso es preciso conocer (mejor si ya lo conocemos de antemano) datos sobre el tipo de producción, sistema, tecnología aplicada e historial sanitario del centro, con el objetivo de valorar a posteriori los riesgos y puntos críticos que puede presentar esta explotación. C: El contexto de la población afectada Una vez nos hayamos familiarizado con las características del centro, es el momento de pasar al nivel siguiente, el contexto de la población afectada. En este punto es necesario obtener datos sobre qué parte o partes del sistema se encuentran afectados. Es posible que el problema pueda expresarse solamente en unos estanques/ tanques/jaulas determinados, en una especie en particular (si coexisten en el sistema dos o más especies), en un rango de edad específico, en peces de una determinada procedencia, en peces que han sido alimentados o han recibido un manejo especial, etc. D: El contexto particularizado de los peces afectados Una vez tenemos acotada de forma mas precisa cómo se distribuye el problema en el centro, pasamos a la parte final, lo que seria el corazón del problema, que sería el contexto particularizado de los peces afectados. En este punto es preciso obtener el máximo posible de datos para que se puedan analizar posteriormente. Generalmente es lo que conocemos como fase analítica y en la que tendremos que seleccionar las pruebas, lo que conocemos propiamente como TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO que pueden aplicarse en función de parámetros como información aportada, especificidad, sensibilidad, capacidad diagnóstica de los resultados y coste económico. El primer análisis de datos se puede obtener a partir de lo que conocemos habitualmente como historial clínico o ficha del caso. Esta ficha o historial puede ser general o adaptada para cada tipo de instalación. De la misma manera pueden idearse fichas similares para la recopilación de datos sobre los contextos de sistema y de población afectada. Evidentemente, cada técnico podrá confeccionar las suyas a partir de su propia experiencia. Al final de este tema incluimos un ejemplo de lo que podríamos considerar como un historial-tipo y al que se pueden añadir los datos obtenidos de las distintas pruebas diagnósticas realizadas (por ejemplo, tipo “dossier”). 1.3.- EL PROCESO DE DIAGNÓSTICO

Como hemos comentado anteriormente, ahora sólo queda proceder con los protocolos de diagnóstico correspondientes a las técnicas diagnósticas seleccionadas y esperar a conocer los resultados. La descripción pormenorizada de estas técnicas de diagnóstico y de sus protocolos serán tratadas más adelante.


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Con estos resultados habremos obtenido una serie de “inputs” o informaciones y a partir de aquí entramos en la segunda parte, lo que sería la segunda parte del trayecto (hacia “fuera” de la diana virtual que hemos esquematizado al principio de este apartado) Se trata de analizar e interpretar estos datos, valorarlos, razonarlos y ponderarlos. Con ello se deberá llegar al elemento final, EL DIAGNÓSTICO. El diagnóstico es sin duda la parte más difícil de todo este proceso. En la primera parte pueden seguirse unas guías más o menos completas. Sin embargo, en el diagnóstico, la utilización de guías o cuadros es mucho más compleja y depende en buena manera de la habilidad y experiencia del técnico encargado de emitir este diagnóstico. Además, es probable que no se dispongan de elementos de juicio suficientes para emitir un diagnóstico suficientemente claro. Nuestra experiencia demuestra que uno de los aspectos que pueden mejorar las habilidades diagnósticas es mejorar el conocimiento de la epidemiología aplicada a la ictiopatología. Por ello hemos incluido un apartado específico sobre Epidemiología en este bloque con el objetivo de intentar llenar algunas lagunas sobre determinados conceptos epidemiológicos y su tratamiento, que creemos son importantes a la hora de recoger y valorar la información así como en la realización de un diagnóstico. Evidentemente también es muy importante tener una base lo más amplia posible sobre conocimientos de patología de peces. Estos conocimientos los podemos adquirir a través de varios canales: Cursos, libros, revistas, internet. Los veremos en el apartado final de este capítulo. Identificación de los trastornos de salud vs diagnóstico del problema Hemos comentado antes que muchas veces las patologías en las explotaciones acuícolas son procesos multifactoriales y complejos y no siempre es fácil llegar a un diagnóstico definitivo. Siempre se requerirá esfuerzo, tiempo y práctica para dominar todas las técnicas que requiere el “arte” del diagnóstico. Desde nuestro punto de vista, no es tan importante el “qué es”, sino reconocer si lo que vemos es “normal” o no. Al piscicultor, que está cada día trabajando con los peces, le puede costar diagnosticar una enfermedad, pero no reconocer si sus animales están enfermos o no, y qué pasos debe dar para a partir de ese momento para llegar al diagnóstico final. Esa identificación de los transtornos de salud, será clave en el diagnóstico rápido. Y por ello determinante en el proceso de prevención. Una vez detectado el problema, podrá él mismo aplicar las técnicas correspondientes o enviar una muestra a un laboratorio especializado. Esa “reacción rápida” es lo fundamental. Más delante repasaremos cómo podemos reconocer la presencia de enfermedad en los peces. El concepto de “mortalidad natural” Es frecuente que en conversaciones entre colegas salga el término de “mortalidad natural”, en referencia a aquellas mortalidades que se asumen como “normales” en una determinada explotación.


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Nuestra opinión es que se trata de un término utilizado incorrectamente ya que si bien en todas las poblaciones existen unas ciertas mortalidades en cada uno de los rangos de edad, estas mortalidades dependen totalmente de cada una de las circunstancias de cada población. Para poner un ejemplo, si comparamos la mortalidad neonatal humana entre la existente en países desarrollados y la que existe en países del tercer mundo veremos que puede existir un abismo en cuanto al porcentaje sobre nacimientos. ¿Podríamos denominar a esta mortalidad como “natural” cuando en uno y otro lugar son bien claras las causas de esta mortalidad? ¿O más bien hemos de hablar de “tasa” de mortalidad de referencia para cada país?. De una forma parecida, cada una de las explotaciones tiene unas tasas de mortalidad “basales” que dependerán siempre de las circunstancias propias de la empresa y de su capacidad de gestión. Si las asumimos como “naturales” podemos caer en el error de pensar que son invariables y no mejorables. Con esta información, ¿podría ser cero la mortalidad natural en una piscifactoría? Las infecciones latentes y las dificultades de diagnóstico Por desgracia para nosotros y a pesar de lo que podamos pensar, el sector de la sanidad en piscicultura supone solamente una infinitésima parte (en términos de inversión, personas trabajando, instalaciones disponibles, información generada, etc.) de lo que representa la sanidad en otros sectores, como la producción bovina, de cerdos, de aves, y no digamos la sanidad en animales domésticos (y no hablemos de la humana) Por ello, el trabajo en patología de peces supone muchas veces una lucha constante entre el desaliento que produce esa sensación de “desconocimiento” sobre muchos aspectos de la patología de los peces y el estímulo que ofrece un campo de estudio tan abierto. A pesar de lo que podemos aportar en este curso y en el trabajo diario, son muchos los aspectos que desconocemos sobre etiología, patogenia, epidemiología, prevención y tratamiento de las enfermedades de peces. Rara vez disponemos de “enciclopedias de todo el saber” o “recetas mágicas” donde podamos tener métodos operativos precisos con resultados garantizados. Uno de estos problemas derivados de esta falta de conocimientos son las infecciones latentes. Como infección latente o “encubierta”, en un sentido laxo, podemos incluir a aquellas infecciones por organismos biológicos cuyo nivel de presencia es difícilmente detectable por la técnicas de diagnóstico empleadas. Por ello, de nuevo hay que reafirmar en que un diagnóstico nunca debe basarse en el resultado de una única prueba diagnóstica sino en el razonamiento de todos aquellos datos disponibles sobre el contexto total que rodea a un grupo de peces. Un ejemplo claro está en la detección de Photobacterium damselae ssp piscicida. Si bien el diagnóstico sobre casos clínicos reales es “relativamente” fácil mediante las técnicas habituales (cultivo), la detección de animales portadores en infecciones latentes, subclínicas o “encubiertas” es muy difícil y en muchos casos sólo las técnicas más sensibles (moleculares o inmunológicas) son capaces de detectarlas (aunque con problemas de especificidad y sensibilidad debido a lo “fino” de la propia metodología).


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En muchos de estos casos se ha demostrado que únicamente un test de estrés previo podrá identificar positivamente la existencia de infecciones latentes en poblaciones de doradas o lubinas. 1.4.- FUENTES DE INFORMACIÓN En este apartado recopilamos libros y revistas científicas especializadas en patología de peces y acuicultura, así como enlaces de internet que consideramos pueden resultar de interés para el conocimiento de este tema tan amplio. LIBROS Manual on Hatchery Production of Sea bass and Gilthead Sea bream. FAO, 1999 Aquaculture for veterinarians: Fish husbandry and medicine. Editor Lydia Brown. Pergamon Press 1993. (También en castellano: Editorial Acribia) Fish Disease. Diagnosis and Treatment. Noga, E.J. Iowa State University Press / Ames. 2000 Fish Medicine. Stoskopf, Michael K. W.B. Saunders Company cop. 1993 Manual on Hatchery Production of Sea bass and Gilthead Sea bream. FAO, 1999 Fish Pathology. editor Ronald J. Roberts. Churchill Livingstone. 2001 Fish Diseases and Disorders: Volumes 1, 2& 3. CABI Publishing. 1995, 1998, 1999 What should I do. A practical guide for the marine fish farmer . Bruno D.W., Alderman, D.J. and Scholtfeldt H.J. European Association of Fish Pathologists. (En inglés y castellano). Bacteria from Fish and Other Aquatic Animals: A Practical Identification Manual. Buller, N.B. CABI Publishing. 2004 Systemic Pathology of Fish. Ferguson, Hugh W. Ames, Iowa Iowa State University Press 1989 Applied Fish Pharmacology. Treves-Brown, K.M. Springer, 2000 Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals 2nd ed. Lindsay G. Ross and Barbara Ross, Blackwell Science, 1999. International Aquatic Animal Health Code. O.I.E. 2004 Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases. O.I E. 2003 Applied Veterinary Epidemiology and the Control of Disease in Populations. Toma, B. et al. Maisons-Alfort AEEMA. 1999.


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REVISTAS CIENTÍFICAS Aquaculture http://www.elsevier.com/wps/find/journaldescription.cws_home/503302/description Aquaculture International http://www.ingentaconnect.com/content/klu/aqui Bulletin of the European Association of Fish Pathologists http://www.eafp.org/bulletin.html Diseases of Aquatic Organisms http://www.int-res.com/journals/dao/ Fish & Shellfish Immunology http://www.elsevier.com/wps/find/journaldescription.cws_home/622832/description Journal of Aquatic Animal Health http://afs.allenpress.com/afsonline/?request=index-html Journal of Fish Biology http://www.blackwell-synergy.com/loi/jfb Journal of Fish Diseases http://www.blackwell-synergy.com/servlet/useragent?func=showIssues&code=jfd ENLACES DE INTERNET Agencia Española del Medicamento http://www.agemed.es/ Agencia Europea de Evaluación de Medicamentos http://www.emea.eu.int/ Departamento de pesca de la FAO http://www.fao.org/fi/default.asp Diccionario de Bacteriología Veterinaria http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/garde.html Taxonomía Bacteriana http://www.bacterio.cict.fr/index.html Revista AquaTIC http://www.revistaaquatic.com/ Observatorio Español de Acuicultura http://www.observatorio-acuicultura.org/ Portal de la Piscicultura en España http://www.mispeces.com/


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Federación Europea de Productores Acuícolas http://www.feap.info/feap/ European Aquaculture Society http://www.easonline.org/ Asociación Europea de Patólogos de Peces http://www.eafp.org/ Organización Internacional de Epizootias http://www.oie.int/aac/eng/en_fdc.htm AquaFeed http://www.aquafeed.com/ Aqua-Flow http://www.aquaflow.org/ IntraFish http://www.intrafish.com/ UF / IFAS http://edis.ifas.ufl.edu/ Bases de datos de peces http://www.fishbase.org/search.cfm Instituto Nacional de Meteorología http://www.inm.es/ Buscadores científicos http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Buscadores generales http://www.google.com/ http://www.yahoo.com/


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2.- EPIDEMIOLOGÍA EN SANIDAD PISCÍCOLA 2.1.- ¿QUÉ ENTENDEMOS POR EPIDEMIOLOGIA? La epidemiología es el estudio del estado de salud de las poblaciones o, más concretamente, el estudio de la enfermedad y de los factores que determinan su presentación y frecuencia en una población. Su objetivo final va a ser la prevención de la enfermedad y su control en caso de que ésta aparezca. En el caso de una enfermedad infecciosa o transmisible, existe una interacción entre el agente, la población y el ambiente donde vive esa población, que determinará las características epidemiológicas de esa enfermedad. Es lo que se conoce como teoría multifactorial de causa.

Las bacterias o parásitos viven en equilibrio con sus huéspedes, los peces, y, en situaciones normales, no va a existir enfermedad. En la piscicultura intensiva, los factores estresantes son los que frecuentemente van a desplazar la balanza en favor de los agentes infecciosos y desencadenarán las enfermedades. Muchos de los problemas patológicos que nos vamos a encontrar en las instalaciones piscícolas van a ser resultado de diferentes interacciones entre estos factores determinantes. Existen diferentes aproximaciones a las investigaciones epidemiológicas que, tradicionalmente, se han denominado “tipos” de epidemiología. Estos tipos son epidemiología descriptiva, analítica, experimental, operacional, teórica... Sea cual sea el tipo de epidemiología que apliquemos, el hecho de trabajar con poblaciones implica necesariamente que los resultados obtenidos deben ser expresados numéricamente. De ello deriva la importancia de la cuantificación en epidemiología.

POBLACIÓN AGENTE

AMBIENTE

•Raza•Sexo•Edad

•Resistencia•Tropismo

•Manejo•Climatología

•Vectores


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2.2.- CONCEPTOS BÁSICOS EN EPIDEMIOLOGÍA Proporción y ratio Existen algunos valores básicos comúnmente utilizados en epidemiología y que por su interés deben ser conocidos. Se trata de dos fracciones o medidas relativas: la PROPORCION y la RATIO. En la proporción (o tasa), el numerador forma parte del denominador y en la ratio (o razón) el denominador no incluye el numerador. Si a y b son dos poblaciones distintas, la PROPORCIÓN viene definida por la razón: a/ (a+b), mientras que la RATIO viene definida por la razón a/b. Ejemplo. Supongamos una población de 8 tiburones de puntas negras (por que no?) en un acuario de exhibición, en los cuales tenemos 3 machos y 5 hembras, la PROPORCION de hembras en el conjunto será 5/(3+5)= 5/8= 0.625 o 62.5%. En cambio, la RATIO de hembras respecto a los machos será de 5/3= 1.6 (la ratio no se expresa en %) Descriptores de medida de enfermedad: Prevalencia e incidencia Con frecuencia prevalencia e incidencia se utilizan como sinónimos y de forma incorrecta. Sin embargo, cada uno expresa una condición distinta: PREVALENCIA indica el número de casos de una determinada enfermedad en una determinada población de riesgo durante un periodo de tiempo (puntual o intervalo). Es una medida “estática” que nos indica la probabilidad que tiene un determinado animal de esa población de estar infectado. Por el contrario, INCIDENCIA indica el número de nuevos casos de una determinada enfermedad en una determinada población durante un determinado intervalo de tiempo. Es una medida “dinámica” de la velocidad a la que nuevos animales van enfermando. Existen también otros muchos descriptores de enfermedad, tales como, morbilidad, mortalidad, tasa de ataque, tasa de mortalidad, tasa de mortalidad específica, tasa de letalidad, etc. Las definiciones de todas ellas las podemos encontrar en la bibliografía recomendada. 2.3.- PATRONES DE ENFERMEDAD Según el tipo de presentación de una enfermedad en una población con relación al tiempo, se puede establecer la siguiente clasificación: - Endemia (o enzootía): presencia de una enfermedad a niveles constantes a lo largo del tiempo (incidencia más o menos estable), o presentación habitual de la misma en una población. No se refiere a la cantidad de individuos afectados, si no a la constancia en la proporción de individuos. - Epidemia (o epizootía): presencia de una enfermedad por encima de su nivel normal o endémico (aumento importante de la incidencia), o partiendo de un nivel nulo de enfermedad. - Las pandemias (o panzootías) son epidemias a gran escala que afectan a una zona muy amplia (diferentes países)


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- Presentación esporádica: aparición irregular y casual de una enfermedad (incidencia baja) 2.4.- DETECCIÓN DE ENFERMEDAD Los métodos de diagnóstico de las enfermedades no son siempre perfectos (o más bien dicho, prácticamente no existen métodos perfectos), por eso a veces se pueden cometer errores. Cabe la posibilidad de que la prueba clasifique como positivo a un animal sano (falso positivo), o que lo clasifique como negativo cuando realmente está enfermo (falso negativo). Estos errores se pueden cuantificar comparando los métodos de diagnóstico disponibles con la situación verdadera (revelada con un test de referencia o “golden standard”)

Enfermedad Positivo Negativo

Positivo Verdaderos positivos VP

Falsos positivos FP Prueba

Negativo Falsos negativos FN

Verdaderos negativos VN

La “eficacia” de nuestro test se puede expresar mediante las siguientes medidas: Sensibilidad: la proporción de verdaderos positivos que detecta el test

respecto al total de enfermos

Se = VP / (VP+FN) Especificidad: la proporción de verdaderos negativos que detecta el test

respcto al total de sanos

Ep = VN / (VN+FP) Valor predictivo de los positivos: la probabilidad de que un individuo diagnosticado

como positivo realmente lo sea o la proporción de verdaderos positivos respecto al total de positivos que detecta el test

VP+ = VP / (VP+FP)

Valor predictivo de los negativos: la probabilidad de que un individuo diagnosticado

como negativo realmente lo sea o la proporción de verdaderos negativos respecto al total de negativos que detecta el test VP- = VN / (VN+FN)


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2.5.- MUESTREOS A diferencia de otras especies, en ictiopatología muchas veces nos tenemos que enfrentar con el estudio de grandes poblaciones de peces. El estudio de poblaciones reducidas, en las que podemos tomar datos de todos y cada uno de los componentes, es muchas veces un lujo y sólo se produce en algunos casos en la clínica de especies ornamentales o en los acuarios de exhibición en especies de alto valor biológico o económico. Por ello muchas veces debemos seleccionar una parte reducida de esa población para analizarla. Es lo que habitualmente denominamos como muestra. Cuando realizamos un estudio a partir de una muestra, los valores obtenidos son una estimación de lo que realmente sucede en la población. Sin embargo, después de obtener estos datos nos puede surgir una pregunta: ¿los resultados obtenidos a partir de esta muestra pueden ser extrapolados la población general? O, en otras palabras, ¿serán el reflejo de lo que pasa en esta población? Si la respuesta es no, habremos hecho un trabajo en vano, por lo cual es importante seleccionar previamente una muestra adecuada. ¿Cuáles son las propiedades que ha de tener una muestra? La estimación obtenida a partir de la muestra ha de ser exacta y precisa. La exactitud nos da una idea de cuanto se acerca nuestra estimación a los valores reales en la población. Para que esta estimación sea lo más exacta posible, la muestra ha de ser representativa de la población. Esto lo conseguiremos mediante la selección aleatoria. El muestreo aleatorio nos asegura que cada individuo de la población a estudiar tiene las mismas posibilidades de ser seleccionado. Ejemplo: Hacer estudios de prevalencia de enfermedades diagnosticadas en nuestro Servicio de Diagnóstico no sería correcto, pues las muestras que nos remiten no son representativas de la población general, ya que la mayoría provienen de peces sintomáticos que no se han recogido de forma aleatoria. La precisión nos da una idea de la dispersión obtenida en nuestra estimación respecto al verdadero valor en la población. Esta precisión viene determinada por el tamaño de la muestra de tal manera que, aumentando el numero de individuos muestreados aumentaremos también el nivel de precisión, y al revés. ¿Cómo seleccionamos la muestra? Básicamente existen dos métodos principales para realizar un muestreo: 1. - No probabilístico, intencionado o dirigido: la selección de la muestra se realiza por “conveniencia” del investigador 2. - Probabilístico: la selección se realiza mediante un proceso aleatorio o al azar. MUESTREOS NO PROBABILÍSTICOS Aquí, el encargado de seleccionar las muestras las recoge en función de unos determinados parámetros que esta persona considera importantes. En este caso se


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pierde representatividad en el muestreo pero se gana tiempo en el procesado de las muestras ya que normalmente el número de muestras a recoger es menor. En algunos casos este tipo de muestreo intencionado es muy adecuado, como el que se realiza normalmente para la detección de una enfermedad, por ejemplo, en caso de sospechar de un brote de Vibriosis en lubina. El técnico evidentemente recogerá peces sintomáticos (peces con hemorragias en piel y órganos internos) El resultado de ese estudio posiblemente pueda confirmar la presencia de Listonella anguillarum y por lo tanto del brote de Vibriosis, aunque no va a permitir determinar qué cantidad de población se encuentra afectada. Seguramente si calculáramos la prevalencia a partir de estas muestras tendríamos una sobrestimación de la misma. Aunque parezca extraño, no es aconsejable en estos casos seleccionar peces que presenten una sintomatología muy acusada o avanzada. Frecuentemente esos peces presentan problemas secundarios (infecciones por bacterias oportunistas como alguna Pseudomonas, Aeromonas o algunas vibrionáceas, dependiendo del medio) que nos podrán dificultar mucho el diagnóstico. MUESTREOS PROBABILÍSTICOS a) Muestreo aleatorio simple Las muestras se seleccionan al azar de una población, cada miembro de la cual tiene las mismas posibilidades de ser elegido. Es imprescindible tener una lista de todos los individuos de la población, lo que se conoce como marco del muestreo. Este método lo aplicaríamos en el caso de considerar que toda la población sea homogénea o uniforme. Ejemplo: Tenemos en una explotación mayorista de peces ornamentales un stock de neones repartidos en doce tanques a los que queremos chequear de una determinada enfermedad (por ejemplo, presencia del microsporidio Pleistophora). Cada tanque esta numerado del uno al doce y el modelo de muestreo nos dice que es necesario chequear cuatro de los doce tanques. Lo que podemos hacer para seleccionar estos tanques es utilizar tablas de números aleatorios o bien aplicar la función matemática “random” existente en muchos programas informáticos. Lo mismo se puede aplicar a peces, asignando un número a cada uno (aunque esto lo reservaríamos tal vez para el caso de tener peces de alto valor, como en el caso de reproductores o peces de exhibición. b) Muestreo aleatorio sistemático Cuando no disponemos del marco del muestreo, se puede aplicar un método sistemático, que más o menos viene a ser seleccionar animales mediante un determinado orden preestablecido, aunque iniciado al azar. Por ejemplo, podemos recoger peces a intervalos determinados (lubinas) durante todo el proceso de clasificación de una jaula. Sin embargo, cuando se utiliza este método es muy importante que se muestree durante todo el proceso. Si se recogen peces sólo en la primer parte del muestreo corremos el riesgo de que la muestra contemple los primeros peces recogidos y que siempre suelen ser los que se dejan coger mas fácilmente (peces enfermos).


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c) Muestreo aleatorio estratificado En este caso realizamos un muestro aleatorio dentro de unos estratos de la población que se han definido previamente. Un estrato sería un subgrupo dentro de la población más homogéneo respecto a unas características concretas, como la edad, origen, peso…. Existen también otros modelos más complicados, aunque a efectos prácticos sólo se requieren en el caso de estudios epidemiológicos determinados. ¿Qué tamaño de muestra necesitamos? La respuesta a esta pregunta es compleja, pues cada tipo de estudio epidemiológico tiene unas necesidades tamaño de muestra específicas derivadas de los cálculos estadísticos a aplicar. También depende de criterios específicos en cada caso, como la prevalencia esperada, nivel de confianza del test, población de muestreo, etc. Existe un software informático específico que podemos utilizar para realizar el cálculo del tamaño de la muestra, como el STATCALC o WINEPISCOPE. Podemos expresar algunos casos prácticos sencillos, pero muy frecuentes, en los que se puede obtener un número de muestra concreto. a) Confirmaciones rutinarias de enfermedad El primer caso es el de confirmaciones de “rutina” de existencia de una determinada enfermedad en una explotación ante unos determinados problemas. ¿Cuántas muestras hemos de recoger? En general, consideraremos que es razonable seleccionar un número mínimo de:

Peces mayores de 100-150 gramos 5 ejemplares Juveniles (5-150 gramos) 10 ejemplares Alevines y larvas (<5 gramos) 20 ejemplares

Considerando siempre que se recogen peces que se consideran enfermos o representativos del problema que estamos observando (muestreo dirigido). Con este número de ejemplares y utilizando las técnicas diagnósticas adecuadas en la mayor parte de los casos se llega a comprobar la enfermedad. b) Detección de la presencia de enfermedad en una población Este es el supuesto de un estudio de control sanitario en el que consideramos una población de peces en la que queremos comprobar la presencia / ausencia de una determinada enfermedad. En este caso, el tamaño de muestra va a depender de: a) El tamaño de población b) Prevalencia supuesta de la enfermedad c) Nivel confianza del test


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En este caso, suponiendo que la técnica diagnóstica tiene una sensibilidad total, nos aseguramos que recogiendo ese número de muestras y con un nivel n de confianza determinado detectaremos al menos un pez enfermo, en el caso de que exista enfermedad. Para calcular al tamaño de la muestra podemos utilizar una complicada fórmula o, más fácilmente, utilizar las tablas apropiadas. A continuación resumimos una de ellas, con un nivel de confianza del 95% (uno de los más razonables).

Tamaño de la población P 100 500 1000 5000 10000 25000 50000 100000 500000 1.106 0.1% --- --- 950 2253 2587 2822 2906 2950 2985 2990 0.5% --- 349 450 563 580 591 595 596 597 598 1% 95 224 258 289 294 295 296 296 296 296

10% 25 28 28 28 28 28 28 28 30 30 Como comprobamos en la tabla, a medida que la población a examinar se hace mayor, el número de peces a muestrear se reduce proporcionalmente. Evidentemente, a menor prevalencia supuesta de la enfermedad, mayor esfuerzo de muestreo se deberá realizar. c) Medida de la prevalencia de una enfermedad en una población En el caso de que queramos determinar la prevalencia de una enfermedad en una población el tamaño de la muestra va a depender de: a) El tamaño de población b) Prevalencia esperada de enfermedad c) La precisión o error d) Nivel confianza del test También podemos aplicar la fórmula adecuada o una serie de tablas que nos van a relacionar el tamaño de la muestra a elegir, con la precisión deseada y la prevalencia esperada. Si desconocemos este último valor, se asumirá una prevalencia del 50% y escogeremos el mayor tamaño de muestra. Así, para un tamaño grande de población y con un nivel de confianza del 95%:

Precisión absoluta deseada Prevalencia esperada 10% 5% 1% 10% 35 138 3457 20% 61 246 6147 30% 81 323 8067 40% 92 369 9220 50% 96 384 9604 60% 92 369 9220 70% 81 323 8067 80% 51 246 6147 90% 35 138 3457


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Si nuestra población total de animales es pequeña, aplicaremos la siguiente fórmula una vez obtenido el tamaño de la muestra requerido a partir de las tablas: 1/n=1/nt+1/N donde n: tamaño de la muestra

nt: numero obtenido en la tabla N: tamaño de la población

Errores en la toma de muestras En un estudio epidemiológico podemos encontrar dos tipos de errores, errores aleatorios o errores sistemáticos (sesgos). La suma de ambos nos da el error total producido en el estudio. Ambos tipos se pueden producir en las diferentes fases del estudio, al muestrear, al observar o medir los datos y al procesarlos. En el muestreo podemos provocar un error aleatorio al escoger un tamaño de muestra inadecuado (imprecisión); o un error sistemático o sesgo al no utilizar la selección aleatoria de las muestras (no representatividad). En nuestros estudios epidemiológicos será muy importante no sesgar las muestras mediante malas prácticas de muestreo. Aquí exponemos algunos ejemplos de los sesgos más frecuentes en la toma de muestras: 1. Recoger peces mediante salabre si antes no se han concentrado: - Los peces no son tontos y huyen cuando ven el salabre. Si vamos recolectando

peces de esta manera es muy probable que estemos seleccionando peces con problemas en la natación, peces enfermos, peces deformes, peces con problemas en la visión, etc

- Si utilizamos un salabre de malla ancha podemos estar seleccionado solo los peces grandes.

2. Recoger peces sólo del fondo, de superficie, cerca de la entrada de agua o cerca

del sumidero: Seguro que recogemos peces enfermos o con problemas. En ambos casos la muestra no será representativa de la población total. Para evitar estos errores (por otra parte MUY frecuentes) recomendamos agrupar los peces antes de tomar la muestra. En tanques es posible hacerlo mediante redes. Es muy importante que esta operación se haga de forma correcta, impidiendo que se escapen peces. Una vez esta concentrada TODA la población a muestrear (y los peces están bien concentrados) coger un salabre mas pequeño y recoger una submuestra “generosa” en número. Hay que ir con cuidado que al concentrar los peces no se estratifiquen por pesos. De estas submuestra la volvemos a concentrar y cogemos al azar el número de ejemplares necesarios. Evidentemente estas son las recomendaciones teóricas, pero es muy importante indicar que en muchos casos las operaciones de concentración de los peces y toma de muestras aleatoria tienen una logística muy complicada (sobre todo en tanques grandes, estanques de grandes dimensiones y en especial en jaulas en mar abierto), lo que muchas veces dificulta o impide la realización de muestreos en condiciones.


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2.6. INVESTIGANDO LAS CAUSAS DE ENFERMEDAD Podemos determinar la existencia de relaciones entre la presencia de un problema o patología y la presencia o ausencia de determinados factores?. Efectivamente, existen una serie de estudios analíticos que nos pueden indicar si hay relación entre un determinado factor y el desarrollo de una determinada enfermedad. Generalmente estas relaciones se establecen a través de una serie de estudios estadísticos realizados a partir de modelos de estudio predeterminados. Existen dos tipos de estudios analíticos, los estudios observacionales y los estudios experimentales. En los estudios observacionales sólo se “observa” y no existe intervención del experimentador. Los grupos se distribuyen a posteriori y no de forma aleatoria. Existen tres tipos: transversales, casos-controles y de cohortes. En los estudios experimentales existe una distribución a priori y de forma aleatoria por parte del experimentador. Existen tres tipos: ensayos clínicos, pruebas de campo y ensayo comunitario de intervención. No es objetivo de este curso el explicar para que sirven, como se estructuran y como se realizan. Para ello es aconsejable consultar con un especialista en epidemiología o bien consultar las obras y referencias citadas en la bibliografía.


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3.- PROTOCOLOS GENERALES DE DIAGNÓSTICO De forma teórica, en el proceso de diagnóstico se pueden definir diferentes niveles de actuación aunque, en la práctica, muchas veces se realizará de forma conjunta.

Niveles de actuación

1 Información básica y situación epidemiológica general 2 Historia clínica y anamnesis 3 Examen "in situ" 4 Selección y envío de muestras 5 Análisis directo de los peces 6 Pruebas “rápidas” directas 7 Análisis complementarios 8 Diagnóstico e interpretación de los resultados 3.1.- INFORMACIÓN BÁSICA Y SITUACIÓN EPIDEMIÓLOGICA GENERAL Como comentamos al principio del manual en el apartado del contexto informativo general, “sólo reconocemos aquello que conocemos”. Por ello es fundamental adquirir una serie de conocimientos básicos si nos vamos a enfrentar con un problema patológico en una explotación acuícola. Esta información y formación continuada deberá ser tanto sobre enfermedades de peces en particular, como de los sistemas de cultivo en general. Sin olvidarnos de la biología, nutrición y alimentación, hidrología, etc.. ¡ Hay que estar siempre muy al día ! ¿Fuentes de información? Como ya comentamos antes, cursos, congresos, libros, revistas e internet (imprescindible en los tiempos que corren) 3.2.- ANAMNESIS E HISTORIA CLÍNICA El primer paso a dar cuando nos enfrentamos ante el problema, es recopilar la mayor cantidad de información posible sobre el mismo y registrarla en una ficha o historial clínico para su posterior análisis. Nuestra experiencia nos dice que, la mayoría de veces, esos datos serán imprescindibles para llegar a la causa final del problema. Al final del manual incluimos un modelo de ficha clínica. A la hora de obtener la información necesaria es fundamental la aportación del personal que está cada día en contacto con los animales: Piscicultor, alimentador, buzo o cuidador. Ellos, que saben cual el estado “normal” de los peces, pues los observan cada día, saben cómo se comportan y como se alimentan. Cualquier desviación de esa normalidad nos debe ser notificada inmediatamente.


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La formación y educación en salud del personal de la granja es fundamental dentro del programa rutinario de gestión sanitaria. Haciendo una comparación con un las filas de un ejército, ellos son la “vanguardia”, la primera línea del frente. Normalmente serán los primeros en detectar que existe un problema. Aquí mostramos un ejemplo de una lista de preguntas a realizar durante nuestra anamnesis: Sobre la instalación y el problema observado: - Características del sistema de cultivo: Jaulas, esteros. - Localización geográfica. - Situación dentro de la granja de las unidades afectadas - Historiales de enfermedades previas - Especies afectadas: Si tenemos más de una en nuestra instalación - Rango de tallas afectadas: Tamaño, edad - Alimentación: Tipo y pautas - Problema específico que se ha observado: Mortalidad, mal crecimiento, anorexia - Desde cuándo se observa ese problema - Día donde ha comenzado el problema: “Síndrome del fin de semana” - Condiciones ambientales y climatología previa al problema. - Historial previo de situación de estrés: Movimientos, clasificaciones - Tratamientos terapéuticos y vacunaciones administradas - Temperatura: Niveles de riesgo, variaciones bruscas - Evolución en el tiempo de la mortalidad: Aguda, crónica, intermitente. Sobre los peces: - Respuesta a estímulos: Alimentación, captura - Distribución de los peces en el agua: Aislados, en grupo, en superficie - Alteraciones de la natación: Ataxia, errática, en círculos, “rascado” - Alteraciones de la actividad respiratoria: Rápida, lenta - Alteraciones en el aspecto externo - Se observa alguna lesión interna Y finalmente: ¿Alguna sospecha por parte los cuidadores de los animales? Parece una lista demasiado amplia, pero hay que insistir y no debemos preocuparnos por “bombardear” a preguntas para obtener los datos que creamos necesarios para realizar nuestro diagnóstico. Aunque nosotros realizaremos nuestras técnicas de una forma ordenada, sistemática y completa, es fundamental que antes de empezar a examinar los peces tengamos una idea en mente del problema al que nos enfrentamos.


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3.3.- EXAMEN IN SITU Cuando sea posible, siempre es recomendable examinar a los peces directamente en el medio donde se encuentren. Es este capítulo veremos cómo vamos a manipular los peces para su posterior análisis, según si los podemos sacrificar o no y cómo vamos a identificar los trastornos de salud mediante nuestra anamnesis previa y la observación clínica de los peces en el agua Manipulación de los animales La manipulación que realizaremos sobre los peces es distinta según si:

a) El pez va a ser sacrificado. b) El pez no va a ser sacrificado.

MANIPULACIÓN CON SACRIFICIO Si el pez va a ser o puede ser sacrificado para su análisis, entonces hay que proceder lo antes posible al sacrificio del mismo. El sacrificio de los animales puede realizarse de diversas formas: - Mediante una sobredosis de anestésico: Pueden utilizarse los mismos anestésicos

que indicamos en el apartado siguiente, en dosis altas de sacrificio. En algunos casos (sobre todo si no se conoce bien este procedimiento) se deben aplicar a continuación otros métodos para asegurar la muerte clínica del pez y evitar que el pez despierte en el caso que hayamos utilizado una dosis o un tiempo incorrecto.

- Mediante decapitación, seccionando la médula espinal a la salida del cráneo. Esta operación puede realizarse mediante un instrumento afilado, como un cuchillo, bisturí, tijeras… En estos casos es aconsejable sedar primero los peces con una dosis baja de anestésico.

- Mediante concusión: golpeando la base del cráneo mediante un golpe seco contra una superficie roma y dura (canto de una mesa, madera…)

- Por frío: inmersionando los peces en agua cercana a 0ºC. Cada uno de estos métodos presenta una serie de ventajas en inconvenientes: En el caso de la sobredosis de anestésico: Es el método recomendado para asegurar un sacrificio ajustado a los cánones de ética en el manejo animal. Los animales mueren sin sufrimiento en un plazo de tiempo razonablemente corto. También se evitan algunas alteraciones debidas al manejo (hemorragias). Como inconvenientes tiene el precio del anestésico (poco significativo si se usan productos asequibles como el fenoxietanol o el aceite de clavo) y que algunos parásitos se pueden llegar a desprender durante el proceso de la anestesia y pueden llegar a ser pasados por alto. En los casos de concusión y decapitación: Son un método rápido y económico si se efectúan con rapidez y eficacia, aunque son menos recomendables desde el punto de vista del bienestar animal, especialmente en el caso de que no ser suficientemente diestro. Combinados con anestesia suelen ser más indicados. Estas técnicas producen artefactos en las muestras para histopatología (telangiectasias debido a la dilatación de vasos debida a la sobrepresión sanguínea ejercida durante la operación de sacrificio.


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El sacrificio por frío (añadiendo hielo al agua o refrigerando ésta) es el método utilizado habitualmente en explotaciones comerciales ya que permite sacrificar gran cantidad de peces en poco tiempo, disminuyendo relativamente el estrés y permitiendo bajar rápidamente la temperatura del pescado para asegurar la calidad nutricional y sanitaria de los mismos. Este método se basa en que al ser los peces organismos poiquilotermos, al disminuir la temperatura ambiente también disminuye su metabolismo. También existen otros sistemas menos utilizados como el sacrificio con dióxido de carbono (añadiendo bicarbonato) o mediante electrocución, métodos más cruentos aunque en algunos casos también son prácticos Una vez hayamos comprobado la muerte de los animales podremos empezar con el resto de protocolos de diagnóstico. MANIPULACION SIN SACRIFICIO Cuando debamos obtener muestras de animales que no van a ser sacrificados hemos de considerar que su manejo debe de ser especialmente cuidadoso, más aún es especies clásicamente sensibles como la mayoría de los peces ornamentales marinos y algunas especies comerciales como las lubinas. A continuación indicamos algunas de las medidas que hemos de tomar: - Sedación y/o anestesia:

Para asegurar una buena manipulación de los animales es muy importante tranquilizarlos o anestesiarlos previamente. Con ello evitaremos la producción de lesiones al manejarlos (recordemos que son extremadamente resbaladizos), podremos obtener más fácilmente muestras de sangre o biopsias y evitaremos en parte la generación de respuesta de estrés debida al manejo y que puede comprometer seriamente su recuperación posterior. Más adelante explicamos de forma resumida qué anestésicos podemos utilizar.

- Manejo: Para manejar los animales hemos de tener en cuenta que su piel es mucho más sensible que la de los mamíferos debido a la presencia de moco, la delgadez de la epidermis y la falta de queratina. Por ello, durante la manipulación de los peces los peores enemigos son: las abrasiones de la piel, la pérdida de moco y la deshidratación. - Para evitar las abrasiones es aconsejable o bien manipular los peces con

guantes de plástico o látex. En caso de no disponer de ellos, recomendamos humedecer las manos unos 30 segundos con el fin de reblandecer la queratina de la piel de la mano y hacerla menos áspera. Personalmente recomiendo este tipo de manejo para especies muy resbaladizas (anguila, trucha) cuyo manejo con guantes puede verse dificultado. Sin embargo, el uso de guantes es recomendable por motivos higiénicos y para la prevención de algunas de las escasas zoonosis transmisibles en peces como las Micobacteriosis.

- Para evitar la pérdida de moco evitaremos realizar las operaciones de manejo sobre superficies rugosas o absorbentes. Buscaremos superficies lisas, impermeables y a poder ser no duras. Hemos de evitar en lo posible el uso de esponjas, bayetas, toallas o papeles y utilizar plásticos y bases de goma. Evidentemente estas superficies son más resbaladizas pero a su vez son menos traumáticas

-


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- Para evitar la deshidratación es necesario mantener húmeda la superficie del

pez. Como norma general hemos de evitar trabajar en ambientes con aire acondicionado ya que resecan con mayor facilidad al pez. También es conveniente humedecer cada 2-3 minutos el cuerpo del pez e incluso puede rodearse al mismo con un plástico fino (tipo plástico transparente de uso alimentario) para evitar su desecación si la operación va a durar varios minutos.

- En algunas especies (por ejemplo en el rodaballo) es especialmente beneficioso tapar los ojos a los peces con un plástico para facilitar su tranquilización.

SEDACIÓN Y ANESTESIA Existen distintos productos que podemos utilizar para sedar o anestesiar a los peces. Generalmente el mismo tipo de producto anestésico tiene propiedades de sedación, utilizado a dosis menores o con menores tiempos de inducción. Normalmente estos productos se añaden al mismo agua. Para una correcta anestesia o tranquilización hemos de considerar los siguientes puntos: - Hemos de sedar /anestesiar los peces en un pequeño volumen de agua y dejar un

recipiente con suficiente cantidad de agua sin anestésico para su recuperación. - La recuperación en el caso de anestesia por inhalación (anestésico en el agua) la

recuperación se realiza de forma rápida después de transferir los peces a agua sin anestésico. Se puede forzar esta recuperación forzando la natación a contracorriente, poniéndolos debajo de un chorro de agua o un burbujeo fuerte.

- La solución anestésica debe estar a la misma temperatura que el agua de origen. - El anestésico debe mezclarse de forma eficiente con el agua (muchos anestésicos

son bastante hidrófobos) - Hemos de observar los distintos movimientos de los peces durante la inducción, lo

que nos indicará el plano de sedación o anestesia que se encuentra. Estos comportamientos se definen en la siguiente tabla:

ESTADIO PLANO ESTADO COMPORTAMIENTO

I

1 Sedación ligera Tras un pequeño periodo de aparente excitación, los peces reducen sus movimientos.

2 Sedación profunda Los peces están prácticamente quietos y sólo responden a estímulos fuertes. La analgesia es ligera

II 1 Anestesia ligera Los peces empiezan a perder el equilibrio, pero luchan por no ponerse de costado. La analgesia es total

2 Anestesia profunda Los peces se echan de costado, al levantarlos la cola y las aletas caen hacia abajo. Respiración esporádica

III Anestesia quirúrgica Completa ausencia de tono muscular y respuesta a estímulos.

IV Colapso medular (eutanasia) Cese de la respiración durante varios minutos. Paro cardíaco. Muerte del animal


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Para las manipulaciones habituales como por ejemplo para la toma de sangre es suficiente con una anestesia ligera. Para la toma de biopsias recomendamos una anestesia profunda o quirúrgica. Los productos utilizado más habitualmente son MS-222, Benzocaina, Quinaldina, Fenoxietanol y aceite de clavo (eugenol). Las dosis y tiempos de inducción son extremadamente variables entre especies, tallas y dependiendo del plano de anestesia que queramos conseguir, por lo que vamos a expresar sólo valores orientativos en el siguiente cuadro. Para más detalles recomendamos las obras de de Ross & Ross (1999), Noga (1996) y Stoskopff (1992).

PRODUCTO DOSIS ORIENTATIVAS MS-222 10-250 mg/L

Benzocaína 10-500 mg/L Quinaldina 1-100 mg/L

Fenoxietanol 0.1-0.4 mg/L Aceite de clavo 0.1-0.5 mg/L

BIOPSIAS La toma de muestras de tejidos vivos a partir de peces tranquilizados o anestesiados no es tan difícil ni infrecuente en la práctica clínica. Las biopsias más habituales son las de piel y aletas debido a su fácil accesibilidad y a que son relativamente poco agresivas. Generalmente se realizan mediante las técnicas de raspado de piel y aletas y la excisión de trozos de aleta. La técnica del raspado de piel es la misma que se describe más adelante, con la salvedad de que debe realizarse de forma más cuidadosa y no agresiva que sea posible. En el caso de las aletas normalmente pueden cortarse sin más problemas (no suele haber sangrado en los teleósteos si no se cortan desde la base). Otra técnica de biopsia que puede realizarse sin demasiado problema es la biopsia branquial. Con el animal suficientemente sedado o anestesiado, y mediante unas tijeras finas podemos cortar una pequeña porción de filamentos branquiales a nivel del tercio proximal del arco branquial. Debido a que se trata de un órgano fuertemente vascularizado, después de la excisión la branquia seccionada suele sangrar. Personalmente utilizo una ligera cauterización con un instrumento metálico fino (fórceps, pinzas) calentado moderadamente con un mechero, para cortar la hemorragia, añadiendo sobre esa zona una pomada dérmica mezclada con antibiótico (sulfamidas) en polvo para evitar en lo posible la infección en esa herida. Sin embargo, en muchos de los casos, la herida coagula rápidamente si más en contacto con el agua. Una vez obtenidas, la biopsias de piel o branquia pueden mantenerse durante un corto tiempo en solución salina o suero fisiológico, aunque deben ser siempre examinadas lo antes posible. También es posible obtener muestras de órganos internos mediante laparatomía, aunque esta técnica es más complicada y no es el objeto de este curso.


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Identificación de los trastornos de salud ¿Como vamos a reconocer que existe una enfermedad en nuestra explotación? ¿Sólo por que existe mortalidad? NO, GRAVE ERROR: No siempre tenemos que esperar a que aparezcan la “bajas” para poder detectar que existe un problema en mi granja. Como comentamos antes, la experiencia de los cuidadores o alimentadores en el día a día, siendo capaces de detectar si un pez esta enfermo o normal, es fundamental en este punto. HISTORIAL PREVIO Periodos estacionales de riesgo En la mayoría de explotaciones, la temperatura es fundamental en el desencadenamiento de las enfermedades. Cada patología, vírica, bacteriana o parasitaria, tiene su época del año de riesgo. Debemos conocerlas, no sólo para poder estar preparados y saber cuándo debemos extremar las medidas de prevención de nuestros peces, sino también para establecer un diagnóstico correcto. Ejemplo: Si estamos en el mes de enero, con 12ºC en el agua, y al analizar unas doradas de nuestras jaulas encontramos unos bazos granulomatosos, ¿podemos estar ante un brote de Pasteurelosis? Por otro lado, y si es posible, cuando llegan los momentos más críticos del año no está demás reforzar la comunicación con nuestros colegas vecinos (otros piscicultores) o consultar a patólogos expertos para ver como está la situación de esa enfermedad concreta tan grave, si la tenemos cerca y estar preparados. Variaciones medioambientales Algunas instalaciones están muy expuestas a las variaciones medioambientales, como el cultivo en jaulas flotantes en el mar: Fuertes corrientes, temporales, ... Estas alteraciones muchas veces van ser las responsables de problemas mecánico/traumáticos, que pueden derivar en heridas y contaminaciones por bacterias Por otro lado, las variaciones de temperatura bruscas, principalmente en primavera y otoño, suelen desencadenar muchos problemas patológicos. Ejemplos:La Vibriosis por Listonella anguillarum en la lubina aparece más frecuentemente en primavera, con las variaciones al alza de la temperatura, y la Pasteurelosis en otoño, con las variaciones a la baja.. El famoso “estrés” que sufren los peces durante un trabajo rutinario, como un movimiento o transporte, muchas veces va a desencadenar un problema patológico debido a la inmunodepresión consecuente. Es importante destacar que cuanto más severa es una situación estresante, más tardarán los peces en recuperarse (de 1 a 3 semanas) Durante todo ese periodo la población será más susceptible de padecer infecciones y enfermedades.


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ALTERACIONES DE LOS PARÁMETROS PRODUCTIVOS Es importante recordar que los peces enfermos no suelen comer, y pierden el apetito. La monitorización de los parámetros productivos, como el crecimiento y la conversión, es fundamental a la hora de detectar un problema. Si en los muestreos mensuales nos damos cuenta que los peces no han crecido como deberían, quizás sea una buena idea chequear bien los lotes, por si hubiera algún problema patológico subyacente. CAMBIOS DE COMPORTAMIENTO Distribución de los peces en el agua Los peces en las unidades de cultivo suelen nadar en grupo. Si vemos algunos aislados y que nadan de forma separada, quizás estén enfermos. Si los peces están en superficie boqueando, con los opérculos muy abiertos y en cabecera del estanque puede ser sintomático que de que les falta oxígeno (por ejemplo, niveles bajos de oxígeno en el estanque o por qué no, una parasitosis severa branquial) Tipo de natación Un pez enfermo normalmente nadará de forma lenta y errática. SI nada en espiral puede indicar que problema del sistema nerviosos central (por ejemplo, si se trata de una jaula de lubinas, una posible infección por rickettsias e incluso un caso de necrosis nerviosa viral) Si se “rasca” contra las paredes de la red o el estanque podría tratarse de un problema parasitario externo. Actividad respiratoria Normalmente los peces afectados por un problema infecciosos suelen tener su actividad respiratoria más reducida que sus compañeros sanos. Por otro lado, si necesita aumentar su aporte de oxígeno sanguíneo estará “hiperventilando” (por ejemplo, bajón de oxígeno en la unidad o infección severa bacteriana branquial ) MORTALIDAD No sólo hay que darse cuenta de que se mueren los peces, sino de cómo se mueren. Tenemos que estudiar la evolución en el tiempo de esta mortalidad. Si de un día para otro nos aparecen mil peces muertos, no existe ningún proceso infeccioso que de un día para otro tenga ese patrón. Este tipo de mortalidades suelen ser debidas a alteraciones medioambientales o problemas de estrés sobreagudos (falta de oxígeno, temporales, accidentes) En general, los procesos agudos suelen estar causados por virus y algunas bacterias; y los procesos crónicos serán debidos a parásitos y bacterias. De todas formas es necesario conocer la epidemiología de cada enfermedad y saber cuál es el patrón de mortalidad característico que que suele provocar.


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Distribución “normal de los patógenos” en una población En una población de peces de cultivo tenemos una distribución normal de tallas, donde encontraremos una mayoría de peces “normales”, y una serie de “cabezas” y “colas” cuyo número normalmente dependerá de lo bien que esté clasificado ese lote. De la misma manera, encontraremos una relación con el nivel de agentes infecciosos que conviven de forma habitual con la población. Así en las cabezas su número será mucho menor que el que podemos encontrar en las colas. Este hecho es fundamental a la hora de interpretar un hallazgo en nuestro proceso de diagnóstico.

Distribución normal de protozoos ciliados parásitos en una población de doradas


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3.4.- SELECCIÓN Y ENVÍO DE MUESTRAS Con toda la información que estamos recogiendo en la anamnesis y con el examen in situ, ya podemos seleccionar algunos ejemplares de peces para su análisis. Hemos visto que NUNCA esta selección se debe hacer al azar, sino que deberemos recoger peces enfermos y, en su defecto, recién muertos. Es un muestreo siempre DIRIGIDO. Normalmente en esta muestra se podrá detectar la causa de la patología. A veces, según el tipo de instalación, como las jaulas flotantes, puede ser difícil recoger las muestras si los peces no están “claramente” enfermos. A veces lo más fácil es echar un poco de pienso y cogerlos ¡ Eso es un error fatal ! En esta muestra, los peces estarán sanos (recordad la distribución normal mencionada antes) y podemos no encontrar el origen del problema. Perderemos un tiempo precioso para iniciar el tratamiento. Por ello insistimos: Hay que recoger las muestras de forma correcta y utilizando todo el tiempo que sea necesario. De los bien que se haga dependerá el éxito de todo el análisis posterior. Por otro lado es importante conocer la forma de enviar las muestras según el tipo de análisis a realizar. No debemos olvidar enviar una historia clínica y, si es posible, AVISAR al laboratorio donde vamos a enviar ka muestra.

Vivos Refrigerados (4ºC)

Congelados Fijados en Glutaraldehído

Fijados en Formol

Examen directo

+++ ++ + - +

Toxicología

+++ ++ +++ ¿? ¿?

Parasitología

+++ ++ ++ ++ ++

Bacteriología

+++ ++ - - -

Virología

+++ +++ ++ - -

Bioquímica, hematología serología, biología molecular

+++ + Depende depende Depende

Histopatología

+++ - - ++ +++

Microscopía electrónica

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Envíos de muestras: Normas generales La mejor forma de enviar muestras es siempre peces vivos. Si estos peces se han de transportar durante distancias largas o periodos largos de tiempo antes de llegar al laboratorio, los peces deben embalarse en buenas condiciones. Estos son algunos consejos: - Deben situarse en bolsas de plástico resistente (si pueden ser dobles, mejor) que

estarán convenientemente identificadas con el número de la unidad de cultivo. - Estas bolsas deben llenarse con 1/3 parte de agua (a poder ser, la misma donde

están los peces) - Las 2/3 partes restantes deben ser llenadas con oxígeno (si se hace con aire, el

oxígeno en agua bajará de forma extremadamente rápida). - Debemos sellar convenientemente la bolsa y depositarla en un contenedor

adecuado. Las cajas de porex suelen ser muy adecuadas por ser relativamente baratas, resistentes y aislantes. El contenedor puede ser rellenado con virutas o con papeles para que quede bien encajada.

- Pondremos algunas bolsas con hielo encima y debajo de la bolsa con peces para evitar las subidas de temperatura (importante en verano) o bien bolsas de "calor químico" si se prevén temperaturas por debajo de las óptimas de los peces (especialmente especies tropicales en envíos en invierno).

- El volumen máximo de biomasa de peces a transportar debe ser como norma no superior a 1/4 parte del volumen de agua.

- No deben enviarse de esta forma peces con peso superior a los 250 gramos ya que soportan mal este tipo de transporte. Hay que ir con mucho cuidado con enviar peces enfermos puesto que es posible que no soporten el viaje y lleguen muertos

- Si se puede, los peces deben estar en ayunas 24/48 horas para evitar que se ensucie el agua de transporte.

Para enviar peces refrigerados, utilizaremos las mismas bolsas de plástico donde introduciremos los peces, SIN AGUA. Las cerraremos bien y las colocaremos en las cajas de porex o contenderos estanco adecuado. Alrededor colocaremos hielo picado en otra bolsa o placas congeladoras. Importante: Que no contacten nunca los peces con el agua. Este será el sistema de elección para peces grandes y enfermos.

Envío de peces vívos Envío de peces refrigerados

O2

h h


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3.5.- ANÁLISIS DIRECTO DE LOS PECES Observación externa La observación externa de un animal puede ser realizada de múltiples formas. Sin embargo es importante que siempre tengamos en cuenta lo siguiente: - Es conveniente que anotemos los parámetros biométricos más importantes de los

animales examinados (de todos ellos o de algunos) sobre todo especie, peso, talla (longitud total, longitud estándar…), sexo (si es reconocible), grupo de edad (si se conoce), origen o estirpe. Estos datos pueden llegar a tener un valor importante para el estudio epidemiológico.

- Hemos de anotar el aspecto externo y la presencia de cualquier alteración observada: Malformaciones, úlceras, erosiones, etc. Más adelante en el capítulo revisaremos las alteraciones más importantes.

- En ocasiones es bastante útil utilizar una ficha en la que podemos indicar sobre un esquema la localización y extensión de las alteraciones, como la que presentamos al final del manual.


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Necropsia La necropsia en los peces es el proceso por el cual examinamos mediante una disección sistematizada el aspecto de los órganos internos de los peces. Durante este proceso podemos aprovechar también para incluir la toma de muestras para otras pruebas. Importante recordar: Hay que ser siempre sistemático, ordenado y completo.

Atención : ALGUNAS CONSIDERACIONES PREVIAS Sin embargo es importante en este punto considerar un aspecto muy importante en el proceso de necropsia y toma de muestras. Este aspecto particular es la AUTOLISIS y la HETEROLISIS La AUTOLISIS es el proceso natural de degradación de los tejidos después de la muerte del animal. Esta degradación está principalmente determinado por la liberación de las propias enzimas (fosforilasas, catepsinas, lipasas, proteasas, etc) de las células del pez que autodegradan los tejidos. El problema es que en los peces este proceso tiene lugar con una sorprendente RAPIDEZ, debido principalmente que al ser poiquilotermos, sus carga enzimática está adaptada a trabajar a la mismas temperaturas que vive el pez. En cambio, en las aves y mamíferos, al ser homeotermos, después de la muerte la temperatura corporal disminuye de los 37-40ºC hasta temperatura ambiente, lo que hace que disminuya la actividad de los enzimas de estos animales. Por ello, una vez muerto, la temperatura de los peces sigue siendo la misma que antes de su muerte, con lo cual no hay cambio de actividad. Por poner un ejemplo, lo que pasa en los peces es lo mismo que si dejamos un cadaver de un perro en pleno mes de agosto al sol a 40ºC: el ritmo en que tarda ese perro en corromperse sería relativamente similar al de un pez a 20-25ºC. Además, es importante añadir que a más temperatura, los enzimas actúan con mayor rapidez. De ahí la importancia de tomar las muestras tan rápidamente y conservar los peces en hielo. A este fenómeno hay que añadir que en los peces las proteasas se liberan muy rapidamente de las vísceras debido a su estructura menos compacta. Además, el descenso del pH tisular post-mortem activa aún más la actividad de las proteasas. Por ello la evisceración rápida de los peces aumenta mucho la “vida” útil del pescado. Es MUY importante que tengamos siempre en cuenta estas consideraciones ya que de ello depende en buena parte que las muestras que podamos obtener tengan una calidad suficiente y no nos den problemas de falsas lecturas La HETEROLISIS es el proceso de destrucción del los órganos y tejidos debido a la acción de microorganismos. En condiciones normales, los microorganismos tienen dificultad en penetrar en estos tejidos debido a la existencia de barreras físicas (piel). Sin embargo, en los peces estas barreras son mucho menos gruesas y además son muy alterables debido a la autolisis, como hemos indicado anteriormente. Por ello, la contaminación bacteriana y el expolio en los distintos tejidos es mucho más fácil que ocurra en los peces una vez muertos. Un caso particularmente dramático es el tubo digestivo, el cual contiene habitualmente una microbiota endógena bastante importante. Como hemos indicado anteriormente, el tubo digestivo y los órganos internos son muy ricos en proteasas que se liberan de inmediato, afectando seriamente la integridad de estos órganos, dejando escapar rápidamente los microorganismos del tubo digestivo, los cuales pueden “sembrar” por completo y de forma rápida toda la cavidad abdominal y sus órganos. Algunos autores afirman que incluso este proceso puede darse durante la agonía de los peces. Este fenómeno adquiere importancia capital en la toma de muestras para microbiología ya que de no


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tener cuidado en recoger peces vivos o recién muertos y refrigerarlos de forma inmediata se pueden cometer errores graves al sembrar a partir que órganos que se habrán contaminado previamente, enmascarando el verdadero origen del problema. Este problema sigue siendo aún relativamente habitual. PROCEDIMIENTO DE LA NECROPSIA Para la realización de la necropsia realizaremos las siguientes operaciones: 1- Extracción del ojo(s) de su(s) órbita(s) y examen interno 2- Separación del opérculo y exposición de branquias 3- Apertura de la cavidad abdominal 4- Apertura y exposición del cerebro 5- Observación de la musculatura Como se indicará más adelante, esta técnica debe ser modificada si se desean obtener muestras para pruebas complementarias, especialmente en el caso de bacteriología. Material necesario: Para la realización de la necropsia es conveniente utilizar el siguiente material: - Base de disección: Es importante que sea de un material mínimamente rígido, no poroso, no absorbente, de fácil limpieza y desinfección. Nuestra experiencia con cubetas metálicas y planchas de látex nos ha dado muy buenos resultados - Tijeras: Es recomendable tener un juego de tres tijeras: pequeñas (de unos 8 cm aprox.), medianas (mejor curvas, de aprox. 16 cm) y unas tijeras grandes y fuertes (e.g. "tijeras de pescadero") para el opérculo y los huesos duros de peces de gran tamaño. - Pinzas: Es suficiente con unas pinzas de dientes de ratón y unas pinzas más finas de superficie de contacto estriada. Pueden ser también de utilidad unas pinzas hemostáticas para separar órganos y tejidos. - Bisturí con hojas de recambio, aunque debido a la menor consistencia de los órganos y tejidos en los peces nuestra experiencia nos demuestra que hojas de afeitar, “cutters” o de cualquier otro tipo son muy útiles para realizar secciones de forma rápida y fácil. Protocolo de necropsia: Este es un protocolo general de necropsia. Es válido para la mayoría de los peces aunque las múltiples morfologías que pueden presentar pueden hacer variar la forma de realizarlo Con el animal recostado sobre su lado derecho, realizaremos la necropsia siguiendo los siguientes pasos: 1.- Extracción del globo ocular de la órbita. Lo observaremos y realizaremos una incisión en su plano medio para evidenciar su interior. Nos fijaremos en su forma, la presencia de la retina y el cristalino, su aspecto y la presencia de alteraciones como masas anormales de tejido, sangre, burbujas de aire, opacidad de córnea o de cristalino, etc.


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2.- Separación de opérculo y observación de branquias. Procederemos a cortar el opérculo, observando también su cara interna. Procederemos posteriormente a observar cada uno de los arcos branquiales observando su color, aspecto y presencia de formaciones extrañas.

3.- Apertura de la cavidad abdominal. Para la apertura de la cavidad abdominal, procederemos del modo siguiente: - Realizaremos una incisión a nivel del ano (recomendamos con tijeras), dirigiéndonos en unos 45 grados y en dirección craneal hacia la línea lateral del ejemplar, siguiendo la incisión cranealmente más o menos a nivel de esta línea lateral hasta llegar a la región branquial. - A continuación, volveremos al ano y realizaremos una incisión en dirección craneal en la línea media ventral hasta llegar a la base de las branquias. - Realizaremos una tercera incisión uniendo los dos cortes en la zona branquial y podremos levantar la pared abdominal. Al levantarla, observaremos si hay adherencias y el aspecto que presenta la cara interna del abdomen. Reconoceremos todos y cada uno de los órganos internos, su color y aspecto. Retiraremos la vejiga natatoria para exponer mejor el riñón. También podemos cortar a nivel de esófago e intestino posterior y extraer el paquete visceral para su mejor examen. En este punto observaremos y anotaremos cualquier lesión que aparezca. Más adelante del capítulo comentaremos las más importantes que podemos encontrar.


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4.- Apertura del cráneo y exposición del sistema nervioso central. Esta técnica es bastante variable según la especie y la localización del cerebro en ésta. La apertura puede iniciarse por una incisión entre las narinas, para seguir de forma simétrica hacia la zona superior de cada una de las órbitas oculares. Desde esta zona hay que seguir cortando el cráneo en dirección caudal hasta llegar a la zona de separación entre cráneo y tronco y unir las dos incisiones paralelas. Posteriormente y haciendo palanca con las pinzas, levantar cuidadosamente para exponer el encéfalo.


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5- Observación de la musculatura Es conveniente también levantar la piel de la región media para observar el aspecto de la musculatura. Una sección transversal de la cola del pez puede ser también útil para examinar la musculatura. Esta maniobra puede realizarse también al inicio del proceso de la necropsia Reconocimiento de enfermedad: Diagnóstico diferencial de lesiones CAMBIOS DE FORMA Y COLOR: Deformidades, melanosis (oscurecimiento), aclaración, hinchazón, dilatación abdominal, adelgazamiento ALTERACIONES EN PIEL: Manchas de color, despigmentación, hiperpigmentación, pérdida de escamas, presencia de hemorragias petequiales (puntiformes) y equimosis (extendidas), burbujas, forúnculos, nodulaciones, masas algodonosas y filamentosas, erosiones, úlceras, parásitos macroscópicos. ALTERACIONES DE LAS ALETAS: Deshilachamiento, erosiones, pérdida parcial o total ALTERACIONES DE LOS OJOS: Manchas de color en la superficie, opacidad corneal, burbujas, exoftalmia (inflamación), endoftalmia (hundimiento), masas extrañas en el interior ALTERACIONES DE LAS BRANQUIAS: Ausencia de arcos y/o filamentos, palidez (anemia), inflamación, exceso de mucosidad, hemorragias, manchas de color (blanco, amarillo, negro, ...), erosiones, necrosis. ALTERACIONES INTERNAS: Líquido en cavidad abdominal (ascitis), líquido en tubo digestivo, inflamación , congestión, hemorragias, nodulaciones, abscesos, granulomas, parásitos macroscópicos.


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3.6. - PRUEBAS DIAGNÓSTICAS RÁPIDAS Además de la necropsia, puede hacerse una observación con lupa binocular de los órganos, además de una serie de pruebas directas que son de realización fácil y rápida que son muy útiles en el diagnóstico patológico en peces, sobre todo en planta. Estas pruebas son las siguientes: - RASPADOS DE PIEL - PREPARACIÓN EN FRESCO DE BRANQUIA - "SQUASHES" DE TEJIDO: Cerebro y órganos internos - IMPRONTAS DE BRANQUIA - IMPRONTAS DE TEJIDOS - PREPARACIONES DE LÍQUIDO BILIAR Y ASCÍTICO - PREPARACIONES DE CONTENIDO INTESTINAL - PREPARACIONES DE MUSCULATURA Raspados de piel En los raspados de piel podremos detectar la presencia de ectoparásitos como protozoos ciliados, monogenea, bacterias, hongos etc. El procedimiento es bastante simple. a/ Raspar la superficie del cuerpo y de las aletas del pez a examinar usando una hoja de bisturí o simplemente mediante un portaobjetos. Aconsejamos realizar esta maniobra en dirección cráneo-caudal ya que en dirección contraria podemos levantar demasiadas escamas (en los peces que las posean) que pueden enmascarar la observación, especialmente si no se tiene una cierta experiencia. b/ Depositar y extender bien el material obtenido sobre un portaobjetos. Cubrir el material con un cubreobjetos. Con una pipeta o similar, introducir por capilaridad solución salina o suero fisiológico hasta que ocupe la totalidad del espacio por debajo del cubreobjetos. En caso de no disponer, utilizar agua corriente. Si se utiliza agua marina, el líquido se evapora rápidamente y se forman cristales de sal que entorpecen la observación. c/ Observar al microscopio, trabajando con el condensador bastante cerrado. Se observarán de forma normal mucus, células epiteliales aisladas o en grupo y escamas.


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Preparaciones en fresco de branquia Esta sencilla técnica puede darnos, con un mínimo de experiencia, bastante información acerca del estado y las patologías de un órgano diana como la branquia. a/ Tomar uno de los arcos branquiales y separar parte de los filamentos del eje del arco hasta que se individualicen los distintos filamentos. b/ Repartir los diferentes filamentos sobre un portaobjetos (que no queden uno sobre otro), cubrir con un cubreobjetos e introducir solución salina de la misma forma que describimos en el raspado de piel. c/ Observar al microscopio, trabajando con el condensador bastante cerrado. Observaremos tanto el interior de las branquias como su contorno y las zonas adyacentes. Podemos ayudarnos de soluciones de lugol para identificar parásitos como Oodinium y Amyloodinium.

"Squashes” de tejido Esta técnica está especialmente indicada para la detección de parásitos en los órganos. a/ Cortar una sección fina y de pequeño tamaño del tejido a examinar. b/ Cubrir con un cubreobjetos haciendo presión suave hasta que vemos que el tejido se expande e introducir solución salina de la misma forma que describimos en el raspado de piel. c/ Observar al microscopio


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Improntas de branquia y tejidos En estas muestras se pueden observar la presencia de parásitos y bacterias en los diferentes tejidos. a/ Cortar un trozo pequeño del órgano o branquia a examinar y con unas pinzas presionar varias veces con este trozo sobre la superficie de un portaobjetos, hasta que veamos que deja una huella. b/ Dejar secar al aire o secar a la llama c/ Teñir con las coloraciones habituales. Particularmente rápidas son las tinciones de Giemsa, Diff-Quick y especialmente la tinción de GRAM d/ Observación al microscopio. A 1000x aumentos, si existe una infección bacteriana activa, las bacterias puedes ser observadas claramente. Hay que prestar atención a su morfología, tamaño y disposición dentro de los órganos. Ejemplos de bacterias que se pueden observar: GRAM negativa, bacilos muy largos, formaciones en red: Tenacibaculum maritimum GRAM negativa, bacilos muy cortos, tinción bipolar, agrupados, intracelulares: Photobacterium damselae sp piscicida. GRAM negativa, bacilos largos, forma de coma: Vibrios


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Preparaciones de líquido biliar, ascítico y contenido intestinal También el examen del líquido ascítico, bilis o contenido intestinal pueden aportar información. En líquido ascítico podremos observar la presencia de células inflamatorias, macrófagos con bacterias, bacterias libres, hongos, etc. En la bilis y contenido intestinal podremos observar la presencia de parásitos (sobre todo mixosporidios) y algunos microorganismos (aunque considerando siempre la posibilidad de contaminación retrógrada de la bilis procedente del tubo digestivo) Ambos líquidos pueden recogerse mediante una punción con aguja. El líquido ascítico lo trataremos como si fuera para realizar una extensión de sangre mientras que el líquido biliar lo depositaremos en un portaobjetos, pondremos un cubreobjetos y lo examinaremos directamente al microscopio. Para el examen del contenido intestinal, cortaremos una sección del intestino y realizaremos un raspado de la mucosa, depositando este material en un portaobjetos, lo cubriremos y examinaremos. Preparaciones de musculatura Para los casos de control de parásitos en musculatura podemos aprovechar la técnica que se utiliza para el control de Triquinas en el músculo de cerdo. Consiste en dos placas de cristal (placas de triquina) que se unen a presión con unos tornillos. La muestra de musculatura se introduce entre ambos cristales y se hace presión con los tornillos para que se extienda bien. Observando esta placa en la lupa se puede observar la presencia de quistes de parásitos, nematodos, etc. Otra forma más sencilla consiste en cortar un trocito pequeño de músculo donde sospechemos que están los parásitos y lo colocaremos entre dos portaobjetos o entre un porta y un cubreobjetos. Examinaremos a condensador cerrado. 3.7.- ANALISIS COMPLEMENTARIOS En los protocolos de diagnóstico muy frecuentemente necesitaremos de otros tipos de estudios más particularizados con el objetivo de evidenciar la implicación de agentes bióticos o abióticos en el proceso patológico detectado. Sin embargo, el objetivo de este manual no es explicar todas y cada una de las técnicas disponibles en cada especialidad, sino sencillamente indicar cuáles son, para qué nos pueden servir y sobre todo cómo hemos de proceder para poder obtener las muestras correctamente, en las mejores condiciones posibles y remitirlas adecuadamente a los laboratorios de referencia que disponemos. Uno de los problemas más habituales es que una muestra recogida de forma inadecuada suele ser no apta para su estudio, lo que hace que aparte de que se pierde tiempo y dinero, puede inducir a error en el diagnóstico, lo que es peor. Es muy importante seleccionar adecuadamente qué tipo de análisis necesitamos en cada caso y aún más importante es la correcta evaluación de los resultados obtenidos de éstos. Recordemos: NUNCA debemos considerar que un resultado de una prueba puede tener un valor diagnóstico absoluto.


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ANÁLISIS DE AGUA Hay múltiples parámetros que es necesario controlar en el agua, aunque algunos deben ser comprobados con mayor frecuencia y precisión dependiendo de nuestras condiciones de trabajo y el riesgo existente. Algunos de estos parámetros son habitualmente controlados en las instalaciones, mientras que otros deben ser remitidos a centros especializados (generalmente son las muestras de toxicología). Los parámetros que es necesario controlar con mayor detalle son: Oxígeno y Temperatura Son los parámetros más necesarios de controlar con mayor detalle. En estos dos casos hay que procurar obtener varias lecturas durante el día y más frecuentemente aún si se sospecha que pueden haber oscilaciones. En estos casos lo ideal es tener mediciones constantes y registradas acopladas a un sistema informático de análisis de datos y conexión de alarmas. La falta de oxígeno ha sido tradicionalmente una de las mayores causas de mortalidad y de generación de problemas debido principalmente a que los episodios de hipoxia pueden desarrollarse de forma relativamente rápida y si no se efectúan los controles oportunos pueden quedar sin detección Las oscilaciones de temperatura son también un fenómeno muy habitual que afecta seriamente a los peces. En general podemos decir que los cambios de temperatura si son suficientemente bruscos, afectan a la salud del pez reduciendo la respuesta de sus sistemas de defensa y alterando su metabolismo durante varios días. Además hay que añadir que la temperatura es uno de los factores más importantes en la epizootiología de las enfermedades de los peces Otros parámetros a controlar de forma periódica serán: - pH, salinidad, amoniaco, nitritos, nitratos y reserva alcalina - materias en suspensión, fosfatos, DBO, conductividad, potencial redox, dureza - saturación de gases, cloro libre - carga microbiana del agua: coliformes, mesófilos y estreptococos fecales También hemos de considerar los análisis “especiales” de agua como el de la presencia y niveles de productos terapéuticos (formol, sulfato de cobre, cloro, peróxido de hidrógeno…) o de tóxicos (herbicidas, pesticidas organoclorados, organofosforados, cianuros, tensoactivos, metales pesados, fenoles, PCB’s etc.) Toma de muestras de agua En los casos concretos de la temperatura y el oxígeno, las muestras se toman “in situ” mediante termómetros / termógrafos y sondas de oxígeno (oxímetros). En el caso particular del oxígeno es de vital importancia el realizar un mantenimiento adecuado de los mismos y calibrarlos periódicamente (aunque parezca una tontería, este es un punto MUY importante y en la práctica se observan todavía errores demasiado frecuentemente). Para los parámetros indicados posteriormente (pH, salinidad, amoniaco, nitritos y reserva alcalina) y para buena parte de los descritos posteriormente (cloro, dureza


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total y fosfatos) o bien se utilizan aparatos específicos (pHmetro,, salinómetro, densímetro) o bien suelen utilizarse kits comerciales. Estos kits suelen dar bastante buenos resultados (aunque a veces poco precisos) y son bastante prácticos y rápidos de utilizar, por lo que se adaptan bien a la práctica diaria de la empresa. También se pueden determinar mediante valoraciones químicas, aunque estas técnicas generalmente son de difícil realización en el centro de trabajo y suelen reservarse a los laboratorios de referencia. El resto de parámetros pueden determinarse de la siguiente forma: En todos los casos es importante que la muestra de agua a recoger sea representativa de lo que queremos analizar. Tengamos siempre presentes: - El tiempo: Los sistemas acuáticos son dinámicos y lo que en un momento está en

el agua, al cabo de un tiempo corto puede haberse eliminado por el recambio del agua o haberse degradado.

- Localización: La muestra ha de tomarse a distintos niveles (entrada de agua, salida de agua, distintos tanques, distintas unidades de cultivo, etc)

- Profundidad. Sobre todo cuando se trate de analizar sistemas en grandes masas de agua (por ejemplo jaulas o estanques ) es importante recordar el fenómeno de la estratificación del agua y tenerlo en cuenta a la hora del muestreo del agua.

La cantidad y la forma de conservación de las muestras de agua pueden variar notablemente según el laboratorio y las técnicas de detección empleadas. Aunque la tendencia es la de utilización de técnicas "miniaturizadas" donde es suficiente un volumen de muestra pequeño, nuestro consejo es ser generosos con la cantidad de muestra remitida (1-2 litros de agua suelen ser suficientes en todos los casos para cada una de las muestras) Hemos de considerar los siguientes aspectos ya que son de absolutamente necesarios para poder garantizar por parte nuestra la fiabilidad de los resultados del análisis: - Recipientes a utilizar: A poder ser, deben utilizarse recipientes limpios, estériles,

opacos y fáciles de identificar. Mejor si son de cristal, especialmente en el caso de determinación de derivados de petróleo, aunque los envases de Polietileno son menos frágiles. Como frecuentemente no se dispone del recipiente ideal, hay que procurar que al menos esté limpio.

- Llenado de los recipientes: Debe realizarse en el interior del agua y llenarlo hasta arriba. Esta técnica se utiliza para evitar la presencia de aire en contacto con el agua que pueda modificar sobre todo los valores de gases disueltos.

- Rotulación de los frascos: tiene que ser clara, y marcada en el frasco (no en el tapón).Utilizar marcadores resistentes al agua.

- Envío: De forma rápida y mantenida en refrigeración (4ºC)


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TECNICAS BACTERIOLÓGICAS Las técnicas bacteriológicas o microbiológicas que habitualmente se precisan en patología de peces tienen por objetivo el aislamiento e identificación a partir de las muestras de microorganismos (generalmente bacterias) potencialmente implicados en problemas patológicos. También comprenden la realización de antibiogramas para comprobar la sensibilidad de esas bacterias de distintos antibióticos. Las técnicas más habituales se basan en la siembra en medios de cultivo adecuados a partir de las muestras y la comprobación de la presencia o ausencia de crecimiento de los microorganismos potencialmente presentes en esa muestra. Posteriormente, los microorganismos que crecen en estos medios de cultivo se identifican a través de distintas pruebas bioquímicas, serológicas y/o moleculares. Consideraciones al interpretar los resultados de la microbiología La importancia de la contaminación: El hecho de realizar una siembra a partir de una muestra de bazo, riñón o piel significa que nosotros queremos saber si en esa muestra existen bacterias que al ser sembradas en un medio de cultivo se revelan en forma de colonias macroscópicas. En condiciones normales, los órganos internos de los peces sanos no pueden contener microorganismos y por lo tanto, si obtenemos crecimiento el razonamiento lógico es pensar en que en esos peces existe una infección que hace que los microorganismos responsables de la misma se encuentren en ese órgano. Sin embargo la relación crecimiento / infección no es siempre verdadera. La observación de crecimiento a partir de la siembra también se puede dar por la existencia de contaminación. Esta contaminación puede proceder de:

a) Heterolisis: El estado de la conservación de la muestra no es adecuada ya que se ha permitido que bacterias del exterior o del tubo digestivo contaminen los órganos seleccionados. En el caso de la siembra a partir de heridas exteriores o úlceras, la contaminación casi siempre proviene de la misma microbiota del agua.

b) Contaminación iatrogénica: Corresponde a la contaminación producida por

una necropsia mal realizada y/o por la manipulación incorrecta de las muestras, sin guardar la debida asepsia. Por ello, si en la necropsia pensamos en tomar muestras para microbiología hemos de tener mucho cuidado con la esterilidad del material y de no contaminar los órganos durante el proceso de la necropsia (por ejemplo, romper el tubo digestivo y vaciar su contenido sobre los órganos abdominales).

La elección del medio adecuado: Cada medio de cultivo presenta unas características específicas que permiten el crecimiento de los microorganismos de una forma más o menos selectiva. Siempre hemos de utilizar medios generales como el TSA (Tripicasa Soja Agar, con sal para peces marinos), MA (agar marino) o medios generales enriquecidos como el AS (agar sangre) Una inadecuada elección del medio puede dar como consecuencia la ausencia de crecimiento y por tanto un falso no aislamiento. Por ejemplo, en el caso de las Flexibacteriosis es necesario utilizar medios específicos (FMM) ya que no suelen crecer en los medios generales.


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La elección de la muestra: En la mayoría de los procesos infecciosos por bacterias existen fases en las cuales el germen puede ser aislado de forma más o menos fácil. En las fases de diseminación o septicémicas es cuando estos microorganismos pueden ser aislados de forma más fácil. Sin embargo, en fases muy iniciales o en fases crónicas pueden acantonarse o disminuir su viabilidad, aunque seguir presentando sintomatología o eliminando toxinas. Por ejemplo, en las fases crónicas de Pasteurelosis, la bacteria queda acantonada en el interior de macrófagos y es difícilmente cultivable. En el caso de Pseudomonas anguilliseptica en muchos casos se acantona sólo a nivel del sistema nervioso central, no pudiendo ser cultivable a partir de riñón, bazo o hígado. El uso de antibióticos y desinfectantes: En algunos casos las muestras pueden proceder de peces que han sido tratados previamente, con lo cual disminuimos la viabilidad de las bacterias debido al poder bactericida y/o bacteriostático de los antibióticos, transformándolos en no cultivables. Toma de muestras microbiológicas Para el envío de muestras de peces al laboratorio de referencia de microbiología hemos de procurar enviar peces moribundos o muertos recientemente y que no presenten externamente signos de autolisis o heterolisis (hinchamiento abdominal por fermentación). Los peces deben ser enviados en hielo o refrigerados para evitar el crecimiento de contaminación bacteriana. Sin embargo, también podemos procesar los peces y realizar siembras con un equipo mínimo. - Para la toma de muestras necesitaremos la presencia de una llama para poder

trabajar alrededor de la misma en unas mínimas condiciones de esterilidad (pueden utilizarse mecheros de alcohol o incluso un "camping-gas"), instrumental para recoger la muestra (asa de platino, asas de plástico estériles, pipetas Pasteur estériles, hisopos estériles o cualquier otro instrumento afín) y medio de cultivo.

- Para iniciar la operación de toma de muestras, podemos desinfectar la piel del pez

mediante una solución de hipoclorito o amonio cuaternario, o simplemente retirar el moco de la zona de incisión mediante un paño o papel absorbente.

- A continuación, procederemos a la apertura de la cavidad abdominal tal y como se

describe en el apartado referente a la necropsia, teniendo la precaución de utilizar las tijeras y pinzas desinfectadas pasándolas por alcohol y dejándolo quemar o bien puede incidirse solamente por su lado ventral para mejorar las condiciones de esterilidad (en estos casos, unos mondadientes estériles suelen ir bien como "retractores" abdominales).

- Cuidaremos de no puncionar por error los intestinos puesto que facilitaría mucho la

contaminación de la muestra, tal y como hemos indicado anteriormente. Una vez hemos expuesto los órganos internos, procederemos a la toma de muestras. Generalmente se toman muestras de riñón craneal (pronéfrico) y bazo por sus características de órganos filtradores y hemopoyéticos en los que se reflejan la mayoría de enfermedades bacterianas. Particularmente es preferible sembrar de riñón craneal ya que es un órgano separado de la cavidad abdominal y es menos


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- susceptible a contaminación procedente del tubo digestivo. Pueden utilizarse

también el hígado, cerebro o cualquier otro órgano que pueda presentar lesiones. En el caso de tomar muestras estos órganos o de lesiones la piel recordemos que hemos de tener en cuenta que nos encontraremos con importante contaminación bacteriana secundaria.

- Para tomar muestras de riñón craneal pueden traccionarse el paquete visceral con

unas pinzas estériles, punzando si es preciso la vejiga natatoria y dejando al descubierto el riñón. Con el asa de platino al rojo o un escalpelo estéril, incidiremos en la zona media del riñón sobre la capa fibrosa que recubre a éste para permitir el paso libre al parénquima renal. A continuación, con la punta del instrumento de recogida (la misma asa, o otra de plástico o una pipeta estéril, entraremos en este corte para recoger una muestra de riñón. Debe irse con cuidado de no tocar el resto de órganos de la cavidad abdominal al entrar o salir de ella.

Inoculación de medios Para la inoculación de placas con los medios utilizamos la misma técnica en estría que para otros casos. En casos de múltiples muestras, podemos dividir las placas en "porciones". También podemos hacer las siembras en tubos con medio líquido ("caldo") para después pasarlo a medio sólido en placas. Los medios más frecuentemente utilizados en peces marinos son los siguientes: - Medios generales: Agar Marino (MA), Agar sangre (AS), Tripticasa Soja Agar (TSA) - Medios específicos: TCBS (Vibrios), FMM (Flexibacter maritimus) Estos medios se pueden realizar más o menos fácilmente o bien pueden ser adquiridos ya preparados. En algunos casos, algunos laboratorios prefieren utilizar otros medios menos habituales y que suelen dar buenos resultados. Incubación En general se consideran temperaturas de incubación aceptables entre 15 y 30 grados, siendo 20 y 25 grados las más aceptables. En caso de no tener estufa, puede dejarse a temperatura ambiente, aunque los resultados son mucho menos fiables. Normalmente, si existe una infección bacteriana activa, en 24-48 horas ya tendremos un crecimiento significativo, aunque es recomendable dejar las placas incubando al menos una semana, pues existen algunos patógenos que crecen más lentamente, como Pseudomonas angulliseptica o Tenacibaculum maritimum. Identificación y antibiograma Una vez obtenemos en las placas sembradas, podemos enviar la placa a un laboratorio de microbiología para la identificación del agente en cuestión mediante técnicas bioquímicas (API), serológicas y/o moleculares. El antibiograma está casi siempre ligada a la identificación bacteriana, aunque muchas veces es lo que realmente desea conocer el responsable de los peces. La técnica utilizada es la misma que podemos utilizar para diagnóstico en otras especies.


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TECNICAS VIROLOGICAS Las técnicas de detección virológica son tal vez el grupo de técnicas más complejas, laboriosas y de elevado coste económico que requieren de un laboratorio y personal sumamente especializado (bastante escasos) en este tipo de determinaciones. En este apartado no abordaremos los protocolos utilizados en el diagnóstico virológico y solo indicaremos algunos consejos para a la toma de muestras para virología. Toma de muestras para virología La toma de muestras para virología frecuentemente debe realizarse aparte de las técnicas habituales. Este hecho es debido a las especiales condiciones del muestreo virológico. Se debe evitar la contaminación cruzada por poner en contacto material infectivo, sobre todo si se muestrean varios grupos, ya que daría lugar a resultados equívocos. Las muestras pueden consistir en ejemplares vivos remitidos directamente al laboratorio de diagnóstico virológico o bien muestras de peces muertos refrigerados o de órganos como riñón, bazo y/o encéfalo (más de 1 g). Estas muestras deben ser recogidas asépticamente y en envases esterilizados. Posteriormente han de enviarse refrigeradas en hielo a una temperatura inferior a 10 grados y deben poder ser procesadas antes de las 48 horas, avisando al laboratorio del envío de las muestras. En el caso de alevines muy pequeños, pueden ser considerados como órganos. Pueden ser remitidos sin cabeza ni cola la mayoría de las veces. ANÁLISIS PARASITOLOGICO Para la detección de parásitos se emplean casi todas las técnicas diagnósticas que comentamos en este manual. Normalmente, en nuestro examen directo de los peces y con las pruebas rápidas ya realizamos un análisis parasitológico. Preliminar. Después, también se pueden utilizar microscopía óptica y electrónica, técnicas inmunológicas e incluso moleculares Cualquier organismo parasitario que encontremos y queramos enviar a un laboratorio especializado deberá ser conservado en un bote con alcohol 70% y convenientemente rotulado. MICOLOGIA Existen comparativamente pocos grupos de hongos patógenos en peces y su diagnóstico puede realizarse de forma más o menos fácil mediante técnicas que no requieren su cultivo. De todas formas como medio general puede utilizarse el medio de Sabouraud con adición de antibiótico como medio base para el aislamiento de hongos. Saprolegniales: Diagnóstico directo por raspados de piel y observación de la morfología de hifas y conidios. Puede intentarse su cultivo en cañamón. Ichyhyophonus, Exophiala, Phoma: Diagnóstico directo por “squashes” de tejido o por histopatología.


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HISTOPATOLOGIA Esta técnica nos permite visualizar en secciones de tejido las lesiones ocasionadas en los diferentes procesos patológico y a partir de la visualización de un tipo u otro de lesión, determinar su naturaleza. Para ello es necesario una larga experiencia en diagnóstico para poder discernir entre los distintos cuadros patológicos que pueden aparecer. Toma de muestras para histopatología (Microscopía Óptica) Si se desean tomar muestras para histopatología es MUY IMPORTANTE que sean muestras a partir de peces vivos, moribundos o muertos MUY RECIENTEMENTE, ya que como hemos comentando anteriormente respecto a la autolisis en peces, los procesos de alteración de las estructuras del pez son extremadamente rápidas y pueden comprometer seriamente la calidad de la muestra, transformándola en muestra no apta. Por ello es muy importante fijar rápidamente la muestra y que esta muestra tenga el máximo contacto posible con la solución fijadora. Es MUY importante que las muestras se remitan en recipientes con ABUNDANTE FIJADOR, ya que de lo contrario la fijación es deficiente. Como mínimo hay que poner 3 partes de fijador por cada parte de muestra, siendo lo ideal una relación de 9:1. Si se envían peces enteros es muy necesario que se tome la precaución de abrir el abdomen y revertir las muestras al exterior para mejorar la fijación. Esta práctica incluye también a peces pequeños, ya que normalmente se les fijan mal los órganos abdominales. También es recomendable pinchar o retirar la vejiga natatoria para que el fijador pueda acceder al riñón. Es importante incluir en la muestra tanto tejido sano como tejido alterado. También es necesario indicar que lesiones avanzadas como ulceras o tejidos que presenten un grado de alteración avanzado no suelen ser buenas muestras para el diagnóstico, ya que en estas muestras frecuentemente sólo se observan procesos degenerativos terminales o infecciones secundarias que enmascaran el origen inicial del problema. Para fijar las muestras, los fijadores más habituales son Formol al 10% tamponado (el que recomendamos) y Formol salino. La formulación para preparar estos fijadores es: Formol al 10% tamponado Formol comercial (37-40%): 100 ml Agua destilada: 900 mL Fosfato monosódico (monohidrato): 4 g Fosfato disódico (anhidro): 6 g (Si usamos agua del grifo y tiene suficiente contenido en sales, puede usarse sin necesidad de añadir tampón.).El formol salino se prepara con agua de mar filtrada (con agua limpia es suficiente) en lugar de agua destilada. Las muestras fijadas también permiten realizar sobre ellas las mismas técnicas que las que describimos en las preparaciones en fresco. También hemos de tener en cuenta que algunos parásitos (sobre todo los monogenea, los copépodos y los isópodos) pueden desprenderse de los tejidos o de la superficie de piel y branquias cuando se sumergen las muestras en el fijador, por lo que es interesante pipetear los fondos de los recipientes y observar el contenido de este arrastre al microscopio. Recordemos que


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precisamente el formol es uno de los antiparasitarios utilizados con mayor frecuencia. Recordemos también utilizar botes de plástico (mejor que los de cristal) de cierre hermético (o de lo contrario corremos el riesgo de que tengan pérdidas durante el transporte, nos lleguen las muestras secas y con el cartón de la caja empapado de formol. Las muestras deben fijarse unas 48 horas antes de su procesado. También es preferible mantener las muestras en un lugar fresco y alejado de la luz directa. Toma de muestras para Microscopía Electrónica En ocasiones es necesario realizar estudios más precisos para conocer con más detalle el carácter de las lesiones o de los agentes patógenos que se encuentran en estas lesiones. Por ello puede ser necesario utilizar el microscopio electrónico (de transmisión y/o barrido). No nos extenderemos comentando el procesado de las muestras para estas técnicas ya que son las mismas que se utilizan para otro tipo de muestras, sino que sólo indicaremos como se debe proceder para obtener muestras para esta técnica. Las muestras para microscopio electrónico deben tomarse muy rápidamente y a partir solo de material muy fresco. Es importante indicar las muestras de tejidos deben ser porciones muy pequeñas (si es posible porciones de menos de 1 milímetro cúbico) y fijarlas muy rápidamente en el fijador para microscopio electrónico. Existen distintos tipos de fijadores para este tipo de estudios, aunque nosotros siempre utilizamos el glutaraldehido como fijador de elección, siguiendo este protocolo: Solución fijadora de glutaraldehido: Glutaraldehido al 2%. La muestras se fijan en esta solución a 4ºC durante 1-2 horas. Posteriormente se lavan con tampón fosfato, tampón de Sorenson, tampón Millonig, tampón cacodilato o con tampones similares, conservándose en tampón hasta que tiene lugar la postfijación con tetraóxido de osmio al 1% (en tampón) y conservándose en tampón de nuevo hasta su transporte hasta el laboratorio de referencia. HEMATOLOGIA El estudio de la sangre puede ser también bastante útil para el diagnóstico. A partir de una muestra de sangre pueden realizarse determinaciones como hematocrito, extensiones sanguíneas, hemograma, bioquímica sanguínea y serología. La mayoría de estas pruebas necesitan del conocimiento de los valores habituales (y su rango de variación) para poder ser comparadas. Debido al menor número de datos que se poseen sobre especies de peces en comparación con la especie humana y otros vertebrados, su utilización es a veces de poca significación diagnóstica. Toma de muestras Para tomar muestras de sangre utilizamos el mismo tipo de agujas y jeringas que se utilizan en medicina veterinaria, adaptándolas al tamaño del pez y cantidad de sangre a recoger. Nuestra experiencia indica que es útil (si se puede) utilizar una aguja y jeringa heparinizadas para evitar la rápida coagulación de la sangre. En general y de forma habitual se toma muestras de sangre a partir de: - vena caudal - corazón (ventrículo o seno venoso) - arteria aorta dorsal (menos frecuente) - Sección de pedúnculo caudal


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Extracción de sangre de la vena caudal Incidir en la zona ventral de la cola, justo después de la aleta anal y en dirección dorsal avanzar hasta contactar con la columna vertebral, rotar ligeramente la aguja y recoger la sangre. También puede incidirse en unos 60 grados desde una zona próxima a la línea lateral. Extracción de sangre del corazón Incidir en la zona ventral de la región de transición entre cabeza y cola, entre las aletas pectorales y la zona de los opérculos. Rápidamente se llega al ventrículo de donde se puede recoger sangre de forma fácil. Si se incide ligeramente por delante de la aleta pectoral se consigue tomar sangre del seno venoso.

Extracción de sangre de la arteria aorta dorsal Abrir la boca del pez e incidir en la zona más caudal de la inserción dorsal de los arcos branquiales. Sección del pedúnculo caudal Para los peces que por su tamaño no es posible sacar sangre de las otras formas descritas y pueden sacrificarse, puede seccionarse el pedúnculo caudal (después de anestesiar al pez), secar la superficie de corte y recoger la sangre que sale de la aorta dorsal y vena caudal seccionadas.


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Conservación de muestras de sangre Tras retirar la aguja, la sangre puede ser recogida en tubos sin anticoagulante y dejarlas coagular en un lugar fresco para separar el suero o bien recoger en tubos con anticoagulante (en general, EDTA o heparina, según el tipo de análisis a realizar) y mantener a 4 grados. Extensiones sanguíneas Depositar una gota pequeña de sangre fresca en un portaobjetos (fresca o con anticoagulante) y aplicar otro portaobjetos en ángulo agudo, dejar extender la gota de sangre por el lado del segundo portaobjetos y con un movimiento rápido realizar una extensión de la gota de sangre. Después se seca al aire y teñir con las técnicas habituales como Giemsa, May-Grünwald-Giemsa o Diff-Quick. En este tipo de muestras es posible evidenciar la existencia de parásitos, morfologías extrañas o cuerpos raros en las células sanguíneas. Pueden realizarse contajes semi-cuantitativos de los diferentes tipos celulares presentes, aunque a veces es necesario estar habituado o contar con la ayuda de un experto para diferenciar cada tipo celular. Hematocrito Se debe llenar el 70-80% de un tubo capilar heparinizado o con EDTA y después sellar ambos bordes con plastilina o similar. Centrifugar durante 4-5 minutos a unos 12.000 g y calcular el porcentaje de la columna roja con el del total de sangre. El valor calculado es el PCV (Packed Cell Volume) o hematocrito. Hemograma, bioquímica sanguínea Estas técnicas son bastante especializadas y suelen estar solamente al alcance de determinados laboratorios. No obstante, describiremos brevemente qué técnicas se utilizan habitualmente.

- Hemograma: La determinación cuantitativa de los elementos celulares presentes en sangre Se realiza utilizando las mismas técnicas descritas para vertebrados terrestres (contajes en cámara de recuento de diversos tipos). Frecuentemente esta técnica se encuentra con el problema de la enorme variabilidad individual, variabilidad según condiciones del medio y la falta de valores de referencia suficientemente establecidos para las diferentes especies.

- Bioquímica sanguínea: Son múltiples los parámetros que pueden determinarse en una muestra de sangre. Desafortunadamente, hasta el momento estas técnicas son de escasa utilización diagnóstica en la clínica habitual, quedándose frecuentemente limitadas a los trabajos de investigación. Posiblemente en el futuro estas técnicas puedan tener una mayor implantación en patología de peces

TECNICAS INMUNOLÓGICAS Las técnicas inmunológicas se basan en la utilización de anticuerpos específicos para demostrar la presencia de un agente vírico, bacteriano, parasitario etc. Frecuentemente


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se utilizan como complemento a el resto de técnicas anteriormente comentadas. Entre las técnicas utilizadas habitualmente para el diagnóstico en peces podemos destacar: Técnicas de aglutinación Bastante sencillas y utilizados sobre todo para el diagnóstico bacteriano. Se basan en poner en contacto las bacterias de una colonia con un suero en el que existen anticuerpos específicos contra esa bacteria. En el caso de que los anticuerpos reconozcan a los antígenos bacterianos, se producirá una aglutinación visible a simple vista. Esta técnica se puede realizar sobre un portaobjetos o sobre otra base similar sobre la cual se coloca una muestra de colonia y a continuación se le añade el suero, observándose o no aglutinación (que puede ser fuerte o débil) a los pocos minutos. Esta técnica depende de que el suero utilizado tenga suficiente cantidad de anticuerpos (título alto). Existen ya bastantes kits comerciales en el mercado que utilizan esta técnica para la identificación rápida. También pueden obtenerse en el mercado antisueros monoclonales o policlonales para la realización de esta y otras técnicas. Técnicas de ELISA Utilizadas para la cuantificación de anticuerpos en sangre o presencia de antígenos en extractos celulares. Esta técnica se basa en la adsorción mediante incubación de partículas antigénicas víricas, bacterianas, etc. (en el caso de querer detectar anticuerpos en suero) o de anticuerpos (en el caso de querer detectar partículas antigénicas) y posterior fijación en pocillos de placas de microtitulación. A continuación se lavan con soluciones tampón y se incorporan las soluciones a testar (suero con anticuerpos o soluciones con el antígeno) Se volverá a lavar con soluciones tampón y si el antígeno o anticuerpo ha reconocido a su homólogo unido al pocillo, no se perderá al lavar. Para revela la existencia de esta unión utilizaremos anticuerpos contra el antígeno o contra la fracción Fc de los anticuerpos de la especie de pez de la que testamos el suero. Estos anticuerpos están conjugados con una enzima o con un sistema amplificador (por ejemplo avidina-biotina o otro anticuerpo contra el anticuerpo anterior). Al final de la cadena está un enzima fijado a uno de los componentes amplificadores que al ponerlo en contacto con una sustancia (sustrato) se observa la existencia de reacción por un cambio de color que se puede cuantificar. Estas técnicas ELISA son generalmente las utilizadas en el análisis virológico y son las técnicas obligatorias para el análisis de VHS y IHN. Los protocolos de realización pueden variar bastante según el tipo de determinación a realizar. Técnicas de inmunofluorescencia Directa e indirecta (FAT e IFAT) sobre improntas de órganos y/o tejidos celulares o bien en suero. Utilizada para el diagnóstico de BKD y la mayoría de las virosis. Técnicas de inmunohistoquímica Se basan en la detección en cortes histológicos de los antígenos o estructuras específicas de pared o membrana de distintos agentes patógenos en peces. Para detectar estos antígenos o estructuras se utilizan anticuerpos monoclonales o policlonales o bien sustancias específicas como las lectinas. En el caso que exista reconocimiento, la unión se revela mediante el uso de un segundo anticuerpo marcado o bien marcando el primero de los anticuerpos o sustancia específica. Los marcadores


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pueden ser sustancias fluorescentes, complejo avidina-biotina o con un enzima acoplado a un sistema revelador (cromógeno). TÉCNICAS MOLECULARES Estas técnicas son bastante recientes y derivan en su mayoría de las técnicas de PCR (Polymerase Chain Reaction). Se basan en el la detección de la presencia del DNA del agente patógeno mediante su multiplicación del DNA o RNA en varios ciclos mediante una polimerasa y en la posterior identificación mediante la utilización de sondas específicas. Son técnicas complicadas pero que se están poniendo a punto para los diferentes patógenos. Una de las mejores ventajas de esta técnica es su alta sensibilidad pero su utilización para diagnósticos de rutina es aún limitada, pero puede tener una importancia cada vez mayor en el futuro. TEST DE STRESS Estos test se utilizan de experimental para comprobar la resistencia de los peces a condiciones extremas y de esta forma asegurar la calidad de los grupos de peces, o bien, se utilizan para detectar portadores asintomáticos (“carriers”) e suelen dar negativo a las otras técnicas. En el primero de los casos, se utiliza especialmente en el cultivo larvario y consiste en exponer a las larvas/juveniles a altas salinidades (55-65 por mil) y medir la supervivencia a intervalos de tiempo regulares. En el segundo de los casos se somete a los peces a un cambio súbito de temperatura y se les administran inmunodepresores (p. ej. prednisolona) y se les muestrea unos días después para ver si los test habituales dan positivo. RADIOLOGIA Se utiliza especialmente en el diagnóstico de malformaciones en juveniles. Particularmente sensibles para esta técnica se han demostrado las placas de mamografía CONSIDERACIONES PRÁCTICAS SOBRE LOS ANÁLISIS COMPLEMENTARIOS La gran mayoría de técnicas indicadas anteriormente son técnicas utilizadas habitualmente en el diagnóstico de patologías humanas o de animales domésticos terrestres. En su mayoría se trata de pruebas ya completamente estandarizadas y contrastadas en condiciones de campo, de las que se conocen muy bien sus cualidades como sensibilidad, especificidad, etc. Todas estas técnicas están también teóricamente disponibles para poderlas utilizar en el diagnóstico en peces. Sin embargo, en las técnicas aparentemente más específicas como las técnicas inmunológicas o las técnicas moleculares nos encontramos muy frecuentemente con el problema que muchas de estas técnicas están únicamente disponibles como herramientas de investigación y aplicadas sólo a estudios


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experimentales concretos. El problema surge cuando pretendemos utilizar estas técnicas sobre muestras “de campo” o en muestras distintas a las testadas experimentalmente. En ese momento nos encontramos con grandes problemas para conseguir una fiabilidad de los resultados y por lo tanto se nos reduce mucho la confianza que podamos tener en esos resultados. 3.8.- DIAGNÓSTICO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Una vez hemos realizado todo los análisis correspondientes de forma ordenada y completa y con todos los resultados de las pruebas complementarias, ya podemos emitir nuestro diagnóstico. A la hora de interpretar los resultados de una analítica, hemos de recordar que nunca una sola prueba es definitiva, y siempre, como últimos responsables de la salud de los animales, podemos dudar de estos resultados. Ejemplo: En un chequeo rutinario de mis alevines de lubina me han detectado un positivo por PCR a Nodavirus, pero en mi granja los peces están sanos y no hay mortalidad, ¿debo creerme este diagnóstico? Quizás debería esperar al cultivo celular. O también puedo enviar nuevas muestras a otro laboratorio.


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4.- EL DIAGNÓSTICO EN LA GRANJA DE CULTIVO En el apartado anterior hemos revisado de forma detallada los protocolos de diagnóstico patológico en peces. Para la realización de muchos de ellos en ocasiones se requiere un equipo especializado que no siempre se dispone en los centros de producción. Es importante recalcar que nosotros siempre recomendamos que haya un responsable de salud en cada granja, que sea capaz de emitir un primer diagnóstico preliminar que le permita iniciar un tratamiento. De este modo, uno debe adaptarse a cada situación e intentar realizar en diagnóstico con los medios que tenga a su alcance: “Nadie cometió un mayor error que aquél que no hizo nada porque sólo podía hacer un poco” De todas formas, siempre enviaremos una muestra al laboratorio especializado para confirmar el diagnóstico. 4.1.- NIVELES DE DIAGNÓSTICO EN PLANTA 0.- Examen externo y necropsia con “navaja”

Disponemos de lo más básico y sólo podemos intuir la causa del problema por nuestros conocimientos teóricos y las lesiones observadas externa e internamente. Puede parecer “justito”, pero muchas veces suele ser suficiente.

1.- Material de necropsia, pruebas rápidas, tinciones y microscopio

Tenemos la enorme suerte de disponer de un microscopio, material de disección y tinciones. Ya no se nos puede escapar “casi” nada, pues podemos realizar las pruebas más importantes del diagnóstico, las pruebas rápidas directas, preparaciones en fresco e improntas.

Nosotros consideramos que hasta aquí es lo imprescindible que debe poder realizar en una granja.

2..- Siembras en medios de cultivo y antibiogramas

Disponemos además de placas variadas y discos de antibiograma. Puedo realizar siembras y confirmar la sensibilidad de las cepas bacterianas que aísle en mi granja. También puedo controlar la flora microbiana del agua. Después enviaré las bacterias al laboratorio de microbiología para que las identifiquen.

3.- Sistemas de identificación bioquímica

Tenemos un laboratorio perfectamente equipado para poder diagnosticar la mayoría de enfermedades que sufrirán mis peces. Puedo identificar casi todas las cepas que aísle.


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4.2.- “TELEDIAGNÓSTICO” El proceso de diagnóstico puede y debe aprovecharse de las nuevas tecnologías como soporte. Muchas veces al técnico le pueden surgir dudas mientras está realizando el análisis, así que puede servirse de estos elementos para recoger la opinión de los patólogos expertos de una forma rápida y sencilla. De menor a mayor tecnificación podemos encontrar diferentes formas de soporte al diagnóstico: Móvil Consulta telefónica normal de una duda. Móvil con cámara incorporada Enviamos una imagen de las lesiones concretas que queremos consultar. Móvil con cámara incorporada y microscopio Podemos enviar imágenes de las lesiones y de lo que encontremos al realizar las pruebas rápidas de diagnóstico, si tenemos habilidad para fotografiar lo que vemos por el ocular. Cámara digital y microscopio Como antes, pero con mayor calidad de imagen Quizás en un futuro no muy lejano, los procedimientos de diagnóstico on-line serán habituales, aunque deberemos seguir siendo cautos. Serán de ayuda, pero nunca sustitutivas. Al final siempre será necesario interpretar lo que encontremos.


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5.- ANEXO I: EJEMPLO DE HISTORIA CLÍNICA

CLIENTE CODIGO

DIRECCION TELEFONO / FAX DIRECCION ELECTRONICA CENTRO DE ORIGEN DE LOS PECES CODIGO DE CENTRO

ESPECIES

TIPO DE AGUA

TEMPERATURAS DEL AGUA REGISTRADAS APETITO

EVOLUCION DE LAS MORTALIDADES DIARIAS

EVOLUCION

OBSERVACION CLÍNICA: NATACIÓN: RESPIRACION: ASPECTO EXTERNO (PIEL, ALETAS, OJOS…): ASPECTO BRANQUIAL:


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NECROPSIA:

MUESTRAS TOMADAS: (Preparaciones en fresco, improntas, sangre, microbiología, virología, histopatología, toxicología…)

DIAGNOSTICO PRELIMINAR DIAGNOSTICO DEFINITIVO TRATAMIENTO RECOMENDADO


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6.- ANEXO II: EJEMPLO DE FICHA DE LESIONES

FICHA DE IDENTIFICACIÓN DE LESIONES EXTERNAS E INTERNAS Nº de caso: Nº de ejemplar: Especie:

Lesiones en piel: Forúnculos... Úlceras... Despigmentación... Hiperpigmentación... Melanosis... Pérdida de escamas... Perdida de piel... Hemorragias ... Petequias... Equimosis ... Presencia de masas algodonosas ...... Cuerpos extraños... Erosiones ... Parásitos... Nodulaciones... Dilataciones.... Vesículas... Otros…………….. Lesiones en branquias: Anemia... Necrosis... Masas amarillentas.... Oscuras... Parásitos...... Hemorragias ... Inflamación .. Mucosidad... Deshilachamiento ... Otros…………….. Lesiones en aletas: Erosiones... Deshilachamiento... Atrofia .... Pérdida parcial ... Total .... Masas extrañas... Parásitos... Hemorragias... Otros……………… Lesiones en ojos: Exoftalmia... Exoftalmia... Microftalmia .... Panoftalmitis... Opacidad corneal... Hemorragias... Pérdida de globo ocular... Presencia de masas extrañas... Otros............. Lesiones en la boca: Hemorragias... Masas extrañas... Material necrótico.... Parásitos.... Otros……… Lesiones en el ano: Ano prolapsado... Hiperémico... Hemorrágico... Otros………………. Lesiones internas: Ascitis .... Inflamación.... Congestión... Hemorragias... Parásitos....... Parásitos... Granulomas... Abscesos.... Nodulaciones .... Otros..................

manual de ictiopatolog

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