marçal pastor-anglada
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BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A LA QUIMIOTERAPIA Y ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE DIANAS INTRACELULARES. Marçal Pastor-Anglada. DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR, UNIVERSIDAD DE BARCELONA. CURSO DE POST-GRADO EN GENÓMICA Y PROTEÓMICA 10 de Febrero de 2005. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A LA QUIMIOTERAPIA Y ANÁLISIS
FARMACOGENÓMICO DE DIANAS INTRACELULARES
Marçal Pastor-AngladaDEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y
BIOLOGÍA MOLECULAR, UNIVERSIDAD DE BARCELONA
CURSO DE POST-GRADO EN GENÓMICA Y CURSO DE POST-GRADO EN GENÓMICA Y PROTEÓMICAPROTEÓMICA
10 de Febrero de 200510 de Febrero de 2005
•MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS
•ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs)
•FARMACOLOGÍA DE LOS NTs
•PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS
•ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS
QUIMIOTERAPIA. MECANISMOS DE ACCIÓN
•Mayoritarimente análogos de nucleósidos. Antimetabolitos
•Interferencia en la síntesis de nucleótidos.
•Acción en fase S.
•Incorporación a DNA y RNA.
•Reparación---Radiosensibilización
•Integridad mitocondrial
•Arresto en ciclo o muerte por apoptosis.Adaptado de Pastor-Anglada et al., Trends
in Pharmacological Sciences 19:424.430, 1998
GEMCITABINA. MECANISMO DE ACCIÓN
Fosforilada por la dCK y TK2
O
H O
H O
F
H N
N
N H 2
O
F
O
H O
H O
F
H N
N
N H 2
O
F
O
H O
H O
F
H N
N
N H 2
O
F
-P
O
H O
H O
F
H N
N
N H 2
O
F
-PP
dFdC
dFdCMP
Desfosforilada por la 5’-NT I
Detoxificación a dFdUMP y dFdU
dCDA
dCMPdA
dFdCDP
Quinasas
Quinasas
O
H O
H O
F
H N
N
N H 2
O
F
-PPPdFdCTP
GEMCITABINA. MECANISMO DE ACCIÓN O
H O
H O
F
H N
N
N H 2
O
F
O
H O
H O
F
H N
N
N H 2
O
F
dFdC•Inhibición de la citidina desaminasa y la dCDA.
•Inhibición de la timidilato sintasa.
O
H O
H O
F
H N
N
N H 2
O
F
-P dFdCMP •Inhibición de la citidina desaminasa y la dCDA.
O
H O
H O
F
H N
N
N H 2
O
F
-PP dFdCDP •Inhibición de la ribonucleótido reductasa.
dFdCTP O
H O
H O
F
H N
N
N H 2
O
F
-PPP• Incorporación a DNA y RNA
•Radiosensibilización
CAPECITABINA. MECANISMO DE ACCIÓN
•Inhibición TS
•Incorporación a RNA y DNA
DIANAS DEL 5-FU
H N
NH
O
O
F
5-fluorouracilo
H N
NH
NH2
O
F
H N
NH
O
O
F
Carboxil esterasa
Citidina desaminasa
Timidina fosforilasa
5’-deoxy-5-fluorouridine
5’-deoxy-5-fluorocytidine
N4-pentyloxycarbamyl-5’-deoxy-5-fluorocytidine
H N
NH
NH2
O
F
Capecitabina
5’-DFC
5’-DFUR
5-FU
H N
NH
NH2
O
F
EJEMPLOS DE MECANISMOS DE RESISTENCIA A EJEMPLOS DE MECANISMOS DE RESISTENCIA A FLUOROPIRIMIDINASFLUOROPIRIMIDINAS
RESISTENCIA A GEMCITABINA. METABOLISMO
•dCK
•TK2
•Disminución de la actividad causa resistencia
•Baja actividad aumenta la sensibilidad debido a que fosforila más eficientemente el nucleósido natural dCyd
•5’-NT •La sobreexpresión causa resistencia al desfosforilar los nucleótidos a nucleósidos
•RR •Un aumento de la actividad o falta de inhibición de la ribonucleótido reductasa causa resistencia a gemcitabina.
NUEVOS ELEMENTOS IMPLICADOS EN LAS BASES MOLECULARES DE NUEVOS ELEMENTOS IMPLICADOS EN LAS BASES MOLECULARES DE LA RESISTENCIA A LA QUIMIOTERAPIALA RESISTENCIA A LA QUIMIOTERAPIA
RESISTENCIA A GEMCITABINA: TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS??
•Mutaciones en el gen p53.
•Proteínas de la familia Bcl-2.
•Caspasa 8.
•Vía PI3’K.
•DNA y RNA polimerasas.
•Metabolismo intracelular.
•TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOSTRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS
•MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS
•ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs)
•FARMACOLOGÍA DE LOS NTs
•PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS
•ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS
UP-HILL DOWN-HILL
S
S S
S
S
NaS
Na
IN
OUT
IN
OUT
CNTConcentrativeNucleosideTransporter
ENTEquilibrativeNucleosideTransporter
Mecanismos de transporte de nucleósidos al interior de la célula
NH3+
CO2-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
hENT family
ei
ENT2
es
ENT1
UridineUridine
NBTI
PROTEIN GENE LENGTH IDENTITY INHIBITORS (IC50) SUBSTRATES (Km) TISSUE DISTRIBUTION
hENT1 SLC29A1 456 50% NBTI 0.4nM Dip 5nM U 0.26mM A 0.04mM Ubiquitous, plasma, perinuclearI 0.17mM C 0.58mM and mitochondrial membranes
hENT2 SLC29A2 456 NBTI 2.8M Dip 356nM U 0.25mM A 0.14mM Ubiquitous, highly abundant I 0.05mM C 5.61mM in skeletal muscleNuclebases (hypoxanthine)
ENTs (SLC29), transportadores de baja afinidad y amplia selectividadPastor-Anglada, M.; Baldwin, S.A. Drug Development Research 52:431-437, 2001
NH3+
CO2-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 132 8
hCNT family
CNTs (SLC28), transportadores de alta afinidad, relativamente específicos
N
CNT 1-3
Na Uridine
PROTEIN GENE LENGTH IDENTITY STOICHIOMETRY SUBSTRATES (Km) TISSUE DISTRIBUTION
hCNT1 SLC28A1 650 72% and 48% 1-2Na/1Nucleoside U 40-60M T 6M Most epithelia, macrophages, (kidney, intestine) C 34 I n.t.
hCNT2 SLC28A2 658 47% 1Na/1Nucleoside U 80M I 4.5M Epithelia (liver), macrophages,brain, ilots, B,T cells, brain,heart,skel.muscle A 8M T n.t.
hCNT3 SLC28A3 691 2Na/1Nucleoside U 22M T 21M Widely distributed, not solved yet at the protein levelI 53M A 15M
Pastor-Anglada, M.; Baldwin, S.A. Drug Development Research 52:431-437, 2001
Barrett andGrisham, 1995Biochemistry
Vias biosintéticas:LOS NUCLEÓSIDOS SON
MOLÉCULAS CARAS
Algunos tipos celulares, especialmente aquellos de alto
recambio, dependen esencialmente de las vías de “recuperación”
-ENTEROCITOS-CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE
Los transportadores de nucleósidos en la naturaleza
Los CNTs humanos y de mamíferos
tienen ortólogos en nemátodos, insectos, protozoos, levaduras,
bacterias,....La vía de
recuperación está altamente
conservada
Role of nucleoside transporters SLC28 and SLC29 in cancer chemotherapy. Pastor-Anglada, M., Casado, F.J., en Deoxynucleoside analogs in cancer therapy (Peters, G.J., editor) Cancer Drug Discovery and Development book series. The
Humana Press, Inc.Totowa, New Jersey, en prensa
Procesos celulares en los que los nucleós(t)idos están involucrados
-Precursores de ácidos nucléicos (ARN y ADN)-Activadores en vías biosintéticas (p.e. UDP)-Unidades de transferencia de energía (ATP,GTP) -Coenzimas (NAD, FAD)-Moduladores de la fisiología celular (cAMP, ATP, Ado)
La base de la quimioterapia radica en el aprovechamiento de las vías de recuperación de aquellas células que presentan elevados índices
de proliferación
•MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS
•ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs)
•FARMACOLOGÍA DE LOS NTs
•PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS
•ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS
LA GEMCITABINE (GEMZAR), PERO NO LA FLUDARABINA, ES UN SUBSTRATO CAPTADO
CON ALTA AFINIDAD APARENTE POR EL TRANSPORTADOR hCNT1
EJEMPLO DE SISTEMAS HETERÓLOGOS DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS PARA DEFINIR PERFILES FARMACOLÓGICOS
Lostao, M.P., Mata, J.F., Larrayoz, I.M., Inzillo, S.M., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M.FEBS Letters 481:137-140, 2000
K 0.5 (M) % corriente uridina
0.5mM
Uridine 37±7 (8) 100 (8)
Cytidine 29±8 (6) 47±7 (6)
Thymidine 26±7 (4) 109±19 (4)
Gemcitabine 18±5 (8) 33±5 (8)
5’-DFUR 245±39 (7) 147±18 (7)
Vh=-50 mV
Larráyoz, I.M., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M., Lostao, M.P. Journal Biological Chemistry 279:8999-9007, 2004.
La capecitabina (Xeloda) es un profármaco oral de última generación utilizado en el tratamiento de tumores de colon y mama
Capecitabina 5’-desoxi-5-fluorocitidina
5’-desoxi-5-fluorouridina (5-DFUR)
5-fluorouracilo
Carboxilesterasa
HÍGADOCitidina desaminasa
HÍGADO - TUMORES?
TImidinaFosforilasa
TUMORES
5-DFUR, EL INTERMEDIARIO INMEDIATO DE 5-FU EN
TUMORES, ES SUBSTRATO DEL TRANSPORTADOR
CONCENTRATIVO DE ALTA AFINIDAD hCNT1
Mata, J.F., García-Manteiga, J.M., Lostao, M.P., Fernández-Veledo, S., Guillén-Gómez, E., Larrayoz, I.M., Lloberas, J., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M.Molecular Pharmacology 59:1542-1548, 2001
La expresión heteróloga de hCNT1 confiere sensibilidad a 5-DFUR, independientemente de las actividades equilibrativas
endógenas.
Mata, J.F., García-Manteiga, J.M., Lostao, M.P., Fernández-Veledo, S., Guillén-Gómez, E., Larrayoz, I.M., Lloberas, J., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M.Molecular Pharmacology 59:1542-1548, 2001
CHO wtCHO wt
CHO-vectorCHO-vector
CHO-hCNT1CHO-hCNT1
100010010
100
50
0
5'-DFUR (µM)
% C
EL
L S
UR
VIV
AL
WT
PC1
HC1
100010010
100
50
0
5'-DFUR (µM)
% C
EL
L S
UR
VIV
AL
-dipyridamol +dipyridamol
CÉLULAS TUMORALES PANCREÁTICAS. SENSIBILIDAD A GEMCITABINA
EFECTO DE LA REINTRODUCCIÓN DE hCNT1 SOBRE LA ACCIÓN CITOTÓXICA DE LA GEMCITABINA
HC1
NP-9
TANTO EN UNA EXPOSICIÓN A GEMCITABINA COMO EN UN PROTOCOLO DE TRIPLE EXPOSICIÓN AL FÁRMACO, LA PRESENCIA DE hCNT1 SENSIBILIZÓ LAS CÉLULAS AL TRATAMIENTO CON EL FÁRMACO
ENSAYO DE CITOTOXICIDAD DE GEMCITABINA EN LOS CLONES DE NP-9 72 H DESPUÉS DE 90 MINUTOS DE INCUBACIÓN AL FÁRMACO
PC1
García-Manteiga, J., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Mazo, A., Pastor-Anglada, M.Clinical Cancer Research 9:5000-5008, 2003
IC50 (M) Km (M)Cytidine 4.5±0.2 3.1±0.7Thymidine 12.55±1.93 NDAZT 1004±150 963±135d4T 4525±301 15600±4700ddC 5730±222 NT3tC >>20000 NTGemcitabine ND 17±25-DFUR ND 209±51
O
HOH
HH
HH
HO
N
NH
O
O
H3C
N
NH2
ON
O
OHOH
HH
HH
HO
O
HN3
HH
HH
HO
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NH
O
O
H3C
O
HH
HO
N
NH
O
O
H3C
O
HH
HH
HH
HO
N
N
NH2
O
NH
O
ON
O
HOH
HH
HH
H3C
F
O
FOH
FH
HH
HO
N
N
NH2
O
Thymidine AZT d4T 5-DFUR
Cytidine ddC 3tC Gemcitabine
S
O
H
H
HO
N
N
NH2
O
Cano-Soldado, P., Larráyoz, I., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Martínez-Picado, J., Lostao, M.P., Pastor-Anglada, M. Antiviral Therapy 9:993-1002, 2004
N
NH2
ON
O
OHOH
HH
HH
HO
O
HOH
HH
HH
HO
N
N
NH2
O
O
HH
HH
HH
HO
N
N
NH2
O
Cytidine 2’-deoxycytidine ddC
Selectividad farmacológica de hCNT1
Cano-Soldado, P., Larráyoz, I., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Martínez-Picado, J., Lostao, M.P., Pastor-Anglada, M.Antiviral Therapy 9:993-1002, 2004
Concentrative systems Equilibrative systems
Drugs as substrates (apparent Km)
Drugs as substrates (apparent Km)
hENT1
gemcitabine++++ (160M) citarabine ++++ fludarabine +++ cladribine ++++
hCNT1 hCNT2 hCNT3
gemcitabine ++++ (17M) 5’-DFUR (209 M) citarabine + fludarabine – cladribine –
cladribine + fludarabine – gemcitabine –
cladribine +++ fludarabine ++ gemcitabine ++
hENT2
gemcitabine ++ (740M) fludarabine++ cladribine ++ citarabinea +
(+) lowly transported; (++) moderately transported; (+++ / ++++) highly transported; (-) not transported a drug tested as inhibitor
Deoxynucleoside transporters in cancer therapy. Pastor-Anglada, M., Casado, F.J. En Deoxynucleoside Analogs in Cancer Therapy (Peters, G.J., editor) Cancer Drug Discovery and Development book series. The Humana Press, Inc. Totowa, New Jersey. En prensa
Pastor-Anglada, M., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Bellosillo, B., Colomer, D., Gil, J. Leukemia 18:385-393, 2004
Perfiles farmacológicos preliminares de los transportadores hCNT y hENT
•MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS
•ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs)
•FARMACOLOGÍA DE LOS NTs
•PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS
•ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS
LOS TRANSPORTADORES SON PRACTICAMENTE UBICUOS LOS TRANSPORTADORES SON PRACTICAMENTE UBICUOS Y SU EXPRESIÓN ESTÁ ALTAMENTE CONDICIONADA POR Y SU EXPRESIÓN ESTÁ ALTAMENTE CONDICIONADA POR
EL ESTADO DE DIFERENCIACIÓN CELULAREL ESTADO DE DIFERENCIACIÓN CELULAR
Las células de hepatoma presentan un perfil diferente de expresión de CNT y ENT.
La diferenciación de hepatocitos fetales con dexametasona induce CNT2.
Valdés, R., Ortega, M.A., Casado, F.J., Felipe, A., Gil, A., Sánchez-Pozo, A., Pastor-Anglada, M.
Gastroenterology 119:1623-1630, 2000
del Santo, B., Valdés, R., Mata, J.F., Felipe, A., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M.Hepatology 28:1504-1511, 1998
CNT2
ENT1
ENT2 Del Santo, B., Tarafa, G., Felipe, A., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M.
Journal of Hepatology 34:873-880, 2001
La expresión de estas proteínas es prácticamente ubicua o muy amplia
H&EH&E G-6PasaG-6Pasa
¿PERO SE OBSERVA REALMENTE UNA PÉRDIDA DE EXPRESIÓN ¿PERO SE OBSERVA REALMENTE UNA PÉRDIDA DE EXPRESIÓN DE TRANSPORTDAORES CNT EN MODELOS IN VIVO? DE TRANSPORTDAORES CNT EN MODELOS IN VIVO?
HEPATOCARCINOGÉNESIS INDUCIDA QUÍMICAMENTEHEPATOCARCINOGÉNESIS INDUCIDA QUÍMICAMENTE
GSTGSTrCNT2rCNT2
Dragan, Y., Valdés, R., Gómez-Angelats, M., Felipe, A., Casado, F.J., Pitot, H.C., Pastor-Anglada, M.
Hepatology 32:239-246, 2000
SE DEMUESTRA POR PRIMERA VEZ LA PÉRDIDA DE SE DEMUESTRA POR PRIMERA VEZ LA PÉRDIDA DE EXPRESIÓN DE UN TRANSPORTADOR DE LA FAMILIA EXPRESIÓN DE UN TRANSPORTADOR DE LA FAMILIA GÉNICA CNT1 EN UN MODELO ANIMAL DE CÁNCERGÉNICA CNT1 EN UN MODELO ANIMAL DE CÁNCER
H&EH&E
T-SV40T-SV40
G-6PasaG-6Pasa
rCNT1rCNT1
MODELO DE RATA TRANSGÉNICA Alb-SV40MODELO DE RATA TRANSGÉNICA Alb-SV40
Dragan, Y., Valdés, R., Gómez-Angelats, M., Felipe, A., Casado, F.J., Pitot, H.C., Pastor-Anglada, M.
Hepatology 32:239-246, 2000
•PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS
•evidencias de expresión diferencial de NTs en tumores
•primeros estudios clínicos (tumores sólidos y enfermedades linfoproliferativas)
CÉLULAS TUMORALES PANCREÁTICAS. EXPRESIÓN DE TRANSPORTADORES
ANALISIS POR RT-PCR DE LA EXPRESIÓN DE hENT1, hENT2, hCNT1, hCNT2 y hCNT3 EN NPs
LAS CUATRO LÍNEAS MUESTRAN ALTOS NIVELES DE mRNA DE hENT1
TAMBIEN SE DETECTA, AUNQUE EN MENOR MEDIDA EL mRNA DE hENT2
A PESAR DE LA AUSENCIA DE ACTIVIDAD CONCENTRATIVA DETECTADA EN LOS ENSAYOS DE TRANSPORTE TODAS LAS LÍNEAS NP EXPRESAN EL mRNA DE UNO O MÁS TRANSPORTADORES CONCENTRATIVOS.
García-Manteiga, J., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Mazo, A., Pastor-Anglada, M.Clinical Cancer Research, 9:5000-5008, 2003
PANEL DE ANTICUERPOS DESARROLLADOS CONTRA TRANSPORTADORES NT
hCNT1a Extracellular No IHC
hCNT1b Intracellular No IHC
hCNT1a Extracellular
hCNT2a Intracellular No
hCNT2b Intracellular WESTERN
hCNT3 Intracellular hENT1a Intracellular IHC
hENT1b Intracellular No
hENT2 Intracellular IHCWESTERN
western ICC IHC
M.Pastor Anglada, F.J.Casado Merediz, A.Felipe Campo, Method and in vitro kit for selecting a drug for chemotherapyWO 00/52477 Balagué Center, S.A. Países: ESTADOS UNIDOS DE AMERICA ; JAPON ; CANADA ; UNIÓN EUROPEA
Matrices de tejidos “Tissue array”
Analisis simultáneo de muchas muestrasAnalisis simultáneo de muchas muestrasCilindros adecuados para IHQCilindros adecuados para IHQ
2 mm................60 muestras2 mm................60 muestras1.5 mm.......... 1351.5 mm.......... 1351 mm............. 2001 mm............. 200
Controles positivos y negativos internosControles positivos y negativos internosTinción homogéneaTinción homogéneaEficiente y rápidoEficiente y rápido
Tongue
Uterus
Lung
Kidney
Liver Breast
PATRONES DE EXPRESIÓN DE
TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS
EN TUMORES GINECOLÓGICOS
A C
GF
EDC
B
hCNT1 hENT1 hENT2
hCNT1 hENT1 hENT2
hCNT1 hCNT1
Expression of the nucleoside-derived drug transporters hCNT1, hENT1 and hENT2 in gynecological tumors.Farré,X..,Guillén-Gómez,E.,Sánchez, Hardisson, D., Plaza, Y., Lloberas, J., Casado, F.J., Palacios, J., Pastor-Anglada, M.International Journal of Cancer 112:959-966, 2004
Ovarian
carcinomas
Expression- + ++
hENT1 (n =90) 8 (8.8 %) 41 (45.6 %) 41 (45.6 %)
hENT2 (n= 89) 14 (15.7 %) 54 (60.7 %) 21 (23.6 %)
hCNT1 (n = 90) 30 (33.3 %) 45 (50.0 %) 15 (16.7 %)
Endometrial carcinomas
Expression- + ++
hENT1 (n = 80) 0 (0 %) 27 (33.8 %) 53 (66.2 %)
hENT2 (n = 78) 0 (0 %) 47 (60.3 %) 31 (39.7 %)
hCNT1 (n = 79) 12 (15.2 %) 60 (75.9 %) 7 (8.9 %)
Uterine cervix carcinomas
Expression- + ++
hENT1 (n = 117) 5 (4.2 %) 63 (53.9 %) 49 (41.9 %)
hENT2 (n = 117) 2 (1.7 %) 55 (47.0 %) 60 (51.3 %)
hCNT1 (n = 118) 46 (39.0 %) 33 (28.0 %) 39 (33.0 %)
SEMI-CUANTIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS NT EN TUMORES GINECOLÓGICOS
Expression of the nucleoside-derived drug transporters hCNT1, hENT1 and hENT2 in gynecological tumors.Farré,X..,Guillén-Gómez,E.,Sánchez, Hardisson, D., Plaza, Y., Lloberas, J., Casado, F.J., Palacios, J., Pastor-Anglada, M.International Journal of Cancer 112:959-966, 2004
LA PÉRDIDA DE LA EXPRESIÓN DE hCNT1 SE ASOCIA CON SUBTIPOS HISTOLÓGICOS CONCRETOS DE TUMORES GINECOLÓGICOS
Expression of hCNT1 in ovarian carcinomas by hystologic type
Hystologic type Expression
- + / ++ (%)
Serous 6 25 80.6
Mucinous 5 9 64.3
Endometrioid 1 9 90.0
Clear cell 18 17 48.6
p = 0.016
Expression of hCNT1 in uterine cervix carcinomas by hystologic typeHystologic type Expression
- + / ++ (%)
Adenocarcinoma 35 29 45.3
Squamous cell 11 43 79.6
p < 0.001
Expression of the nucleoside-derived drug transporters hCNT1, hENT1 and hENT2 in gynecological tumors.Farré,X..,Guillén-Gómez,E.,Sánchez, Hardisson, D., Plaza, Y., Lloberas, J., Casado, F.J., Palacios, J., Pastor-Anglada, M.International Journal of Cancer 112:959-966, 2004
•evidencias de expresión diferencial de NTs en tumores
•primeros estudios clínicos (tumores sólidos y enfermedades linfoproliferativas)
•PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS
ENT1
J J 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 220.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.9
1.0
1.1
PC
R a
rbit
rary
un
its
0
0,1
0,2
0,3
0,4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
pmol
flud
a/m
g pr
ot/1
0s
HO
N
NN
N
NH2
O
HOH
OHH
HH
F 2-fluoroadenine-9-2-fluoroadenine-9--D-arabinofuranoside-D-arabinofuranoside
La sensibilidad ex-vivo a la fludarabina se correlaciona con el transporte del fármaco mediado por proteínas ENT, pero no guarda
correlación con sus niveles de ARNm
p=0.029r=0.488
p=0.006r=0.591
0.0 0.1 0.2 0.30
50
100
pmol fluda/mg prot/ 10s
% v
iab
ility
0.0 0.1 0.2 0.30
50
100
pmol fluda/mg prot/10s
%vi
abilit
y
Molina-Arcas, M., Bellosillo, B., Casado, F.J., Montserrat, E., Gil, J., Colomer, D., Pastor-Anglada, M. Fludarabine uptake mechanisms in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 101:2328-2334, 2003
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
EN
T1
pro
tein
0
2
4
6
8
10
12
EN
T2
pro
tein
ENT1 AND ENT2 PROTEIN EXPRESSION IN CLL PATIENTS
Equilibrative Nucleoside Transporter-2 (hENT2) Protein correlates with ex-vivo Sensitivity to Fludarabine in Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL)-cells. Molina-Arcas, M., Marcé, S., Villamor, N., Huber-Ruano, I., Casado, F.J., Bellosillo, B., Montserrat, E., Gil, J., Colomer, D., Pastor-Anglada, M. Leukemia 19:64-68, 2005
0 2 4 6 8 10 120.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
ENT2 protein
EN
T2
mR
NA
p= 0.1206
r = 0.379
0 2 4 6 8 10 120.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
ENT2 protein
pm
ol g
ua
n/m
g/1
0s
ec
p= 0.0258
r = 0.538
0 2 4 6 8 10 120.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
ENT2 protein
pm
ol f
lud
a/m
g/1
0sec
p= 0.0465
r = 0.475
0 2 4 6 8 10 1225
50
75
100
ENT2 protein
%v
iabi
lity
p= 0.0060
r = 0.693
Equilibrative Nucleoside Transporter-2 (hENT2) Protein correlates with ex-vivo Sensitivity to Fludarabine in Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL)-cells. Molina-Arcas, M., Marcé, S., Villamor, N., Huber-Ruano, I., Casado, F.J., Bellosillo, B., Montserrat, E., Gil, J., Colomer, D., Pastor-Anglada, M. Leukemia 19:64-68, 2005
LA PROTEINA hENT2 COMO BIOMARCADOR DE LA RESPUESTA A LA FLUDARABINA EN ENFERMOS DE LLC
LA AUSENCIA DE hENT1 SE ASOCIA CON UNA MENOR SUPERVIVENCIA EN PACIENTES CON ADENOCARCINOMA
PANCREÁTICO TRATADOS CON GEMCITABINA
The absence of human equilibrative nucleoside transporter 1 is associated with
reduced survival in patients with gemcitabine-treated pancreas adenocarcinoma Spratlin,J.,
Sangha, R., Glubrecht, D., Dabbagh, L., Young, J.D., Dumontet, C., Cass, C., Lai, R.,
Mackey, R.. Clinical Cancer Research 10:6956-6961, 2004
1.-EL PATRÓN DE EXPRESION DE LAS PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS CNT Y ENT PUEDE TENER RELEVANCIA DIAGNÓSTICA, AUNQUE ANTICIPAMOS QUE SERÁ VARIABLE EN FUNCIÓN DEL TIPO DE TUMOR.
2.-ES FUNDAMENTAL ANALIZAR ESTOS PATRONES DE EXPRESIÓN EN TUMORES SÓLIDOS DE ENFERMOS QUE ESTÉN BAJO UNA TERAPIA CON DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS.
3.-LA POSIBILIDAD DE REGULAR FARMACOLÓGICAMENTE LA FUNCIÓN DE ESTAS PROTEÍNAS TAMBIEN SE APUNTA COMO UNA APLICACIÓN TERAPÉUTICA COADYUVANTE, AL PODER EVENTUALMENTE MODULAR LA BIOASEQUIBILIDAD DE FÁRMACOS.
CONCLUSIONES
•MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS
•ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs)
•FARMACOLOGÍA DE LOS NTs
•PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS
•ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS
OBJETIVOOBJETIVO
Utilizar la técnica de microarrays de DNA para:Utilizar la técnica de microarrays de DNA para:
Profundizar en las bases moleculares de la acción Profundizar en las bases moleculares de la acción farmácológica de los análogos de nucleósidosfarmácológica de los análogos de nucleósidos
Estudiar el papel de los transportadores de nucleósidos en la Estudiar el papel de los transportadores de nucleósidos en la acción de los análogos de nucleósidosacción de los análogos de nucleósidos
Efecto del 5’DFUR en células MCF7 (tumor de mama)
Inhibición del transportador ENT1 con NBTI
100.0 102.5 105.0 107.5
25
50
75
100
5'DFUR IC50=76M
5'DFUR+NBTI IC50=312M
[5'DFUR] nM
% v
iab
ility
100.0 102.5 105.0 107.5
25
50
75
100
5FU IC50= 49M
5FU+NBTI IC50=58M
[5'FU] nM
% v
iab
ility
Caracterización de la línea MCF7Caracterización de la línea MCF7
0
3
6
9
uridina 5'DFUR
pm
ol/m
g/1
5seg
ENT1
ENT2
• Expresa los cinco transportadores de Expresa los cinco transportadores de nucleósidosnucleósidos• Presenta únicamente transporte Presenta únicamente transporte equilibrativo, principalmente ENT1equilibrativo, principalmente ENT1• 5’DFUR es transportado mayoritariamente 5’DFUR es transportado mayoritariamente a través de ENT1a través de ENT1
Citotoxicidad de 5’DFURCitotoxicidad de 5’DFUR
• 90 minuto de tratamiento90 minuto de tratamiento• Medida por contaje celularMedida por contaje celular• +/- NBTI 100nM+/- NBTI 100nM
CONDICIONES ELEGIDAS PARA LOS ESTUDIOS FARMACOGENÓMICOSCONDICIONES ELEGIDAS PARA LOS ESTUDIOS FARMACOGENÓMICOS
5’-DFUR 250 5’-DFUR 250 M M NBTI NBTI IC75 + NBTI IC75 + NBTI IC50 IC50
90 minutos de tratamiento90 minutos de tratamiento
+/- NBTI 100 nM (pre-incubación 30 min)+/- NBTI 100 nM (pre-incubación 30 min)
Efecto a tiempos cortos 4h y a tiempos largos 24hEfecto a tiempos cortos 4h y a tiempos largos 24h
8 condiciones experimentales8 condiciones experimentales
controlcontrol NBTI 100nMNBTI 100nM
5’-DFUR 2505’-DFUR 250MM 5’-DFUR 2505’-DFUR 250M + NBTI 100nMM + NBTI 100nM
4 y 24 horas 4 y 24 horas postratamientopostratamiento
arraysarrays
2 experimentos independientes2 experimentos independientes
marcaje Cy3 y Cy5marcaje Cy3 y Cy532 arrays32 arrays
4h
24h
ctrl NBTI 5’DFUR 5’DFUR+NBTI
G0/G1- 41% S- 36% G2- 23%
G0/G1- 42% S- 36% G2- 22%
G0/G1- 51% S- 34% G2- 16%
G0/G1- 52% S- 33% G2- 15%
G0/G1- 54% S- 25% G2- 21%
G0/G1- 50% S- 26% G2- 23%
G0/G1- 42% S- 38% G2- 19%
G0/G1- 53% S- 24% G2- 21%
EFECTO DEL TRATAMIENTO CON 5’DFUR Y DE LA INHIBICIÓN FARMACOLÓGICA DEL
TRANSPORTADOR hENT1 SOBRE EL CICLO CELULAR
1- Obtención y amplificación de RNA1- Obtención y amplificación de RNA
2- Síntesis y marcaje del cDNA2- Síntesis y marcaje del cDNA
3 – Hibridación de los arrays (respecto a un control universal)3 – Hibridación de los arrays (respecto a un control universal)
4- Scanning4- Scanning
5- Cuantificación de las señales de hibridación: Gene pix5- Cuantificación de las señales de hibridación: Gene pix
6- Obtención de datos6- Obtención de datos
Descartar las columnas que no interesan. Nos quedamos (por ejemplo) con:
- Flag- Bloque- Columna- Fila- Nombre- ID
- Media F635- Mediana B635- Media F532- Mediana B532
ANÁLISIS INFORMÁTICOANÁLISIS INFORMÁTICO
ONCOCHIP-CNIO
>27.000 SPOTS
>12.000 GENES
Role of hENT1 in fluropyrimidine-induced gene expression in breast cancer cells. Molina-Arcas, M., Moreno-Bueno, G., Hernández, H.L., Casado, F.J., Palacios, J., Pastor-Anglada, M., submitted
RT-PCR semicuantitativaRT-PCR semicuantitativa
Diseñar primers de los genes a validarDiseñar primers de los genes a validar- Análisis de homologia con isoformas de la misma familiaAnálisis de homologia con isoformas de la misma familia- Control endógeno GAPDH (banda 175pb)- Control endógeno GAPDH (banda 175pb)
Buscar para cada gen condiciones no saturantesBuscar para cada gen condiciones no saturantes
1,25 2,5 5 10
94ºC --- 5 min
94ºC --- 5 s55ºC --- 30 s72ºC --- 30 s
72ºC --- 7 min
30 ciclos
Amplificación del gen de interés conjuntamente con el control Amplificación del gen de interés conjuntamente con el control endógeno (GAPDH)endógeno (GAPDH)
- + - +
PLK2 RRM2B
GAPDH
Muy complicado amplificar el gen sin saturar la GAPDH
Hacemos- cada gen por separado- cada condición por duplicado
PLK2
TP53I3
RRM2B
AQP3
TP53INP1
GAPDH
CTRL NBTI 5’DFUR 5’DFUR+N CTRL NBTI 5’DFUR 5’DFUR+N
4 horas 24 horas
RT-PCR semicuantitativaRT-PCR semicuantitativa
4hores 24 hores0
5
10
15CTRLNBTI
5DFUR
5DFUR-NBTI
FA
S
4hores 24 hores0
5
10
CTRLNBTI
5DFUR
5DFUR-NBTI
40
45
50
p21
Real-time PCR: FAS y p21Real-time PCR: FAS y p21
Real-time PCR Real-time PCR RNA RNA
Arrays Arrays RNA amplificado RNA amplificado
Hemos perdido información al amplificar el RNA?
4h
24h
ctrl NBTI 5’DFUR 5’DFUR+NBTI
Immunocitoquímica: MDM2Immunocitoquímica: MDM2
Profundizar en las bases moleculares de la acción Profundizar en las bases moleculares de la acción farmácológica de los análogos de nucleósidosfarmácológica de los análogos de nucleósidos
- 90 minutos de tratamiento es un tiempo suficiente para ejercer una acción 90 minutos de tratamiento es un tiempo suficiente para ejercer una acción farmacológicafarmacológica
- El tratamiento induce parada de ciclo en fase SEl tratamiento induce parada de ciclo en fase S
- El mayor efecto se produce a las 24 horas después de 90 minutos de tratamiento. - El mayor efecto se produce a las 24 horas después de 90 minutos de tratamiento. La mayoría de genes que se inducen son dependientes de p53La mayoría de genes que se inducen son dependientes de p53
- El tratamiento con NBTI revierte el efecto sobre ciclo y la inducción de la mayoría El tratamiento con NBTI revierte el efecto sobre ciclo y la inducción de la mayoría de los genesde los genes
- En realidad estas técnicas tan sólo son generadoras de hipótesisEn realidad estas técnicas tan sólo son generadoras de hipótesis
- Se demuestra imprescindible realizar análisis funcionales de las posibles dianas Se demuestra imprescindible realizar análisis funcionales de las posibles dianas farmacológicasfarmacológicas
- El microchip se transforma en un listado discreto de genes. En nuestro caso los El microchip se transforma en un listado discreto de genes. En nuestro caso los validaremos tanto analizando el efecto de otros fármacos como determinando el validaremos tanto analizando el efecto de otros fármacos como determinando el papel de funciones transportadoras concretas sobre su funciónpapel de funciones transportadoras concretas sobre su función
José García-ManteigaSylvie DuflotIvette
Aymerich
Javier Casado
Sonia Fernández Veledo
Míriam Molina
Marçal Pastor-Anglada
Elena Guillén-Gómez
DEPARTMENT OFBIOCHEMISTRYAND MOLECULARBIOLOGY
UNIVERSITYOF BARCELONA
REGULATION OF TRANSPORT SYSTEMS RESEARCH GROUP
Pedro Cano-Soldado Isabel Huber Ruano FIS (Ministerio de Sanidad y Consumo), Plan Nacional en Biomedicina (Ministerio de Educación y Ciencia), Generalitat de Catalunya, Fundación Ramón Areces, FIPSE, Fundación “la Caixa”, Lilly, Roche Diagnostics,
Balagué Center