Masarykova univerzita

Lékařská fakulta

ZÁCHYT BORDETELLA PERTUSSIS V KLINICKÉM MATERIÁLU

METODOU PCR

Bakalářská práce

v oboru zdravotní laborant

Vedoucí bakalářské práce: Autor:

MUDr. Jana Bednářová, Ph.D. Kateřina Lufinková

Brno, duben 2014

Jméno a příjmení autora: Kateřina Lufinková

Název bakalářské práce: Záchyt Bordetella pertussis v klinickém materiálu metodou PCR

Pracoviště: Oddělení klinické mikrobiologie, Fakultní nemocnice Brno

Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Jana Bednářová, Ph.D.

Rok obhajoby bakalářské práce: 2014

Souhrn:

Bordetella pertussis je původcem černého kašle. I přes zavedené očkování se onemocnění

vyskytuje i v dnešní době, jak u dospělých pacientů, tak i u dětí. Průkaz etiologického agens

spočívá v přímém průkazu (kultivace, molekulárně biologické metody) i v nepřímém průkazu

(detekce protilátek). V práci bude zhodnocen přínos metody PCR ke klinické diagnostice.

Klíčová slova: Bordetella pertussis, dávivý/černý kašel/pertuse, polymerázová řetězová

reakce

Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných

norem.

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Jany

Bednářové, Ph.D., a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje.

V Brně dne ……………… ………………………………

(Kateřina Lufinková)

Mé velké a upřímné poděkování patří paní MUDr. Janě Bednářové, Ph.D., za její odborné

vedení, profesionální a lidské jednání, cenné informace a pomoc při vypracování bakalářské

práce. Děkuji celému týmu laboratoře OKM FN Brno za předané zkušenosti a trpělivost,

stejně tak jako mým rodičům a partnerovi za podporu.

OBSAH

1. ÚVOD ................................................................................................................................ - 9 -

2. OBECNÁ ČÁST .............................................................................................................. - 10 -

2.1 Bakterie Bordetella pertussis ..................................................................................... - 10 -

2.1.1 Charakteristika ..................................................................................................... - 10 -

2.1.2 Historie ................................................................................................................ - 11 -

2.1.3 Význam ................................................................................................................ - 12 -

2.2 Patogenita a virulence ................................................................................................ - 12 -

2.2.1 Patogeneze ........................................................................................................... - 12 -

2.2.2 Stadia onemocnění ............................................................................................... - 13 -

2.2.3 Komplikace .......................................................................................................... - 14 -

2.2.4 Toxiny .................................................................................................................. - 14 -

2.3 Prevence ..................................................................................................................... - 15 -

2.4 Léčba .......................................................................................................................... - 18 -

2.5 Imunitní odpověď ....................................................................................................... - 19 -

2.6 Diagnostika pertuse .................................................................................................... - 20 -

2.6.1 Odběr materiálu ................................................................................................... - 20 -

2.6.1.1 Nazofaryngeální výtěr nebo aspirát na kultivační vyšetření ............................ - 20 -

2.6.1.2 Nazofaryngeální výtěr nebo aspirát na PCR .................................................... - 21 -

2.6.1.3 Bronchoalveolární laváž ................................................................................... - 22 -

2.6.2 Odběr materiálu pro sérologii .............................................................................. - 22 -

2.7 Uchovávání a transport materiálu .............................................................................. - 22 -

2.7.1 Transport vzorků pro kultivaci ............................................................................ - 22 -

2.7.2 Transport vzorků pro PCR ................................................................................... - 23 -

2.7.3 Uchovávání vzorků pro sérologickou detekci ..................................................... - 23 -

2.8 Přímá detekce patogenu ............................................................................................. - 23 -

2.8.1 Mikroskopický průkaz ......................................................................................... - 23 -

2.8.2 Kultivační průkaz ................................................................................................ - 23 -

2.8.3 Přímá imunofluorescence (DFA) ........................................................................ - 25 -

2.8.4 Polymerázová řetězová reakce (PCR) ................................................................. - 26 -

2.8.4.1 Princip ............................................................................................................... - 26 -

2.8.4.2 PCR diagnostika B. pertussis ........................................................................... - 29 -

2.9 Sérologie – nepřímá detekce patogenu ...................................................................... - 30 -

2.9.1 Aglutinace ............................................................................................................ - 31 -

2.9.1.1 Charakteristika .................................................................................................. - 31 -

2.9.1.2 Diagnostika B.pertussis metodou aglutinace .................................................... - 32 -

2.9.2 ELISA .................................................................................................................. - 33 -

2.9.2.1 Charakteristika .................................................................................................. - 33 -

2.9.2.2 Diagnostika B.pertussis metodou ELISA ......................................................... - 35 -

2.9.3 Imunoblot ............................................................................................................ - 36 -

3. CÍLE PRÁCE ................................................................................................................... - 37 -

4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ........................................................................................... - 38 -

4.1. Materiál a metody ..................................................................................................... - 38 -

4.1.1. Pacienti a odběr vzorků ...................................................................................... - 38 -

4.1.2. Přístroje ............................................................................................................... - 38 -

4.1.3. Pomůcky ............................................................................................................. - 40 -

4.1.4 Přímý průkaz ....................................................................................................... - 41 -

4.1.4.1 Real-time PCR pomocí komerční soupravy Pneumoplex Dynex .................... - 41 -

4.1.4.2 Real-time PCR pomocí komerční soupravy B.pertussis/parapertussis Bio-

Evolution ...................................................................................................................... - 41 -

4.1.5 Nepřímý průkaz ................................................................................................... - 43 -

4.1.5.1 ELISA ............................................................................................................... - 43 -

4.1.5.1.1 Detekce specifických protilátek pomocí komerční soupravy SERION ELISA

classic ........................................................................................................................... - 43 -

4.1.5.2 Aglutinace ......................................................................................................... - 44 -

4.2 Výsledky .................................................................................................................... - 46 -

4.2.1 Rozdělení souboru ............................................................................................... - 46 -

4.2.3. Skupina A ...................................................................................................... - 48 -

4.2.4. Skupina B ....................................................................................................... - 50 -

4.2.5. Negativní ........................................................................................................ - 51 -

4.2.6. Porovnání souboru podle věku a pohlaví ....................................................... - 51 -

5. ZÁVĚR ............................................................................................................................ - 52 -

6. SEZNAM LITERATURY A POUŽITÝCH ZDROJŮ ................................................... - 53 -

SEZNAM SYMBOLŮ A ZKRATEK

BP – Bordetella pertussis

DNA – deoxyribonukleová kyselina

DTP – vakcína proti záškrtu, tetanu a pertusi

ELISA – Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

EU – Evropská unie

FHA – filamentózní hemaglutinin

IgG, M, A – imunoglobulin G, M, A

IKD – inkubační doba

KHS – Krajská hygienická stanice

LIS – laboratorní informační systém

OKM FN Brno – Oddělení klinické mikrobiologie, Fakultní nemocnice Brno

PCR – polymerázová řetězová reakce

PT – pertusový toxin

SZÚ – Státní zdravotní ústav

WHO – Světová zdravotnická organizace

- 9 -

1. ÚVOD

Práce má standardní členění do částí – teoretická a experimentální, přičemž se v celém

průběhu opírá především o literaturu a výzkum, které souvisejí s touto problematikou.

V teoretické části je věnován prostor charakteristice bakterie Bordetella pertussis (obecná

charakteristika bakterie, virulentní faktory, apod.), dále onemocnění, včetně jeho nezbytných

charakteristik – průběh, následky, diagnostika, prevence, očkování, očkovací kalendář, léčba,

historie, epidemiologická situace, atd., které způsobuje. V další části je pozornost věnována

metodě PCR a průkaznosti etiologického agens spočívajícího v přímém průkazu (kultivace,

molekulárně biologické metody) i nepřímém průkazu (detekce protilátek).

V experimentální části zpracovávám soubor pacientů, který mi byl poskytnut

z laboratorního informačního systému Oddělení klinické mikrobiologie ve Fakultní nemocnici

Brno.

Využití metody PCR při identifikaci bakterie Bordetella pertussis v sobě skrývá obrovský

potenciál i s ohledem na vážnost onemocnění – černý kašel, který způsobuje a je i v těchto

letech stále aktuálním tématem, neboť i přes zavedené očkování se druh tohoto onemocnění

vyskytuje relativně hojně a to jak u dospělých pacientů, tak i u dětí.

V závěru práce jsou shrnuty teoretické a praktické poznatky, na základě kterých jsou

zhodnoceny přínosy metody PCR v případě klinické diagnostiky.

- 10 -

2. OBECNÁ ČÁST

2.1 Bakterie Bordetella pertussis

2.1.1 Charakteristika

Bordetella pertussis je malá gramnegativní tyčinka způsobující černý kašel (též pertussis,

pertuse, divý, zádušní, zajíkavý anebo dávivý kašel), což je vysoce nakažlivé onemocnění

dýchacích cest postihující zejména humánní populaci (TestLine, 2013).

Dle WHO je pertuse definována jako kašel trvající déle než 21 dní, současně potvrzený

laboratorně.

V České republice patří mezi povinně hlášená a dlouhodobě sledovaná infekční

onemocnění. Souhrnná data o úmrtnosti na pertusi na území historických českých zemí od

roku 1890 jsou v archivu SZÚ (PELC, 1929).

Obr. 1: Bordetella pertussis

Zdroj:[http://sciencesavvy.files.wordpress.com/2012/08/bordetella_pertussis_bacteria_in_trachea-spl-nibsc1.jpg]

- 11 -

2.1.2 Historie

Pertuse je onemocnění známé již od 14. století, které postihuje celý svět. Odhaduje se, že

každý rok onemocní pertusí více než 50 milionů osob a 300 000 na tuto nemoc zemře

(BENEŠ, 2010).

Dříve byla pertuse jedním z nejčastějších dětských onemocnění, přičemž více než polovina

dětí se nakazila před nástupem do školy. Ve 40. letech 20. století výskyt dramaticky poklesl

s vývojem celobuněčné vakcíny, na základě čehož mnohé země včetně České republiky

zavedly povinné vakcinační programy pro děti. Po zavedení očkování nemocnost dramaticky

poklesla, z původních 30 000 případů v roce 1958 na 5 – 40 v roce 1992. Navzdory tomu

v současné době incidence tohoto onemocnění vzrůstá a současně se posouvá do vyšších

věkových kategorií dětí, adolescentů a dokonce i dospělých, u kterých se ovšem vyskytuje

bez typických záchvatů a zpravidla nemá fatální následky. V loňském roce bylo u nás

zaznamenáno přes 880 případů nakažených (KŘÍŽ, 2003; CHLÍBEK, 2011).

Obr. 2: Incidence pertuse v České republice v letech 1987 – 2008

Zdroj:[CHLÍBEK.R., 2011, dostupné na: www.zdn.cz]

- 12 -

2.1.3 Význam

Rod Bordetella zahrnuje v současnosti 7 druhů velmi malých, opouzdřených,

nepohyblivých, gramnegativních kokobacilů s fimbriemi, z nichž v humánním lékařství jsou

významnými patogeny Bordetella pertussis a Bordetella parapertussis, obě původce dávivého

kašle. Kromě původců dávivého kašle patří do rodu Bordetella zoopatogenní B. avium a B.

bronchiseptica a další druhy, B. hinzii, B. holmensii a B. trematum, jejichž význam v přírodě

dosud není dostatečně objasněn. Všechny druhy Bordetell mohou zvláště u

imunosuprimovaných jedinců způsobit onemocnění respiračního aparátu, otitidu nebo rannou

infekci (BENEŠ, 2010).

Bordetella pertussis (BP) potřebuje ke kultivaci striktně aerobní podmínky, nicméně

neroste na běžných kultivačních médiích (krevní agar, MacConkey agar), jelikož běžné agary

obsahují některé toxické součásti. Ke kultivaci tedy používáme půdy obohacené aktivním

uhlím, s přídavkem krve, albuminu nebo škrobu a nikotinamidu, jmenovitě Bordet-Gengou

agar (resp. Charcoal agar). Ke kultivaci přistupujeme nejlépe na konci inkubační doby,

v průběhu katarálního, případně na začátku paroxysmálního stadia, před začátkem

antibiotické terapie (VOTAVA a kol., 2003).

2.2 Patogenita a virulence

2.2.1 Patogeneze

Černý kašel se přenáší kapénkovou infekcí – vzduchem, ale i dotykem předmětů, které

byly v kontaktu s nakaženou osobou. Nakažlivost je vysoká, nejvnímavější jsou kojenci do 3

měsíců věku, u kterých nebyla provedena či dokončena vakcinace. Závažný průběh

onemocnění bývá sledován i u starých lidí. Onemocnění se vyskytuje častěji v podzimních a

zimních měsících, spíše u dětí navštěvujících kolektivní zařízení (HAVLÍK, 2002).

- 13 -

2.2.2 Stadia onemocnění

Typická forma onemocnění zahrnuje 4 stadia probíhající během 6 – 8 týdnů.

První, bezpříznakové stadium, inkubační doba (IKD) trvá 6 až 21 dní.

Ve druhém, katarálním stadiu, 1 – 2 týdny, již můžeme pozorovat počáteční netypické

příznaky podobné běžnému nachlazení. Rýmu, rhinitidu, slzení, subfebrilie a zhoršující se

suchý dráždivý kašel, který přechází z mírného do záchvatovitého stadia.

Třetí, paroxysmální stadium, trvající většinou 1 – 4 týdny, se projevuje typickými

epizodami dráždivého, záchvatovitého, zajíkavého kašle s přerývavým inspiriem, rudnutím,

otoky víček, cyanotickým zabarvením v obličeji a někdy i subkonjunktiválními hematomy.

Na konci záchvatů můžeme pozorovat apnoickou pauzu následovanou hlasitým, zajíkavým

táhlým inspiriem (někdy připomíná kokrhání kohouta) nebo zvracení, což je život ohrožující

obzvláště pro kojence.

V konečném stadiu rekonvalescence, 1 – 3 týdny, příznaky postupně odeznívají, záchvaty

kašle se snižují a zmírňují (BENEŠ, 2010; HOLČÍKOVÁ, 2003).

Tab. 1: Tabulka přehledu stádií onemocnění

IKD Katarální stádium Paroxysmální stádium Rekonvalescence

Trvání 6 - 21 dní 1 - 2 týdny 1 - 4 týdny 1 - 3 týdny

Symptomy žádnérýma, kašel,

nechutenství

dráždivý,

záchvatovitý,

zajíkavý kašel

ústup záchvatů,

nástup

sekundárních

komplikací

Průkaz agens

Zdroj: [http://www.pmfhk.cz/WWW/HVD_2008/12_Mare%C5%A1ov%C3%A1.pdf]

- 14 -

2.2.3 Komplikace

Nejčastější komplikací tohoto onemocnění je pneumonie, která u malých dětí bývá

příčinou fatálního konce. Bývá způsobena přímým účinkem pertusových toxinů nebo je

následkem aspirace. Mezi další komplikace patří pneumotorax, prolaps rekta a nebývá vzácné

poranění uzdičky jazyka zuby či subkonjunktivální hemoragie. Mnohdy je nemoc spjata

s opakovaným zvracením, které může vést až k malnutrici, celkovým vyčerpáním a díky

úpornému kašli může dojít až ke zlomeninám žeber, vzniku kýly či pomočování.

K nejzávažnějším komplikacím ale patří poškození centrálního nervového systému, na

kterém má podíl anoxie, hypoglykémie, krvácení a přímý účinek pertusového toxinu.

Onemocnění může být proto provázeno křečemi a poruchami vědomí. Neobvyklostí nebývají

ani trvalé následky v podobě hluchoty, slepoty a mentální retardace. V krajním případě může

toto onemocnění skončit úmrtím (HOLČÍKOVÁ, 2003; HAVLÍK, 2002; KHS, 2008).

2.2.4 Toxiny

BP po vniknutí do horních cest dýchacích adheruje na povrch řasinkového epitelu sliznice

nosohltanu, hltanu, průdušnice a průdušek a způsobuje onemocnění uvolněním svých toxinů,

jimiž vyvolává celou řadu imunologických a patofyziologických odpovědí organismu.

Hlavními virulentními faktory černého kašle jsou pertusové toxiny, které působí oslabení

imunitního systému a dále adheziny jako filamentózní hemaglutinin (FHA) a fimbrie,

pertactin a dermonektorický toxin, které umožňují přilnutí mikroba na hostiteli.

Pertusový toxin (PT) je specifický pouze pro BP. Skládá se z aktivního enzymu a

vazebných subjednotek. Aktivní enzym je polypeptid ADP-ribosyl transferáza. Vazebné

subjednotky se skládají z minimálně tří různých polypeptidů, které se váží na specifické

karbohydráty na buněčných površích a na glykoproteinech obsažených v krevním séru.

Výsledným efektem PT je vazba na regulační protein vázaný na membránu, což způsobuje

stimulaci adenylátcyklázy. Kromě toho způsobuje především hypoglykemii, zvyšuje citlivost

na histamin a zesiluje permeabilitu kapilár. U experimentálních zvířat má vliv také na

imunitní reakce, podněcuje lymfocytózu uvolňováním B a T lymfocytů z kostní dřeně, sleziny

a mízních uzlin.

- 15 -

Stimulace adenylátcyklázy je zajištěna taktéž adenylátcyklázovým toxinem, což napomáhá

prvnímu stupni rozvoje infekce.

Dalším produktem BP je dermonekrotický toxin (nověji letální toxin), který způsobuje

lokální nekrózu po intradermálním vpichu.

Epizody záchvatovitého kašle jsou pravděpodobně způsobeny tracheálním cytotoxinem,

který je toxický pro řasinkový respirační epitel.

Mezi adheziny patří filamentózní hemaglutinin a pertaktin, které jsou součástí acelulárních

multikomplexních očkovacích látek. Dále sem patří dva odlišitelné sérotypy fimbrií, sérotyp 2

a 3, které zodpovídají za další stabilizaci přichycení na epitelie horních cest dýchacích

(BEDNÁŘ, 1996).

2.3 Prevence

V České republice se proti pertusi očkuje preventivně od roku 1958. Základní schéma

zahrnovalo pět dávek celobuněčné vakcíny, tři základní dávky a dvě přeočkování (první

dávka v 9. týdnu věku dítěte, druhá 6 – 8 týdnů po první, třetí 6 – 8 měsíců po druhé dávce a

revakcinační dávky ve třech a šesti letech věku dítěte). Očkovací schéma bylo aktualizováno

na základě výsledků sérologických přehledů a v roce 1994 došlo taktéž k záměně druhu

používané československé trivakcíny DTP za zahraniční tetravakcínu DTP-Hib, která byla v

roce 2007 nahrazena základní hexavakcínou Infanrix hexa (GlaxoSmithKline) s acelulární

pertusovou složkou (HUČKOVÁ, KOLLÁROVÁ, 2012).

V podstatě tedy existují dva typy vakcín, tzv. vakcíny celobuněčné, které obsahují

inaktivovanou suspenzi B. pertussis, nebo vakcíny označované jako acelulární, které obsahují

jen jednotlivé antigenní složky, např. vláknitý hemaglutinin, pertusový toxin a pertactin. Ta je

součástí trivalentní (DTP) vakcíny registrované pod jménem Infanrix. Obě vakcíny mají

schopnost navodit ochranu proti pertusi, u acelulární je však pozorován nižší výskyt

nežádoucích reakcí po očkování.

Konvenční celobuněčné vakcíny jsou vyráběny v mnoha zemích. Jejich nevýhodou je

vysoká reaktogenita a možný vznik nežádoucích účinků a komplikací. Až u 22 procent dětí

docházelo po očkování k lokálním reakcím – zarudnutí, otok, bolestivost. Méně časté jsou

- 16 -

komplikace jako encefalopatie, křeče, psychomotorická retardace, ale i možnost

irreverzibilního poškození CNS. To vedlo v některých státech (Japonsko, Švédsko) k poklesu

proočkovanosti populace s následným vzestupem počtu onemocnění, a dokonce i k úmrtím.

(BENEŠ, 2010; VOTAVA, 2009; FABIÁNOVÁ, KŘÍŽ, 2007)

V současné době se u nás používají vakcíny, které kombinují očkování proti pertusi

s očkováním proti záškrtu a tetanu, případně i proti infekcím, které působí Haemophilus

influenzae sérotypu b a dětské přenosné obrně. Očkovací kalendář černého kašle je zahájen od

9. týdne věku dítěte, kdy je podána očkovací látka Infanrix hexa. Očkovací schéma pokračuje

druhou, třetí a čtvrtou dávkou ve třetím, čtvrtém a osmnáctém měsíci života. První

přeočkování je doporučeno mezi pátým a šestým rokem stále stejnou vakcínou, druhé potom

v desátém až jedenáctém roce očkovací látkou Boostrix polio. Očkování proti černému kašli

se řadí mezi povinná očkování, je tedy plně hrazené za zdravotního pojištění (Česká

vakcinologická společnost ČLS JEP).

Imunita proti černému kašli ovšem není celoživotní, vymizí zpravidla po 4 – 12 letech po

očkování. Tzn., že v dospělém věku již ani očkovaní jedinci nejsou chráněni (BENEŠ, 2009).

Do dospělosti přetrvávají pouze protilátky proti pertusovému toxinu, protilátky proti

hemaglutininu postupně vymizí. Postvakcinační a postinfekční imunita získaná po

onemocnění způsobeném B. pertussis nechrání před onemocněním způsobeným B.

parapertussis.

Kontraindikováno je očkování proti pertusi u pacientů s anafylaktickými reakcemi na

vakcinační nebo pomocnou složku očkovací látky, v případě akutních onemocnění, pacientů

s progresivními neurologickými nebo metabolickými onemocněními a encefalopatiemi.

(Očkovací látky, Dostupné na: www.vakciny.net)

- 17 -

Obr. 3: Vakcína Infanrix hexa Obr. 4: Vakcína Boostrix polio

Zdroj:[http://www.ockovaniprokazdeho.cz/2012/10/stazeni-vakciny-infanrix-hexa-z-trhu.html]

[http://helsepersonell.gsk.no/produktoversikt/boostrix-polio.html]

Obr. 5: Očkovací kalendář v ČR platný k 1. 1. 2013

od 4. dne – 6. týdne Tuberkulóza (pouze u rizikových dětí s indikací)

BCG vaccine SSI

od 6. týdne Rotavirové nákazy Rotarix, Rotateq

(1. dávka)

od 9. týdne (2. měsíc) Záškrt, tetanus, černý kašel, dětská obrna,

žloutenka typu B,

onemocnění vyvolaná

Haemophilus influenzae typu B

Infanrix hexa (1. dávka)

Pneumokoková onemocnění*

Synflorix, Prevenar 13 (1. dávka)

Rotavirové nákazy Rotarix, Rotateq

(2. dávka-za měsíc po

1. dávce)

3. měsíc Záškrt, tetanus, černý kašel, dětská obrna,

žloutenka typu B,

onemocnění vyvolaná

Haemophilus influenzae typu B

Infanrix hexa (2. dávka-za měsíc po

1. dávce)

Pneumokoková onemocnění*

Synflorix, Prevenar 13 (2. dávka-za měsíc po

1. dávce)

Rotavirové nákazy Rotateq (3. dávka-za

měsíc po 2. dávce)

- 18 -

4. měsíc Záškrt, tetanus, černý

kašel, dětská obrna, žloutenka typu B,

onemocnění vyvolaná

Haemophilus influenzae

typu B

Infanrix hexa

(3. dávka-za měsíc po 2. dávce)

Pneumokoková

onemocnění*

Synflorix, Prevenar 13

(3. dávka-za měsíc po 2. dávce)

11.-15. měsíc Pneumokoková onemocnění*

Synflorix, Prevenar 13 (přeočkování)

15. měsíc Spalničky, zarděnky,

příušnice

Priorix (1. dávka) Plané neštovice, spalničky,

zarděnky, příušnice

Priorix-Tetra (1. dávka)

do 18. měsíce Záškrt, tetanus, černý kašel, dětská obrna,

žloutenka typu B,

onemocnění vyvolaná

Haemophilus influenzae typu B

Infanrix hexa (4. dávka)

21. až 25. měsíc Spalničky, zarděnky,

příušnice

Priorix (2. dávka-za 6-

10 měsíců po

1. dávce)

Plané neštovice, spalničky,

zarděnky, příušnice

Priorix-Tetra (2. dávka)

5. - 6. rok Záškrt, tetanus, černý kašel

Infanrix (přeočkování)

10. - 11. rok Záškrt, tetanus, černý

kašel, dětská obrna

Boostrix polio

(přeočkování)

13. rok (jen dívky) Onemocnění lidským papilomavirem (karcinom

děložního čípku)*

Cervarix, Silgard (celkem 3 dávky)

14. rok (u

neočkovaných v 10-11 letech)

Tetanus Tetavax, Tetanol Pur

(přeočkování)

Záškrt, tetanus, černý kašel Boostrix, Adacel

(přeočkování)

Zdroj:[ http://www.vakcinace.eu/ockovani-v-cr]

2.4 Léčba

Ačkoliv je dávivý kašel bakteriální onemocnění, jakmile se rozvine a uplatní vliv toxinů,

antibiotika již průběh pertuse příliš neovlivní. Tato klinická neúčinnost je vysvětlována již

existující fixaci toxinů v respiračním aparátu. Antimikrobní terapie je však indikována i v této

- 19 -

fázi onemocnění za účelem eliminace šíření toxického agens v populaci. Pacienti by měli být

taktéž izolováni po několik týdnů nebo do doby, kdy je jejich kultivační nález negativní.

Na druhé straně právě v katarálním stádiu, kdy by bylo podávání antibiotik žádoucí a

nejúčinnější, většinou pertuse ještě rozpoznána není. (BENEŠ, 2010; VOTAVA a kol., 2009).

Zejména v katarálním stadiu je bakterie in vitro dobře citlivá na řadu antimikrobních látek.

Lékem první volby jsou makrolidová antibiotika, zejména erytromycin, který může být použit

i profylakticky u osob, které přišly do kontaktu s nakaženým. Účinné jsou také tetracykliny,

co-trimoxazol nebo chloramfenikol.

Beta-laktamová antibiotika nejsou vhodná, protože nedosahují účinných koncentrací na

sliznici cest dýchacích. Léčba antibiotiky rychle zbaví pacienta bakterií, avšak záchvaty kašle

ovlivní jen málo nebo vůbec ne.

Doporučené dávkovací schéma u erytromycinu pro bronchitis acuta vyvolanou Bordetella

pertussis nebo parapertussis je: dospělí 500 mg per os každých 6 hodin, děti 30-50 mg/kg/den

ve čtyřech dávkách taktéž po 6 hodinách. Aplikuje se po dobu 10 dní. V České republice není

erytromycin dostupný, využívá se klaritromycin. (BÉBROVÁ a kol., 2003)

Nebyla prokázána žádná symptomatická léčba, která by pozitivně ovlivnila průběh

onemocnění (trvání a intenzitu záchvatů, dobu hospitalizace atd.).

2.5 Imunitní odpověď

Imunita po proběhlém onemocnění ani po očkování není celoživotní (4 – 20 let). Hladina

protilátek po očkování postupně klesá s věkem (3 – 12 let). Imunita po očkování acelulární

vakcínou je kratší než po očkování celobuněčnou vakcínou. Transplacentárně přenesené

protilátky mizí v průběhu 4. – 8. týdne života a 95% dětí ve věku 2 měsíců již nemá žádné

protilátky. Vysoké hladiny mateřských protilátek nemají vliv na délku jejich přetrvávání a u

dětí negativně ovlivňují tvorbu vlastních protilátek po očkování. (FABIÁNOVÁ, 2011)

- 20 -

Imunitní odpověď na infekci pertuse je zaměřena proti různým antigenům.

Nejspolehlivější je ale reakce protilátek IgG proti PT, které jsou změřitelné u 90%

nakažených lidí a mohou perzistovat několik let.

V séru se vyskytují nejdříve po 2 – 3 týdnech od počátku onemocnění a svého maxima

dosahují po 6 – 8 týdnech, kdy dochází k typickým projevům záchvatovitého kašle. V případě

primární infekce obvykle začíná produkce protilátek ve druhém týdnu paroxysmálního stadia.

Nejdříve jsou detekovatelné IgM, které se podílí na primární imunitní odpovědi, mají krátký

poločas a přetrvávají v krevním séru po dobu 2 – 3 měsíců. Analyzujeme je již 5 – 10 dní po

začátku infekce. Po 1 – 2 týdnech mohou být stanoveny taktéž IgA protilátky, které perzistují

6 – 24 měsíců. Rozvoj antigenní odpovědi u dětí může být opožděn.

2.6 Diagnostika pertuse

2.6.1 Odběr materiálu

Klinické projevy infekce dýchacích cest napodobující pertusi mohou vyvolat i jiné

mikroorganismy, zejména další druhy Bordetel, Haemophilus influenzae a různé typy

adenovirů, proto je nesmírně nezbytná rychlá a správná diagnostika. Laboratorní diagnostika

pertuse se opírá o přímý průkaz (kultivace, izolace agens a PCR detekce) a nepřímý průkaz

(sérologie, průkaz specifických protilátek). Optimální načasování pro diagnostiku B. pertussis

je v akutní fázi onemocnění – od objevení klinických příznaků – kašel.

2.6.1.1 Nazofaryngeální výtěr nebo aspirát na kultivační vyšetření

Odběr materiálu pro kultivaci je nutné provést před zahájením antibiotické léčby.

Ke kultivačnímu vyšetření se odebírá výtěr z nazofaryngu. Stěr se provádí nosem ze zadní

stěny nosohltanu tamponem na krátkém drátku (obr. 6). Orofaryngeální výtěr neobsahuje

dostatečný počet buněk řasinkového epitelu. Používají se tampony calcium alginat nebo

Dacron fiber, bavlněné tampony nejsou vhodné, jelikož obsahují mastné kyseliny, které jsou

- 21 -

pro B. pertussis toxické. Ideální provedení výtěru je ráno na lačno, pacient by taktéž před

odběrem neměl minimálně 2 – 3 hodiny žvýkat, kouřit ani si čistit zuby. Odběr může být pro

pacienta velmi nepříjemný, je obtížně proveditelný a vyžaduje trénink, provádí ho tedy

školený ORL specialista. Vzorek je uchováván při pokojové teplotě, zpracován ideálně do 4

hodin po odběru.

Vyšetřující laboratoře jsou povinny podle Vyhlášky č.473/2008 Sb. zasílat každý

izolovaný kmen B. pertussis a B. parapertussis do Národní referenční laboratoře pro pertusi a

difterii v SZÚ. (MAREŠOVÁ, 2008)

2.6.1.2 Nazofaryngeální výtěr nebo aspirát na PCR

Na rozdíl od odběru klinického materiálu na kultivační vyšetření pro metodu PCR lze

výtěr provézt i při probíhající antibiotické terapii. Tato metoda je rychlým a vysoce citlivým

řešením průkazu B. pertussis, avšak můžeme k ní přistoupit pouze v časné fázi onemocnění.

Obr. 6: Výtěr z nosohltanu

zdroj: [http://www.zuova.cz/Home/Page/Moznosti-mikrobiologicke-diagnostiky-daviveho-kasle]

- 22 -

2.6.1.3 Bronchoalveolární laváž

Odběr materiálu bronchoalveolární laváží je taktéž nutné provést na počátku onemocnění,

před zahájením antibiotické léčby. Bronchoalveolární laváž, zkráceně BAL, je diagnostická

metoda, při níž je získána bronchoalveolární tekutina ze segmentálních bronchů, bronchiol a

plicních alveol, která se použije k další diagnostice.

Tato metoda se provádí aplikací 150 – 300 ml fyziologického roztoku do segmentálního

bronchu, který je následně aspirován. Vzhledem k provedení metody je nutné zvážit riziko

komplikací jako krvácení, pneumotorax nebo poškození hlasových vazů a sliznice dýchacích

cest. (Česká pneumologická a ftizeologická společnost, 2004).

2.6.2 Odběr materiálu pro sérologii

Krev k sérologické diagnostice se odebírá sterilními jehlami po dezinfekci místa odběru do

sterilních uzavřených nádobek s vakuem, případně do sterilní stříkačky, ze které se později

vstříkne do zkumavky (TOMAN, 2009). Doporučuje se provést dva odběry séra, první co

nejdříve v akutní fázi a druhý s odstupem 3 - 4 týdnů. Vzorky je třeba vyšetřit současně a k

průkazu infekce je třeba prokázat signifikantní (alespoň čtyřnásobný) vzestup titru protilátek.

2.7 Uchovávání a transport materiálu

2.7.1 Transport vzorků pro kultivaci

Optimální pro transport vzorku je jeho přímé naočkování na kultivační plotnu. Tampon je

třeba po odběru ihned zanořit do transportního média, např. AMIES s aktivním uhlím).

Odebraný materiál se přepravuje a uchovává při pokojové teplotě, ne v lednici. Materiál je

třeba po odběru zpracovat co nejrychleji, ideálně do 4 hodin, maximálně do 24 hodin.

Bordetelly jsou velmi citlivé na vyschnutí, při použití tamponu bez transportního média je

tedy třeba nejpozději do hodiny přímo vyočkovat bakterii na kultivační plotnu

(ZAVADILOVÁ, SZU, 2011).

- 23 -

2.7.2 Transport vzorků pro PCR

Materiál pro vyšetření metodou PCR je taktéž vhodné zpracovat co nejrychleji, případně

lze skladovat při -20°C. Přepravování odebraného vzorku je vhodné při teplotě 2 – 8 C°.

Narozdíl od přepravy vzorku pro kultivační diagnostiku, tampon může být po odběru

přepravován suchý (ZAVADILOVÁ, 2011).

2.7.3 Uchovávání vzorků pro sérologickou detekci

V ideálním případě je sérum zpracováno bezprostředně po získání. Pokud je zpracováno

během jednoho týdne, je nutné jej uchovávat v chladničce při 2 – 8 °C, při delším uchovávání

uložit při teplotě -18°C a nižší.

2.8 Přímá detekce patogenu

2.8.1 Mikroskopický průkaz

Pro svou malou citlivost a specifitu není využíván.

2.8.2 Kultivační průkaz

Kultivační průkaz je považován za „zlatý standard“ průkazu B. pertussis (AVDIČOVÁ,

KRIŠTÚFKOVÁ, 2009) Tento patogen potřebuje ke kultivaci striktně aerobní podmínky,

nicméně neroste na běžných kultivačních médiích (krevní agar, MacConkey agar), jelikož

běžné agary obsahují některé toxické součásti. Ke kultivaci tedy používáme půdy obohacené

aktivním uhlím, s přídavkem krve, albuminu nebo škrobu a nikotinamidu, jmenovitě

neselektivní půdy jako Bordet-Gengou agar, což je půda obsahující bramborový extrakt

s glycerinem a 25% beraní krve (výrobce Difco), dále Charcoal agar, Regan-Lowe charcoal

agar a selektivní půdy s přídavkem 40mg/l cephalexinu (Charcoal agar se suplementem).

Půda musí být v misce dostatečně vysoko vylitá, aby během dlouhé doby inkubace

nevysychala (výška 7 – 10 mm). B. pertussis roste v normální atmosféře při teplotě 35 – 36°C

- 24 -

po dobu 7 dní při pH půdy 7,4 ± 0,2. Každý den odečteme plotny. Ke kultivaci přistupujeme

nejlépe na konci inkubační doby, v průběhu katarálního, případně na začátku paroxysmálního

stadia, před začátkem antibiotické terapie (VOTAVA a kol., 2003).

B. pertussis roste 48 – 72 hodin, na agaru najdeme drobné, stříbrošedé, hladké, lesklé,

polokulovité, kličkou dobře roztíratelné kolonie, u kterých se na Bordet-Gengou agaru

objevuje slabá zóna hemolýzy (viz obr. 7). Na rozdíl od toho větší, šedostříbrné kolonie B.

parapertussis vyrůstají již po 24 hod, tvoří hnědý pigment a při delší inkubaci jsou vpadlé do

půdy. Na Bordet-Gengou agaru je výrazná zóna hemolýzy a černohnědý pigment. Tato

bakterie roste také na krevním agaru (VOTAVA a kol., 2003).

K největším výhodám kultivačního průkazu se řadí vysoká specifičnost (100%) a

sledování rezistence a genetických změn izolátů kolujících v populaci. Tato metoda má však i

své nevýhody, nízkou citlivost (12 - 60%), potřebu speciálních kultivačních médií a délku

kultivace (7 – 10 dní). (HUČKOVÁ, KOLLÁROVÁ, 2012)

Mezi nejčastější příčiny neúspěchu kultivace patří špatně provedený odběr, nedodržení

transportních podmínek, špatná volba kultivační půdy, použití kultivačního média jen

s cefalosporinem (je třeba použít oba dva druhy medií, jak s cefalosporinem, tak bez něj),

stará krev nebo nedostatečně vylitá plotna.

Vyšetřující laboratoře jsou povinny podle Vyhlášky č.473/2008 Sb. zasílat každý izolovaný

kmen B. pertussis a B. parapertussis do Národní referenční laboratoře pro pertusi a difterii

v SZÚ (VOTAVA a kol., 2009; ZAVADILOVÁ, SZÚ).

- 25 -

Obr. 7: Kultivace Bordetella pertussis

zdroj:[ http://www.microbiologyinpictures.com/bordetella%20pertussis.html]

2.8.3 Přímá imunofluorescence (DFA)

Tato metoda se používá pouze v rychlé diagnostice pertuse. Jelikož má nízkou citlivost,

v současné době je nahrazována PCR diagnostikou (MATTOO, CHERRY, 2005).

- 26 -

2.8.4 Polymerázová řetězová reakce (PCR)

2.8.4.1 Princip

PCR je zkratka pro anglický název „polymerase chain reaction“ (polymerázová řetězová

reakce), což je metoda sloužící k mnohonásobnému zmnožení (amplifikaci) specifického

úseku DNA in vitro.

Princip syntézy DNA touto metodou je velmi podobný replikaci DNA. Kopie úseku DNA

jsou syntetizovány prostřednictvím enzymu DNA-polymerázy podle templátu ve formě

jednořetězcové DNA na principu komplementarity bazí. Reakce je zahájena dvěma primery,

což jsou chemicky syntetizované krátké oligonukleotidy, které se připojují ke

komplementárním úsekům protilehlých řetězců DNA tím způsobem, že 3-OH-konce směřují

proti sobě. Primery vymezují úsek DNA, který bude amplifikován z templátů dvouřetězcové

DNA.

PCR je třífázová metoda zmnožení určitého úseku DNA, jejíž tři děje se cyklicky opakují.

Reakce začíná denaturací DNA, zahřátím na teplotu 94 – 98°C při které se rozpadnou

vodíkové můstky mezi vlákny dvouřetězcové DNA a jsou separovány řetězce. Tato reakce

trvá asi 20 – 45 sekund.

Po ní následuje hybridizace, označovaná anglickým termínem annealing (tzn. po rozpálení

prudce ochladit). Tato reakce probíhá při teplotě 50 – 65°C a trvá 30 – 90 sekund. Molekuly

jednořetězcové DNA se po ochlazení opět renaturují. Je nutné dodržet přesně stanovenou

teplotu, při příliš nízké teplotě by primery mohly nasedat i na ostatní sekvence, které nejsou

plně komplementární, a naopak při vyšší teplotě by nedošlo k dostatečné hybridizaci, což by

vedlo k nedostatečné produkci.

Třetím krokem je již vlastní polymerační reakce, která zahajuje prodlužování řetězců

pomocí DNA-polymerázy, jež syntetizuje komplementární řetězce DNA z volných

nukleotidů. Při této elongaci je nutné zajistit teplotu 65 – 75°C po dobu trvání 45 – 90 sekund.

V tomto kroku slouží jako nový templát oligonukleotidy, které dosedly na jednořetězcovou

DNA v předchozím kroku. Syntéza nového řetězce začíná od 3´- konce.

Cyklické opakování jednotlivých kroků (25 – 30 cyklů) umožňuje speciální přístroj –

termocykler, který umožňuje střídání teploty reakční směsi.

- 27 -

Výsledný produkt PCR je tedy amplifikovaný úsek DNA, který můžeme dále analyzovat

např. stanovením velikosti produktu gelovou elektroforézou, štěpením produktu restrikčními

enzymy a posouzením spektra vznikajících restrikčních fragmentů, hybridizací se značenou

sondou komplementární k části sekvence amplifikovaného úseku nebo stanovením sekvence

DNA (MULLER, HOPPE, KONIG, 1997).

Variantou PCR je polymerázová řetězová reakce sledovaná v reálném čase (real-time

PCR), která umožňuje přímou kvantifikaci PCR produktu. Provádí se prostřednictvím detekce

a kvantifikace fluorescenčního signálu ve speciálním přístrojovém zařízení, které umožňuje

cyklické střídání teplot, detekci fluorescence a monitorování postupu PCR v reálném čase bez

nutnosti detekovat PCR produkty elektroforeticky.

Výhodou této metody je zvláště možnost získat ohromné množství kopií z minimálního

množství DNA. Princip zmnožení DNA je znázorněn na obr. 8. Mimo to je to metoda velice

rychlá (do 8 hodin), vysoce citlivá (70 – 99 %) a specifická (86 – 100 %). I PCR má ale své

nevýhody, v průběhu metody se může objevit potenciálně mylná pozitivita nebo zkřížená

kontaminace DNA (HUČKOVÁ, KOLLÁROVÁ, 2009).

- 28 -

Obr. 8: Princip PCR

upraveno dle: https://www.neb.com/applications/dna-amplification-and-pcr/pcr

- 29 -

2.8.4.2 PCR diagnostika B. pertussis

PCR diagnostika je důležitá zejména pro diagnostiku B. pertussis a jiných patogenů, kteří

se obtížně kultivují. Pro tuto metodu se používá laryngeální výtěr nebo aspirát k

primovyšetření, případně izolovaná DNA ke konfirmaci nebo k vyšetření – detekci PtxA-pr,

které se zasílají do Národní referenční laboratoře. Metoda má vysokou specifitu, i když

mnohdy se nepodaří odlišit B. pertussis od ostatních druhů Bordetel.

Pro diagnostiku B.pertussis se nejčastěji využívá inzertní sekvence IS481, která se

v genomu B.pertussis vyskytuje v 80 – 100 kopiích. Tato sekvence však není specifická pouze

pro tento druh, nachází se rovněž u druhu B. holmesii a u některých kmenů B. bronchiseptica.

Jako druhá nejvhodnější oblast je používána sekvence promotoru S1 podjednotky pertusového

toxinu (PT promoter, PtxA-pr), která je však v porovnání s IS481 specifická pro druh B.

pertussis, avšak vyskytuje se pouze v 1 kopii, proto je detekována s nižší senzitivitou než

IS481. K detekci PtxA-pr přikročíme tedy teprve v případě negativity IS481. Stanovujeme jej

vždy u pacientů v kojeneckém věku, u starších pacientů pak selektivně podle klinických a

epidemiologických okolností (ZAVADILOVÁ, SZÚ). Lze použít i další specifické úseky jako

např. gen pro pertaktin, porin či adenylát cyklázu (NEČAS, 2006). Pro diagnostiku B.

parapertussis se využívá specifická inzerční sekvence IS1001 (ZAVADILOVÁ, SZÚ).

Interpretace výsledků je založena na pozitivitě nebo negativitě výsledků IS481, PtxA-pr,

případně IS1001. V případě, že je IS481 negativní, ve vyšetřovaném materiálu není průkaz

DNA B. pertussis. K dalším testům přistupujeme jen v závažných případech (kojenci, nebo

kontakt s neočkovanými dětmi). Až poté, pokud je negativní i PtxA-pr, lze průkazně prohlásit,

že ve vyšetřovaném materiálu není prokázána DNA B. pertussis. Pokud by PtxA-pr vyšlo

pozitivně, jednalo by se o dubiózní výsledek, při kterém je doporučeno zopakovat první test.

V případě pozitivity IS481, případně i PtxA-pr, je ve vyšetřovaném vzorku prokázána DNA B.

pertussis. V případě pozitivity IS1001 je infekce pravděpodobně způsobená B. parapertussis

(ZAVADILOVÁ, SZÚ).

- 30 -

2.9 Sérologie – nepřímá detekce patogenu

Sérologických metod je využíváno k pozdní, retrospektivní diagnóze, používají se

k průkazu specifických protilátek nebo antigenu. Pro sérologický průkaz infekční choroby

není obvykle významná absolutní koncentrace specifických protilátek, ale především

dynamika jejich změn.

Vyšetřují se dva vzorky sér – akutní a rekonvalescentní s odstupem 3 - 4 týdnů. Tento

interval je nejvhodnější, ukáže až čtyřnásobný vzestup nebo pokles protilátek. U těchto metod

nelze odlišit protilátky postinfekční od postvakcinačních, lze prokázat pouze signifikantní

vzestup nebo pokles množství protilátek nebo sérokonverzi (zvýšení hladiny specifických

protilátek) z negativity do pozitivity. Séra se stanovují vždy současně, stejnou metodou, v téže

laboratoři, tzv. párová séra. Aby nedošlo k záměně vzorků, je nutné mít vždy označené dva

vzorky séra s datem odběru, znát údaje o očkování pacienta a datum narození pacienta

(ZAVADILOVÁ, SZÚ, 2011; KHS Karlovy Vary, 2013; MULLER, 1997).

Základem všech sérologických metod je reakce protilátek s antigenem, u níž se využívá

specifické vazby příslušných antigenních determinant antigenu k vazebnému místu

odpovídající protilátky. Vlastní reakce není viditelná, probíhá na submikroskopické úrovni,

kdy se pomocí nekovalentních sil krátkého dosahu váže antigen s protilátkou. Pro B. pertussis

jsou specifické pouze protilátky proti pertusovému toxinu (HOŘEJŠÍ, BARTŮŇKOVÁ,

2008).

Na doporučení EU Pertstrain group z roku 2010 se k sérologické diagnostice B. pertussis

používají komerční ELISA soupravy ke stanovení IgG protilátek proti pertusovému toxinu,

IgA protilátky se stanovují pouze při nejasném výsledku prvního testu nebo není-li možné

odebrat druhý vzorek. Pro rutinní laboratorní diagnostiku naopak není doporučeno používat

komerční ELISA soupravy se směsnými antigeny, které jsou nízce specifické a je u nich

patrná zkřížená reaktivita s B. parapertussis, Haemophilus sp., Mycoplasma pneumoniae a

Escherichia coli.

- 31 -

2.9.1 Aglutinace

2.9.1.1 Charakteristika

Aglutinace patří mezi tradiční, osvědčené a levné vyšetření v diagnostice infekce

B.pertussis. Výhodou této metody je možnost použití jak k průkazu akutního onemocnění, tak

k průkazu přetrvávání protilátek po očkování celobuněčnou vakcínou proti pertusi. Nicméně

Doporučení EU Pertstrain group z roku 2010 nedoporučuje aglutinační testy k diagnostice

pertuse, označuje je za vhodné pouze pro sledování „promořenosti“ populace antigeny B.

pertussis (ŠTĚPÁNÍKOVÁ, 2012).

Principem aglutinace je stanovení koncentrace aglutininu (protilátek) proti korpuskulárním

antigenům (aglutinogenům), což vede ke vzniku viditelných shluků jemného vločkovitého

aglutinátu – aglutinaci. Na vzniku aglutinátu se mimo vzájemné navázání Fab fragmentů

specifických protilátek a jednotlivých částic antigenu podílí i neutralizace povrchového

náboje, který zajišťuje stálost roztoku v suspenzi. Testem je možné prokázat protilátky ze

všech imunoglobulinových tříd. Rychlost reakce je různá a záleží především na teplotě.

V aglutinaci jsou nejúčinnější protilátky izotopu IgM. K průběhu reakce je důležité použít

vhodný poměr protilátek a antigenu, přebytek protilátek může způsobit útlum aglutinace,

který se nazývá prozónou.

Aglutinační reakce dělíme na přímé (rychlé a pomalé), nepřímé (Coombsův

antiglobulinový test) a pasivní (hemaglutinace, latexová aglutinace). V případě přímé

aglutinace se shlukuje antigen s protilátkou. Podle rychlosti mohou být rychlé, prováděné

v laboratoři na sklíčku nebo pomalé, zkumavkové. Nepřímé metody slouží k průkazu

inkompletních protilátek, tzn. protilátek, které nejsou schopné samy vyvolat aglutinaci.

Prokazují se pomocí druhově specifického antiglobulinového séra, tj. sérum proti

imunoglobulinům druhu, v jehož séru prokazujeme inkompletní protilátky. Pasivní, neboli

latexová aglutinace, je reakce, při níž je nahrazována málo citlivá precipitace dobře

pozorovatelnou aglutinací. Používá se solubilní antigen, který pokryje povrch opracovaných

krvinek nebo latexových částic a následně reaguje se sérem proti tomuto antigenu (TOMAN,

2009; MULLER, 1997; NEČAS, 2006).

- 32 -

Obr. 10: Aglutinace na mikrotitrační destičce

upraveno dle: http://leccos.com/index.php/clanky/aglutinace

2.9.1.2 Diagnostika B.pertussis metodou aglutinace

V současné době jsou na trhu k dispozici aglutinogeny vyráběné pro B.pertussis i B.

parapertussis firmou TestLine s.r.o..

K provedení testu potřebujeme aglutinogen Bordetella pertussis, což je koncentrovaný

roztok inaktivovaných bakterií konzervovaný např. 0,01% methiolátem sodným. Další

potřebné vybavení zahrnuje pozitivní kontrolu B.pertussis, fyziologický roztok, mikrotitrační

destičky a termostat 37°C s vlhkou komůrkou na inkubaci destiček.

K sérologickému vyšetření se odebírají párové vzorky séra – akutní a rekonvalescentní.

Průkazným výsledkem, který svědčí o akutní infekci organismu, je minimálně čtyřnásobný

vzestup titru protilátek v párových vzorcích. Jestliže dojde k poklesu protilátek ve druhém

vzorku, jedná se o rekonvalescenci po proběhlém onemocnění. Jestliže nedojde k vzestupu,

jedná se o postvakcinační titr protilátek pacienta (ZAVADILOVÁ, 2011; TestLine, 2013).

- 33 -

2.9.2 ELISA

2.9.2.1 Charakteristika

ELISA test je zkratka pro anglický název „enzyme linked imunosorbent assay“ (enzymová

imunosorpční kvantitativní analýza). Řadí se mezi jednu z nejcitlivějších metod na bázi

imunoenzymatické reakce, která je používána jak k detekci protilátek, tak pro zjištění

přítomnosti antigenu. ELISA slouží ke stanovení IgA, IgM a IgG protilátek nejčastěji proti

pertusovému toxinu, filamentóznímu hemaglutininu, pertaktinu, popř. směsi antigenů.

Reakce je založena na specifické interakci protilátek s příslušným antigenem, přičemž na

jednu z těchto složek je navázán vhodný enzym. Tento kovalentně vázaný enzym působí na

v dalším kroku přidaný substrát a výsledkem je barevná reakce.

ELISA test existuje v řadě modifikací, nejčastěji používaná „sendvičková metoda“

k průkazu protilátek nebo antigenu a její modifikace, přímá a „double sandwich“ metoda.

„Sendvičová metoda“ pro průkaz specifických protilátek začíná navázáním známého

antigenu na plastovou mikrotitrační plotnu, v dalších krocích se postupně přidává testované

sérum, protilátka proti druhově specifickým imunoglobulinům konjugovaná s enzymem a

nakonec detekční systém, což je substrát reagující s enzymem, který pod vlivem enzymatické

reakce buď změní barvu, nebo odštěpuje produkty, které s další přidanou látkou,

chromogenem, vytváří barevnou reakci. Mezi jednotlivými kroky přidávání substancí je třeba

plotny promýt, čímž se zbaví přebytečných reagujících látek. V pozitivním případě, tedy

pokud jsou ve vyšetřovaném séru přítomny specifické protilátky, dojde k postupnému

navázání všech složek a jamka se zbarví podle charakteru použitého substrátu. Vyhodnocení

se provádí nejčastěji spektrofotometricky, přičemž se měří absorbance standardních a

vyšetřovaných vzorků. K vyhodnocení je možné sestrojit kalibrační křivku nebo určit tzv. titr,

což je poslední ředění vzorku, při němž jamka mikrotitrační destičky ještě vykazuje pozitivní

reakci. Vizuální vyhodnocení poskytne pouze kvalitativní porovnání s výsledky negativních

kontrol. Za pozitivní považujeme vzorky s tmavším zbarvením než negativní kontrola.

„Sendvičová metoda“ pro průkaz antigenu se liší pouze v pořadí navazovaných reagencií.

Na mikrotitrační plotnu se nejprve naváže známá protilátka specifická pro daný hledaný

antigen a pak se postupně přidává tekutina testovaná na přítomnost antigenu, detekční

protilátka specifická pro daný antigen konjugovaná s enzymem a nakonec detekční systém

obsahující substrát.

- 34 -

U této metody je nutné, aby hledaný antigen měl dvě vazebná místa, pro navázání

protilátky na mikroplotně a druhé, detekční protilátky (TOMAN, 2009; SCHNEIDERKA,

2004).

Obr. 11: Sendvičová ELISA pro průkaz antigenu

zdroj: [http://www.wikiskripta.eu/index.php/Soubor:Schema-ELISA.png]

Obr. 12: Sendvičová ELISA pro průkaz protilátky

zdroj: [http://www.wikiskripta.eu/index.php/Soubor:Schema-ELISA-capcure.png]

- 35 -

U přímé metody se hledaný antigen navazuje na mikroplotnu a na něj se přímo působí

protilátkou s již navázaným enzymem.

K vizualizaci reakce se používá celá řada systémů enzym, substrát, chromogen. Jedním

z nich je enzym křenová peroxidáza, která reaguje se substrátem peroxidem vodíku, který

rozloží na kyslík a vodu. Kyslík dále reaguje s jedním z chromogenů např.

tetramethylbenzidinem, diaminobenzidinem nebo 5aminosalycilovou kyselinou za vzniku

barevné reakce. Jiný systém využívá enzym alkalickou fosfatázu a substrát

paranitrofenylfosfát.

Metoda stanovuje výsledky protilátek IgA, IgM nebo IgG proti pertusovému toxinu. Jako

signifikantní se hodnotí vzestup koncentrace protilátek v séru o 100 % počáteční hodnoty

naměřené v prvním vzorku párových sér nebo pokles koncentrace protilátek o 50 % počáteční

hodnoty. Výsledná koncentrace protilátek je nejčastěji udávána v mezinárodních jednotkách

IU/ml. Při vyhodnocování testu je nezbytně nutné znát dobu očkování a typ použité vakcíny.

Pokud je použita celobuněčná vakcína, protilátky IgG proti pertusovému toxinu se nemusí

vždy vytvořit, je tedy nutno stanovovat je metodou pomalé aglutinace. Naopak při použití

acelulární vakcíny je nutný průkaz ELISA proti pertusovému toxinu. Nejdříve detekovatelné

jsou protilátky IgM, 5 – 10 dní po vzniku infekce. Nicméně v organismu přetrvávají pouze 6 –

12 týdnů, významnější je tedy průkaz protilátek ze třídy IgA a IgG, které s velkou

pravděpodobností svědčí o akutní infekci v období delším než 1 rok po očkování. IgA-PT je

možné prokázat již 11 dní od nástupu infekce, u vakcinovaných dospělých se tvoří i u

zdravých jedinců po přirozené reinfekci. Naopak u dětí ve věku 1 roku se IgA-PT netvoří.

V čase klesající IgG-PT se tvoří později, nejdříve 2 – 3 týdny od počátku infekce a jsou hlavní

složkou odpovědi proti infekci (KHS Karlovy Vary).

2.9.2.2 Diagnostika B.pertussis metodou ELISA

V současné době použití ELISA testů k detekci specifických protilátek je metodou první

volby pro diagnostiku Bordetella pertussis. V současné době je na trhu řada komerčních

souprav pro detekci protilátek proti pertusovému toxinu. Detekce protilátek IgG a IgM je

možná brzy po vakcinaci, přičemž protilátky IgG přetrvávají zpravidla několik let. Na rozdíl

od toho protilátky typu IgA jsou důležitým diagnostickým markerem v případě akutních

- 36 -

infekcí, jsou detekovatelné po vakcinaci, nicméně u kojenců mladších šesti měsíců na ně

neexistuje žádná odezva (SERION ELISA, manuál).

2.9.3 Imunoblot

Imunoblot, někdy nazývaný Western blot, je široce rozšířená analytická metoda užívaná

k detekci specifických proteinů v části tkáně nebo homogenního extraktu. V sérologii se

využívá jako konfirmační metoda pro stanovení ELISA testem. Touto metodou je možné

kvalitativně detekovat jednotlivé třídy imunoglobulinů IgG, IgA a IgM, avšak v diagnostice B.

pertussis není v současné době doporučován. B. pertussis nelze touto metodou kvantifikovat a

je možnost zkřížené reaktivity protilátek proti některým antigenům (ŠTĚPÁNÍKOVÁ, 2012).

- 37 -

3. CÍLE PRÁCE

1. Posouzení diagnostiky akutní infekce pertuse u dětí do půl roku věku metodou

PCR.

2. Porovnání diagnostiky pertuse sérologickým průkazem a metodou real-time

PCR.

3. Prohloubení všeobecné informovanosti o problematice černého kašle, hlavně

v oblasti diagnostiky.

- 38 -

4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

4.1. Materiál a metody

Pracovní postupy vycházejí z příslušných Standardních operačních postupů Oddělení

klinické mikrobiologie Fakultní nemocnice Brno.

4.1.1. Pacienti a odběr vzorků

V roce 2013 bylo v sérologické laboratoři Oddělení klinické mikrobiologie Fakultní

nemocnice Brno vyšetřeno 46 pacientů na přítomnost původce onemocnění pertuse metodou

PCR, kteří byli vybraní podle celosvětově platných kritérií WHO, tzn. jedinci s kašlem

perzistujícím déle než 14 dní.

Do souboru byli zahrnuti zástupci všech věkových kategorií, tzn. děti od 1 měsíce věku po

dospělé ve věku 78 let. Nejednalo se o zcela náhodnou skupinu celoplošného výběru, nýbrž o

pacienty Fakultní nemocnice Brno, tedy pacienty z jihomoravského kraje. Studie byla

zaměřena především na děti do půl roku věku.

Přímý průkaz metodou real-time PCR byl vyšetřen z následujících materiálů: stěr, výtěr,

brochoalveolární laváž nebo ze vzorků odsátého materiálu, slin a sputa.

U nepřímého stanovení původce metodami přímé aglutinace nebo ELISA bylo použito

sérum pacientů. (MAREŠOVÁ, 2008; KHS Karlovy Vary, 2013)

4.1.2. Přístroje

Rotor-Gene Q – výrobce Quiagen (viz obr. 13)

Smartcycler – výrobce Cepheid (viz obr. 14)

- 39 -

Obr. 13: Rotor Gene Q

zdroj: [http://www.centrodiagnosticopoccia.it/analisi-cliniche/]

Obr. 14: Smartcycler

zdroj: [http://www.gene-quantification.de/platform2.html]

- 40 -

suchá lázeň

laminární box

centrifuga

termostat

třepačka

fotometr

4.1.3. Pomůcky

automatické pipety (0,5 – 1000 μl)

sterilní špičky s filtrem pro mikropipety

PCR zkumavky / destičky

sterilní mikrozkumavky

chladící bloček

stojánek na nosič PCR zkumavek

rukavice na jedno použití, bez pudru

kontejner na biologický odpad

sterilní fyziologický roztok

sterilní odběrové tampony včetně transportního média

mikrotitrační destičky

běžné laboratorní sklo

- 41 -

4.1.4 Přímý průkaz

4.1.4.1 Real-time PCR pomocí komerční soupravy Pneumoplex Dynex

Real-time Multiplex assay od firmy Dynex (Česká republika) slouží nejen k detekci

Bordetella pertussis, ale také dalších patogenních bakterií zahrnujících Legionella

pneumophila, Legionella micdadei, Mycoplasma pneumoniae a Chlamydia pneumoniae.

Ke stanovení jsou doporučené vzorky získané bronchoalveolární laváží nebo výtěrem

z nosohltanu. Souprava je optimalizována jak pro přístroj RotorGene, tak pro Smart Cycler.

Souprava obsahuje pozitivní kontrolu, Mastermix 1, ve které jsou obsaženy cílové

sekvence všech detekovaných agens. Mastermix 2 zahrnuje interní kontrolu, jejíž signál je

sledován v oddělené zkumavce, aby nedocházelo ke snížení citlivosti reakce.

Reakce začíná napipetováním mastermixů do dvou sad SMART zkumavek, poté je

pipetována negativní kontrola, pufr nebo destilovaná voda a izolované vzorky. Nakonec je

dávkována pozitivní kontrola, plazmid, který obsahuje cílové sekvence DNA všech

detekovaných bakterií. Vzorky se centrifugují ve Smart centrifuze a umístí se do cykleru

k analýze. Pozitivní výsledek přítomnosti B. pertussis je sledován ve 4. optickém kanálu, Cy5.

Výsledek považujeme za validní v případě, že k danému vzorku existuje pozitivní signál

mastermixu interní kontroly a signál pozitivní kontroly je pozitivní ve všech detekčních

kanálech.

4.1.4.2 Real-time PCR pomocí komerční soupravy B.pertussis/parapertussis Bio-

Evolution

Tato komerční souprava od firmy Bio-Evolution (Francie) slouží ke stanovení přítomnosti

Bordetella pertussis, inzertní sekvence IS481 a Bordetella parapertussis, inzertní sekvence

IS1001 v biologických vzorcích pomocí přístroje Rotor-Gene Q.

Ke stanovení lze použít všechny druhy respiračních vzorků: sputum, bronchoalveolární

tekutinu, nasofaryngeální výplach i výtěr. Výtěry je třeba nejprve vytřepat do fosfátového

- 42 -

pufru (dále PBS), zahájit centrifugaci a pokud nelze vzorek bezprostředně poté zpracovat,

uchovávat při -20°C v temnu, chráněný před světlem.

Souprava real-time PCR kitu B. pertussis/parapertussis obsahuje Bordetella mix, pozitivní

kontrolu, tj. plazmidová DNA obou druhů Bordetel a PCR vodu. Všechny reagencie jsou

označeny barevnými uzávěry pro lepší orientaci. Pro předejití opakovanému rozmrazování a

zamrazování je doporučené po prvním otevření pozitivní kontroly rozdělit směs do

jednotlivých alikvotů po 10 μl, které uchováváme při -20°C.

Reakce začíná izolací DNA kitem QIAamp a následnou centrifugací. Následuje detekce

DNA. Do dvou zkumavek se stejně jako v předchozí metodě napipetují 2 Mastermixy,

pozitivní kontroly značené růžovým uzávěrem a nakonec negativní kontroly – PCR voda.

Vzorky musí být kompletně rozmraženy, promíchány a krátce stočeny. Po nadávkování do

PCR zkumavek je promícháme a centrifugujeme.

Detekce amplifikačního produktu B. pertussis je prováděna pomocí fluorimetru

užívajícího FAM kanál, Green channel a detekce B. parapertussis na VIC kanálu, Yellow

channel. Kit obsahu navíc vnitřní kontrolu, tzv. housekeeping gen vypovídající o úspěšné

izolaci lidské buněčné nukleové kyseliny, detekovatelnou v kanále Cy5, Red channel. Tato

vnitřní kontrola slouží jako pozitivní kontrola správného průběhu reakce. Pro pozitivní

vyhodnocení B. pertussis musí být signál detekovaný v kanále Green v rozmezí nižším než

38. Pozitivní výsledek přítomnosti Bordetella parapertussis detekujeme v kanále Yellow se

stejným Ct. Vzorek nelze jednoznačně hodnotit, pokud je v kanále Green nebo Yellow

detekován signál v rozmezí Ct 38 až 40. Při detekci jediného signálu v kanále Red, jehož Ct

je nižší než 32, vzorek hodnotíme jako negativní. Pokud není signál zjištěn v žádném

z kanálů, vzorek je inhibován (TOMAN, 2009)

- 43 -

4.1.5 Nepřímý průkaz

4.1.5.1 ELISA

4.1.5.1.1 Detekce specifických protilátek pomocí komerční soupravy SERION ELISA

classic

Testy SERION ELISA (Německo) classic Bordetella pertussis Toxin IgG a IgA jsou

kvalitativní a kvantitativní imunoanalýzy k detekci humánních protilátek proti toxinu

Bordetella pertussis v séru nebo plazmě. Pomocí této soupravy se tedy detekují protilátky

proti pertusovému toxinu ve třídě IgG nebo IgA. Eseje je možné použít v kombinaci s testy

SERION ELISA classic Bordetella pertussis IgA, IgG a IgM pro diferenciální diagnostiku

pneumonie.

Reakce k průkazu protilátek je založena na specifické interakci protilátek s příslušným

antigenem. Test SERION ELISA je založený na „sendvičové metodě“ průkazu specifických

protilátek. Jako detekční systém se používá enzym alkalická fosfatáza, bezbarvý substrát p-

nitrofenylfosfát, který je přeměněn na barevný produkt p-nitrofenol.

Mezi komponenty k vyšetření dodávané firmou patří oddělené proužky mikrotitračního

testu, standardní lidské sérum ve fosfátovém pufru s proteinem, negativní kontrolní sérum,

protilátkový konjugát proti humánním IgA, IgG nebo IgM, koncentrát promývacího roztoku

(roztok chloridu sodného), ředící fosfátový pufr, zastavovací roztok hydroxid sodný (slouží

k zastavení výsledné barevné reakce), substrát para-nitrofenylfosfát a osvědčení o kontrole

kvality se standardní křivkou a vyhodnocovací tabulkou (SERION ELISA manuál).

Výsledky průkazu pertusového toxinu ve třídě IgG metodou ELISA jsou uváděny

v IU/ml, z anglického International Unit, což je mezinárodní měrná jednotka pro množství

účinné látky založená na naměřeném biologickém účinku (ONDREJKOVÁ a spol., 2013).

Protilátky IgG proti toxinu Bordetella pertussis jsou hodnoceny jako pozitivní při hodnotě

vyšší než 100 IU/ml, hodnota 40-100 IU/ml je považována za hraniční a výsledek nižší než 40

IU/ml je negativní.

- 44 -

4.1.5.2 Aglutinace

Principem aglutinační reakce je reakce aglutinogenů (antigenů) a aglutininů (protilátek),

která vede ke vzniku obvykle pouhým okem detekovatelných shluků – aglutinaci. Testem

jsou prokazovány protilátky všech imunoglobulinových tříd (nelze samostatně prokázat jeden

typ imunoglobulinů, např. IgG). K průkazu infekce se používá vyšetření párových vzorků.

Test od firmy TestLine Clinical Diagnostics s.r.o. (Česká republika) obsahuje

koncentrované roztoky inaktivovaných bakterií dávivého kašle, určené k diagnostickým

účelům in vitro. Tyto aglutinogeny, Bordetella pertussis – AR – Ag a Bordetella

parapertussis – AR – Ag, slouží k průkazu specifických protilátek Bordetella pertussis a

Bordetella parapertussis v lidském séru. Jsou to 10x koncentrované roztoky konzervované

0,01% merthiolátem sodným.

Mezi další komponenty dodávané firmou patří pozitivní kontroly B. pertussis i B.

parapertussis a fyziologický roztok (0,9 % roztok NaCl).

Vlastní průběh reakce začíná přípravou pracovních roztoků, kdy jsou aglutinogeny

Bordetella pertussis – AR – Ag nebo Bordetella parapertussis – AR – Ag ředěny

fyziologickým roztokem v poměru 1:10 (1 díl aglutinogenu + 9 dílů fyziologického roztoku).

Pracovní roztok je třeba používat vždy čerstvě naředěný. Dále se rozmístí kontroly

aglutinogenů a vzorků dle pracovního schématu (viz obr. 15). Do všech jamek mikrotitrační

destičky je třeba pipetovat 50 µl fyziologického roztoku, dále do prvního sloupce, řada A,

pipetovat 50 µl pozitivní kontroly a v do dalších řad, B – G, pipetovat 50 µl vyšetřovaných

sér, čímž získáme ředění 1:2. V řadě H se provádí kontrola aglutinogenu. V dalším kroku se

8 kanálovou pipetou přenáší 50 µl takto naředěných sér ze sloupce 1 do sloupce 2, čímž je

získáno ředění 1:4. V tomto postupu se analogicky pokračuje až do ředění 1:4096 ve sloupci

12. Z jamek v posledním sloupci je odebráno 50 µl roztoku. Posléze se do všech jamek

destičky pipetuje 50 µl Bordetella pertussis – AR – Ag nebo Bordetella parapertussis – AR –

Ag v pracovním ředění a destička je protřepána v třepačce po dobu 15 vteřin. Vzorky se dále

inkubují po dobu 2,5 hodiny v termostatu ve vlhké komůrce při teplotě 37°C a potom při

laboratorní teplotě po dobu 18-20 hodin (TestLine, 2013).

- 45 -

Obr. 15: Pracovní schéma aglutinační reakce

Po ukončení inkubace je hodnocen vznik aglutinátu v jamkách. V případě pozitivní reakce

je přítomen zřetelný aglutinát ve vyčeřené tekutině až do dvoukřížkové reakce (tj. cca 50%).

Negativní reakce se vyznačuje přítomností terčíku na dně jamky (TestLine, 2013).

Výsledky aglutinační reakce jsou uváděny v titru (1:8, 1:16, 1:32,…). Titr je převrácená

hodnota nejvyššího ředění, které dává ještě pozitivní reakci (TOMAN, 2009), v sérologii bývá

užívaný k vyjádření stupně zředění vyšetřovaného krevního séra, v němž přítomné sérové

protilátky jsou schopné viditelně reagovat s příslušným antigenem za vzniku aglutinátu. Např.

titr 32 znamená, že ředění séra 1:32 bylo poslední, které dávalo ještě pozitivní reakci v testu.

Čím vyšší je titr, tím více je třeba zředit sérum a docílit příslušné reakce. Z toho vyplývá, že

čím je titr vyšší, tím větší množství protilátek je obsaženo v séru.

Průkazným výsledkem, který svědčí o akutní infekci, je minimálně čtyřnásobný vzestup

titru protilátek v párových vzorcích.

- 46 -

4.2 Výsledky

4.2.1 Rozdělení souboru

Do souboru bylo zahrnuto 46 pacientů Fakultní nemocnice Brno (22 mužů a 24 žen) – viz

graf 1. Vyšetření byla provedená v období od 1. 1. 2013 – 31. 12. 2013.

Graf 1: Rozdělení pacientů dle pohlaví

Pozitivní průkaz původce onemocnění metodou PCR byl detekován u 10 pacientů, z toho 4

muži a 6 žen (viz graf 2). U 36 pacientů byl výsledek vyšetření metodou PCR negativní.

Pacienti s pozitivitou průkazu PCR byli rozděleni do skupiny A, u které byl požadován

sérologický průkaz protilátek a skupiny B, která nebyla dále sérologicky diagnostikována.

- 47 -

Graf 2: Rozdělení pozitivních pacientů dle pohlaví

4.2.2. Porovnání vyšetřeného materiálu

Z celkového počtu 46 vyšetřených pacientů byla u 18 osob provedena diagnostika

metodou PCR – Dynex a u 28 jedinců průkaz metodou PCR – Bio – Evolution (viz graf 3).

Graf 3: Počty vyšetření jednotlivými komerčními soupravami

- 48 -

U obou z použitých komerčních souprav významně převažoval odběr materiálu na průkaz

Bordetalla pertussis stěrem, použit celkem u 37 osob. Z dalších odběrových technik 4 jedinci

podstoupili technicky složitější metodu odběru bronchoalveolární laváž, u 2 jedinců byl

materiál získán výtěrem ze zadní stěny nazofaryngu. Pouze u 1 pacienta byla diagnostika

provedena z odsátého materiálu, který se získává endotracheálními kanylami nebo

bronchoaspirárami (ROZSYPALOVÁ, 2002). U 1 bylo použito sputum, výměšek dýchacího

ústrojí, vykašlaná hmota, charakterizovaná jako zmnožený sekret dýchacích cest

(ONDREJKOVÁ, 2013). U posledního jedince byly k průkazu použity sliny.

Graf 4: Podíl jedinců dle odebraného materiálu

4.2.3. Skupina A

Skupina A je tvořena 6 pozitivními jedinci (4 muži a 2 ženy), ve věkovém rozmezí od 2

měsíců do 17 let (5 pacientů tvořili děti do půl roku věku).

- 49 -

Graf 5: Složení testované skupiny A dle pohlaví

Tab. 2: Složení testované skupiny A dle věku

věk

(měsíce) počet

2 2

4 1

6 2

204 1

celkem (n) 2-204 6

Pozitivita byla u těchto pacientů diagnostikována metodou real-time PCR, navíc byl

požadován ještě průkaz protilátek v krvi sérologickým vyšetřením.

Sérologické vyšetření Fakultní nemocnice Brno zahrnovalo aglutinační reakci a průkaz

protilátek proti pertusovému toxinu ve třídě imunoglobulinů IgG metodou ELISA.

Ve skupině PCR pozitivních jedinců byly prokazatelně zjištěny aglutinační protilátky u

jednoho ze sledovaných pacientů (titr 1:1024), u jednoho z pacientů byl prokázán titr 1:32, u

dalších 3 pacientů již byla hodnota nižší (titr 1:16) a u posledního jedince byl titr pouze 1:4.

Protilátky proti pertusovému toxinu byly prokázány u 1 z pacientů (17%) a u dalších 2 (33%)

byla hodnota hodnocena jako hraniční (viz Tab. 2).

- 50 -

Tab. 3: Porovnání výsledků PCR, aglutinace a vyšetření na protilátky proti pertusovému

toxinu

1 2 3 4 5 6

věk (měsíce) 2 6 2 4 6 204

PCR + + + + + +

aglutinace (titr) 1:32 1:16 1:16 1:4 1:16 1:1024

protilátky proti

pertusovému

toxinu (IU/ml) < 40 65 < 40 < 40 93 520

- hraniční - - hraniční +

4.2.4. Skupina B

Skupinu B tvoří 4 pozitivní jedinci (pouze 4 ženy), ve věkovém rozmezí od 1 měsíce do 60

let. Tito pacienti byli diagnostikováni pouze metodou real-time PCR, sérologický průkaz již

nebyl požadován.

Graf 6: Složení testované skupiny B dle pohlaví

- 51 -

Tab. 4: Složení testované skupiny B dle věku

věk

(měsíce) počet

1 1

180 1

384 1

720 1

celkem (n) 1-720 4

4.2.5. Negativní

Skupinu PCR negativních jedinců pro onemocnění černým kašlem tvoří 36 osob (18 mužů

a 18 žen) ve věku od 1 měsíce do 78 let. Metodou Dynex bylo vyšetřeno 17 jedinců, metodou

Bio-Evolution bylo vyšetřeno 19 pacientů.

Graf 7: Složení negativních jedinců dle věku

4.2.6. Porovnání souboru podle věku a pohlaví

Sloučením skupiny A a skupiny B dostaneme soubor všech pozitivních jedinců na průkaz

patogenu Bordetella pertussis metodou PCR. Nejvyšší četnost infekce byla diagnostikována u

dětí ve věkové kategorii 1-6 měsíců věku, tj. 60% vyšetřovaných pacientů. V celé skupině

pozitivních dětí do půl roku věku je stejný podíl chlapců (50%) i děvčat (50%).

- 52 -

5. ZÁVĚR

Incidence onemocnění pertusí nejen v dětské populaci stále vzrůstá a představuje

aktuální problém v pediatrii. V poslední době se dostává více do podvědomí lékařů, nicméně

problematika diagnostiky a interpretace laboratorních vyšetření stále zaostává a pertuse často

zůstává nediagnostikovaná a uniká pozornosti epidemiologů.

Mezi hlavní přednosti PCR bych zařadila relativně krátkou dobu trvání celého

procesu, což má obrovský význam především ve včasné diagnostice akutního onemocnění

pertusí, potřebu malého množství DNA a vysokou citlivost. Tato největší přednost může být

ale v některých případech považována za nevýhodu a to v případě, že je vzorek kontaminován

cizí molekulou, čímž se výsledek celé reakce stává falešně pozitivní.

PCR diagnostika B. pertussis má význam zejména u dětí do půl roku věku, u nichž se

ještě netvoří protilátky v krvi a sérologické vyšetření je nedostačující k diagnostice akutní

infekce.

Tento fakt dokazují výsledky vyšetření pacientů testované skupiny A (viz Tab. 2),

z nichž je zřejmé, že i přes negativní sérologický průkaz akutní infekce pertusového kašle,

PCR průkaz potvrdil přítomnost patogenní bakterie.

- 53 -

6. SEZNAM LITERATURY A POUŽITÝCH ZDROJŮ

AVDIČOVÁ, M., RÚVZ Banská Bystrica, KRIŠTÚFKOVÁ, Z., FVZ SZU Bratislava,

Je pertussis problémom dospelej populácie?, 23. - 25. 4. 2009, dostupné na:

http://www.vpl.sk/files/file/13kongresforum/2_Avdicova_pertussis_problem_dosp.popul_09.

pdf

BÉBROVÁ, JINDRÁK, KOLÁŘ, MAREŠOVÁ, URBÁŠKOVÁ, Doporučený postup pro

antibiotickou léčbu respiračních infekcí v primární péči, Praktický lékař, 2003, 83 (9): 502–

515, str. 502-515

BEDNÁŘ, M., Lékařská mikrobiologie, 2009, ISBN-13: 9781422215050, str. 257-259

BENEŠ, J., Infekční lékařství, první vydání, 2010, Praha, ISBN 9788072626441, str. 228-231

Bio-Evolution, Real time PCR kit, Bordetella pertussis/parapertussis, user manual, France,

2013

Česká pneumologická a ftizeologická společnost, Standardní postup pro provádění BAL a při

vyšetřování bronchoalveolární tekutiny (BAT), 2004, dostupné na:

http://www.pneumologie.cz/odborne/doc/BAL_Standard_Studia_po_recenzi_8_2004.pdf

ČESKÁ VAKCINOLOGICKÁ SPOLEČNOST ČLS JEP, Očkování v ČR, dostupné na:

http://www.vakcinace.eu/ockovani-v-cr

DYNEX, Příloha: Návod PneumoPlex L+M+Ch+BP, 12. 6. 2009, user manual

FABIÁNOVÁ, BENEŠ, ŠEBESTOVÁ, KYNČL, ČÁSTKOVÁ, ZAVADILOVÁ,

LŽIČAŘOVÁ, KŘÍŽ, Pertuse v ČR v roce 2012 – rozbor epidemiologické situace, 2013,

Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2013; 22(2): 55–61, dostupné na SZÚ:

http://www.szu.cz/tema/prevence/pertuse-v-cr-v-roce-2012-rozbor-epidemiologicke-situace

- 54 -

FABIÁNOVÁ, K., Informace z NRL a odborných pracovišť CEM, Zprávy centra

epidemiologie a mikrobiologie, SZÚ, Praha, 2013; 22(9)

FABIÁNOVÁ, K., KŘÍŽ, B., Pertuse a současné možnosti očkování, Vakcinologie, 2007,

Státní zdravotní ústav, Praha, 3. LF UK, str. 70-77

FABIÁNOVÁ, K., Epidemiologie pertuse, Odborná konference „Problematika pertuse“,

15. 4. 2011, Praha, Státní zdravotní ústav, ISBN 978-80-244-2733-1, dostupné na:

http://www.szu.cz/uploads/Pertuse_prezentace_konference_SZU_2011_KF.pdf

GALL, MYERS, PICHICHERO, Maternal immunization with tetanus, Am. J. Obstet.

Gynecol., 2011, Apr; 204(4): 334 e1-5. doi: 10.1016/j.ajog.2010.11.024. Epub 2011 Jan 26

GANONG, W. F., Přehled lékařské fyziologie, 2005, ISBN: 8072623117, str. 666, 682-683

HAVLÍK, J. et al., Infekční nemoci, 2. vydání, 2002, Praha, ISBN 8072621734, str. 55-56

HOLČÍKOVÁ, A., Pertuse a parapertuse v současné dětské populaci (Pertussis and

Parapertussis in Children), Česko-slovenská pediatrie, Praha: ČLS, 1998, vol. 53, No 9, p.

533-535, ISSN 0069-2328, str. 227-238

HOŘEJŠÍ, BARTŮŇKOVÁ. Základy imunologie, 4. vydání. Praha, 2009, ISBN 978-80-

7387-280-9

HUČKOVÁ, KOLLÁROVÁ, Čierny kašel´, Stúpajúca incidencia a možnosti laboratórnej

diagnostiky, Bratislava, 2012, dostupné na:

http://www.vpl.sk/files/file/XXXIII%20prezentacie%20pdf/sala%201/1%20stvrtok/Doobeda/

laborat%20HPL/Pertussis_Huckova.pdf

HUNT, M., Real time PCR, The Board of Trustees of University of South Carolina, July 1,

2010, dostupné na: http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/realtime-home.htm

- 55 -

CHLÍBEK, R., Pertussis and current status of vaccination, 2011, ISBN 978-80-87327-28-9,

dostupné na: http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-medicina/pertuse-a-soucasnost-

ockovani-462088

KRAJSKÁ HYGIENICKÁ STANICE HRADEC KRÁLOVÉ, Opatření ke zlepšení pertuse,

2008, ISBN 9788097002428, dostupné na: KHSHK:

http://www.khshk.cz/khsdata/epi/aktuality/opatreni_ke_zlepseni_pertuse.pdf

KRAJSKÁ HYGIENICKÁ STANICE SE SÍDLEM V KARLOVÝCH VARECH,

Dávivý kašel pertussis, 2013, dostupné na: http://www.khskv.cz/odborna_cinnost/epi/pertuse_

v_karlovarskem_%20kraji_vyskyt_dg_ockovani.pdf

KRAUS, Jiří a kol., Nový akademický slovník cizích slov, Praha, Academia, 2006, str. 745,

ISBN: 80-200-1415-2

KŘÍŽ, ČÁSTKOVÁ, ŠRÁMKOVÁ, ŠVANDOVÁ, Zprávy centra epidemiologie a

mikrobiologie, 2003, ISBN 978-80-7159-173-3; roč. 12, příloha 1: 16-18

MAREŠOVÁ, Pertuse, diagnostika a klinické projevy, Praha, 2008, dostupné na:

http://www.pmfhk.cz/WWW/HVD_2008/12_Mare%C5%A1ov%C3%A1.pdf

MATTOO, CHERRY, Molecular pathogenesis, epidemiology, and clinical manifestations of

respiratory infections due to Bordetella pertussis and other Bordetella subspecies, Clin.

Microbiol Rev. 2005 April; 18(2): 326-383

MIČUDA, FUKSA, BRČÁLKOVÁ, CERMANOVÁ, GERŠL, Molekulárně biologické

metodiky ve farmakologii, Ústav farmakologie, Univerzita Karlova v Praze, LF HK, 2006,

dostupné na: http://staryweb.lfhk.cuni.cz/farmakol/interakce/micuda/6.htm

MULLER, HOPPE, KONIG, Laboratory diagnosis of pertussis: State of the Art in 1997, J.

Clin. Microbiol. 1997; 2435-2443

- 56 -

NEČAS, E., ŠULC, K., VOKURKA M., Patologická fyziologie orgánových systémů. Část I.

1. vydání, 2006, ISBN 8072622102

Očkovací látky, Očkování proti záškrtu, tetanu, dávivému kašli a proti Haemophilus

influenzae typu b, dostupné na: www.vakciny.net

ONDREJKOVÁ, A., PAVLÍKOVÁ, B., HANZELKOVÁ, A., ŠPAČKOVÁ, I.,

BENEŠOVÁ, K., Laboratorní příručka, Laboratoř imunologie a sérologie, Laboratoře AGEL

a.s., Nový Jičín, BLP/LIS, 2013

PELC, Zdravotní stav obyvatelstva Československé republiky v jejím prvním desetiletí, 1929,

ISBN 80 7079-112-8

REGISTER, NICHOLSON, GUTHRIE, Evaluation of Specificity of BP3385 for Bordetella

pertussis detection, 2010 September; 48(9): 3334-3337

ROZSYPALOVÁ, M. a ŠAFRÁNKOVÁ, A., Ošetřovatelství I., II., 1. vydání, Praha, 2002,

str. 239, ISBN 80-86073-97-1

SERION ELISA classic Bordetella pertussis Toxin IgA/IgG, user manual

SCHNEIDERKA, P., et al. Kapitoly z klinické biochemie. 2. vydání. Praha, 2004, ISBN 80-

246-0678-X

ŠMARDA, Metody molekulární biologie, 1. vydání, Brno, Masarykova univerzita, 2005,

ISBN 80-210-3841-1

ŠTĚPÁNÍKOVÁ, O., B. pertussis, laboratorní diagnostika a očkování,

Imunologické oddělení laboratoří IFCOR-99, Brno, 27. 3. 2012, dostupné na: Dynex:

http://www.dynex.cz/files/akce-dynex/borelie2012/11_PertuseDynexbrezen-2012.pdf

TestLine Clinical Diagnostics, s.r.o., Bordetella pertussis-AR-Ag, Bordetella parapertussis-

AR-AG, verze 8, Brno 2013

- 57 -

Test-line Clinical Diagnostics, spol. s.r.o., Bordetella, Brno, dostupné na:

http://www.testlinecd.cz/file/1460/bordetella-let%C3%A1k.pdf

TOMAN, M. a kol., Veterinární imunologie, 2. vydání, 2009, ISBN 8024724642,

9788024724645. str. 359-361, 364

VOTAVA, M. a kol., Lékařská mikrobiologie obecná, 1. vydání, Brno, 2001, ISBN 80-

902896-2-2

VOTAVA, M. a kol., Lékařská mikrobiologie speciální, 1. vydání, Brno, 2003, ISBN 80-

902896-6-5, str. 39-42

ZAVADILOVÁ, FABIÁNOVÁ, MAIXNEROVÁ, Zprávy epidemiologie a mikrobiologie,

SZÚ, Praha, 2009; 18(1)

ZAVADILOVÁ, J., Informace o průkazu DNA B. pertussis a parapertussis v klinickém

materiálu metodou RT-PCR, SZÚ, dostupné na: SZÚ:

http://www.szu.cz/uploads/documents/CeM/NRLs/dift_pertuse/doporucene_postupy/Bordetel

la_RT_PCR.pdf

ZAVADILOVÁ, J., Pertuse, Laboratorní diagnostika, SZÚ, Konference „Problematika

pertuse“, Praha, 15. 4. 2011, dostupné na: SZÚ:

http://www.szu.cz/uploads/PERTUSE_LABORATORNI_DIAGNOSTIKA_030511.pdf