MANUAL DE PCR EN TIEMPO REAL PARA ENFERMEDADES

INFECCIOSAS

La Reacción en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real tiene varias ventajas

sobre la técnica convencional; resaltamos el hecho de obviar el paso de

electroforesis, lo cual reduce el tiempo de análisis y entrega de los resultados.

El procedimiento es el mismo en todos los casos, solo cambian los primers,

sondas y controles a usar, según sea solicitado el examen. Se hace el montaje

en el termociclador Applied Biosystems 7300

ADN Polimerasa: Está guardada en nevera a 4°C, el proveedor es EXOGENA

Tels:

Primers y Sondas: Están guardados en el congelador a –20°C y la solución

Stock (900nmol) está en el congelador. En caso de que se terminen los primers

y/o sondas, el proveedor es GENTECH: Ruben Colorado, Tels:

El proveedor de los ADN control es ANNAR: Andrea Perdomo Tels:

A la fecha se cuenta con la siguiente lista de primers y sondas:

Citomegalovirus CMV

Toxoplasma TOXO

Herpes virus I – II HVSI y HVSII

Micobacterium TBC

Poliomavirus BKV

Epstein Barr EBV

PROCEDIMIENTO

1. EXTRACCIÓN DE ADN CON KIT COMERCIAL MARCA FERMENTAS

En un tubo eppendorff mezclar 400 μL de solución de lisis y 200 μL de sangre

total anticoagulada con EDTA e incubar a 65°C por 5 minutos.

Adicionar 600 μL de cloroformo y mezclar hasta crear una emulsión

Centrifugar 2 minutos a 10.000 rpm

Sacar el sobrenadante con mucho cuidado y traspasarlo a un tubo que

contiene una solución diluída y recién preparada de precipitante de

proteínas (720 μL de H2O y 80 μL de solución concentrada)

Mezclar por inversión durante 2 minutos

Centrifugar 2 minutos a 10.000 rpm

Botar completamente el sobrenadante

Agregar 100 μL

1. PRE-PCR: Emplear siempre un plato nuevo

REACTIVOS VOL FINAL (μL)

PRIMER FORWARD (900nmol) 0.55

PRIMER REVERSE (900nmol) 0.55

SONDA 1

ADN POLIMERASA 13.5

ADN 9.4

2. PCR