SESIÓN # 5:PURIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS.

INTRODUCCIÓN:La mayor parte de las investigaciones bioquímicas requieren la purificación, al menos parcial, de las sustancias objeto de estudio. Esto requiere generalmente un esfuerzo ya que una célula contiene miles de sustancias diferentes y la molécula deseada puede ser extremamente inestable o encontrarse a concentraciones muy bajas.

Métodos de ruptura celular y extracción de proteínas:El primer paso en el aislamiento de una proteína es la ruptura celular, para posteriormente poder extraer la proteína con un tampón adecuado. El método de ruptura a elegir depende de las características mecánicas del tejido o células de donde se va a aislar la proteína, así como de su localización. Entre los distintos métodos están:

a. Lisis Celular: Válido para células sin pared celular como las células de tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias. consiste en suspender las células en una solución hipotónica (más diluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmótica el agua difunde al interior de la célula, causando su hinchamiento y rotura.

b. Destrucción Mecánica: Entre estos métodos se encuentran la Homogenización (hacer pasar las células entre un tubo y un pistón de vidrio que ajustan casi totalmente); moler en un Mortero con arena; Molino con perlas de vidrio; la Prensa de French (que hace pasar las células a gran velocidad a través de un pequeño orificio), la Sonicación (someter las células a vibraciones de ultrasonido).

c. Congelación – Descongelación: La rotura se produce al someter las células a un cambio brusco de temperatura, congelando primero a -196 °C (con nitrógeno líquido) y pasándolas rápidamente a temperatura de laboratorio (25

°C). tras la rotura, o bien, si se requiere, durante el proceso de rotura. Se utilizan tampones de extracción para solubilizar las proteínas.

Existen varios métodos para determinar la concentración de proteínas de una muestra, tales como la determinación de la Absorbancia a 280 nm o mediante la formación de derivados coloreados de las proteínas, base de los métodos Biuret o de Lowry.

El método que vamos a utilizar en esta práctica (Bradford) se basa en un principio diferente: se emplea un colorante hidrofóbico (comassie blue - C45H44N3NaO7S2) cuyas disoluciones acuosas en presencia de ácido fosfórico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul intenso que se puede medir fácilmente. Este método (Bradford) depende de la interacción relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las proteínas. Su principal ventaja es que resulta más rápido y fácil de emplear que otros métodos alternativos y es más sensible que la medida de Absorbancia a 280 nm.

SESIÓN # 4:OBTENCIÓN Y CLARIFICACIÓN DE JUGOS DE FRUTAS POR MÉTODOS ENZIMÁTICOS.

INTRODUCCIÓN:

En los extractos comerciales de pectinasas usados para la fabricación de jugos de fruta coexisten tres enzimas: la pectinliasa, la poligalacturonasa y la pectinesterasa. La pectina es un polisacárido constituido principalmente por la unión de muchas moléculas de ácido galacturónico (el derivado ácido de la galactosa)

parcialmente metoxilado (es decir, con los grupos H del ácido reemplazados por CH3, denominados metilas). La figura 1 muestra los puntos de ataque (la unión química que se rompe) de las diversas pectinasas. La pectinliasa actúa sobre la pectina; las pectinesterasas remueven los grupos CH3, por lo que se las denomina enzimas demetoxilantes, y la poligalacturonasa actúa solamente si la pectina ha sido previamente desprovista de los

metilos por acción de las pectinesterasas.

Fig 1.- Acción de las pectinasas sobre la pectina. A) Efecto directo de la pectinliasa. B: efecto de la poligalacturonasa sobre la pectinliasa. B) efecto de la poligalacturonasa sobre la pectina previamente Como se observa en esa figura, la demetoxilación de la pectina por la pectinesterasa libera metanol (o alcohol metilico), que queda en el jugo; se trata de un caso típico de generación de una substancia tóxica como parte del procesamiento de un alimento. Por lo general, los jugos se concentran, por calentamiento o por ultrafiltración, en el lugar de producción, para reducir el flete; luego se los diluye y envasa cerca de los sitios de venta. Aquellos que fueron sometidos a este proceso de concentración y dilución suelen llevar un rótulo que así lo indica y tienen la ventaja de haber perdido casi totalmente el metanol, junto con algunos compuestos aromáticos, debido al concentrado. Pero también se venden jugos que no siguieron los pasos anteriores, distribuidos directamente al público luego de ser prensada la fruta y aclarado el zumo: son los que conservan el metanol y, por ende, expondrían a los grandes bebedores de zumo a riesgos de los que aún se sabe poco.

Electroforesis

INTRODUCCIONLa electroforesis en gel de proteínas vegetales constituye una herramienta muy útil para el estudio del metabolismo del vegetal. La extracción de proteínas es considerada a menudo como un paso preliminar para una subsiguiente purificación o para un estudio electroforético, pero de hecho constituye un paso crucial para el estudio de proteínas vegetales, ya que el procedimiento de extracción determina la naturaleza y la estabilidad de las proteínas extraídas, lo que a su vez determina la calidad y la validez de los resultados. Para comprobar si la proteína de interés se ha separado del resto, es decir si la proteína está pura, se requieren las técnicas electroforéticas. La electroforesis de proteínas se lleva a cabo generalmente en geles de poliacrilamida. Se trata de geles porosos, cuya porosidad se puede regular en función de la concentración de acrilamida.Durante la electroforesis la fuerza que provoca la migración de las proteínas es un campo eléctrico, y el gel actúa como filtro molecular, garantizando la migración de las proteínas en función de su relación carga/masa. A diferencia de lo que ocurría en la cromatografía de filtración, en las electroforesis las proteínas mayores son retardadas y se mueven más lentamente a través del gel, ya que las va frenando el tamaño del poro y las proteínas más pequeñas avanzan más rápidamente.En la figura vemos un típico aparato de electroforesis. El gel se encuentra entre dos placas (normalmente de vidrio). La colocación de un peine de electroforesis en la parte superior antes de que la acrilamida gelifique permite la formación de unos pozos, donde se colocarán posteriormente y una vez retirado el peine, las muestras, que se desplazarán por calles paralelas al aplicar el campo eléctrico.A las muestras de proteína se les agrega un buffer de carga (un colorante azul) de pequeño peso molecular que nos indica la migración del frente. Se cierra la cámara, el sistema se conecta a una fuente de alimentación y las proteínas migran hacia el polo positivo, situado en la base del gel. Después el gel se retira de la cámara que lo contiene y se incuba en presencia del colorante adecuado (azul de Coomassie), que tiñe por completo el gel. Cumplidas 24 h, el gel se lava con agua destilada, obteniéndose:Existen dos tipos principales de electroforesis, en condiciones Nativas las proteínas se separan en función de su carga/masa; y en condiciones desnaturalizantes la electroforesis se realiza en presencia de un detergente, el SDS (dodecil sulfato sódico). El SDS es un detergente aniónico, que se une a todas las proteínas en la misma proporción formando una especie de micela cargada

negativamente. La gran carga negativa del SDS enmascara la carga intrínseca de las proteínas, con lo que éstas se separan solo en función de su masa e independientemente de su carga. El único inconveniente de esta técnica es que el SDS desnaturaliza las proteínas y las proteínas multiméricas se separan en sus subunidades. Las electroforesis en SDS además de permitir calcular el peso molecular de las cadenas polipeptídicas, nos indican las distintas subunidades que posee la proteína. Generalmente la proteína interés se analizan incluyendo calles con marcadores moleculares, que son proteínas de peso molecular conocido que nos permiten determinar el peso molecular de la cadena polipeptídica, como se muestra en la siguiente figura.