mass spectrometry - inti 24 mayo 2013

Espectrometría de masasEspectrometría de masas

Mayo 2013 - D’Amico Sistemas S.A.Diapositiva 1

Espectrometría de masasEspectrometría de masas

Agenda

� Breve Introducción a la espectrometría de Masas.

� Principios y fundamentos teóricos

� Ionización a Presión Atmosférica: Electrospray, Ionización Química, Fotoionización, APGC


Fotoionización, APGC

� Analizadores: Cuadrupolo vs Tiempo de vuelo

� Instrumentación disponible en el mercado

� Alcances de la técnica

� Aplicaciones de interés

Espectrometría de Masas (MS)

Es un método utilizado para Medición de pesos moleculares de sustancias en fase gaseosa, que permite su identificación o

estudio estructural

Espectrometría de masas


La espectrometría de masas trabaja con Iones en fase gaseosa

Antes de obtener el espectro correspondiente, la sustancia debe ser ionizada (de no encontrarse en ese estado)



Las moléculas pueden ser ionizadas por adición o eliminación de un electrón (e-)

M + e- � M +. + 2 e-

(M + e- � M - . ) ---- raramente usado

En ambos casos, el ion obtenido posee una masa igual a su peso molecular

Alternativamente, las moléculas pueden ser ionizadas por adición (o substracción) de un ion

[ M + X ] + or [ M + X ] –

I_____________________________I

Ion quasi molecular



La masa del ion difiere del peso molecular del fragmento que le dio origen

Los iones son acelerados en el vacío a través de un campo magnético y/o electrico para ser separados de acuerdo a su relación masa / carga (m/z), donde

m/z = m porque generalmente, z = 1

Los iones con la apropiada relación m/z pasan a través delanalizador para impactar en el detector, generando la señalcorrespondiente



La señal obtenida se denomina espectro de masas, y en el segrafica la intensidad relativa de los iones vs. m/z




Todos los picos restantes, se reportan

Pico Base (pico de mayor señal en el espectro,

corresponde al fragmento principal o mas estable)


Generalmente se observa la presencia de pequeños picos adyacentes a los demayor intensidad, debidos a la abundancia natural isotópica de los elementos(12C, 13C o 1H, 2H, etc.)

Todos los picos restantes, se reportan

en relación al pico base

M+ Ion molecular


100

%

124.0

121.0

96.3

100.0

142.0

135.0

147.1

400.0O

HO

H H

H O

NO

OH

142H2O-

124

+

+ H

+[M+H]

21-Hidroxi Deflazacort


60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440m/z0

100

%

0

100.0 135.0

171.0 225.0

397.1

337.1

309.1

291.1

237.1147.1

319.1

327.2

355.1

379.1

415.1

435.2

+ H

HF H2O- -415 397

+

O

HO

F H

H

OHO

O

O +[M+H]

21-Aceto Dexametasona

� Tres funciones básicas:

� transformación de una muestra a iones en fase gaseosa (fuente de ionización)



� separación de estos iones según su relación masa/carga (analizador)

� detección de los iones separados (detector)

� Instrumentos para aplicaciones orgánicas y bioquímicas



� Espectrómetros de masas para análisis de relaciones isotópicas

� sistemas para análisis de elementos traza

MS por si sola, puede no ser ideal para el análisis de mezclas

Espectrometría de masas, Limitaciones


El espectro de masas de una mezcla, es la resultante de la superposición de los espectros individuales de cada componente

Mobile phase carrying mixture of components

LC - MS


Identificación de compuestos previamente separados

Fuente de Ionización


Las moléculas, en estado gaseoso, son bombardeadas porelectrones energetizados para producir su ionización, estocausa disociaciones o fragmentaciones secundarias. Un excesoconstante de energía (70 eV) asegura reproducibilidad en lafragmentación

Impacto de electrones (EI)


fragmentación

M + e M +2e- + -.

F F F1 2 3

Impacto de Electrones

Introducción

Filamento

Ion

-Repeller


MIntroducciónde muestra

Colector Sistema de enfoquede iones

Ion

Al Analizador-

Espectro de Ionización por Impacto de Electrones y de Biblioteca


Consiste en hacer reaccionar las moléculas de interés con un

gas reactivo (previamente ionizado por EI y que halla reaccionado

con una molécula neutra del mismo)

Ionización Química (CI)


CH4 + e- -----> CH4+. + 2e-

Metano Metano radical cationico

CH4+. + CH4 -----> CH5

+ + CH3.

Ion reactivo

M + CH5+ -----> MH+ + CH4

Muestra Ion Quasi molecular

Electrospray: Es una tecnica de ionizacion a presion atmosferica que permite elingreso de la muestra desde el LC y su ionizacion en forma conjunta

� Utiliza un campo eléctrico para producir la nebulización de la muestra

Electrospray (ESI)


� La muestra ingresa a través de un capilar, en cuyo extremo se aplica unpotencial negativo o positivo

� Este alto potencial sumado al pequeño radio de curvatura del capilar genera unfuerte campo eléctrico que causa que el liquido emergente sea una mezcla depequeñas gotas y vapor (nebulización)

Contraelectrodo

CapilarCaudal

LC

Electrospray (ESI): Overview


Fuente de alto voltaje

Mayor abundancia de

iones negativos

Electrospray (ESI)

Mayor abundancia de

iones positivos


Caudal

LC

Capilar a alto voltaje

Cono de TaylorGotas cargadas

positivamente

� Las gotas producidas en la nebulización tienen carga superficial

� Al evaporarse el solvente estas gotas reducen su tamaño, incrementando la repulsión de cargas

Electrospray (ESI)


� Cuando la repulsión de cargas es mayor que la tensión superficial se produce una fisión generando gotas muy pequeñas cargadas eléctricamente.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ +

++

+

+

+

+

+Fisión

Coulombica

+

+

+

Evaporación

de solvente

�Mecanismo de desorción iónica

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

++

+

+

+

+

+

+

+++

+++

++++

+

+

++

Electrospray (ESI)


� Mecanismo de carga residual

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ ++++

+

+

+

++

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ +

NN C H3

O

CH 3

H

+ H+

Lidocaina

NN C H3

O

CH 3

H

+

H

Iones positivos - ESI

Electrospray (ESI): Formación de iones


CH 3 CH 3

C H 3

O

OH

C H 3

CH 3

C H 3

O

O

C H 3

CH 3

+ H+

Ibuprofen

Iones negativos - ESI

Muestra

Venteo

Gas de cono

ESIProbe

Presión atmosférica

Vacio moderado

Alto vacio

Electrospray (ESI): Fuente de ionización


Gas de nebulización

Gas de desolvatación

Bomba rotativa Bomba turbomolecularCono extractor

Cono de muestra

Válvula deaislamiento

Lentes RF(Hexápolo) Cuadrupolo

Fragmentos Multi-cargados

Electrospray tiene tendencia a producir iones multi-cargados, permitiendola determinación de pesos moleculares elevados que estarían fuera delrango de trabajo del sistema.

Electrospray (ESI)


Cuando se forman iones multi-cargados m/z ≠ m debido a que z ≠ 1

Para z > 1 resulta m/z < m, la masa aparente del ion es mucho menor quela verdadera

Hemoglobina

1001681.6

A +9A chain (+10, +9, +8)A chain + Heme (+10, +9, +8)B chain (+10, +9, +8)B chain + Heme (+10, +9, +8)


1475 1500 1525 1550 1575 1600 1625 1650 1675 1700 1725 1750 1775 1800 1825 1850 1875 1900 1925 1950 1975 2000 2025m/z0

%

1587.6

1513.6

1575.2

1515.8 1649.31589.9

1764.0

1750.1

1684.1

1891.7

1832.41766.4

1968.81984.3

A +10

B +10

B +9A +8

B +8

A +8heme

B +9heme

A +9heme

B +10heme

A +10heme

� Desventajas

� Fragmentación limitada

� Limitada a bajos caudales de

trabajo

� Ventajas

� Confirmación de pesos

moleculares

� Indicada para analitos iónicos,

muy polares y proticos

Electrospray (ESI)


� Si bien las interfaces (ZSpray)

permiten el trabajo con buffer no

volátiles, altas concentraciones de

modificadores iónicos reducen la

sensibilidad

muy polares y proticos

� Buena sensibilidad

� Moléculas de alto peso molecular

pueden ser determinadas a través

de la formación de fragmentos

multicargados

� Acoplable a cromatografía

liquida, cromatografía capilar y

electroforesis capilar

APcI – Overview

� El liquido es forzado a pasar por un capilar de diámetro pequeño a efectos de proporcionarle una gran velocidad lineal

� La calefacción de la sonda combinada con el gas de nebulización vaporiza el liquido

� Los vapores del solvente y del analito pasan a través de la zona de descarga eléctrica para producir los iones en fase gaseosa


Caudal

LC


APcI Calefactor

(400-650°C)

Vaporizacion

Aguja de descarga

Cono de muestra

Corona de descarga

Vapores de

solvente y analito

APcI – Ionizacion en fase gaseosa

H2O+

H3O+

H2O

N

Region de descarga(Plasma)

Cono de muestra

e-


H2O+

N2+

++

++

+

e- e-

N2+

N2+ H2O

+

H3O+

N2+

H2O

H2O

N2

N2

N2

Corona de descarga2-5 µA

(Plasma)e-

Iones positivos APcI:Mecanismos de formación

1. Protón, transferencia: H3O+ + M (M+H)+ + H2O

CH3OH2+ + M (M+H)+ + CH3OH

CH3CNH+ + M (M+H)+ + CH3CNNH4

+ + M (M+H)+ + NH3+

2. Formación de aductos: NH + + M (M+ NH )+

Más probable


2. Formación de aductos: NH4+ + M (M+ NH4)

+

CH3CNH+ + M (M+ CH3CNH)+

CH3OH2+ + M (M+ CH3OH2)

+

H3O+ + M (M+ H3O)+

3. Intercambio de cargas: N2+. + M M+. + N2

H2O+. + M M+. + H2O

Menos probable

1. Protón, extracción: HO- + M (M-H)- + H2OCH3O

- + M (M-H)- + CH3OHCH2CN- + M (M-H)- + CH3CN

2. Formación de aductos: Cl- + M (M+ Cl)-

Iones negativos APcI:Mecanismos de formación

Más probable


2. Formación de aductos: Cl- + M (M+ Cl)-

CH3COO- + M (M+ CH3COO)-

3. Intercambio de cargas: O2-. + M M-. + O2

4. Captura de electrones: e- + M M-.

Menos probable

Muestra

Venteo

Gas de cono

APCI

Probe

APcI calefactorCorona de descarga Presión atmosférica

Vacio moderado

Alto vacio

APcI: Fuente de ionización




Gas de cono

Bomba rotativa Bomba TurbomolecularCono extractor

Cono de muestra

Válvula de

aislamiento

RF Lentes

(Hexápolo) Cuadrupolo

� Desventajas

� Fragmentación limitada

� Valores de ruido químico muy

intensos para bajos valores de

� Ventajas

� Confirmación de pesos

moleculares

� Indicada para analitos neutros

Ionización Química a Presión atmosférica (APcI)


masas

� No es adecuada para moléculas

muy poco volátiles

y polares

� Buena sensibilidad

� Robustez, la posición del

capilar y el pin corona no es

critica

� Permite trabajar con caudales

de hasta 2 mL/min.

Fotoionización (APPI)

� APPI utiliza la misma punta de ionizacion que APcI con el agregado de una fuente de luz UV en lugar de la corona de descarga

� Al igual que en APcI:

� El liquido es forzado a pasar a traves de un capilar para obtener una alta velocidad lineal

� La calefaccion y el gas de nebulizacion vaporizan el caudal del liquido

� La ionizacion se produce en forma directa o quimica en la region de la luz UV


Caudal LCCalefactor

Vaporización

Fuente UV

Cono de muestra

Vapores de

Solvente y analito

Electrodo

Repeller

hν

� La ionizacion se produce en forma directa o quimica en la region de la luz UV


Direct APPI

M + hv → M+

M + S → MH + S[-H]

El analito M es ionizado a su ion

molecular M+. (Esto ocurre si el

potencial de ionización del analito esta

por debajo de la energía del fotón)


M+ + S → MH+ + S[-H]

Dopant APPI

D + hv → D+

D+ + M → MH+ + D[-H]D+ + M → M+ + D

En presencia de solventes proteicos

M+ puede extraer un átomo de

hidrogeno para formar MH+.

Un dopante fotoionizable es agregado

en alta concentración para generar

iones D+

D+ provoca la ionización de M por

transferencia de un protón o electrón

PhotoMateTM

Kripton 10.0 eV, 10.6 eV

Potenciales de Ionización (IP)

Antraceno 7.4 eV

IP Dopantes (solventes)

Tolueno 8.82 eV



Antraceno 7.4 eV

Fluorantreno 7.8 eV

Cafeina 8.0 eV

4-Nitrotolueno 9.5 eV

Tolueno 8.82 eV

Acetona 9.70 eV

Metanol 10.85 eV

Acetonitrilo 12.19 eV

Agua 12.61 eV

10. eV

Muestra

Venteo

Gas de cono

APCI

Probe

Calefactor Luz UVRepeller

Electrodo

APPI: Fuente de ionización




Gas de cono

Bomba rotativa Bomba TurbomolecularCono extractor

Cono de muestra

Valvula de

aislamiento

RF Lentes

(Hexápolo) Cuadrupolo

Modo de Ionización vs Polaridad

ESI


APcI

APPI

API: Interface ZSpray


Z-Spray


API Interface


Puntas de Ionización


Fragmentación: Información Estructural

Los iones pueden ser inducidos a fragmentarse, incrementando elpotencial eléctrico (voltaje de cono).

CID: Interface ZSpray


La aceleración de estos iones ocasiona que colisionen con mayorfuerza con las moléculas neutras, causando una mayorfragmentación. (Collision induced decomposition CID)

El estudio de estos fragmento permite el estudio desde el punto devista estructural, posibilitando la confirmación de la presencia de unasustancia

Extraction ConeExtraction Cone

8,000

10,000

12,000

NH

N

N

CH 3

CH3

NH 2 S

O

O

Sulfamethazine

[M+H]+

4,000

6,000

8,000

10,000

12,000Parent Ion Region

MW 278Positive ion mode, ESI, 2 ul/min, 50%MeOH:49%H2O:1% HOAc



100 150 200 250 3000

2,000

4,000

6,000

8,000

m/z

Inte

nsit

y

Sample ConeSample Cone

30V30V

HexapoleHexapole

ionion--bridgebridge

277 278 279 280 281 282

2,000

4,000

m/z

H2O:1% HOAc

ExtractionExtraction ConeCone

NH

N

N

CH 3

CH3

NH 2 S

O

O

Sulfamethazine

10,000 8,000

10,000

Fragment Ion Region

MW 186C6H8N3O2S

92156

186



Collision induced Collision induced molecular ion molecular ion dissociation priordissociation priorto mass analysisto mass analysis

Sample ConeSample Cone

70V70V

100 150 200 250 3000

2,000

4,000

6,000

8,000

m/z

Inte

nsit

y

HexapoleHexapole

ionion--bridgebridge

[M+H]+

183 184 185 186 187 188

2,000

4,000

6,000

m/z

LC/MS y CIDGeneración de fragmentos y librerías

[MH][MH][MH][MH]++++ Ion molecularIon molecularIon molecularIon molecular

+15 Volts

+30 Volts

[M[M[M[M----H]H]H]H]----

-15 Volts

-30 VoltsMW: 355 CAS# 86-42-0 C20H22ClN3O (toxm l180804) Am odiaquine [ESI+ @ 15V]

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 3800

50

100

179199

356

NCl

HN

OH

N


FFFF++++

Fragmentación totalFragmentación totalFragmentación totalFragmentación total

+45 Volts

+60 Volts

+75 Volts

+90 Volts

Información

estructural

FFFF----

-45 Volts

-60 Volts

-75 Volts

-90 Volts

MW: 355 CAS# 86-42-0 C20H22ClN3O (toxm l180804) Am odiaquine [ESI+ @ 90V]

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 3800

50

100

118

128

136

163

177 205

219

228

240

255

268

283

356

NCl

HN

OH

N

100

0

100

%

0

100

%

236

207180

179158

181190196

208 235 237282

282

236

208176235 237

254283

282

ESI+@90V

ESI+@70V

ESI+@50V

NITRAZEPAMNITRAZEPAMNITRAZEPAMNITRAZEPAM

CCCC15151515HHHH11111111

NNNN3333OOOO3333

MW 281.27 (Nominal 281)MW 281.27 (Nominal 281)MW 281.27 (Nominal 281)MW 281.27 (Nominal 281)

CAS# 146CAS# 146CAS# 146CAS# 146----22222222----5555

NH

O

LC/MS y CIDGeneración de fragmentos y librerías


160 180 200 220 240 260 280 300m/z0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

% 283

252222

194

166 195 206 223 280253281

252

222

253280

280

252 281

ESI-@90V

ESI-@70V

ESI-@50VAlgunas moléculas presentan una adecuada respuesta en

ESI para iones positivos y negativos facilitando su

inequívoca identificación

NN+

O-

O

Waters APGC/MS Interface


� APGC

— Atmospheric pressure GC interface

� Mayor rango de compuestos

— LC & GC en un solo instrumento



— LC & GC en un solo instrumento

— Rápido intercambio de la fuente de

ionización

— Espectro APCI

— APGC no es un reemplazo de los

modos tradicionales de ionización

EI o CI en GC/MS

� Transferencia de carga

� N2+ y N4+ se forma en la region del plasma

– N2++M > M+. + N2

– N4++M > M+. + 2N2

� Protonación

� En presencia de trazas de agua.

SOURCE ENCLOSURE

Ion Chamber Corona Discharge

Transfer Line Tip

Cone Column

Modifier Reference



� En presencia de trazas de agua.

�H3O+

– H3O+ + M > MH+ + H20

� modificadores (H2O o MeOH) pueden ser añadidos a efectos de favorecer la protonación

� Ionización mas “blanda” que EI, siendo el ion molecular generalmente predominante y

la fragmentación reducida significativamente.

� La fragmentación para análisis estructural se obtiene a través de CID o MSMS.

Biblioteca NIST

(mainlib ) Benzene, 1,4-dinitro-

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 1800

50

100

12 16

28

30

32

38

43 46

50

53

64

75

79 82 86

92

106

122

138152

168

O

N

O

N

OO

Ionización APGC: Protonación

1,4 Dinitrobenzene


Espectro

Obtenido M+

Teorico M+.

13:28:17

m/z50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

%

0

100

%

0

100

APGC160408RUN007_8270 1358 (6.105) Cm (1356:1362-1300:1353) TOF MS AP+ 464169.0248

122.025275.0228

64.0296 76.028694.0407123.0290

152.0225170.0253

APGC160408RUN007_8270 (0.021) Is (1.00,0.10) C6H4N2O4 TOF MS AP+ 9.20e12168.0171

169.0199

1,4-Dinitrobenzene

(mainlib ) Phenol, 2,6-dimethyl-

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 1300

50

100

15 1826

27

29 31

38

39

40

41

42

43

45 47 49

50

51

53

55 60 62

63

64

65

6668 74 76

77

78

79

8082 86 89

91

93

95 98

103

107

122

OH

2,4-Dimetilfenol

Ionización APGC: Transferencia de cargas

Biblioteca NIST


13:28:17

m/z55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130

%

0

100

%

0

100

APGC160408RUN007_8270 998 (4.491) Cm (995:1001-(965:986+1007:1053)) TOF MS AP+ 2.98e3122.0723

107.0498

121.0658 123.0782

APGC160408RUN007_8270 (0.021) Is (1.00,0.10) C8H10O TOF MS AP+ 9.12e12122.0732

123.0766

2,4-Dimethylphenol

Espectro

Obtenido M+

Teorico M+.

�Mayor de 4 ordenes

�Ejemplo para benzo(g,h,i)perileno 2 pg to 10000 pg

Compound name: Benzo(g,h,i)perylene

Correlation coefficient: r = 0.998814, r^2 = 0.997629

Calibration curve: 0.104709 * x + 0.228912

Response type: External Std, Area

Curve type: Linear, Origin: Include, Weighting: Null, Axis trans: None

0.0

5.0

Compound name: Benzo(g,h,i)perylene

Correlation coefficient: r = 0.992916, r 2̂ = 0.985883

Calibration curve: 0.167382 * x + -82.0944

Response type: External Std, Area

Curve type: Linear, Origin: Include, Weighting: Null, Axis trans: None

0.0

5.0

Waters APGC/MS Interface: Performance


pg0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Re

sp

on

se

0

20

40

60

80

100

pg

Re

sid

ua

l

-20.0

-15.0

-10.0

-5.0

pg0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000

Re

sp

on

se

0

250

500

750

1000

1250

1500

pg

Re

sid

ua

l

-25.0

-20.0

-15.0

-10.0

-5.0

�Los compuestos indicados exhiben LOD en el rango de fg a pg

�PAH’s

�Anilina y compuestos relacionados

�Halo aromáticos

�Halo carbonados

Waters APGC/MS InterfaceTipo de Compuestos


�Halo carbonados

�Ftalatos

�Nitroso-benzenos y productos relacionados

�Fenoles y clorofenoles

�Eteres fenilicos

�Dibenzofuranos

� Isophorone

�Azobenzenos

Luego que los iones son producidos, son separados de acuerdo asu relación masa / carga (m/z) por un analizador

Analizador


Tipos de Analizadores:

- Magneticos

- Electrostaticos

Analizador


- Tiempo de Vuelo (ToF)

- Cuadrupolos (Q)

- Trampa Iónica (IT)

Principales características

- Rango de trabajo: Rango de m/z que pueden separarse

Analizador


- Transmisión: relación entre el numero de iones producidospor la fuente de ionización y los que llegan al detector

- Resolución: capacidad para separar la señal de dos ionescon pequeñas diferencias de masa.

Un cuadrupolo consiste de dos pares de barras de molibdeno exactamenteparalelas entres si, controladas por la combinación de potenciales deradio frecuencia (rf) y corriente continua (dc).

Cuadrupolo

Solo un ion de una masa especificapuede pasar a través del cuadrupolo


puede pasar a través del cuadrupolocuando se aplica un campo oscilatoriode rf y dc, llegando al detector(generalmente un multiplicador deelectrones o un foto multiplicador).El tiempo de vida de un ion desde suformación hasta su detección es de 50 a100 microsegundos.

Cuadrupolo


El principio es muy similar al

cuadrupolo

Trampa de Iones


Los iones son atrapados por

campos RF & DC

Barrido de un campo puede

eyectar iones de un m/z

específico

Por aplicación de una rampa delvoltaje de RF, o por la aplicación deun voltaje suplementario sobre loselectrodos, o por combinación deambos, es posible:

� Desestabilizar los iones yeyectarlos en forma progresiva dela trampa

Trampa de Iones


� Retener solo un ion con undeterminado valor m/z en la trampay luego eyectarlo para observarloespecíficamente

� Retener solo un ion con undeterminado valor m/z en la trampa,fragmentarlo por vibracionesinducidas y observar susfragmentos (MS/MS “in time”)

� Repetir esta ultima operación variasveces en forma progresiva. Esto sedenomina MS/MSn

ToF: Resolución

RESOLUTION: 500

m/z 130

Standard internoMuestra


RESOLUTION: 5000

m/z 130.083

Masas exactas: Introducción


� Todos los elementos encontrados en la naturaleza tienen una única masa.

� Los elementos se combinan entre si para producir compuestos con distintas masas y propiedades fisicoquímicas.

� Estos compuestos pueden se detectados a través de la espectrometría de masas y sus masas medidas

� Si la masa de un compuesto puede ser medida con suficiente exactitud, una única composición elemental puede ser deducida.

�Carbono Tiene una masa igual a 12

�Hidrogeno Tiene una masa igual a 1

�Oxigeno Tiene una masa igual a 16



�Oxigeno Tiene una masa igual a 16

�Nitrógeno Tiene una masa igual a 14

� Estas son masas nominales, que no son exactas

�Carbono Tiene una masa de 12.0000

�Hidrogeno Tiene una masa de 1.0078

�Oxigeno Tiene una masa de 15.9949

�Nitrógeno Tiene una masa de 14.0031



� Es posible la existencia de diferentes combinaciones de átomos con igual masa nominal y diferente masa exacta

�Nitrógeno Tiene una masa de 14.0031

�CO = 27.9949

�N2 = 28.0061

�C2H4 = 28.0313



�Todas las moléculas tienen igual masa nominal y diferentes masas exactas

�Por medición de masas nominales no es posible distinguirlas

�Si un compuesto difiere en su composición elemental en algunas deestas moléculas, para su determinación estructural es necesariorecurrir a la medición de masas exactas.

� En los instrumentos la exactitud de masas que poseen, es medidacomo la diferencia (error) entre el valor determinado y la masaverdadera calculada

� La exactitud es medida en

� milliDaltons (1mDa = 0.001 unidades de masa)

� ppm = partes por millon = ∆m/m x 106

Masas exactas: ppm


� ppm = partes por millon = ∆m/m x 106

Masa verdadera = 400.0000

Masa medida = 400.0020

Diferencia = 0.0020 ( 2 mDa)

0.0020.002

400400x 106x 106ppm error =ppm error = = 5 ppm= 5 ppm

= 500

Ancho de pico 50% = 0.05Da

Resolución (FWHM) = 500 = 10000

Masa 100%

50%

Masas exactas: Resolución espectral


Resolución (FWHM) = 500 = 10000

0.05

FWHM = Full Width Half Maximum

500.0 500.1499.9

50%

0.05 Da

m/z

%

20

40

60

80

100 319.8965 319.9329

Resolution = 10,000

Resolución - Cuadrupolo y ToF


319.8 319.9 320.0 320.1 Mass

0

319.8 319.9 320.0 320.1 Mass

%

0

20

40

60

80

100 Resolution = 1,000

Iones

P

u

s

h

eV1

V2

Tiempo de vuelo (ToF)


e

r

MCP

Espejo “W”

V1

V1 > V2

LockSpray Integrado


Una vez que los iones de interés son separados, estos deben ser convertidosen una señal fácilmente interpretable por el sistema de adquisición dedatos. Esta función la cumplen los detectores

Tipos de detectores:

- Multiplicador de electrones (Dynodos)

Detectores


- Multiplicador de electrones (Dynodos)

- Multicanales

- Fotomultiplicadores

Fotomultiplicador Dynolite

�Los iones provenientes del analizador son convertidos en electrones (conversion dynode)

�Estos electrones colisionan con una placa de fósforo que al ser excitada emite fotones

�Los fotones colisionan con un foto cátodo, ubicado en el frente del fotomultiplicador,donde se liberan electrones y se amplifica la señal producida.

�El fotomultiplicador se encuentra encerrado en un ambiente de vacío a efectos deprevenir posibles contaminaciones e incrementar su tiempo de vida.


El software es el corazón del sistema

• Adquisición de datos

• Procesamiento

• Identificación de espectros

• Control absoluto del sistema

Adquisición y procesamiento de datos


Opciones orientadas a diferentes aplicaciones:

QuanLynx (Cuantificación)

ProteinLynx (Identificación y secuenciación de Proteínas

MetaboLynx (Identificación de metabolitos)

NeoLynx (screenig de neonatos)

TargetLynx (Cuantificación, confirmación y limites permitidos)

Cono demuestra

Enfoquede iones Prefiltro Posfiltro

ConversionDynode

API, Simple cuadrupolo MS


Cono deExtracción

Fuente de ionesZ-Spray

Cuadrupolo

DETECTOR

Fósforo

Fotomultiplicador

ACQUITY UPLC + SQD 2


LC-ToF MS


LC-MS: Aplicaciones


Análisis de CarbamatosMonitoreo de residuos en aguas y suelos

Carbamatos: EPA M531.1


Carbamatos, derivatización


Derivatización postcolumna

Bomba

Columna

DetectorCamara mezcladora


Inyector

Bomba reactivo

Reactor

Carbamatos


LC – MS Condiciones


Cromatogramas, TIC y PDA


Methomyl, linealidad


Methomyl en diferentes matrices


m/z 233


Carbamatos, resumen



LCLC--MS/MS MS/MS Sistemas Sistemas TandemTandem

� Mayor Selectividad

� Reduce o elimina las interferencias debidas

a la matriz de trabajo

� Mayor Sensibilidad

LC-MS/MS vs LC-MS

� MS/MS Modos de trabajo

� Full Scan (Barrido)

� Single Ion Recording (SIR)

� Product Ion Scan


� Determinaciones a nivel de trazas, permite

alcanzar menores limites de detección y

confirmación

� Exactitud en análisis cuantitativos

� Reproducibilidad, estabilidad y rango

dinámico

� Cuantificación precisa a muy bajos niveles

de detección sobre matrices complejas

� Robustez

� Reducción del Clean Up de muestras, aun

en matrices complejas

� Precursor Scan

� Constant Neutral Loss

� Multiple Reaction Monitoring (MRM)

API, Cuadrupolo Tandem MS/MS


XEVO TQ-S: Cuadrupolo tandem


API, Cuadrupolo – Tiempo de vuelo QToF


XEVO G2-S QToF


Cuadrupolo Tandem: Usos

Impurezas, sustancias de degradación

Targets

Confirmación- Compara los tiempos de retención con el Standard

- Relación entre iones específicos SIR/MRM vs Standard

- Cuantificación - trazas


Impurezas, sustancias de degradación Compara los tiempos de Retención con el Standard

- Screening de rutina

- Espectros MS de sustancias conocidas

(Biblioteca)

Confirmación de

estructuras

Sustanciasdesconocidas

Interpretación- Peso Molecular

- Composición elemental

- Elucidación de estructuras

- Secuenciación

QQCuadrupolo Tandem

Rutina:Cuantificación


TOFTiempo de vuelo

Q TOF

Rutina:Screening dirigidos

Análisis de investigación

Cuadrupolo Tandem: Full Scan Mode

Q1 Modo RF Q2 Scan

Celda de colisión(sin gas)


� El sistema esta operando como un sistema LC-MS de simple cuadrupolo

� Realiza un barrido dentro de un rango especificado m/z

306

250 300 350 400

321

380

200 500

306

250 300 350 400

321

380

200 500

Q2 Scan 200 - 500

Cuadrupolo Tandem: Single Ion Recording (SIR)

Celda de colisión(sin gas)

Q1 Modo RF Q2 Estático


� El sistema esta operando como un sistema LC-MS de simple cuadrupolo

� Se monitorean iones de relación m/z seleccionada

306

250 300 350 400

321

380 Q2 selecciona 306 m/z

306

Cuadrupolo Tandem:Multiple Reaction Monitoring (MRM)

Q1 Estático Q2 Estático

Celda de Colisión(Ar gas)

Fragmentación


� El sistema esta trabajando en modo selectivo, permite que solamente un ion determinado llegue a la celda de colisión para su fragmentación y un fragmento especifico sea detectado.

� Esto modo de trabajo se utiliza principalmente con fines cuantitativos

� Múltiples MRM pueden ser usados, también, como confirmatorios de la presencia de una sustancia.

306

250 300 350 400

321


150 300

158

306

158

158

Q2 selecciona 158 m/z

Fragmentación

Multiple Reaction Monitoring: Selectividad

� MS/MS reduce o elimina las interferencias de matriz

MRM


SIR

Celda de colisión: Cambios de energía

100

%

0

100

%

275

275

230

Energía de colisión = 5 eV

(M + H)+


150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290m/z0

100

%

0

100

%

0

% 230

230

275

230




100

0

100

%

230

Energía celda de colisión = 17 eV

(M + H)+

Celda de colisión: Cambios de energía


150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290m/z0

100

%

0

100

% 167230

201180 202

167

201180 194 230



Product Ion Spectrum: Pirimiphos-methyl

Transición de confirmación

Transición de cuantificación

305 → 290


confirmación305 → 180

TargetLynx: Relación de iones

Peak Area

Ratio 0.616

272 → 237

Transición de

cuantificación

Criterios de confirmación

• Dependiendo de la abundanciarelativa de dos transiciones

(Heptachlor)


Ratio 0.616

274 → 239

Transición de

confirmación

� > 0.5 ± 10%

� > 0.2 < 0.5 ± 15%

� > 0.1 < 0.2 ± 20%

• Esta relación es usada para confirmar o rechazar resultados positivos

Relación : 0.554 – 0.678 (0.616 ±±±±10%)

Ciclos de tiempo en MRM

� El tiempo de una transición MRM esta compuesto por dos parámetros principales:

1. Dwell time: Tiempo durante el cual una transición es monitoreada

2. Inter-channel delay: periodo que transcurre entre el monitoreo de transiciones MRMsucesivas, su función es permitir eliminar todos los iones de la celda de colisión

� Después del inter-channel delay, la celda debe ser llenada rápidamente con los iones de lasiguiente transición.

� Si esto no ocurre con la suficiente rapidez (por ejemplo cuando el dwell time es demasiadocorto) la señal puede disminuir en intensidad


corto) la señal puede disminuir en intensidad

100 ms Dwell Time, 10 ms Delay

%

0.63

%

0.63 Peak Width = 1.8 s

Points Across Peak = 7

Convert the x axis to scan number



Peak Width 1.8 s

0 100 105 110 115 120 125 130Scan0

Time0.25 0.75 1.25 1.75

Points Across Peak = 60

0.25 0.75 1.25 1.75Time0

%

0.63

1100 1200 1300 1400Scan0

%

0.63

5 ms Dwell Time, 5 ms Delay

Convert the x axis to scan number

�Cross Talk

� Cuando el “dwell times” y el ”inter-channel delay” son demasiadoscortos, puede ocurrir que no todos los iones sean eliminados de lacelda de colisión.



� Fragmentos de una transición están en la celda de colisióncuando la próxima transición empieza a ingresar.

� Cuando esto ocurre y las sucesivas transiciones tienen fragmentos(hijas) similares pueden generarse falsos positivos en laidentificación de compuestos estructuralmente relacionados opatrones de fragmentación diferentes a los reales.

Señal y Ciclos MRM: Celda T-Wave


Métodos MS/MS: MRM

�Funciones MRM

� Mayor flexibilidad en el uso de “dwell time”

� Mayor cantidad de transiciones por función

� Mayor definición del pico e incremento de la relación Señal / Ruido


Porque, a veces, son necesarias técnicas full scan ?


Cuadrupolo Tandem: Product Ion Scanning

Q1 Estático Q2 Scan

Celda de colisión(Ar gas)

Fragmentación


� El sistema permite seleccionar un ion de m/z definida, el cual es fragmentado en lacelda de colisión y se detectan todos los fragmentos (product ions).

� Se utiliza principalmente con fines cualitativos

306

250 300 350 400

321


150 300

158

306Q2 Scan 100 -310

150 300

158

306

Fragmentación

Product ion scan

Espectro de fragmentación de la reserpina 609m/z

� Puede ser usado en el

desarrollo de métodos para

identificar los fragmentos de

cuantificación y confirmación

en el modo MRM

Parent Ion


Fragmentos: Péptidos

100286.12

340.17

R SDY F I A T M Y" MAXI


100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200m/z0

%

215.08

160.08

86.09

157.13

802.36

800.39

689.29389.21

417.21

542.24

487.07

418.22

455.22

609.29

608.77668.32

690.28

785.36

986.48803.36

915.43

913.44

804.39

916.47987.48

1087.55

1088.52

(M+2H)2+

MS/MS of m/z 608.8/609.8 (M+2H)2+ peptide annotated with y" ion sequenceFigure 2.

Que es MSE ??

Baja energía de colisión

produce el ion precursor MS

%

MS

%


Alta energía de colisión

Produce fragmentación

m/z

MSE

%

m/z

m/z

MSE

%

m/z

time

%

time

%

Cuadrupolo Tandem: Precursor Ion Scan

Q2 EstáticoQ1 Scan



� El primer cuadrupolo permite pasar todos los iones (dentro de un rango de barrido especificado)para su fragmentación y luego se detecta un ion de m/z determinada (product ions).

� Se utiliza principalmente con fines cualitativos o screening de sustancias estructuralmenterelacionadas

Se ven todos losIones que producenEl fragmento m/z 79

OH

NH2+

OH

NH2+

OH

NH2+

Iones de m/z = 116 producido por la ruptura del enlace indicado por

Precursor Ion Scan


OH

O

O

OH

O

OH

O

NH

PropranololMW=259

MetoprololMW=267

PindololMW=248

Precursor Ion Scan

100

%

MIX_MS 1 (1.025) Scan ES+ 1.56e9235

268

260249267

280

295

MS Scan de la mezcla


230 240 250 260 270 280 290 300m/z0

100

%

0MIX_PAR 1 (2.070) Parents of 116ES+

5.63e7249

260268

Iones precursores del ion m/z=116

Metoprolol

PropranololPindolol

Cuadrupolo Tandem: Constant Neutral Loss

Q2 ScanQ1 Scan



� El primer y segundo cuadrupolo trabajan en el modo de barrido dentro de un rango determinado demasas, pero el segundo cuadrupolo permite que únicamente los iones que difieren en una determinadamasa (equivalente a la perdida de un fragmento neutro) respecto de Q1 sean transmitidos hacia eldetector.

� Se utiliza principalmente para el screening de familias de compuestos

� Los ácidos carboxílicos se fragmentan perdiendo una molécula neutra de dióxido de carbono CO2

equivalente a una variación de masa de 44 Da o unidades de masa atómica.

� Principalmente utilizado con fines cualitativos

� Se utiliza estratégicamente en trabajos de screening

NN

O

SO O

O

N

O

O

Glu Cys Gly

Glutathione 307.33 daltons

Constant Neutral Loss


NN

O

SO O

O

N

O

O OH

NCOCH3

NN

O

SO

O

OH

NCOCH3

ON

O

O

Perdida de una molécula de

Acido piroglutámico: –129.0426

Interferencias isobáricasPerdida de acido piroglutámico –129.0426

Constant Neutral Loss


GSH Adduct


Movilidad IónicaMovilidad IónicaCuadrupoloCuadrupolo / / IMSIMS / / ToFToF

SYNAPT™ HDMS™ Cuadrupolo / Movilidad Ionica IMS / ToF


DriftScope™


DriftScope – Superposición de datos

Retention TimeRetention Time


Retention Time

Mass

DriftDrift

Mass

Retention Time

Guía de Iones: TriWave

�Triwave esta constituida por tres T-Wave™

� TRAP

� Separación por Movilidad Iónica(IMS)

� TRANSFER

TRAP

T-Wave

IMS

T-Wave


� TRANSFER

�TRAP y TRANSFER pueden ser utilizadas para CID

� CID/IMS

� IMS/CID

� CID/IMS/CID (TAPfragmentation)

TRANSFER

T-Wave

CID

Experimento IMS MS


Drift time

Iones separados por IMS

m/z

oa-ToF

Drift time

m/z

Transfer: Fragmentación


Drift time

Iones precursores

m/z

Precursores y fragmentos

Drift time

m/z

Iones precursores

Trap: fragmentación


Iones Precursores

y fragmentos

Drift time

Iones separados por IMS

m/z

oa-ToF

Drift time

m/z

Time Aligned Parallel Fragmentation (TAP)

Q1

Precursores


Drift time

Fragmentos separados

por IMS

m/z

Iones precursores

fragmentados

Drift time

m/z

Precursores y fragmentos,

igual drift time

SYNAPT HDMS y MS


Consultas ???Consultas ???Consultas ???Consultas ???Consultas ???Consultas ???Consultas ???Consultas ???


D’Amico Sistemas S.ADaniel [email protected]

mass spectrometry - inti 24 mayo 2013

Documents