manual de prÁcticas de microbiologÍa ii enero 2012 texto final con viro

UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRES

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS Y BIOQUIMICAS

CARRERA DE BIOQUIMICA

MENCION MICROBIOLOGIA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE

MICROBIOLOGÍA II

Autores:

Dr. Miguel Estenssoro Cernadas.

Katty Terrazas Aranda MSc. PhD.

Sergio Quisberth Barrera. MSc.

La Paz – Bolivia 2012

Dr. Miguel Estenssoro C.

Katty Terrazas A. MSc. PhD.

Sergio Quisberth B. MSc.

2

Prologo Segunda Edición

En la primera edición se inicio con algunas bases acerca de los métodos diagnósticos

para la detección de diferentes microorganismos a partir de muestras biológicas, sin

embargo en esta segunda edición se incluye nuevas tablas en las cuales se muestran los

factores de virulencia de diferentes bacterias, además los capítulos de Streptococcus y

Enterobacterias son divididos en partes, para una mejor comprensión y análisis de estos

capítulos. También se completa en el capitulo de Enterobacterias las enfermedades

producidas por los miembros de esta familia así como la clasificación de las especies

diarreogénicas de E. coli. Además se completa en el capitulo de bacilos Gram negativos

no fermentadores, donde se incluyen Pseudomonas y Acinetobacter.

En los capítulos de prácticas de Diagnóstico e Investigación en Virología, se realizan 5

sesiones prácticas, desarrolladas mediante trabajo grupal de análisis y discusión de

procedimientos, elaboración de rutas críticas y su aplicación en el diagnóstico de

procesos virales de importancia en salud pública.

Los estudiantes requieren para cada práctica realizar revisión bibliográfica previa del tema

de la práctica, lo que será evaluado a través de un examen previo a la práctica, donde se

consideraran conceptos básicos, patogenia/patología de procesos a estudiar.

El reporte de la práctica incluye el trabajo del cuestionario y las preguntas de la sesión de

prácticas no respondidas, asimismo la participación en cada componente de la práctica es

importante para la asimilación de conocimientos.

Mención Microbiología

Manual de Prácticas de Microbiología II

3

Tabla de contenido

DIAGNOSTICO DE Bacillus spp. ......................................................................................... 4

DIAGNOSTICO DE Clostridium spp .................................................................................... 9

DIAGNOSTICO DE Staphylococcus spp ............................................................................ 13

DIAGNOSTICO DE Streptococcus y Enterococcus spp ..................................................... 19

DIAGNOSTICO DE Enterobacteriaceae ............................................................................. 30

DIAGNOSTICO DE BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES ........... 39

DIAGNOSTICO DE Haemophilus spp ................................................................................ 43

DIAGNOSTICO DE Neisserias spp .................................................................................... 47

DIAGNOSTICO DE Sífilis .................................................................................................. 51

INTRODUCCIÓN A LA TECNOLOGÍA DE DIAGNÓSTICO DE PROCESOS

VIRALES ............................................................................................................................. 56

ESTUDIO DE PROCESOS VIRALES POR PROCEDIMIENTOS DIRECTOS: VIRUS

GASTROINTESTINALES .................................................................................................. 58

ESTUDIO DE PROCESOS VIRALES POR PROCEDIMIENTOS DIRECTOS: VIRUS

RESPIRATORIOS ............................................................................................................... 60

ESTUDIO DE PROCESOS VIRALES POR PROCEDIMIENTOS INDIRECTOS:

HERPES VIRUS .................................................................................................................. 62




4

DIAGNOSTICO DE Bacillus spp. 1. OBJETIVO:

El objetivo es desarrollar en el estudiante la habilidad de poder aislar e identificar a microorganismos pertenecientes al genero Bacillus a partir de muestras biológicas.

Identificar la morfología que presentan estos bacilos mediante una tinción Gram. Determinar la presencia de microorganismos que se encuentran en la placa de sembrado. Observar la formación de esporas e indicar a que especie corresponde

2. MARCO TEÓRICO:

Características

Bacilos Gram positivo, formadores de esporas, aerobios estrictos y anaerobios facultativos, desarrollan formando cadenas de células grandes (Figura 1).

Figura 1. Desarrollo de bacterias del genero Bacillus.

Presentan un tiempo de generación corto (20-30 min), no son exigentes nutricionalmente; son quimiorganotrofos versátiles ya que pueden tener un metabolismo respiratorio y fermentativo, básicamente fermentación butanodiolica.

Algunas especies pueden metabolizar una gran cantidad de fuentes de carbono, incluyendo metanol, celulosa y quitina.

Esporula y germina fácilmente, lo que permite su gran distribución. Además a través de un sub-cultivo en un medio nutritivo suplementado con MnSO4 a una concentración final de 5 μg/ml e

incubación a 37ºC, se logra también favorecer la esporulación.

Presenta alta resistencia al calor y desecado, respondiendo a condiciones hostiles del medio por la formación de esporas.

En placas de agar sangre desarrollan formando hemólisis beta, siendo la excepción el B. anthracis.

Patógenos para humanos y animales

Bacillus anthracis

Bacillus cereus

Bacillus subtilis.



5

Bacillus anthracis.

El carbunco (enfermedad de los animales herbívoros, ovinos y bovinos, equinos, porcinos y caprinos) es causado por el B. anthacis. Es un bacilo recto que mide de 3 a 5 micras de largo y de 1 a 1.2

micras de ancho, es inmóvil. Estos contaminan los pastizales donde se alimentan los animales, ingresan por la ingesta de alimentos espinosos, forman una pseudomembrana en el lugar de inoculación y luego ingresan a torrente sanguíneo produciendo bacteremia y posteriormente la muerte del animal.

Patogenia.

Los seres humanos se infectan de una de tres formas (Figura 2):

1. La vía cutánea. Los microorganismos acceden a través de pequeñas abrasiones o cortes y se multiplican.

2. Inhalación. Los microorganismos son inhalados, se multiplican en los pulmones y son llevados hacia los ganglios linfáticos hiliares de drenaje, donde se produce una necrosis hemorrágica.

3. Ingestión. Rara vez los microorganismos son ingeridos en carne infectada, una vez ingerida en la carne el microorganismo causa invasión y ulceración de la mucosa gastrointestinal.

Figura 2. Enfermedades producidas por Bacillus anthracis. Tomado de Manual CTO.

Bacillus cereus.

Es una causa de enfermedad transmitida por los alimentos que se reconoce con poca frecuencia. Tiene una morfología celular similar a la del B. anthracis pero a diferencia de éste en general es móvil y no es susceptible a la penicilina.

La intoxicación alimentaría por B. cereus puede causar dos síndromes clínicos:

1. Tipo emético: Tiene un periodo de incubación breve de cuatro horas aproximadamente. Se caracteriza por náuseas y vómitos severos y con frecuencia se confunde con la intoxicación alimentaria estafilocócica.




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2. Tipo diarreico: Tiene un periodo de incubación más prolongado (17 hrs.) y se caracteriza por cólicos abdominales y diarrea. Habitualmente se confunde con la intoxicación alimentaria por clostridios.

Bacillus subtilis.

Este es un Bacillus saprofito pero en pacientes inmuno-comprometidos se observo que pueden producir infecciones oportunistas, desde conjuntivitis hasta bacteremia y meningitis.

Identificación en laboratorio.

Morfología de la colonia: Las especies de Bacillus presentan variaciones en cuanto a la morfología de la colonia. Por ejemplo B. anthacis desarrolla de forma óptima en placas de agar sangre formando colonias características, las cuales no presentan hemólisis, están fuertemente adheridas al medio, son de consistencia viscosa y de aspecto como de vidrio esmerilado y con bordes en forma de cabeza de medusa

Por otra parte las colonias de B. cereus y B. thuringiensis suelen ser grandes observándose una β-

hemolisis presentan bordes lisos y B. subtilis produce colonias grandes planas con β-hemólisis.

Test rápidos: El test más rápido para la detección es la tinción Gram donde se visualizan bacilos con borde recto en cadena, pero también se puede emplear tinción de esporas y pruebas bioquímicas.

Test convencionales: Estos se detallan en la Tabla 1.

Requiere un nivel de bioseguridad 2 para el procesamiento de muestras clínicas infectadas con este patógeno.

Tabla 1. Pruebas de identificación para bacterias del Genero Bacillus.

B. cereus B. cereus var mycoides

B. thuringiensis B. subtilis B. anthrancis

Gram. + + + + +

Catalasa + + + + +

Lecitinasa +/- +/- +/- - +

Movilidad +/- - +/- + -

Citrato + + + + +/-

Crec. Rizoide - + - - -

Gluc. Anaeróbica + + + + +

Red. de nitrato +/- +/- + + +

VP + + + + +

3. MATERIAL Y MEDIOS

Material y equipos Medios de cultivo y pruebas

Material biológico

Portaobjetos. Asas. Mechero Bunsen. Charola de tinción. Set de colorantes de Gram. Aceite de inmersión. Microscopio. Estufa a 37ºC

Caldo soya tripticasa Placas de Agar Sangre Agar Gelatina

Cepa de Bacillus subtilis



7

4. PROCEDIMIENTO

El cultivo en CST se deja incubar durante 7 días, para observar la presencia de esporas por tinción de Gram. 5. CUESTIONARIO

1. Indique 5 ejemplos de especies del genero Bacillus. 2. Indique que pruebas se emplean para diferenciar Bacillus de Clostridium. 3. Indique como contribuye a la patogénesis la toxina del ántrax. 4. Usted tiene un animal de su ganado que lo encuentra muerto en el campo.

a) que características observaría para pensar que trata de un posible carbunco. b) para confirma bacteriológicamente como procedería desde la toma de muestra. c) que medidas preventivas asumiría para evitar que su ganado contraiga la enfermedad. d) como usted evitaría un posible contagio de ántrax.

5. Indique 3 pruebas para diferenciar Bacillus anthracis de otros Bacillus. 6. Realice un esquema para el diagnostico de Bacillus. 7. Indique el fundamento de la prueba de licuefacción de la gelatina. 8. Como determinaría la presencia de los genes que codifican para la síntesis de la toxina del

ántrax. 9. Indique cual es el comportamiento de de las diferentes especies de Bacillus con respecto a

la susceptibilidad a antibióticos. 10. Indique como procede en el laboratorio para evidenciar la presencias de capsula en el

Bacillus anthracis.

6. BIBLIOGRAFIA

Apuntes de Prácticas laboratorio de Microbiología II. Estenssoro M, Terceros P y Quisberth S. (2007) Manual de Prácticas de Microbiología II.1 ed. Goldman E y Green L. (2008) Practical Handbook of Microbiology. CRC Press. 2ed. Harley J y Prescott L. (2002) Laboratory Exercises in Microbiology. McGraw-Hill. 5ed.




8

Mac Faddin J. (2003) Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de Importancia Clínica. Panamericana. 3ed.

Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G y Pfaller M. (2002) Microbiología Médica. Elsevier Science. 4ed. Winn W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger P y Woods G. (2008) Koneman

Diagnostico Microbiológico Texto y Atlas en Color. Panamericana. 6ed.



9

DIAGNOSTICO DE Clostridium spp 1. OBJETIVO:

El objetivo es desarrollar en el estudiante la habilidad para poder aislar e identificar a microorganismos pertenecientes al genero Clostridium a partir de muestras de origen biológico.

2. MARCO TEÓRICO:

Características principales

Los clostridios son bacilos grandes móviles, Gram positivos y anaerobios estrictos, son formadores de esporas que deforman su morfología, muchos descomponen proteínas, forman toxinas o ambas cosas (Figura 1).

Figura 1. Desarrollo de bacterias del genero Clostridium.

Son bacterias anaerobias estrictas ya que no producen catalasa y SOD, sin embargo algunos son aerotolerantes logrando soportar bajas concentraciones de oxigeno (microaerofilia), convirtiéndose este un elemento toxico para estos microorganismos (Figura 2).

Figura 2. Efecto del oxigeno en bacterias aerobias y anaerobias.




10

Pueden ser patógenas por Producción de toxinas (C. tetanii, C. botulinum) Destrucción de tejidos (C. perfringens)

Son los agentes causantes de la «putrefacción de la carne» (descomposición anaerobia de las proteínas).

Rutas fermentativas de las bacterias del género Clostridium.

Presentan una gran variedad de rutas de fermentación: Fermentación de azúcares polimerizados Fermentación del butanol Fermentación acoplada de aminoácidos (disimilación anaerobia de aminoácidos). Fermentación no acoplada de aminoácidos (producción de piruvato) Fermentación de compuestos cíclicos que tienen N2 (por ejemplo: bases nitrogenadas). Fermentación de productos del metabolismo secundario.

Morfología e identificación.

Las bacterias del genero Clostridium se caracterizan por producir esporas que en algunos casos (C. tetani) tienen un diámetro mayor al de los bastoncillos deformando su morfología. Casi todos los clostridios son móviles y poseen flagelos perítricos.

Cultivo.

Crecen solamente en condiciones de anaerobiosis, mediante el método de Gaspack System (BBL) que genera un ambiente de anaerobiosis o en medios líquidos en tubos de ensayo con tejidos de animales que proporcionan proteínas para el desarrollo (carne cocida), o con agentes reductores que generan un potencial redox negativo (Caldo tioglicolato). Se emplean diferentes metodologías para la identificación de las especies de Clostridium que pueden encontrarse causando una enfermedad (Figura 3).

Figura 3. Marcha de procesamiento para bacterias del genero Clostridium.



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Características del crecimiento.

Algunos microorganismos producen colonias grandes, elevadas, con bordes enteros, otros producen colonias más pequeñas, cuyos bordes se extienden en forma de red de finos filamentos. Muchos clostridios producen una zona de hemólisis en agar de sangre.

Los bacilos anaerobios son incapaces de utilizar el oxígeno como aceptor final de hidrógeno; carecen de de citocromo oxidasa y son incapaces de destruir el peróxido de hidrógeno porque carecen de catalasa y peroxidasa. Pueden fermentar una variedad de azúcares; muchos digieren proteínas.



Material biológico

Portaobjetos. Asas. Mechero Bunsen. Charola de tinción. Set de colorantes de Gram. Aceite de inmersión. Microscopio. Estufa a 37ºC Latas de acero Velas, Alka seltzer, virutilla.

Caldo Carne cocida Caldo tioglicolato Placas de Agar Sangre Agar yema de huevo Caldo Leche tornasol

Heces de burro

4. PROCEDIMIENTO

5. CUESTIONARIO

1. Cual es el significado relativo de potencial de oxido – reducción versus oxigeno atmosférico en relación con la supervivencia y el crecimiento de las bacterias anaerobias.




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2. Indique cuales son los 5 géneros propuesto por Collins y colaboradores para el género Clostridium esto debido a su gran heterogeneidad.

3. Indique como se realiza la técnica de cultivo mediante el sistema GasPack y como es que las bacterias anaerobias logran desarrollar.

4. Si Usted no cuenta con el sistema GasPack como lograría cultivar las bacterias anaerobias en el laboratorio.

5. Indique 2 especies de Clostridium que pueden ser aerotolerantes y crecer en un medio de Agar sangre en un ambiente de 5 –10 %de CO2.

6. Cual es el significado metabólico bioquímico de la aero-tolerancia. 7. Indique cuales son las 3 pruebas claves para el diagnóstico de C. perfringens. 8. Explique porqué se observa hemolisis doble en el desarrollo de C. perfringens en placas de agar

sangre. 9. Indique que método puede emplear para la determinación de enterotoxina de C. perfringens. 10. Qué técnica emplearía para determinar la producción de la toxina alfa, beta, delta, épsilon del C.

perfringens. 11. Como determina si la gangrena gaseosa es producida por especies de Clostridium diferentes a C.

perfringens. 12. Indique mediante que pruebas se realiza el diagnóstico de colitis pseudomembranosa. 13. Como se procede para el diagnóstico de botulismo del lactante. 14. Indique cuatro características utilizadas para diferenciar un posible aislamiento de C. tetani de una

muestra de herida de otros clostridios. 15. Cual es el fundamento de las pruebas lecitinasa y lipasa 16. Que prueba utilizaría para demostrar la presencia de toxina botulínica en una muestra de sangre de

una paciente con botulismo, indique la técnica a detalle. 17. Indique por que no se puede realizar el Método de Kirby-Baüer a los anaerobios, y cómo se hacen

las pruebas de susceptibilidad para estos. 18. Se puede realizar la prueba de E-test para anaerobios?, justifique su respuesta. 19. Como se realiza la identificación de Clostridium por el método de cromatografía gas-liquido, y

presentar un resultado de cromatografía de una especie de Clostridium indicando como se tipifica dicha especie.

6. BIBLIOGRAFIA

Apuntes de Prácticas laboratorio de Microbiología II. Estenssoro M, Terceros P y Quisberth S. (2007) Manual de Prácticas de Microbiología II.1 ed. Harley J y Prescott L. (2002) Laboratory Exercises in Microbiology. McGraw-Hill. 5ed. Mac Faddin J. (2003) Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de Importancia Clínica.

Panamericana. 3ed. Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G y Pfaller M. (2002) Microbiología Médica. Elsevier Science. 4ed. Winn W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger P y Woods G. (2008) Koneman




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DIAGNOSTICO DE Staphylococcus spp 1. OBJETIVO:

El objetivo es desarrollar en el estudiante la habilidad para poder aislar e identificar a microorganismos pertenecientes al genero Staphylococcus a partir de muestras biológicas.

2. MARCO TEÓRICO: Características

El género Staphylococcus está compuesto por cocos Gram positivos dispuestas en grupos debido a que la división celular, que se realiza en planos perpendiculares entre sí, y no se logra la separación completa de las células hijas, quedando adheridas unas a otras formando “racimos” (Figura 1).

Figura 1. División de los microorganismos del genero Staphylococcus.

Estos microorganismos son anaerobios facultativos, inmóviles y no esporulados. Producen la enzima

catalasa, pueden desarrollar en medios simples y toleran altas concentraciones de sal. El género está compuesto por 32 especies, pero en clínica humana sólo 3 son de importancia: S. aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus. Patogenia de S. aureus

El principal mecanismo de transmisión de esta bacteria es a través de manos contaminadas. Por esta razón, la medida de prevención más importante para evitar infecciones por este agente es el lavado de manos prolijo y frecuente. S. aureus posee una amplia gama de factores de virulencia que se pueden dividir en estructurales y no estructurales. Los primeros incluyen aquellos que forman parte de la estructura bacteriana y consisten en:

1. Péptidoglicano: Posee importantes actividades biológicas tales como inducción de IL1, atracción de PMN, activación del complemento e inducción de anticuerpos opsónicos entre otras.

2. Acido teicoico: Participaría en la capacidad de adherencia del microorganismo. 3. Proteína A: Está incorporada a la porción externa de la capa de péptidoglicano y es capaz de

unir la fracción Fc de las IgG, evitando la fagocitosis. 4. Cápsula: Su formación es variable. Algunas cepas la poseen y otras no. Tendría un rol

antifagocitario.

En cuanto a los factores de virulencia no estructurales, éstos se refieren a las enzimas y toxinas producidas por la bacteria.

SARM:

S. aureus era originalmente sensible a penicilina. Sin embargo se reportaron posteriormente casos de resistencia a penicilina debido a la producción de una beta lactamasa; introduciéndose la meticilina (pariente de la cloxacilina) como antibiótico resistente a esta penicilinasa (generalmente codificada en plasmidios).




14

Sin embargo, en 1961 se identificó S. aureus meticilino resistente (SAMR) en Inglaterra. En U.S.A. apareció esporádicamente en 1965 hasta que en 1981 emergió en forma importante causando numerosos brotes. Actualmente, la mayoría de los hospitales presentan una situación de endemia en relación a este microorganismo.

La meticilino-resistencia es de origen cromosomal e involucra a todos los beta lactámicos incluyendo

a las cefalosporinas. Se asocia a la aparición de una proteína fijadora de penicilina (PBP) alterada. Estas proteínas son muy importantes en la síntesis de la pared celular y generalmente presentan alta afinidad con los antibióticos beta lactámicos. Sin embargo, en las cepas meticilino resistentes, aparece una PBP llamada PBP2a asociada a la presencia del gen mecA. Si bien todos los SAMR tienen la habilidad genética de

expresar resistencia frente a los antibióticos beta lactámicos, frecuentemente sólo 1 célula en 104-10

8 la

manifiesta. Este fenómeno, llamado hetero-resistencia, constituye un problema en el laboratorio, pues si no se considera podría informarse una cepa resistente como sensible. Para reducir este riesgo el máximo posible, se estimula la expresión del gen de resistencia in vitro, incubando el antibiograma por 24 horas y a

temperaturas menores (30º-35º C), entre otras técnicas.

Tabla 1. Clasificación de S. aureus.

Tipo de S. aureus. Genes de Resistencia

Producto del gen Mecanismo de resistencia

Comentario

Meticilina susceptible MSSA.

mecA (-). Proteína de unión a penicilina (PBP) normal

Afinidad por el antibiótico.

Susceptible a penicilinas, cefalosporinas y otros β-lactámicos.

Bordeline resistente BRSA o BORSA

blaZ, mecA (-). β-lactamasa Hidrólisis enzimático del núcleo β-lactámico

Hiperproducción de β-lactamasa

(MIC´s 1 a 2 μg/ml)

Meticilina Resistente SARM o ORSA

mecA. PBP2a Baja afinidad al antibiótico.

Meticilina resistente y a los β-lactámicos resistentes a β-lactamasa (MIC > 16 μg/ml).

Vancomicina intermedio resistente VISA o Glicopeptido intermedio GISA

van Peptidoglicano alterado D-Ala-D-Lac

Síntesis de un dipéptido que reduce la afinidad de la vancomicina.

Vancomicina MIC 8 a 16 μg/ml

(La mayoría es MIC < 2 μg/ml).

Staphylococcus epidermidis

Es parte de la flora microbiana normal de piel y mucosas, que no tiene la capacidad de producir la enzima coagulasa, razón por la que se encuentra incluido en el grupo de estafilococos coagulasa-negativos. Sin embargo tiene la capacidad de adherirse a superficies extrañas (como catéteres y sondas) debido a que produce una capa de polisacárido extracelular (Limo) la cual se une a los catéteres y las derivaciones, al tiempo que protege al microrganismo de la acción de antibióticos y las células inflamatorias. Una proporción mayor al 50% de las infecciones por catéteres se encuentran asociadas a los estafilococos coagulasa-negativos, convirtiéndose en un problema medico de gran importancia, ya que el uso de catéteres de larga duración son empleados generalmente el pacientes graves.

Figura 2. Morfología de Staphylococcus epidermidis.



15

Staphylococcus saprophyticus

Es agente de infección del tracto urinario en mujeres en edad fértil (principalmente adolescentes) y en pacientes hombres con catéter urinario. También es un Staphylococcus coagulasa negativo. Identificación en Laboratorio.

El diagnóstico microbiológico de especies de estafilococos, al igual que el de la mayoría de las bacterias, incluye las siguientes etapas:

1. Tinción Gram de la muestra: Se observan cocos Gram positivos agrupadas en racimo y también aislados.

2. Siembra y cultivo: Son bacterias poco exigentes nutricinalmente, que crecen en la mayoría de los

medios de cultivo. Generalmente se siembra en agar sangre donde las colonias se ven grandes (2-3 mm de diámetro), de color dorado (S. aureus) debido a la presencia de carotenos y usualmente

rodeadas de un halo de alfa hemólisis y sin pigmebtaciós o grisáceas para los coagulasa negativos. Se incuba a 35-37

oC en atmósfera ambiental por 18 a 24 horas.

3. Identificación: Se basa en las características macroscópicas del cultivo, la tinción de Gram de las

colonias (suele verse mejor la agrupación en racimo cuando la tinción se realiza a partir de un cultivo en medio sólido) y pruebas bioquímicas como la catalasa (es positiva) y la coagulasa (es positiva).

4. Antibiograma: Presentan sensibilidad antibiótica variable ya que poseen diversos mecanismos de resistencia antimicrobiana. De todas ellas la más importante por su implicancia en el tratamiento es la resistencia a la meticilina, por esta razón se debe hacer el tamizaje a la oxacilina.



Material biológico

Portaobjetos. Asas. Mechero Bunsen. Charola de tinción. Set de colorantes de Gram. Aceite de inmersión. Microscopio. Estufa a 37ºC Solución fisiológica Azul Tripan 0,4% PBS pH 7.4

Placas de Agar Sangre Agar Manitol Salado Caldo BHI Agua Oxigenada Agar Müller-Hinton Discos de Novobiocina Caldo BHI-Sac (Anexo 1) Caldo TSB-Glu (Anexo 1) Placa de Rojo Congo Agar CRA (Anexo 1)

Cepa de S. aureus Cepa de S. epidermidis Cepa de S. saprophyticus Plasma Sanguíneo




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4. PROCEDIMIENTO

Prueba de desarrollo de Biofilms por Staphylococcus epidermidis Método de Christensen et al. 1982 prueba en tubo



17

Método de Freeman et al. 1989 prueba en placa

5. CUESTIONARIO

1. Qué es correcto decir Staphylococcus aureus o Staphylococcus aureus subesp aureus y porqué?

2. Cite cinco enfermedades asociadas a estafilococos coagulasa negativos. 3. Explique brevemente como se produce la infección por Staphylococcus epidermidis. 4. Indique que pruebas realizaría para diferenciar Staphylococcus de Micrococcus. 5. Indique como se realiza la prueba de la catalasa. Fundamento de esta. Y finalidad del test. 6. Cómo se realiza la prueba de la coagulasa: a) Ligada y b) Libre. 7. Cual es el principio de la prueba de la coagulasa. Indicando las diferencias de acción de la

coagulasa ligada y coagulasa libre. 8. Indique dos métodos alternativos para determinar la producción de coagulasa por

Staphylococcus aureus. 9. Cómo diagnostica Staphylococcus saprophyticus. Fundamento de la prueba. 10. Indique como se debe realizar el antibiograma para los estafilococos. 11. Si usted determina que un estafilococo es presumiblemente SARM como procede para hacer su

tamizaje. 12. Indique para que se emplea la prueba del manitol salado en el diagnostico de estafilococos. 13. Indique que es el medio Baird Parker. Para que se utiliza y como se debe interpretar el

desarrollo bacteriano en este medio. 14. En el laboratorio que desventaja muestra el hecho de emplear plasma humano para realizar el

test de la coagulasa, y que desventaja se tendría si se tratase de plasma proveniente de un paciente con daño hepático.

15. Realice un flujograma de identificación der los estafilococos coagulasa negativos. 16. Como determina si un estafilococo coagulasa negativo es meticilino resistente, fundamente su

respuesta. 17. Indique como se determina si fenotípicamente la presencia del gen mecA en estafilococos

coagulasa negativos, y cual su importancia clínica. 18. En un periodo de tres semanas, un total de 5 recién nacidos en el cunero del Hospital de la

Mujer, tuvieron infecciones por S. aureus con bacteriemia por el mismo; los aislados presentaron una misma morfología de colonia, propiedades hemolíticas, y patrones de susceptibilidad antimicrobiana los que sugiere que se trata de la misma cepa.

a) Como determina por métodos moleculares, si las cepas de Staphylococcus son la misma (Explique la técnica).

b) Que se debe hacer para el control de este brote.

6. BIBLIOGRAFIA

Apuntes de Prácticas laboratorio de Microbiología II.




18

Christensen GD, Simpson WA, Younger JJ, Baddour LM, Barrett FF, Melton DM, Beachey EH. (1985) Adherence of coagulasenegative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices. J Clin Microbiol Vol 22. Pag: 996 –1006.

Christensen GD, Simpson WA, Anglen JO, Gainor BJ. (2000) Methods for evaluating attached bacteria and biofilms. In: An YH and Friedmann RJ, editors. Handbook of Bacterial Adhesion. Principles, Methods, and Applications. Totowa, New Jersey: Humana Press

Estenssoro M, Terceros P y Quisberth S. (2007) Manual de Prácticas de Microbiología II.1 ed. Freeman DJ, Falkiner FR, Keane CT (1989). New method for detecting slime production by

coagulase-negative staphylococci. J Clin Pathol Vol. 42. Pag: 872– 874. Gamazo C, Lopez-Goñi I y Diaz R. (2005) Manual Práctico de Microbiología. Masson. 3 ed. Goldman E y Green L. (2008) Practical Handbook of Microbiology. CRC Press. 2ed. Harley J y Prescott L. (2002) Laboratory Exercises in Microbiology. McGraw-Hill. 5ed. Mac Faddin J. (2003) Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de Importancia Clínica.

Panamericana. 3ed. Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G y Pfaller M. (2002) Microbiología Médica. Elsevier Science. 4ed. Sacsaquispe R y Ventura G. (2005) Manual de procedimientos Bacteriología en infecciones

Intrahospitalarias. Ministerio de Salud del Perú. Winn W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger P y Woods G. (2008) Koneman




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DIAGNOSTICO DE Streptococcus y Enterococcus spp

1. OBJETIVO:

El objetivo es desarrollar en el estudiante la habilidad para poder aislar e identificar a microorganismos pertenecientes al género Streptococcus y Enterococcus a partir de muestras clínicas.

2. MARCO TEÓRICO:

Características de los Streptococcus

Los géneros Streptococcus y Enterococcus están formados por bacterias esféricas u ovoides (Figura 1.) que crecen en pares o cadenas de longitud variable. La mayoría son anaerobios facultativos, existiendo algunas especies anaerobios obligados. Son Gram positivos, no formadores de esporas, catalasa negativa, inmóvil y tienen complejos y variables requerimientos nutricionales.

Figura 1. División de las bacterias de genero Streptoccocus y Staphylococcus.

La infección estreptocócica es una de las más frecuentes, siendo algunos de los cuadros más importantes relacionados con el género: amigdalitis aguda, otitis media, sinusitis, neumonía, meningitis, infección del tracto urinario, abdominal o cutáneo.

Las infecciones más frecuentemente asociadas con el género Enterococcus son endocarditis, las

infecciones urinarias y la colonización/sobre infección de enfermos que reciben tratamiento con antimicrobianos, especialmente cefalosporinas.

La clasificación de especies dentro de este género es complicada, debido a esta situación se

emplean tres esquemas que son los siguientes (Tabla 1):

Propiedades serológicas: Grupos de Lancefield. Patrones hemolíticos en placas de agar Sangre. Pruebas bioquímicas.




20

Tabla 1. Clasificación de las especies de Streptoccocus.

Grupo Lancefield

Hemólisis en PAS

Bacitracina SXT CAMP PYR Bilis Esculina

Caldo 6,5 NaCl

Hidrólisis Hipurato

Optoquina

Grupo A β S R - + - - - R

Grupo B β o γ R R + - - V + R

Grupo C, F y G

β V S - - - - - R

Enterococos α o γ R R - + + + V R

Grupo D no Enterococos

α o γ R S - + + - - R

Viridans α V S - V v - V R

Neumococo α V S - - - - - S

S= Sencible, v= variable, R= Resistente

PARTE 1 DIAGNOSTICO DE ESTREPTOCOCOS BETA-HEMOLITICOS

Streptococcus pyogenes (Grupo A)

La infección respiratoria más frecuente producida por este agente es la faringoamigdalitis aguda y en algunos casos se puede identificar en cuadros de otitis media y sinusitis. A diferencia de otros microorganismos asociados a infecciones respiratorias, posee la capacidad de provocar una enfermedad aguda y secuelas no supurativas tipo enfermedad reumática y glomerulonefritis, factores importantes a considerar en la erradicación del germen de la faringe.

Figura 2. Morfología de los Streptoccocus Grupo A.

Caracteristicas del Streptococcus pyogenes: Son cocos Gram positivos de 0,5 - 2 um de diámetro, anaerobios facultativos, crecen en pares o en cadenas en medio líquido (Figura 2), son inmóviles, no formadores

de esporas, capsulados, requieren medio nutricionalmente rico y una baja tensión de oxigeno para su desarrollo. Su energía la obtienen a través de un metabolismo de tipo fermentativo, produciendo principalmente lactato, pero no de gas. Son catalasa (-). Generalmente atacan glóbulos rojos provocando lisis total (beta hemólisis). El rango de la temperatura de crecimiento varía entre 25 – 45°C (óptima: 37°C). En la tinción directa de muestras clínicas se observan cadenas cortas, en cambio en los medios de cultivo líquidos se forman cadenas mas largas. El crecimiento óptimo es en agar sangre, pero se inhibe cuando el medio contiene una alta concentración de glucosa. A las 24 horas de incubación a 37°C se formar colonias blancas de 1 - 2 mm. con una marcada zona de beta hemólisis.



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Este patogeno posee un gran arsenal de factores de virulencia que favorecen la infección al huesped, entre los cuales podemos encontrar proteinas de unión (Proteina M, Proteina tipo M y Proteina F), pero tambien tiene la capacidad de producir una amplia variedad de toxinas (Exotoxinas pirógenas, Estreptolisina S, Estreptolisina O, Estreptocinasa, DNasa y C5a peptidasa). Todo este conjusto de factores de virulencia hacen de este patógeno unos de los mas peligrosos. Diagnostico de Laboratorio para Streptococcus del grupo A

Muestras clínicas: Exudado faríngeo, secreción de lesiones cutáneas, tejidos y líquidos estériles.

Cultivo: Las muestras se siembran en agar sangre, se incuban 18 a 24 horas. Las colonias son puntiformes

beta hemolíticas, catalasa negativa y su diagnóstico presuntivo se realiza mediante la prueba de susceptibilidad a la bacitracina y PYR, y su confimación mediante serología con anticuerpos específicos.

Detección de anticuerpos: Estas pruebas se utilizan en el estudio de secuelas post-estreptocócicas y

consisten en detectar la presencia de antiestreptolisina O y antiDNAsa b en suero.

Streptococcus agalactiae (Grupo B)

Streptococcus agalactiae o estreptococo beta hemolítico del grupo B (SGB) fue reportado como

patógeno humano por primera vez en 1935 por Fry, quien describió tres casos de sepsis puerperal. Sin embargo, no fue hasta 1960 que varios autores señalaron la existencia de patología asociada a este microorganismo, indicando que ésta era más frecuente de lo considerado hasta esa fecha.

Caracteristicas del Streptococcus agalactiae: Es un coco Gram positivo, catalasa y oxidasa

negativa, anaerobia facultativa, inmóvil y no esporulada, que se presenta formando cadenas de longitud variable. Este microorganismo puede desarrollar en medios simples, aunque los medios enriquecidos favorecen su desarrollo. Tras 18-24 horas de incubación en agar sangre, las colonias son de unos 2 mm de diámetro, blanco grisáceas y presentan un pequeño halo de beta hemólisis a su alrededor. Para facilitar la recuperación de este agente de muestras polimicrobianas como las genitales, gastrointestinales o en mujeres embarazadas, se utilizan medios selectivos suplementados con antibióticos.

Una de las características mas importantes de este microorganismo es la capacidad de producir el

factor CAMP, que se emplea para su diferenciación frente a Streptococcus pyogenes (Figura 3).

Figura 3. Resultados de Test CAMP. (A: positiva Streptococcus agalactiae y B: negativo Streptococcus pyogenes)




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Material biológico


Placas de Agar Sangre Agua Oxigenada Discos de Bacitracina Discos de SXT

Cepa de S. aureus Cepa de S. pyogenes Cepa de S. agalactiae.

4. PROCEDIMIENTO Determinación de Streptococcus β Hemoliticos (Grupo A y B)



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PARTE 2 DIAGNOSTICO DE ESTREPTOCOCOS ALFA-HEMOLITICOS

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae es un diplococo Gram positivo, capsulado, es un patógeno extracelular y su virulencia está asociada fundamentalmente a la producción de cápsula (Figura 4). Pese a que su descubrimiento fue hace más de 100 años, este agente continúa siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad. Griffith en la década de 1920, demostró la capacidad de transformación de esta bacteria, al observar que neumococos vivos no capsulados inyectados en el peritoneo de ratón, junto a neumococos capsulados destruidos por el calor, determinaban la aparición de bacterias capsuladas viables.

Caracteristicas del Streptococcus pneumoniae: El neumococo es un coco Gram positivo

encapsulado (Figura 4). Las células miden 0,5 a 1,2 μm, tienen forma oval o lanceolada y adoptan una

agrupación en pares o en cadenas cortas. Son anaerobios facultativos, catalasa negativos. Son solubles en

sales biliares y producen una hemólisis en agar sangre. Son susceptibles a optoquina. Requieren medios enriquecidos para desarrollarse.

Figura 4. Streptococcus pneumoniae. (Izq: La capsula confiere protección frente a la fagocitosis y Der:

Streptococcus pneumoniae en tinción donde se visualiza la capsula)

La cápsula permite su clasificación en alrededor de 90 serotipos distintos, lo que se realiza mediante la reacción de Quellung. Para esta prueba los anticuerpos anticapsulares se mezclan con la bacteria y la reacción es positiva cuando aparece aumento de la refracción alrededor de Streptococccus pneumoniae, lo que se visualiza a microscopía. Diagnostico de Laboratorio para Streptococcus del grupo A

Muestras clínicas: LCR., sangre, líquido articular, peritoneal o de otros sitios estériles. Secreciones

provenientes del tracto respiratorio. Tinción de Gram: Se observan diplococos Gram positivos, lo que permite hacer un diagnóstico

presuntivo. Cultivo: En agar sangre, requiere incubación en atmósferas con 5% de CO2. En este medio se visualiza

la hemólisis y la aplicación de pruebas bioquímicas tales como disco de optoquina y solubilidad en

bilis permiten diferenciarlo de otros Streptococcus hemolíticos. El diagnóstico definitivo se realiza

aplicando la reacción de Quellung. Detección de antígenos: El polisacárido capsular soluble se puede detectar con rapidez en líquidos

estériles Ej.: En el LCR se puede detectar con técnicas de aglutinación del látex o de contra inmunoelectroforesis.




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Susceptibilidad antimicrobiana: Se realiza con diferentes técnicas.

- Técnica de difusión en disco. Para evaluar la susceptibilidad a penicilina se utiliza un disco de

oxacilina de 1ugr. Se considera resistente, cuando el halo de inhibición es menor o igual a 20 mm. Es una técnica cualitativa sensible y específica.

- E-TEST: Es una técnica cuantitativa que permite medir Concentración Inhibitoria Mínima (CIM).

Tiene buena correlación con los métodos “gold standard” para evaluar susceptibilidad del S. pneumoniae, que son los de dilución en agar y macrodilución en caldo.

El comité internacional de estandarización de procedimientos de laboratorio clínico (National Committee for Control of Laboratory Standards, NCCLS), ha establecido los siguientes niveles de CIM para el diagnóstico de cepas de S. pneumoniae sensibles o resistentes a Penicilina y Cefotaxima (Tabla 2).

Tabla 2: Niveles de resistencia de Streptococcus pneumoniae a Penicilina y Cefotaxima según CIM.

El mecanismo de resistencia de Streptococcus pneumoniae a Penicilina se debe a la alteración de las proteínas fijadoras de penicilina (PBP), fenómeno debido a la recombinación genética de ADN entre diferentes especies.

Streptococcus viridans

El grupo de los estreptococos viridans es un grupo heterogéneo de estreptococos hemolíticos y no hemolíticos, cuyo nombre de grupo deriva de viridis (del latín verde), un reflejo del hecho de que estas producen un pigmento verde en placas de agar sangre. Actualmente se han registrado 6 grupos que se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3: Clasificación de Streptococcus del grupo viridans.

Grupo Especies S. anginosus S. anginosus, S. constellatus, S. intermedius

S. bovis S. bovis, S. alactolyticus, S. equinus S. mitis S. mitis, S. sanguis, S. parasanguis, S.

gordonii, S. crista, S. oralis

S. mutans S. mutans, S. sobrinus, S. cricetus, S. rattus, S. downei, S. macacae

S. salivarius S. salivarius, S. vestibularis, S. thermophilus

Sin agrupar S. acidominimus, S. suis

Esta clasificación esta basada en metodos tradicionales, con reacciones de idetificación similares a el

neumococo, pero tambien se toma en cuenta algunas caracterisitcas metabolicas y el uso de herramientas moleculares (16S rRNA).

Caracteristicas del Streptococcus viridans: Como la mayoría de los estreptococos, las especies del

grupo viridans son nutricionalmente exigentes, requiriendo medios suplementados con sangre y vitamina B6, así como un ambiente con 5-10% de CO2. Inicialmente estos microorganismos pueden crecer en medios suplementados con sangre, pero al ser subcultivados no desarrollan en medios que carezcan de piridoxal.



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Estos estreptococos colonizan la orofaringe, el tracto gastrointestinal y el tracto genitourinario, colonizando rara vez la piel a causa de que los ácidos grasos de dicha superficie son tóxicos para ellos. Es por esta razón que se encuentran asociados a infecciones en la placa dental, endocarditis aguda e infecciones supurativas intraabdominales.



Material biológico

Portaobjetos. Asas. Mechero Bunsen. Charola de tinción. Set de colorantes de Gram. Aceite de inmersión. Microscopio. Estufa a 37ºC Tinta China Solución Sulfato de cobre a 20%

Placas de Agar Sangre Agua Oxigenada Discos de Optoquina Caldo con sales biliares Solución fisiológica

Cepa de S. viridans Cepa de S. pneumoniae

6. PROCEDIMIENTO Determinación de Streptococcus α Hemoliticos (Grupo S. pneumoniae y S. viridans)

Para la visualización de la capsula producida por neumococo se pueden realizar dos tipos de tinciones:




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Método de Burri o tinción negativa

Método de Antony



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PARTE 3 DIAGNOSTICO DE ENTEROCOCOS

Enterococcus

Desde el establecimiento del género Enterococcus con los estudios quimiotaxonómicos y filogenéticos realizados, se han transferido y descrito nuevas especies en este género por lo que su complejidad aumenta y la diferenciación de algunas de estas especies resulta problemática debido a la coincidencia de características fenotípicas.

Los enterococos son cocos grampositivos, catalasa negativa, inmóviles, anaerobios facultativos y no forman endosporas ni cápsulas (Figura 5). Entre las características fisiológicas que distinguen al género Enterococcus se encuentra la habilidad para crecer en presencia de 6,5 % de ClNa y pH 9,6.

Figura 5. Infección por Enterococcus

Desafortunadamente, no existe una característica de las mencionadas que sea única para este

género; las cepas de bacterias en forma de cocos, Gram positivos y catalasa negativa de los géneros Streptococcus, Lactococcus, Aerococcus, Gemella, Leuconostoc y Lactobacillus pueden mostrar una o más de las características típicas del Enterococcus.

El género Enterococcus se ha revelado como causa de infecciones nosocomiales y de una variedad de infecciones adquiridas en la comunidad, además de ser intrínsicamente resistentes a un número de agentes antimicrobianos, es por esta razón que para su tratamiento se emplea combinaciones de un aminoglucosido con un antibiótico que inhiba la sistesis de la pared celular. Entre las especies de mayor importancia clínica se destacan, Enterococcus faecalis que constituye el 85-90 % de los aislamientos en la mayoría de los laboratorios y Enterococcus faecium del 5-10 % de las cepas detectadas clínicamente.

Crecen fácilmente en medios comunes no selectivos, pese a poseer características similares a los

Streptococcus, estos son fácilmente diferenciables por pruebas bioquímicas: Son capaces de hidrolizar la esculina en presencia de 40 % de bilis y poseen la enzima pyrrolidonyl arylamidasa (PYR positivo). 7. MATERIAL Y MEDIOS


Material biológico


Placas de Agar Sangre Agua Oxigenada Agar Bilis Esculina Caldo 6,5 de NaCl Discos de Optoquina Solución fisiológica

Cepa de E. faecium Cepa de E. fecalis




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8. PROCEDIMIENTO Determinación de Enterococcus

9. CUESTIONARIO

1. Explique brevemente que es el factor de opacidad de los estreptococos del grupo A. 2. Que es la PspA del Neumococo y cual es su función en la patogenia. 3. Indique la diferencia entre enfermedad de comienzo precoz y la enfermedad de comienzo tardío

en la infección producida por S. agalactiae. 4. Defina:

a) α hemólisis b) β hemólisis c) γ hemólisis d) α prima hemólisis

5. Indique porque para el diagnostico de los estreptococos no se usan medios de cultivo que

contengan carbohidratos. 6. Indique porque la concentración de sangre en el medio de cultivo es muy importante. 7. De ejemplo de dos técnicas directas de detección de S. pyogenes. Indique cual es la ventaja y

desventaja de cada una de esas técnicas. 8. Indique cual es la utilidad de la utilización de Sulfametoxazol/Trimetoprim para el aislamiento de

S. pyogenes. 9. Dentro de las bacterias que pueden producir infección en el ser humano se encuentran bacterias

que se parecen mucho a los estreptococos, antes la observación de la hemólisis y la prueba de la catalasa eran pruebas presuntivas de diagnostico previo de estreptococos pero estas bacterias son hemolíticas y también catalasa negativas. Indique que pruebas adicionales se pueden realizar para diferenciar a los estreptococos de estas bacterias.

10. Indique como se realiza la prueba de susceptibilidad a la Bacitracina y como se garantiza que esta se esté realizando solo para el diagnostico del S. pyogenes.



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11. Indique cual es la morfología de una colonia de S. pneumoniae y que influye en la presentación y tamaño de esta.

12. Indique como se realiza la prueba de CAMP y cual es su fundamento. 13. La prueba de CAMP en la actualidad no es la única prueba utilizada para la identificación del S.

agalactiae sino que existen dos pruebas adicionales. Indique cuales son estas y como se realizan.

14. Durante la práctica de identificación de estreptococos para la identificación de S. agalactiae se realizo la prueba de CAMP, la cual no dio como positiva siendo que la cepa empleada era un S. agalactiae. Fundamente porque esta prueba no dio positivo.

15. Porque las bacterias Gram positivas causan enfermedades respiratorias con más frecuencia que las Gram negativas.

16. Cuales son los síntomas típicos de una infección respiratoria estreptocócica. Porque las enfermedades respiratorias deben tratarse con prontitud.

17. Indique que es la prueba de la Bilis Esculina, como se realiza y cual es su fundamento. 18. Indique cual es el fundamento y como se realiza la prueba de tolerancia al NaCl al 6,5%. 19. Indique como se realiza y cual es el fundamento de la prueba de la Optoquina y Solubilidad en

Bilis para la identificación de neumococos. Y como se realizan estas pruebas.

10. BIBLIOGRAFIA

Apuntes de Prácticas laboratorio de Microbiología II. Estenssoro M, Terceros P y Quisberth S. (2007) Manual de Prácticas de Microbiología II.1 ed. Goldman E y Green L. (2008) Practical Handbook of Microbiology. CRC Press. 2ed. Harley J y Prescott L. (2002) Laboratory Exercises in Microbiology. McGraw-Hill. 5ed. Mac Faddin J. (2003) Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de Importancia Clínica.







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DIAGNOSTICO DE Enterobacteriaceae 1. OBJETIVO:

El objetivo es desarrollar en el estudiante la habilidad para poder aislar e identificar a microorganismos pertenecientes a la Familia Enterobacteriacea, a partir de muestras biológicas.

2. MARCO TEÓRICO:

Características de las enterobacterias

El grupo de las Enterobacterias, nombre utilizado para referirse a la Familia Enterobacteriaceae, incluye a bacilos Gram (-), aerobios y anaerobios facultativos, la mayoría de ellos móviles mediante flagelos perítricos. Como característica común tienen la capacidad de fermentar la glucosa; son oxidasa negativos y reducen los nitratos a nitritos, con algunas excepciones (Tabla 1).

Tabla 1. Rasgos fenotípicos de la familia Enterobacteriaceae

Carácter Marcador de Familia Excepción

Formación de espora (-) Serratia marcescens (algunos)

Oxidasa (-) Plesiomonas

Catalasa (+) Shigella dysenteriae 1, Xenorhabdus

Nitrato reductasa (+) Erwinia and Yersinia (algunos)

Tienen como hábitat el intestino de animales inferiores y del hombre. Presentan una amplia distribución en el ambiente, encontrándose en suelo, agua y plantas, como Proteus que cumple una función ecológica importante ya que inicia en el ambiente la degradación de la materia orgánica.

Entre las numerosas especies que constituyen esta familia, encontramos algunos grupos que en su

relación con el hospedero humano son comensales, como es el caso de Escherichia coli un constituyente importante de la flora microbiana intestinal normal, resultando ser beneficioso para el hospedero, ya que como parte de su metabolismo sintetiza vitaminas, participa en la degradación de ácidos y sales biliares. Debido a la presencia masiva de E. coli a nivel intestinal, la detección de E. coli se utiliza como marcador de contaminación fecal y para evaluar la calidad microbiológica del agua potable o de alimentos.

Otros integrantes de este grupo en cambio son patógenos intestinales como el género Salmonella, Shigella, Yersinia y un subgrupo de E. coli con factores de virulencia específicos que afectan el intestino y por ello se denominan E. coli diarreogénicos. Estos grupos o Géneros bacterianos causan infecciones gastrointestinales que pueden expresarse clínicamente como diarrea acuosa, diarrea con sangre (también denominada diarrea enterocólica o síndrome disentérico) y en algunos casos a partir de la infección intestinal estas bacterias pasan al torrente sanguíneo y se puede producir una infección sistémica o bacteremia, como por ejemplo la fiebre tifoidea (Figura 1).

En algunas situaciones una persona puede infectarse con alguna de estas bacterias enteropatógenas

y no sufrir ninguna enfermedad, es decir tener una infección asintomática, en la cual el patógeno se multiplica a nivel intestinal y es excretado junto con las deposiciones. Este fenómeno es importante desde el punto de vista epidemiológico porque la excreción asintomática pasa inadvertida y este sujeto disemina el patógeno al ambiente y eventualmente lo puede transmitir, ya sea a través de manos contaminadas o contaminación de alimentos, a otros sujetos susceptibles en quienes si se manifiesta la enfermedad.

Otra condición biológica interesante de señalar es la portación por periodos más o menos largos de

un patógeno bacteriano entérico. En este caso, después de una infección intestinal generalmente sintomática, no se logra la erradicación del patógeno a nivel intestinal y aunque se superan los síntomas, continua la excreción por periodos que pueden durar semanas, meses o años. Los portadores junto con los pacientes asintomáticos explican la mantención de estos patógenos dentro de una comunidad.



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Un concepto importante de subrayar es que fuera del tracto gastrointestinal, enterobacterias

comensales del intestino pueden producir infecciones. Un buen ejemplo de ello es la participación de E. coli como principal causante de Infección Urinaria, una patología infecciosa muy frecuente principalmente en mujeres en la etapa activa de la vida. En este caso cepas de E. coli del intestino, colonizan la uretra y son capaces a ascender hasta la vejiga donde se multiplican activamente y provocan una respuesta inflamatoria. En otro tipo de pacientes como son los niños recién nacidos y los ancianos, quienes no tienen sus mecanismos de defensa muy eficientes, E. coli y otras enterobacterias comensales del intestino como Klebsiella, pueden pasar a la sangre y provocar focos de infección a distancia como meningitis.

Figura 1. Infecciones ocasionadas por enterobacterias.




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Por último, un concepto también importante de enfatizar es el hecho que algunas especies dentro de esta Familia tienen como hospedero exclusivo al hombre, como es el caso de Salmonella typhi y Shigella. En

cambio otras presentan un amplio reservorio animal y se transmiten en forma natural de los animales al hombre, es decir son zoonóticas, entre ellas tenemos varios tipos de Salmonella, E. coli enterohemorrágico y Yersinia enterocolítica.

Las pruebas o ensayos bioquímicos (Anexo II), son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar de forma clara una determinada característica bioquímica como: presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador) cuyo resultado puede ser diferente aún para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos.

PARTE 1 DIAGNOSTICO DE ENTEROBACTERIAS FERMENTADORAS DE LACTOSA

El grupo de enterobacterias que tiene la capacidad de fermentar la lactosa esta constituido por los

géneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter. Escherichia coli.

Este genero esta constituido por 5 especies, de las cuales E. coli es la más frecuente, y de mayor importancia desde el punto de vista clínico, las cepas de E. coli capaces de producir gastroenteritis se subdividen el 6 grupos, los cuales se muestran en la Tabla 2. Sin embargo como ya se mencionó anteriormente también cepas que no son diarreogenicas pueden ocasionar patologías como: Septicemia e Infecciones de tracto urinario. Tabla 2. Variedades de E. coli que causan enfermedades en el hombre

Microorganismo Lugar de acción Enfermedad

E. coli enterotoxigénica (ETEC) “E. coli O169:H41”

Intestino delgado Diarrea del viajero, diarrea infantil en países sub-desarrollados “Diarrea del destete”, vómitos, espasmos abdominales, nauseas.

E. coli enteropatogénica (EPEC) Intestino delgado Diarrea infantil en países subdesarrollados o en lactantes, vómitos, fiebre, nauseas, heces no sanguinolentas.

E. coli enteroinvasiva (EIEC) Intestino grueso Enfermedad en países subdesarrollados, fiebre, espasmos, diarrea acuosa indistinguible de la ETEC, pudiendo progresar a disentería.

E. coli enterohemorrágica (EHEC) “E. coli O157:H7”

Intestino grueso Colitis hemorrágica (CH) con fuertes espasmos abdominales, inicialmente diarrea acuosa, seguida de diarrea sanguinolenta sin leucocitos sin fiebre a menudo, puede progresar a Síndrome Urémico Hemolítico.

E. coli enteroagregativa (EAEC) Intestino delgado Diarrea acuosa persistente, poco o ningún vómito, fiebre leve, heces no sanguinolentas

E. coli difusamente adherente (DAEC)

Intestino delgado Diarrea acuosa sin sangre y sin leucocitos.

Además de las variedades citadas en la anterior tabla hay que citar a la cepa asociada al brote de SUH en Alemania el año 2011, siendo esta productora de toxina Shiga (STEC) y corresponde al serotipo O104:H4, toxina Shiga 2 (stx2)-positiva, intimina (eae)-negativa, enterohemolisina (ehxA)-negativa y que también presenta factores de virulencia compatibles con E coli enteroagregativa. Esta cepa ocasiono un fuerte impacto en los países del norte, ya que se disemino rápidamente, ocasionando 3222 casos reportados,



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incluyendo 39 fallecimientos, de los cuales 810 (25%) presentaron Síndrome Urémico Hemolítico (SHU) todo esto solo en Alemania.

Klebsiella sp.

Los miembros del género Klebsiella tienen la capacidad de producir capsula prominente que es responsable de la apariencia mucoide de las colonias. La especie que se aísla con mayor frecuencia es K. pneumoniae agente causal de neumonía lobular primaria, siendo los alcohólicos los que presentan mayor predisposición a adquirir este patógeno.

Enterobacter sp.

Los miembros del género Enterobacter son bacterias que tienen la capacidad de producir grandes cantidades de gas, razón por la cual anteriormente se los llamaba Aerobacter aerogenes. Enterobacter aerogenes y Enterobacter cloacae son las especies halladas con mayor frecuencia en muestras clínicas. Se distribuyen ampliamente en el agua, el suelo y las verduras; forman parte de la flora microbiana comensal y se cree que no causan diarreas, sin embargo Paton AW y Paton JC en 1996 aislaron una cepa de Enterobacter cloacae que producía una toxina similar a la de Shiga en las heces de un lactante con Síndrome Urémico Hemolítico.

Citrobacter sp.

Los miembros del género Citrobacter son bacterias que tienen la capacidad de fermentar lentamente la lactosa y es por esta razón que pueden llegar a tener el color característico de colonias pasadas las 24 horas, son bacterias que se encuentran más próximas a Salmonella teniendo la capacidad de producir H2S en medio SS y pruebas bioquímicas. Citrobacter freundii y Citrobacter koseri son las especies halladas con mayor frecuencia en muestras clínicas. 3. MATERIAL Y MEDIOS


Material biológico

Asas. Mechero Bunsen. Estufa a 37ºC Gradillas Pinza Punta bacteriológica

Placas de Agar Sangre Placas de Agar EMB Placas de Agar Mc Conkey Batería de pruebas Bioquímicas (TSI; LIA; SIM; Citrato y Urea) Rvo. De Kovacs. Discos de Oxidasa

Cepa de Enterobacter Cepa de Escherichia Cepa de Klebsiella

4. PROCEDIMIENTO

Diagnostico de Enterobacterias Lactosa positivas




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PARTE 2 DIAGNOSTICO DE ENTEROBACTERIAS NO FERMENTADORAS DE LACTOSA

El grupo de enterobacterias que no tienen la capacidad de fermentar la lactosa y que poseen

importancia clínica son: Salmonella, Shigella, Yersinia y Proteus. Salmonella spp.

Con base en estudios genéticos, existe una sola especie de Salmonella, (Salmonella enterica), pero empleando anticuerpos se han logrado diferenciar más de 2400 serotipos O, sin embargo existen solo unos pocos tipos que comúnmente están asociados con las enfermedades humanas características (S. enteritidis, S. cholerae-suis y S. typhi).

No pertenecientes al grupo de los coliformes, ya que no presentan la capacidad de fermentar la lactosa y tienen un carácter patógeno según la especie. Son bacterias que en general provocan infecciones febriles de carácter entérico como son la fiebre tifoidea o paratifoidea (con deshidratación severa y con escasas defecaciones) pasando a un estado de latencia en vesícula biliar, o de tipo gastroenteritis (con diarrea severa sanguinolenta) llegando en algunos casos a producirse una bacteriemia (Figura 2).

Figura 2. Infecciones ocasionadas por Salmonella sp. Tomado de Manual CTO.

La infección común por Salmonella es la Salmonelosis, está causada por una variedad de serotipos

(más comúnmente por S. enteritidis) y se transmite por alimentos contaminados (tales como huevo y pollo) (Figura 2). No se conoce un reservorio humano y usualmente se presenta como gastroenteritis (nausea,




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vómito y heces no sanguinolentas). La enfermedad es por lo común, auto-limitante y normalmente cede al término de (2 - 5 días). Como Shigella, estos organismos invaden el epitelio y no producen infección

sistémica. En los casos de salmonelosis sin complicaciones, mismos que son una vasta mayoría, la terapia con antibióticos no es útil. S. cholerae-suis (se ha visto menos frecuentemente) causa septicemia después de la invasión. En este caso, la terapia con antibióticos sí se requiere.

La forma mas severa de las infecciones por salmonella, "tifoidea" (o fiebre entérica), es causadas por

Salmonella typhi. Este microorganismo se transmite a partir de un reservorio humano o por medio de las reservas de agua (si las condiciones sanitarias son deficientes) o en alimentos contaminados (Figura 2). Inicialmente invade el epitelio intestinal y durante la fase aguda, se notan los síntomas gastrointestinales. Los microorganismos penetran (normalmente dentro de la primera semana) y pasan al torrente sanguíneo donde se diseminan a través de los macrófagos. Las características típicas de una infección bacteriana sistémica son ya aparentes. La septicemia por lo general es temporal y el microorganismo finalmente se aloja en la vesícula biliar, ocasionando cuadros esporádicos.

Shigella sp.

El género Shigella esta contituido de 4 especies; S. flexneri, S. boydii, S. sonnei, S. dysenteriae; siendo todas causantes de disentería bacilar o shigellosis, (heces sanguinolentas asociadas con dolor intestinal). El microorganismo inicialmente invade la capa epitelial de recubrimiento pero no lleva a cabo penetración. Normalmente dentro de los 2-3 días, aparece disentería como resultado del daño a las capas epiteliales que recubren el intestino, con frecuencia con liberación de mucosa y sangre (los cuales son detectados en las heces) con presencia de leucocitos (presentes en heces en forma de "pus"). Sin embargo la diarrea acuosa se observa frecuentemente, sin evidencia de disentería.

Juega también un importante papel la toxina de Shiga (codificada en el cromosoma), que es neurotóxica, enterotóxica y citotóxica. Su enterotoxicidad puede hacer que la enfermedad aparezca clínicamente como una diarrea. Esta toxina inhibe la síntesis de proteínas, actuando sobre la subunidad ribosomal 70S y eliminando el rRNA 28S. Generalmente esta enfermedad la cursan niños pequeños, siendo el mecanismo de transmisión el contacto oral-fecal; pero también los adultos pueden adquirir de los niños esta enfermedad.



Material biológico

Asas. Mechero Bunsen. Estufa a 37ºC Gradillas Pinza Aguja bacteriológica

Placas de Agar Sangre Placas de Agar Mc Conkey Placas de Agar SS Batería de pruebas Bioquímicas (TSI; LIA; SIM; Citrato y Urea) Rvo. De Kovacs. Discos de Oxidasa

Cepa de Salmonella Cepa de Shigella Cepa de Proteus

6. PROCEDIMIENTO

Diagnostico de Enterobacterias Lactosa negativas



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7. CUESTIONARIO

1. El LPS de las enterobacterias es considerado como endotoxina. Indique de que partes consta y cual de ellas es la parte tóxica.

2. Indique cuales son las tres pruebas utilizadas para identificar al grupo de enterobacterias, especificando cuales son las excepciones a esta regla.

3. Indique cuales son las tres vías de fermentación de glucosa por parte de las enterobacterias. 4. Indique cuales son las dos enzimas que las enterobacterias contienen que les hace posible la

utilización de lactosa, como funcionan y que prueba se utiliza para determinar la presencia de estas. 5. Indique cuáles son los ingredientes y propósito de estos medios diferenciales.

Agar Mc. Conkey Agar EMB Agar SS Agar Hektoen Enterico Agar XLD




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6. Indique cuales son los medio de enriquecimiento para Salmonella y Shigella y cual su función. 7. Indique como serían los resultados de las pruebas bioquímicas y el fundamento de las mismas, para

los siguientes tipos de bacterias.

a) Kliger/TSI b) LIA c) Citrato d) Movilidad e) Indol f) Urea g) Fenilalanina h) Ornitina

1) Escherichia coli 2) Shigella sonnei 3) Yersinia pestis 4) Serratia marcecens 5) Proteus vulgaris 6) Edwardsielleae tarda 7) Enterobacter aerogenes 8) Klebsiella pneumoniae

8. Como se debe realizar el antibiograma para las enterobacterias. 9. Realice 10. Elabore un fichero para la identificación de para las bacterias de la pregunta 7. 11. Como se realiza el diagnostico diferencial de las diferentes variantes de E. coli diarreogenica. 12. Como se realiza y como se interpreta la prueba de Vidal para el diagnostico de Salmonella sp. 13. Mencione cuales son las variedades de Salmonella y como se realiza su diferenciación. 14. Como diagnostica:

1. Enterocolitis por Salmonella 2. Bacteriemia con lesiones focales por Salmonella 3. Fiebre entérica por Salmonella

15. Como se realiza e interpreta la prueba rápida de identificación API20E. 8. BIBLIOGRAFIA







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DIAGNOSTICO DE BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES 1. OBJETIVO:

El objetivo es desarrollar en el estudiante la habilidad para poder aislar e identificar a microorganismos pertenecientes al género Pseudomonas a partir de muestras biológicas.

2. MARCO TEÓRICO:

Al grupo de bacilos Gram negativos no fermentadores pertenecen bacterias taxonómicamente muy diversas, sin embargo realizar esta agrupación es útil en el diagnostico clínico. Muchas de estas especies son incapaces de acidificar medios como el TSI y crecen considerablemente mejor en condiciones aerobias que en condiciones anaeróbicas. Este grupo de bacterias se consideran como patógenos oportunistas, especialmente de infecciones intrahospitalarias, donde los principales factores de riesgo para los pacientes son tratamientos con antimicrobianos y/o cirugía, instrumentación y permanencia del paciente en salas de cuidados intensivos por períodos prolongados. Adicionalmente, es importante considerar la resistencia natural a los antibióticos que muchas de estas bacterias presentan y la facilidad con la que adquieren resistencia a otros antibióticos.

Se emplean diversas pruebas de escrutinio para su identificación, tales como morfología microscópica, oxidasa, movilidad, producción de indol y fermentación de carbohidratos. Algunas cepas solamente crecen a temperatura ambiente y son incapaces de crecer en agar MacConkey. En este grupo se encuentran géneros como Pseudomonas, Burkholderia, Acinetobacter, Moraxella, Eikenella, Flavobacterium, Alcaligenes (Achromobacter), Actinobacillus, Capnocytophaga, Stenotrophomonas y Kingella, entre otras de importancia médica.

Pseudomonas aeruginosa es la especie más frecuentemente aislada de este grupo, seguida de Acinetobacter spp. y Stenotrophomonas maltophilia, caracterizándose estos últimos 2 por producir infecciones intrahospitalarias y en su gran mayoría asociadas al uso de respiradores o al implante de catéteres.

Pseudomonas spp.

Las bacterias del grupo Pseudomonas está constituido por bacilos Gram negativos, móviles por la

presencia de un flagelo polar. Se encuentran ampliamente distribuidos en el suelo, aunque pueden ser patógenos oportunistas (P. aeruginosa) y patógenos de plantas (P. syringae).

Su metabolismo es respiratorio, donde la mayoría usa como aceptor de electrones O2 pero también puede ser anaerobio (algunos usan NO

-). Presentan una versatilidad metabólica muy grande que se traduce

en su capacidad de utilizar como fuente de carbono una gran variedad de compuestos de carbono (hay especies, como P. cepacia, que pueden utilizar como nutrientes más de 100 compuestos químicos diferentes). Por otra parte, hay algunos individuos del grupo que son quimiolitotrofos usando H2 o CO como donadores de electrones.

El metabolismo central de azúcares en este grupo se desarrolla por la vía de Etner-Doudoroff, y disponen de un ciclo de Acidos Tricarboxílicos normal. La versatilidad metabólica del grupo se debe a la presencia de un gran número de plásmidos que contienen operones inducibles para la síntesis de enzimas específicas que permitan catabolizar los compuestos presentes en el medio. Esto confiere una importancia grande a las bacterias del género Pseudomonas como digestores aerobios de materiales animales y vegetales, lo que contribuye al reciclaje biológico de materia orgánica.

Algunas bacterias de este grupo producen pigmentos fluorescentes de colores amarillo-verdosos fácilmente solubles en agua. Estos pigmentos actúan como sideróforos: moléculas cuya función es capturar el hierro del medio necesario para el metabolismo del microorganismo




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Pseudomonas aeruginosa.

Es un bacilo Gram negativo, aerobio estricto, no fermentador, cuyos requerimientos nutricionales no son exigentes, y cuyo desarrollo en medios sólidos presenta un olor característico a frutas.

Pseudomonas aeruginosa tiene una gran cantidad de factores de virulencia, entre los cuales se

encuentran componentes estructurales y toxinas que favorecen su diseminación (Tabla 1), además enzimas que favorecen la resistencia a los antibióticos (Tabla 2) y pigmentos (piocianina).

Tabla 1. Factores de virulencia de Pseudomonas aeruginosa.

Factores de Virulencia Efectos Biológicos

Componentes estructurales

Capsula Exopolisacárido mucoide, con función de adhesina, además inhibe la acción bactericida de los antibióticos aminoglucósidos, suprime la actividad de los neutrófilos y los linfocitos.

Pili Adhesina a los receptores del gangliósido GM-1 sobre superficies de las células epiteliales del huésped.

Lipopolisacárido (LPS) Actividad de endotoxina, causa fiebre, shock, oliguria, leucopenia.

Piocianina Altera la función de los cilios respiratorios, estimula una respuesta inflamatoria, media en el daño tisular con la producción de radicales tóxicos de oxigeno.

Toxinas y Enzimas

Exotoxina A Produce destrucción tisular, inhibición de la síntesis proteica, interrumpe la actividad celular y la respuesta de los macrófagos.

Exotoxina S Inhibe la síntesis proteica.

Leucocidina Es citotóxica para las membranas eucariotas, inhibe la función de neutrófilos y linfocitos.

Elastasa Destruye los tejidos que contienen elastina, colágeno; escinde las inmunoglobulinas y los componentes del complemento, interrumpe la actividad de los neutrófilos.

Proteasa alcalina Destruye los tejidos, inactiva al interferon y al factor de necrosis tumoral.

Fosfolipasa C Destruye la membrana citoplasmática, destruye la sustancia tensioactiva pulmonar, e inactiva las opsoninas.

Tabla 2. Mecanismos de resistencia antibiótica de Pseudomonas aeruginosa.

Antibiótico Mecanismo de resistencia

Β-lactámicos Hidrólisis de Β-lactámicos, disminución de la permeabilidad y alteración las

proteínas de unión.

Aminoglucósidos Hidrólisis enzimática por acetilación, adenilación o fosforilación; disminución de la permeabilidad; alteración de la diana ribosómica.

Cloramfenicol Hidrólisis enzimática por acetiltransferasa, disminución de la permeabilidad.

Fluoroquinolonas Diana alterada (ADN girasa), disminución de la permeabilidad.

Acinetobacter spp. Las especies de Acinetobacter se caracterizan por ser bacilos pequeños o bien cocobacilos, son no

móviles, oxidasa negativa y pueden tener una morfología en pares (diplococo). Sus colonias en agar sangre no son característicos (producen colonias planas, opacas y pequeñas), crecen bien en agar MacConkey, pero con colonias de pequeño tamaño, incoloras o bien escasamente pigmentadas de rosado.



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En infecciones vaginales, es importante descartar la presencia de Acinetobacter spp. ya que puede presentar una morfología semejante Neisseria gonorrhoeae. La diferenciación se puede hacer mediante la prueba de crecimiento en agar MacConkey y la prueba de citocromo C oxidasa. A diferencia de Acinetobacter spp, Neisseria gonorrhoeae no crece en MacConkey y es oxidasa positivo. Las especies de Acinetobacter están ampliamente distribuidas en la naturaleza tanto en ambientes húmedos como en superficies secas y pueden ser parte de la flora normal de la piel y mucosas de los seres humanos.

Stenotrophomonas maltophilia. La especie Stenotrophomonas maltophilia ha sufrido una serie de cambios taxonómicos. Inicialmente,

fue clasificada como Pseudomonas maltophilia, luego se reclasificó en el género Xanthomonas y hasta años recientes que se le asignó a un nuevo género denominado Stenotrophomonas. Esta bacteria es un bacilo no fermentador, que produce colonias en agar sangre de tono amarillento, crema claro o verde lavanda, opacas y con un fuerte olor amoniacal. Si se crece en agar nutritivo, sus colonias presentan una coloración amarillenta, con un pigmento soluble en agua pero que no difunde al agar. Esta especie es móvil, utiliza la maltosa, es oxidasa negativo y ONPG positiva. S. maltophilia se asocia como agente de neumonías primarias e infecciones nosocomiales como septicemias, infecciones urinarias, bronconeumonías por aspiración, infecciones de heridas, mastoiditis y ectima gangrenoso. Es importante en infecciones de pacientes con cáncer.



Material biológico

Portaobjetos. Asas. Mechero Bunsen. Charola de tinción. Set de colorantes de Gram. Aceite de inmersión. Microscopio. Estufa a 37ºC Punta bacteriológica

Agar Muller Hinton TSI OF glucosa Discos de Oxidasa

Cepa de Pseudomonas aeruginosa

4. PROCEDIMIENTO




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5. CUESTIONARIO

1. Indique el tipo de metabolismo que tienen los bacilos Gram negativos no fermentadores. Explicando este de forma bioquímica.

2. Indique dentro de los bacilos Gram negativos no fermentadores cuales son los que se aíslan con mayor frecuencia en el laboratorio de bacteriología.

3. Indique cuales son las tres características observadas en el laboratorio que nos indiquen que se puede tratar de un aislamiento microorganismo no fermentador.

4. Indique cuales son las técnicas usadas para la tinción de flagelos en bacteriología y como se realiza cada una de ellas.

5. Esquematice el sistema de identificación de los bacilos Gram negativos no fermentadores (según Schreckenberger)

6. Siendo que las especies de Pseudomonas son unas bacterias metabólicamente más versátiles, cuando estas son sembradas en medio TSI no ocasionan ningún cambio de color en el medio, pero se observa desarrollo microbiano. Indique porque ocurre esto.

7. De ejemplo de cinco géneros de microorganismos que además de Pseudomonas sean no

fermentadores. 8. Indique que pruebas de laboratorio de Microbiología pueden ser utilizadas como indicadoras de

que existe el desarrollo de un no fermentador. 9. Indique cuales son los métodos de tinción de flagelos mas frecuentemente utilizados y que

cuidados se deben tener en el momento de ser realizados. 10. Que pruebas son concluyentes para determinar que un aislamiento se trata realmente de

Pseudomonas. 11. Indique cual es el fundamento de la Prueba OF. 12. Para diferenciar a las especies de Pseudomonas y Burkholderia de la familia de

Pseudomonadaceae que pruebas utilizaría. Fundamente su respuesta.

6. BIBLIOGRAFIA







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DIAGNOSTICO DE Haemophilus spp 1. OBJETIVO:

El objetivo es desarrollar en el estudiante la habilidad para poder aislar e identificar a

microorganismos pertenecientes al genero Haemophilus a partir de muestras biológicas.

2. MARCO TEÓRICO:

Haemophilus influenzae

H. influenzae es agente etiológico de infecciones respiratorias altas y bajas como también de infecciones invasivas tipo meningitis, bacteremias, artritis y otras. La importancia de H. influenzae tipo b (Hib) como agente productor de enfermedad infecciosa disminuyó drásticamente en la década del 90, después de la incorporación de una vacuna conjugada al programa de vacunas de países desarrollados y en vías de desarrollo. Sin embargo, H. influenzae no capsulado continúa jugando un rol en la patología respiratoria alta tipo otitis media aguda, sinusitis, bronquitis y pueden causar neumonías y enfermedad invasiva en recién nacidos.

Caracteristicas de Haemophilus influenzae. El género Haemophilus incluye varias especies, siendo

H. influenzae la que tiene mayor relevancia para el hombre, tanto por su frecuencia, como por la severidad de los cuadros clínicos que produce. Otras especies de Haemophilus que se asocian menos frecuentemente con infección en el hombre son H. parainfluenzae agente de neumonía y endocarditis, H. aphrophilus a veces aislado de endocarditis, H. aegyptis asociado a conjuntivitis y fiebre purpúrica de Brasil y H. ducreyi agente de chancro blando. H. influenzae es un cocobacilo Gram negativos de 0,3-0,5 mm de diámetro y de 0,5-3,0 mm de longitud,

pleomórficos, inmóviles, anaeróbicos facultativos, citocromo oxidasa y catalasa positivos, capaces de reducir nitratos a nitritos. Su temperatura óptima de crecimiento fluctúa entre 35ºC a 37ºC. Quimiorganotróficos, fermentan carbohidratos generando ácido acético, láctico y succínico, a partir de la glucosa. Son parásitos obligados de las membranas mucosas del hombre.

Figura 1. H. influenzae en muestras biológicas, (Izq: Forma de cocobacilos en una muestra de esputo Der: Formas pleomórficas observadas en un niño de África no vacunado)

Una de las características fisiológicas más relevantes del género Haemophilus, es su dependencia de factores de crecimiento para su desarrollo: factor X (hemina) y/o factor V (nicotín adenina dinucleotido: NAD) Figura 2. En el caso de H. influenzae, esta especie requiere ambos factores (X y V), por lo cual su aislamiento "in vitro" está condicionado el uso de medios enriquecidos como agar chocolate, en el cual los glóbulos rojos de la sangre lisados por calor, aportan los factores requeridos.




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Diagnostico de Haemophilus influenzae

Muestras clínicas: Líquido céfalo-raquídeo (LCR), sangre, líquido articular, secreciones ótica, ocular, senos

paranasales, tracto respiratorio inferior, secreción vaginal y líquido amniótico. En el transporte de la muestra, especialmente del LCR se debe considerar que Haemophilus es muy sensible a la sequedad y

bajas temperaturas, por lo tanto no se debe refrigerar. Tinción de Gram: Se observan bacilos y cocobacilos Gram negativos altamente pleomorfos.

Cultivo: En base a las exigencias de Haemophilus las muestras se siembran en agar chocolate e incuban

37ºC por 18-24 horas en 5% de CO2. H. influenzae forma colonias lisas de bordes regulares, convexas, con una leve coloración verdosa y olor característico. El requerimiento de factores XV es una de las características más importante que permite orientar el diagnóstico de especie. Otras pruebas bioquímicas se utilizan también para este objetivo. (Tabla 1).

Figura 2. Requerimientos de factor V y Factor X para la identificación de H. influenzae.

Tabla 1. Características metabólicas de especies de Haemophilus de importancia clínica.

Especie

Req. de factores

Hemólisis

Fermentación de Catalasa

X V Glucosa Sacarosa Lactosa

H. influenzae + + - + - - +

H. haemolyticus + + + + - - +

H. ducreyi + - - - - - -

H. parainfluenzae - + - + + - V

H. parahaemolyticus

- + + + + - V

H. segnis - + - +d +d - V

H. paraphrophilus - + - + + + -

H. aphrophilus - - - + + + -

V = Variable d = Débil

La determinación del biotipo se basa en tres pruebas bioquímicas: indol, urea y ornitina. En general, se observa que las cepas no capsuladas son heterogéneas a diferencia de las cepas Hib que corresponden a biotipo I sobre el 90% de los casos.



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Detección de antígenos: Se puede pesquisar con técnicas de diagnóstico rápido el antígeno capsular de Hib

especialmente de LCR u otros líquidos de cavidades estériles mediante métodos de coaglutinación o aglutinación con látex, sin embargo estas técnicas no reemplazan al cultivo.

Susceptibilidad a antimicrobianos: H. influenzae presenta resistencia a ampicilina y/o cloranfenicol, debido

a la presencia de enzimas betalactamasas y cloramfenicol acetiltransferasa respectivamente, ambas codificadas por plasmidios. En nuestro país, la resistencia a ampicilina fluctúa entre 10 a 30% y alrededor de un 10% al cloramfenicol. En general son sensibles a cefalosporinas y macrólidos de última generación. Dado que la sensibilidad de H. influenzae es variable se debe realizar antibiograma por el método de difusión en agar Haemophilus test Medium (HTM Oxoid).

3. MATERIAL Y MEDIOS:


Material biológico

Portaobjetos. Asas. Mechero Bunsen. Charola de tinción. Set de colorantes de Gram. Aceite de inmersión. Microscopio. Estufa a 37ºC Pinza

Placas de Agar Chocolate o Thayer Martin Agua Oxigenada Agar Müller-Hinton Discos de factor V y X Disco de Oxidasa

Cepa de H. influenzae

4. PROCEDIMIENTO:




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5. BIBLIOGRAFIA.







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DIAGNOSTICO DE Neisserias spp 1. OBJETIVO:

El objetivo es desarrollar en el estudiante la habilidad para poder aislar e identificar a microorganismos pertenecientes al genero Neisserias a partir de muestras biológicas.

2. MARCO TEÓRICO:

Familia Neissereaceae.

El género Neisseria pertenece conjuntamente con Kingella, Moraxella y Acinetobacter, a la

familia Neissereaceae. Esta familia ha experimentado multiples cambios a través de los estudios genéticos, estudios recientes han demostrado que la antigua especie Branhamella catarrhalis es un subgénero de Moraxella, designándose a la especie más comúnmente hallada en el ser humano como Moraxella (Branhamella) catarrhalis.

A través del uso de técnicas moleculares se estableció que las bacterias del género Neisseria pertenecen al grupo de las β-proteobacteria mientras que las bacterias de género

Moraxella pertenecen al grupo de γ-proteobacteria.

Se caracterizan por ser diplococos Gram negativos arriñonados, catalasa y oxidasa

positivos, aerobios estrictos, inmóviles, que utilizan pocos carbohidratos.

Neisserias

Actualmente el género Neisseria comprende dos especies patógenas para el hombre siendo estas la N. meningitidis y N. gonorrhoeae; donde el hombre es el único reservorio conocido. Otras especies de Neisseria no patógenas, se encuentran habitualmente formando parte de la flora normal de la orofaringe; estas especies no son exigentes nutricionalmente, causando enfermedad solo en personas inmunodeprimidas.

Son bacterias aerobias, que en muestras biológicas (Infecciones gonocócicas con uretritis

purulenta) se visualizan como diplocococs Gram negativos en leucocitos polimorfonucleares Figura 1, son exigentes nutricionalmente, razón por la cual se emplea para su cultivo medios enriquecidos como Thayer-Martin, desarrollan de forma óptima a una temperatura de 37ºC y en un ambiente con 5 a 7 % de CO2. Son oxidasa positiva. Estos requerimientos de cultivo, así como el perfil de fermentación de azúcares (principalmente glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa y fructosa) son de gran utilidad para diferenciar las diferentes especies de Neisserias (Tabla 1)

Figura 1. N. gonorrhoeae en un exudado uretral donde se visualizan diplocococs Gram negativos en leucocitos polimorfonucleares




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Tabla 1. Perfiles metabolicos de las especies de Neisserias.

Especie

Formación de acido a partir de DNAsa

Glucosa Maltosa Sacarosa Fructosa Lactosa

N. meningitidis (+) (+) (-) (-) (-) (-)

N. gonorrhoeae (+) (-) (-) (-) (-) (-)

N. gonorrhoeae ssp. kochii (+) (-) (-) (-) (-) (-)

N. lactamica (+) (+) (-) (-) (+) (-)

N. cinerea (-) (-) (-) (-) (-) (-)

N. flavescens (-) (-) (-) (-) (-) (-)

N. subflava biovar subflava (+) (+) (-) (-) (-) (-)

N. sicca (+) (+) (+) (+) (-) (-)

N. mucosa (+) (+) (+) (+) (-) (-)

N. gonorrhoeae posee diversos factores de virulencia (Figura 2) los cuales se encuentran

enumerados a continuación:

Pilis (adherencia);

Proteínas de membrana externa: Proteina Por (Proteina I): Facilita la

supervivencia intracelular evita la fusión del fagolisosoma;

Proteina Opa (Proteina II): adherencia a células y entre bacterias;

Proteina Rmp (Proteina III): resistencia al suero y protección de la Proteina Por y LOS;

Lipooligosacárido (LOS): Actividad como endotoxina.

Proteina de unión a transferrina;

Proteina de unión a lactoferrina;

Proteina de unión a hemoglobina;

IgA proteasas.

β-Lactamasa

Figura 2. Factores de virulencia de N. gonorrhoeae.

Diagnostico de Laboratorio para N. gonorrhoeae

El diagnóstico se sospecha por la clínica: Varones: Uretritis (disuria y exudado blanquecino) entre los 2-5 días después del contacto. Mujeres: Uretritis, cervicitis no complicada (lo mas frecuente), endometritis, peritonitis

perihepatica o generalizada. El material para examen se obtiene de la uretra, canal endocervical (con ayuda del

especuló), mucosa rectal o faringe. No debe hacerse toma de la vagina ni del canal anal, en las mujeres.



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En caso de uretritis la toma se hace en la mañana antes de la primera micción. La toma de

exudado del endocervix es realizado previo al aseo local y sin la aplicación de tratamiento en las 48 horas previas. El hallazgo en el examen directo con coloración de Gram, de polimorfonucleares, piocitos y diplococos Gram negativos intra y extracelulares, es muy sugestivo y a menudo suficiente para el diagnóstico de etiología gonocócica. Si la técnica se realiza correctamente la sensibilidad y especificidad del frotis del exudado uretral es superior a 90% en hombres sintomáticos. En cambio en la mujer la sensibilidad es menor de 60%. Cuando el examen directo es negativo, debe realizarse cultivo en Agar Thayer-Martin.

Para la identificación de la especie se emplea reacciones de fermentación de azúcares los

cuales se realizan en medio semisólido CTA (agar cisteína tripticasa) con 1% de cada carbohidrato; produciéndose sólo pequeñas cantidades de metabolitos ácidos en las reacciones positivas.


Material y equipos Medios de cultivo y

pruebas Material biológico

Portaobjetos. Asas. Mechero Bunsen. Charola de tinción. Set de colorantes de Gram. Aceite de inmersión. Microscopio. Estufa a 37ºC Pinza

Agar Thayer-Martin. Agar cisteína tripticasa suplementado con glucosa, lactosa, maltosa y sacarosa. Discos de oxidasa Catalasa.

Cepa de N. gonorrhoeae

4. PROCEDIMIENTO




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5. BIBLIOGRAFIA.







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DIAGNOSTICO DE Sífilis 1. OBJETIVO:

El objetivo es desarrollar en el estudiante la habilidad para poder aislar e identificar a microorganismos pertenecientes al genero Neisserias a partir de muestras biológicas.

2. MARCO TEÓRICO:

Treponema pallidum es el agente etiológico de la sífilis, una enfermedad de transmisión sexual, que

presenta características clínicas y secuelas que tiene una importante con notación social. T. pallidum, es una espiroqueta muy sensible a condiciones ambientales, como la desecación y

temperatura y el contacto con antisépticos suaves, por lo que su transmisión requiere un contacto muy directo o muy constante.

La vía fundamental de transmisión de la enfermedad la constituyen las relaciones sexuales, pero la

transmisión transplacentaria debe tenerse en cuenta. Aunque es probable que este microorganismo sea capaz de atravesar la piel o las mucosas intactas, al parecer el mecanismo de contagio es a través de erosiones en superficies húmedas.

Caracteristicas del Treponema pallidum: En el género Treponema, se encuentran bacterias

comensales y patógenos humanos exclusivos. Los treponemas patógenos se encuentran relacionados por su morfología, antigenicidad, homología del DNA y por su capacidad para adherirse a células de mamífero.

Éstos agentes son de forma delgada y helicoidal Figura 1. El citoplasma está rodeado por una

membrana citoplasmática trilaminar, una capa de peptidoglicanos, una capa interna de mucopéptidos (periplasto), una membrana lipoproteíca externa (lipopolisacárido) y una membrana externa (rica en fosfolípidos). Se moviliza con un movimiento rotatorio flotante y suele tener un movimiento ondulante característico cerca del centro del microorganismo.

Los treponemas patógenos, incluido T. pallidum, no pueden ser cultivados in vitro. Sólo pueden

mantenerse viables en nitrógeno líquido (a menos de –70ºC) y en mamíferos (ejemplo, testículos de conejos).

Figura 1. Treponema pallidum en estudio de microscopia, (Izq: Microscopia de Campo oscuro Der: Prueba con anticuerpos fluorescentes directos frente al patogeno)

Treponema pallidum es un microorganismo móvil que, dadas sus dimensiones, 5-15 µ de largo por 0,2 µ de diámetro, se encuentra en el límite de resolución óptica de los microscopios convencionales; por ello no es posible visualizarlo mediante tinciones normales y sí por contraste de fases o tinción argéntica que "engruesan la bacteria". Tampoco es cultivable según el concepto tradicional. Su movilidad se debe a flagelos




52

periplásmicos, y presenta un tiempo de generación de 8 horas en tejidos humanos, por lo que su multiplicación es lenta.

Se distinguen 2 etapas:

1. sífilis precoz o temprana. Es la enfermedad dentro del primer o segundo año y comprende los

períodos: primario, secundario y latente precoz 2. sífilis tardía. Ocurre después de ese tiempo y abarca los períodos de: latencia tardía, sífilis benigna

tardía, sífilis cardiovascular y neurosífilis.

La sífilis primaria es el primer estadío de la enfermedad. Se define por el chancro (Figura 2.) y las

adenopatías satelitales. El período de incubación es de 10 a 90 días (término medio 21); dicho chancro se encuentra localizado en la zona de entrada del patógeno, siendo visible en los genitales externos, siendo otras localizaciones: cuello uterino, boca, periné, canal anal, dedos, etc. Se inicia bajo la forma de una pápula eritematosa que pronto erosiona, quedando constituida una úlcera superficial, bien delimitada, redondeada, indolora, de 0,5 a 2 cm de diámetro, indurada a la palpación, con consistencia de cartílago, de fondo limpio y que no supura (Figura 2). En general es único, aunque puede haber más de un chancro. Puede pasar inadvertido, si se asienta en el cuello uterino o canal anal.

Figura 2. Chancro primario de tallo del pene, habitualmente indoloro

La sífilis secundaria es la expresión de la diseminación hematógena del patógeno (Figura 3).

Ocurre entre las 4 a 12 semanas (término medio 6) después del contacto infectante y sus síntomas son recurrentes en 25% de los casos. Las recurrencias se observan especialmente durante el primer año.

Figura 3. Exantema diseminado en la Sífilis secundaria



53

Sífilis latente es la fase asintomática de la sífilis, cuando se resolvieron las manifestaciones de la

sífilis primaria y secundaria, aunque no implica ausencia de progresión de la enfermedad, al contrario, este periodo es cuando el patógeno se alberga en diversos tejidos sin ocasionar manifestaciones clínicas. La sífilis latente se extiende hasta 1 o 2 años después del contacto infectante. Puede ser asintomática durante todo su curso o éste verse interrumpido por los síntomas de recurrencia de la sífilis secundaria.

Después de 1 o 2 años se habla de sífilis latente tardía, la que es asintomática. Todos los pacientes con sífilis latente tardía deben ser evaluados clínicamente buscando aortitis, neurosífilis, gomas e iritis.

Diagnóstico Directo

La identificación del T. pallidum mediante el examen directo del exudado de la lesión a través de

microscopia de campo oscuro y/o fluorescencia directa (DFA-TP) (Figura 1), siendo esta una prueba definitiva para asegurar el diagnóstico. Un resultado negativo en el examen directo del producto de la lesión no descarta la posibilidad de la enfermedad, ya que pueden existir una baja carga bacteriana en la misma, dependiendo de los días de evolución y de la administración de tratamiento previos. Nunca deberá emplearse para el examen directo material procedente de lesiones sospechosas en la boca, ya que las posibilidades de confundir los treponemas con otras espiroquetas saprofitas son muy altas. La sensibilidad de esta prueba es del 75-80%. Diagnostico Indirecto

La experiencia nos dice que, en la mayoría de las ocasiones, existen dificultades o no es posible

realizar el diagnóstico directo, por lo que el diagnóstico indirecto -serológico- de la enfermedad se ha convertido en el procedimiento más frecuente. Estos marcadores necesitan, aproximadamente, de unos 14 a 20 días para hacerse reactivos. En la Tabla 1 y Tabla 2 se resumen las pruebas que existen actualmente para el diagnóstico serológico de la sífilis y sus grados de sensibilidad.

Tabla 1. Pruebas serologicas empleadas actualmente para el diagnóstico de la sífilis.

Pruebas Valor de referencia Observaciones

No treponémicas

RPR No reactivo

VDRL No reactivo

USR No reactivo

TRUST No reactivo

ELISA Cut-off

Treponémicas

TPHA No reactivo Suero, hemaglutinación

FTA-ABS IgG e IgM No reactivo Suero y LCR

FTA-ABS-DS Doble tinción

ELISA anti-IgG Cut-off Suero

ELISA anti-IgM Cut-off Suero

Western-Blot Prueba confirmatoria

Características Generales Y Peculiaridades De Las Pruebas Serologicas Pruebas no treponémicas:

V.D.R.L. (Venereal Research Disease Laboratory). Únicamente puede emplearse con suero; es un antígeno no particulado. Lectura microscópica.

R.P.R. (Rapid Plasma Reagin). Puede emplearse con suero y plasma. Es un antígeno con partículas

de carbón. La reacción que se obtiene con la muestra positiva es de floculación. TRUST. (Toluidine Red Unheated Serum Test). Puede realizarse con suero o plasma. Es el mismo

antígeno del VDRL con partículas coloreadas con rojo de toluidina. U.S.R. (Unheated Serum Reagin). Puede emplearse con suero. El antígeno no es particulado y la

reacción es de floculación. Lectura microscópica. E.L.I.S.A. Se emplea con suero. Utiliza en la fase sólida antígenos del tipo VDRL.




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Pruebas treponémicas

FTA-ABS 200. (Inmunofluorescencia indirecta con absorción del suero) Antigeno de Treponema cepa

Nichols y absorbente de la cepa Reiter. Puede realizarse sobre con suero y L.C.R. FTA-ABS 200 DS. (Inmunofluorescencia indirecta con absorción y doble tinción). Utiliza el mismo

antígeno y absorbente que en la prueba anterior y puede llevarse a cabo sobre el mismo tipo de muestras. Emplea como antisuero una IgG marcada con isotiocianato de tetrametil rodamina y como contraste un suero antitreponema marcado con isotiocianato de fluoresceína.

TPHA. (Microhemaglutinación). Solo homologada para suero. Utiliza eritrocitos sensibilizados con antígenos de Treponema cepa Nichols y absorbente de cepa Reiter.

Captia Syphilis M. (ELISA de captura anti cadena pesada). Se realiza en suero. Su mayor utilidad se centra en el diagnóstico de la sífilis congénita, sobretodo la sintomática. Parece ser la prueba con mayor sensibilidad para la detección de esta clase de inmunoglobulina.

ELISA IgG. Para utilizar con suero. Existen muchos estudios que demuestran su alta sensibilidad y especificidad.

FTA-ABS 19S IgM. Para suero. Poca sensibilidad. FTA-ABS LCR. Utilizar LCR diluido a 1/5 Western blot. Debe utilizarse como prueba de confirmación.

Sensibilidad y especificidad de las pruebas en diferentes estadíos Tabla 3. Pruebas serologicas empleadas actualmente para el diagnóstico de la sífilis.

Tipo de prueba Primaria Secundaria Latente Tardía Especifidad

VDRL No treponémico 78% 100% 95% 71% 98%

RPR No treponémico 86% 100% 98% 73% 98%

USR No treponémico 84% 100% 97% 99%

TRUST No treponémico 85% 100% 95% 93%

FTA-ABS-DS Treponémico 80% 100% 100% 96% 98%

TPHA Treponémico 76% 100% 97% 94% 99%

Captia IgM* Treponémico 90% ? ? ? 90%



Material biológico

Agitador magnético Placas de RPR Mezcladores

Control reactivo Control no reactivo Reactivo para RPR

Suero reactivo

4. PROCEDIMIENTO RAPID PLASMA REAGIN (RPR) TEST

Dejar atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. Depositar 50 μL de la muestra a ensayar y una gota de cada Control en círculos separados de la

tarjeta visualizadora. Homogeneizar el Reactivo (A) con suavidad antes del ensayo. Adaptar la aguja al extremo del vial

dispensador de plástico. Invertir el conjunto y presionar ligeramente para eliminar el aire retenido en la aguja.

Situar la aguja en posición vertical a la tarjeta y añadir a cada círculo una gota del Reactivo (A) próxima a la muestra a analizar.

Mezclar con ayuda de un palillo desechable, procurando extender la mezcla por toda la superficie interior del círculo. Emplear palillos distintos para cada muestra.

Agitar la tarjeta a 100 r.p.m. durante 8 minutos.



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LECTURA

Examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación antes de transcurrido 1 minuto

tras la parada del agitador. Los resultados se evalúan de acuerdo con el siguiente criterio:

Los sueros positivos pueden titularse. Para la titulación, realizar diluciones dobles en NaCl 9 g/L. Se define el título como la dilución mayor que da resultado positivo.

5. BIBLIOGRAFIA








56

INTRODUCCIÓN A LA TECNOLOGÍA DE DIAGNÓSTICO DE PROCESOS VIRALES

1. OBJETIVO:

Revisar, analizar y discutir conocimientos básicos previos sobre la tecnología aplicada al diagnóstico de procesos virales.

2. MARCO TEÓRICO:

Los virus son, probablemente, los agentes infecciosos más antiguos y ampliamente distribuidos en la naturaleza. La tecnología ha permitido evidenciar su existencia en prácticamente todas las especies y organismos, entre estas bacterias, protozoarios, hongos, algas, insectos, plantas, animales y humanos. Por su biología, los virus han evolucionado con las especies, modulan varios procesos metabólicos y moleculares que son vitales para la célula huésped y su ecología. Los virus se encuentran involucrados en procesos infecto-contagiosos de importancia biomédica que afectan al ser humano y se constituyen en importantes problemas de salud pública ej., Cáncer, SIDA, herpes, diarreas infantiles agudas, infecciones respiratorias agudas, infecciones tropicales, etc. Por lo que el estudio e identificación de virus, mediante estrategias de laboratorio son trascendentales para desarrollar/establecer medidas de control, prevención y/o tratamiento.

La interacción entre un virus y su huésped celular da lugar a procesos genéticos, moleculares y bioquímicos que pueden resultar en cambios genéticos, morfológicos, fisiológicos que difieren dependiendo del virus en particular y el tipo de célula infectada. Por esto, los procedimientos y tecnología aplicados a su estudio y diagnóstico son particulares para cada proceso, y en el caso de los seres humanos también depende de la carga viral de infección, el sistema inmunitario del huésped, de factores genéticos, de la alimentación, de su relación con el medio ambiente, la edad, etc.

2.1. Estrategias para el diagnóstico de laboratorio de procesos infecciosos virales.

La tecnología disponible para el estudio y diagnóstico de procesos virales, en este tiempo, es diversa, por lo que los criterios de su aplicación dependen no solo del proceso viral en particular, sino también del tipo de estudio, i.e., clínico, epidemiológico de investigación básica, de investigación aplicada, etc., etc.

En general los procedimientos pueden ser agrupados en dos categorías:

a) Procedimientos de identificación directa

b) Procedimientos de identificación indirecta

2.1.1. En procedimientos de identificación directa (Figura 1), el espécimen biológico es examinado

directamente por la presencia de partículas virales, antígenos (proteínas) virales, o ácido nucleico (DNA, RNA) viral o propiedades virales. Entre estos procedimientos se incluyen:

Estudios morfológicos por Microscopía electrónica e inmunoelectromicroscopía. Estudio histológico (cuerpos de inclusión) por microscopía de luz. Detección de antígenos por Inmunofluorescencia, Ensayos inmunoenzimáticos. Detección de material genético viral por procedimientos moleculares, microarrays. Estudio de infección viral por tecnología de cultivo celular, infección en huevos, y animales de

experimentación.

2.2.2. En procedimientos de identificación indirecta (Figura 1), el espécimen biológico es analizado

por marcadores biológicos de respuesta antiviral que el huésped desarrolla de modo específico, incluyendo anticuerpos, células, citokinas, propiedades/características celulares



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En estos estudios la diferencia (título) de marcadores humorales (anticuerpos, citokinas) entre estados de infección aguda y convaleciente o la detección de IgM identifica el agente causante de la infección. Estos estudios se pueden realizar por procedimientos clásicos: Fijación de complemento, inhibición de hemaglutinación, Inmunofluorescencia, neutralización, hemólisis radial, ensayos inmunoenzimáticos, aglutinación, western blot.

Como en todo proceso de diagnóstico, el espécimen utilizado para el estudio de laboratorio es muy importante. Un resultado positivo de una muestra colectada del sitio de infección tiene mayor significancia diagnóstica, que aquellos estudios realizados con muestras de otros sitios, por ejemplo, en el caso de una encefalitis por Herpes simplex, un resultado positivo del análisis de fluido cerebro espinal será de mayor significancia que el resultado de una úlcera oral, o de una muestra sérica; debido a que una reactivación de herpes oral es común bajo estrés y el sujeto puede ser portador, respectivamente.

Figura 1. Métodos de diagnostico Viral.

3. PROCEDIMIENTO

Trabajo Grupal: Revisión bibliográfica, análisis y discusión de procedimientos directos e indirectos

4. CUESTIONARIO

1. Cual la estructura de una partícula viral? 2. Cuales son los mecanismos básicos de respuesta inmune antiviral? 3. Represente esquemáticamente la detección de un vp (proteína viral) 4. Represente esquemáticamente la detección de RNA viral.

5. BIBLIOGRAFIA

Martínez J. (1987) Técnicas virológicas de José. Ed. Enpes. Microbiología Medica de Jawetz Specter S. (1986) Manual de Virología Clínica de. ed. 10.




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ESTUDIO DE PROCESOS VIRALES POR PROCEDIMIENTOS DIRECTOS: VIRUS GASTROINTESTINALES

1. OBJETIVO:

Analizar, discutir y aplicar conocimientos y procedimientos para el diagnóstico de infecciones por virus gastrointestinales.

2. MARCO TEÓRICO:

Las infecciones gastrointestinales pueden ser causadas, entre otros virus, por enterovirus,

rhinovirus, rotavirus. Estos virus comparten gran número de características clínicas, epidemiológicas y ecológicas, así como ciertas propiedades físicas y químicas. Difieren entre sí por el distinto comportamiento en cultivo, antigenicidad y ciclo replicativo aunque, en todos los casos, el hábitat común y el lugar de replicación es el tracto intestinal humano.

En la práctica, se realizará el diagnóstico de la infección gastrointestinal causada por rotavirus.

El rotavirus es agente causal de una infección diarreica aguda, de importancia en salud pública porque afecta principalmente a niños pequeños y en edad pre-escolar. Es un virus con alta capacidad replicativa, por lo que el tiempo de incubación es corto, por lo que la identificación de marcadores de la respuesta inmunitaria no es de utilidad diagnóstica, sino epidemiológica. La profusa producción de antígenos virales permite la aplicación de procedimientos de detección directa básicos de captura de antígenos virales a través de anticuerpos capturados en soporte de papel de nitro celulosa.



Material biológico

Puntas descartables Pipetas Pasteur de plástico

Buffer fosfatos Anticuerpos anti vp de rotavirus Papel de nitrocelulosa

Heces fecales

4. PROCEDIMIENTO



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5. CUESTIONARIO

1. Cual el ciclo replicativo del rotavirus? 2. Describe la fisiopatología del proceso infeccioso gastrointestinal que tiene lugar? 3. Represente esquemáticamente procedimientos de diagnóstico epidemiológico de rotavirus 4. Represente esquemáticamente un procedimiento para el diagnóstico de enterovirus.

6. BIBLIOGRAFIA

Martínez J. (1987) Técnicas virológicas de José. Ed. Enpes. Microbiología Medica de Jawetz Specter S. (1986) Manual de Virología Clínica de. ed. 10. .




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ESTUDIO DE PROCESOS VIRALES POR PROCEDIMIENTOS DIRECTOS: VIRUS RESPIRATORIOS

1. OBJETIVO:

Analizar, discutir y aplicar conocimientos y procedimientos para el diagnóstico de infecciones por virus respiratorios.

2. MARCO TEÓRICO:

Las infecciones por virus respiratorios, se constituyen en problema de salud pública debido a que

es la patología más frecuente .a lo largo de toda la vida del ser humano. En nuestro país, atendiendo a los datos publicados en pacientes en edad infantil, las enfermedades infecciosas son el motivo de más del 60% de las consultas en pediatría extrahospitalaria. De ellas, aproximadamente el 70% corresponde a una infección respiratoria y más de la mitad de estas son de origen vírico. La mayoría de las infecciones respiratorias sólo afectan al tracto respiratorio superior y pueden ser consideradas leves, de curso benigno y autolimitado (catarro común, rinitis y faringoamigdalitis). Sin embargo, se estima que alrededor del 5% pueden implicar al tracto respiratorio inferior (bronquitis, bronquiolitis y neumonía). Son infecciones potencialmente más graves que, en muchos casos, requieren el ingreso hospitalario.

En edad adulta las infecciones respiratorias de origen vírico son una causa importante de

morbilidad, sin embargo los cuadros clínicos que precisan atención médica prácticamente se limitan a ancianos y a pacientes severamente inmunodeprimidos o con una patología pulmonar subyacente

En la práctica, se realizará el diagnóstico de la infección respiratoria causada por virus sincitial

respiratorio. Los procedimientos para este virus incluyen:

1. Aislamiento de virus en células Hep-2 es el procedimiento más sensible, en los que se produce el característico efecto citopático.

2. En procesos agudos, la Inmunofluorescencia indirecta es el procedimiento alternativo al aislamiento en cultivo celular.

3. El diagnóstico serológico como la fijación de complemento y EIA pueden ser utilizados. Es posible encontrar anticuerpos en fase aguda de la infección. En niños pequeños, un resultado positivo representa anticuerpos transplacentarios, mientras que en niños mayores representa infección previa con el virus.



Material biológico

Puntas descartables Pipetas Pasteur de plástico Porta objetos Micropipetas graduadas 5 a 50 µl

Medio básico de transporte Anticuerpo monoclonal anti vp de virus sincitial respiratorio Anticuerpos anti Fc-gamma, marcado con fluorescencia Solución de azul de evans

Hisopado nasal o lavado broncopulmonar en medio de transporte viral

4. PROCEDIMIENTO



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5. CUESTIONARIO

1. Cual el ciclo replicativo del virus sincitial respiratorio? 2. Describe la fisiopatología del proceso infeccioso respiratorio? 3. Que otros virus respiratorios conoce y cual el procedimiento de diagnóstico que recomienda

realizar? 4. Represente esquemáticamente un flujograma para el diagnóstico clínico y epidemiológico

del virus de la influenza, discuta similitudes o diferencias.

6. BIBLIOGRAFIA





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ESTUDIO DE PROCESOS VIRALES POR PROCEDIMIENTOS INDIRECTOS: HERPES VIRUS

1. OBJETIVO:

Analizar, discutir y aplicar conocimientos y procedimientos para el diagnóstico de encefalitis por infecciones por virus herpes.

2. MARCO TEÓRICO:

La familia Herpesviridae comprende una serie de virus DNA cuya característica biológica más

notable es su capacidad de producir latencia. Tras la infección primaría, sintomática o no, el virus permanecerá latente en diversos tipos celulares o tejidos. Las reactivaciones, con replicación y producción de nuevas partículas víricas se producen con dinámica diferente. Además de las infecciones primarias y las reactivaciones, en algunos herpesvirus se ha demostrado la posibilidad de reinfección.

El diagnóstico de la infección por herpes virus incluye:

- Diagnóstico diferencial en las infecciones congénitas y neonatales (herpes neonatal). - Prevención del herpes neonatal (las estrategias no bien definidas en la actualidad). - Diagnóstico etiológico de las infecciones del sistema nervioso central (encefalítis). - Diagnóstico de las infecciones generalizadas en inmunodeprimidos. - Establecer el diagnóstico diferencial en formas de presentación clínica inhabituales - Diagnóstico etiológico del herpes genital y diagnóstico diferencial de úlceras genitales - Pruebas de sensibilidad a los antivirales

En la práctica, se realizará el diagnóstico de encefalitis herpética. Los procedimientos para

este virus incluyen:

1. Aislamiento del virus en células Vero es el procedimiento más sensible. El efecto citopático aparece en 2-3 días. El ensayo es complementado por tipificación por inmunofluorescencia o neutralización.

2. En procesos agudos, la Inmunofluorescencia directa es el procedimiento alternativo al aislamiento en cultivo celular en improntas celulares de la vesícula.

3. El diagnóstico serológico de la infección puede ser realizada por determinación del título de anticuerpos específicos, o la detección de IgM. Sin embargo se debe considerar que procesos de reactivación no pueden ser asociados con títulos de anticuerpos o presencia de IgM



Material biológico

Puntas descartables Pipetas Pasteur de plástico Porta objetos Micropipetas graduadas 5 a 50 µl

Anticuerpo monoclonal anti vp de virus herpes simplex Anticuerpos anti Fcgamma, marcado con fluorescencia Solución de azul de evans

Líquido cefalorraquídeo



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4. PROCEDIMIENTO

5. CUESTIONARIO

1. Cual el ciclo replicativo del virus herpes simplex? 2. Describe el mecanismo de infección que da lugar a una encefalitis? 3. Que otros herpesvirus conoce y cual el procedimiento de diagnóstico que recomienda

realizar? 4. Represente esquemáticamente un flujograma para el diagnóstico clínico y epidemiológico

del virus de Epstein Barr, discuta similitudes o diferencias.

6. BIBLIOGRAFIA





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ANEXO I

PREPARACION DE MEDIOS EMPLEADOS PARA LA PRUEBA DE

PRODUCCION DE BIOFILM DE ESTAFILOCOCOS

PBS Buffer de fosfatos pH 7.4 Reactivo Concentración molar Peso

NaCl 137 mM 8 g KCl 2.7 mM 0.2 g Na2 HPO3 10 mM 1.44 g K H2PO3 2 mM 0.24 g Agua destilada 800 mL Ajustar pH a 7.4 con HCl Aforar 1L

Nota: Conservado entre 4-8 °C, es estable por tres o más meses. Desechar si aparecen cambios de coloración o precipitados Caldo Soya Tripticasa Glucosa (TSB-Glu) Christensen et al 1982

Preparar el medio en dos partes, pesar el medio TSB segun la especificación de la casa comercial (~30g/L) y disolver en 70% del volumen final del medio; en el restante 30% disolver glucosa para una concentración final de 1% (10g/L). Autoclavar ambas soluciones por separado y dejar enfriar a temperatura ambiente, cuando el medio se encuentre a una temperatura entre 30-40 oC unir las dos soluciones y dispensar en tubos esteriles. OJO No autoclavar nunca el caldo con el carbohidrato, ya que este puede sufrir modificaciones y caramelizar el medio. Caldo Cerebro-Corazón Sucrosa (BHI-Suc) Christensen et al 1982

Preparar el medio en dos partes, pesar el medio BHI segun la especificación de la casa comercial (~37g/L) y disolver en 70% del volumen final del medio; en el restante 30% disolver sacarosa (Sucrosa) para una concentración final de 2% (20g/L). Autoclavar ambas soluciones por separado y dejar enfriar a temperatura ambiente, cuando el medio se encuentre a una temperatura entre 30-40 oC unir las dos soluciones y dispensar en tubos esteriles. OJO No autoclavar nunca el caldo con el carbohidrato, ya que este puede sufrir modificaciones y puede llegar a hidrolizarse por efecto de la alta temperatura que se encuentra el caldo y caramelizar el medio. Medio Rojo Congo Agar (CRA) Freeman et al 1989

Preparar el medio en tres partes: Solución 1. Pesar el medio BHI según la especificación de la casa comercial (~37g/L) y agar bacteriológico (10g/L) disolver en 70% del volumen final del medio



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Solución 2. Disolver sacarosa (Sucrosa) a una concentración final de 5% (50g/L) en 20% del volumen final de agua destilada. Solución 3. Disolver en agua destilada el Rojo Congo, en el restante 10% del volumen final a una concentración final de 0,8g/L. Autoclavar las soluciones por separado y dejar enfriar a temperatura ambiente, cuando el medio se encuentre a una temperatura entre 50-55 oC unir las tres soluciones y dispensar en cajas petri esteriles.




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ANEXO II

PRUEBAS BIOQUIMICAS EMPLEADAS

PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE IDENTIFICACIÓN PRUEBA DE LA OXIDASA.

Introducción

El sistema citocromo oxidasa está constituido por hemoproteínas capaces de catalizar la oxidación de un citocromo reducido por el oxígeno molecular. Las bacterias que obtienen su energía por respiración y utilización del oxígeno molecular como aceptor final de electrones, contienen diferentes sistemas citocromo oxidasa, en tanto que las bacterias anaerobias obligadas no contienen tales sistemas

Principio

El ensayo de citocromo oxidasa permite detectar la presencia en el microorganismo de ciertas enzimas del sistema citocromo oxidasa, capaces de catalizar el transporte de electrones entre un dador presente en la bacteria y el colorante redox tetrametil-p- fenilendiamina (reactivo de Wurster). Este ensayo es útil para sospechar la presencia

de los géneros de bacterias que dan el ensayo positivo como Neisseria, Aeromonas, Vibrio, Camplylobacter y Pseudomonas y para excluir las

Enterobacterias que dan reacciones negativas.

Procedimiento

Técnica directa en placa: añadir directamente 2

a 3 gotas de reactivo a las colonias aisladas que desarrollan en placas.

Interpretación

Cuando se utiliza el reactivo tetrametil-p-fenilendiamina, se considera el ensayo como positivo cuando aparece un color azul profundo en un tiempo menor a 10 seg. Se considera positivo lento a confirmar cuando el color aparece entre 10 y 60 seg. y se considera negativo cuando no hay desarrollo de color o cuando se produce en un tiempo mayor a 60 seg.

TEST DE LA CATALASA. Introducción

La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua. Químicamente, la catalasa es una hemoproteína de estructura similar a la de la hemoglobina, excepto que los 4 átomos de hierro de la molécula están en estado oxidado (Fe

+++) en lugar de

reducido (Fe++

). Excluyendo los estreptococos, la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa.

Principio

El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el peróxido de hidrógeno es letal para

las células bacterianas. La catalasa transforma el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente reacción:

2 H2O2 → H2O + O2 (burbujas de gas)

La prueba de catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es comúnmente utilizada para diferenciar estreptococos (negativos) de estafilococos (positivos).

Procedimiento • Coger con cuidado una colonia con el asa de

siembra (evitar coger agar). • Poner la colonia directamente sobre un

portaobjetos sin añadir agua.



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• Echar sobre la colonia una gota de agua

oxigenada pura o al 30 %. • Observar si se forman burbujas de oxígeno.

Resultado: La aparición de burbujas indica que el

microorganismo es catalasa positivo.

TEST DE TSI (Triple sugar iron)

En este test son medidos varios datos fisiológicos importantes para determinar si un microorganismo es: fermentador de glucosa, fermentador de lactosa, productor de gas, productor de ácido sulfhídrico. Es un medio que requiere un

procedimiento de inoculación especial. Procedimiento • Inocular los microorganismos aislados en un

tubo con medio TSI con la punta bacteriológica. La siembra se hará de la siguiente manera: sembrar la superficie por estría y sembrar la parte interna del medio por picadura (es necesario

pinchar suficientemente, sobre todo para la detección de producción de sulfhídrico. • Incubar 18-24 h a 37°C. Observar e interpretar

los cambios producidos en el medio. • Fermentación de glucosa y lactosa. El medio

contiene una pequeña cantidad de glucosa y una gran cantidad de lactosa. Los microorganismos capaces de fermentar cualquiera de estos compuestos darán lugar a la formación de ácidos que bajan el pH del medio. Como consecuencia el rojo fenol vira a amarillo. La sucesión de eventos metabólicos es la siguiente: 1. El microorganismo utiliza la fuente de carbono más fácilmente utilizable en el medio, la glucosa.

Pero como se encuentra en el medio en muy baja concentración esta se agota rápidamente y los productos de su degradación acidifican el medio que cambia de rojo a amarillo. 2. Al agotarse la glucosa empieza a utilizar las peptonas, pero solamente en aerobiosis (se

corresponde a la zona del pico de flauta). Este consumo da lugar a residuos amoniacales, produciendo una alcalinización del medio. El indicador vira a rojo en esta parte del tubo. 3. Posteriormente se produce el consumo de lactosa, en el caso de los microorganismos que

sean capaces de utilizar este disacárido. Esto da lugar a un descenso de pH por lo que cambiará el

medio de rojo a amarillo. La razón de que la lactosa se utilice después es debido al tipo de regulación de la ß galactosidasa, que es la enzima que hidroliza

este disacárido para dar los correspondientes monosacáridos. Se trata de una enzima inducible, lo que significa que existe un periodo

de latencia entre el agotamiento de la glucosa y la producción de las primeras moléculas de ß galactosidasa, de tal forma que después de un tiempo de consumo de peptonas se comienza a utilizar lactosa.

• Producción de gas. La producción de gas se

detecta por la formación en el medio de burbujas de gas perfectamente visibles ya que estas logran partir el medio. El gas se origina mediante la reacción catalizada por la enzima formiato liasa a

partir de ácido fórmico.

• Producción de SH2. Algunas bacterias son

capaces de llevar a cabo la siguiente reacción a partir del tiosulfato añadido al medio:

El ácido sulfhídrico es detectado por la reacciona con las sales de metales pesados (Fe2+) presentes en el medio dando lugar a la formación de sulfuro de hierro.




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LIA (Lisina Iron Agar)

Este es un medio que nos permite realizar un estudio de la capacidad que tienen los microorganismos de descarboxilar la lisina liberando la amina aromática cadaverina y dióxido d carbono. En el proceso interviene la lisina descarboxilasa; además este medio posee entre sus componentes glucosa la cual es consumida por los microorganismos durante las primeras horas acidificando el medio, una vez consumida la glucosa si el microorganismo tiene la capacidad de descarboxilar a la lisina el medio se alcalinizara nuevamente retornando a su color inicial tomándose como positivo para descarboxilacion,

si no tiene la capacidad de descarboxilar la lisina el fondo será amarillo y el pico solamente retornara a su color inicial considerándose como negativa la prueba. Pero si el microorganismo tiene la capacidad de desaminar a la lisina a acido alfa cetocarbonico como lo hace Proteus spp, este forma un compuesto pardo-rojizo en el pico de flauta del medio se cree que es por la condensación del acido formado con el indicador, pero hasta ahora no se conoce. Además este medio pone de manifiesto la capacidad de reducir el azufre a sulfuro por la formación de un precipitado negro en el fondo del tubo.



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SIM (Sulfuro Indol Movilidad) Principio:

Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrogeno en un mismo tubo. Fundamento:

El triptofano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, particularmente de la tripteina, que puedes ser oxidado por algunas bacterias. El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos.

La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich.

La movilidad viene proporcionado por los flagelos principalmente peritricos de los microorganismos poseen en su superficie, la movilidad es apreciada gracias a turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, ya que al tratarse de un medio semisólido la fuerza de oposición es mínima.

Y la cepas productoras de sulfuro se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7,2.




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CITRATO DE SIMMONS

Principio

La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias.

Fundamento:

El metabolismo del citrato se realiza en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del acido tricarboxilico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente oxalacetato y piruvato sin participación de

coenzima A. Este último en presencia de un medio alcalino da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono producen carbonatos y bicarbonato alcalinos; además este medio al poseer en su composición sales de amonio, estas sales sirven como única fuente de nitrógeno siendo degradadas a amoniaco, el cual en presencia de agua da hidróxido de amonio esto aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.



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PRUEBA DE LA UREA

Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado.

Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este medio se complementa después del autoclavado con 50ml/l de urea. Ésta será degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta

degradación produce amoniaco que hará variar el color del indicador de amarillo a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa.

Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubación ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco después de la inoculación y sus resultados deben ser leídos en las primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubación.




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PRUEBA DE OXIDO-FERMENTACIÓN (OF)

Introducción

La prueba de óxido-fermentación es importante en las primeras etapas de identificación de un cultivo. Permite diferenciar las bacterias según el rol del oxígeno atmosférico en la utilización de carbohidratos.

Principio

El medio más comúnmente utilizado es el de Hugh-Leifson que -a diferencia de otros medios de cultivo- contiene una baja concentración de peptonas (0.2 %). A las concentraciones de peptona habitualmente usadas en otros medios (1

al 2%), no es posible detectar la baja concentración de ácidos que se produce por metabolismo oxidativo de azúcares, ya que las aminas generadas por el uso aerobio de las peptonas alcalinizan el medio. La baja concentración de peptona del medio Hugh-Leifson permite diferenciar los microorganismos oxidativos de los inactivos frente a la glucosa. En ausencia de otros aceptores externos de electrones (Ej. NO3-), la oxidación de carbohidratos es un proceso estrictamente aerobio, en tanto que la fermentación es un proceso que no requiere oxígeno. El medio de cultivo es semisólido.



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manual de prÁcticas de microbiologÍa ii enero 2012 texto final con viro

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