PRUEBAS PARA EL DIAGNOSTICO DE MASTITIS Y CALIDAD DE LECHE

Código FLA-23 V. 00

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1, Objetivo General: Conocer los fundamentos de las pruebas utilizadas para el diagnóstico de mastitis bovina y calidad de la leche.

2. Objetivos Específicos:

Desarrollar la prueba de la reductasa o reducción del azul de metileno para la determinación de la calidad de la lecheDesarrollar y conocer el fundamento de la prueba de Californian Mastitis Test.Desarrollar la metodología para el diagnóstico microbiológico de la mastitis bovina. Conocer otras pruebas diagnósticasutilizadas para la determinación de la mastitis en bovinos..

3. Marco Teórico:Mastitis (del griego mastos = glándula mamaria y del sufijo itis = inflamación). Se define como la inflamación de la glándula mamaria que generalmente se presenta como una respuesta a la invasión por microorganismos y se caracteriza por daños en el epitelio glandular, seguido por una inflamación clínica o subclínica, pudiendo presentarse con cambios patológicos localizados o generalizados, dependiendo de la magnitud del daño

La mastitis se clasifica en mastitis clínica, subclínica e infección latente, según el grado de inflamación.La inflamación de la glándula mamaria se caracteriza por los signos cardinales de ésta, los cuales son tumor, rubor, dolor, calor y disminución de la función.Clínicamente la mastitis puede presentarse como: a) severamente aguda, b) suave que por la severidad inflamatoria se subdivide moderada y ligera, c) crónica y d) gangrenosa.

La muestra de leche es obtenida para hacer diferentes pruebas relacionadas a mastitis: subclínica, clínica y composición de la misma, por lo tanto, la muestra se toma durante el ordeño de la vaca, dependiendo el momento, según el propósito perseguido con la muestra se pueden realizar las siguientes pruebas:

• Cloro en leche. En la leche la relación lactosa- cloro es influenciada por:o Estado lactacionalo Presentación de mastitisEn casos de mastitis el contenido de cloro en la leche tiende a incrementarse en proporción a la lactosa, lo que ocasiona en la leche un sabor ligeramente salado.Un método confiable para determinar el contenido de cloro en leche es el potenciómetro, que consiste en cuantificar los iones cloro usando electrodos específicos.

• Determinación de pH en leche. El pH identificado en calostro es de 6.4, en tanto que en la leche es de 6.5 -6.8, cantidad que a media lactación es de 6.6 - 6.7, y al final es de 6.8 o mayor.También se ha considerado que la leche que proviene de glándulas mamarias afectadas

por mastitis el pH es alcalino (6.9) lo que se atribuye a la disminución de la lactosa e incremento de sales que pasan de sangre a la lechePara determinar el pH en la leche podemos emplear:o púrpura de bromocresolo azul de bromotimolo potenciómetroso escala de valoración en papel indicador de pH

• Determinación de albúmina sérica en leche. Uno de los primeros cambios en vacas con mastitis fue la presencia de albúmina sanguínea en leche, atribuida al aumento de permeabilidad capilar en el proceso inflamatorio. Garza, et al., (1974), encontraron que los valores de albúmina sérica en la leche fueron proporcionales a la gravedad de la inflamación de la glándula mamaria.Para determinar la tasa de albúmina sérica en la leche se sugiere llenar con este líquido aproximadamente tres cuartas partes de un tubo de microhematocrito; enseguida se sella con fuego el lado del tubo que contiene leche y se centrifuga a 12000 x G durante 5 minutos (Yañez, 1980). A continuación se rompe el tubo abajo de la separación grasa-leche y con la leche descremada se procede a la determinación de albúmina sérica, empleando la técnica descrita por Richterich, (1970). Se considera que la leche proviene de animales positivos a mastitis cuando contiene más de 0.20 mg/ml.

• Conductividad eléctrica. La secreción láctea de una glándula mamaria con mastitis tiene una alta conductividad eléctrica por el elevado contenido electrolítico, especialmente en iones de sodio y cloro; lo que se presenta como uno de los primeros signos en la mastitis, siendo esto un elemento útil en el diagnóstico, considerando que niveles superiores a 6.9 m/cm2 entre 20-30°C son anormales.

• Determinación del número de células somáticas. Esta prueba se puede realizar de una forma directa o indirecta:

Examen microscópico y cálculo del número de célulasColocar laminilla con frotis sobre platina del microscopio, usando el objetivo calibrado.Enfocar el campo a estudiar, contando el número de células presentes y anotar el total de células observadas, repetir la actividad recorriendo los campos con un seguimiento al patrón dibujado por la sutura mattress (cenefa). Al alcanzar aproximadamente 50 células, es sugerible cambiar de zona de observación.Calcular el número de células, lo que hacemos considerando todo campo estudiado y sacando el promedio de células por campo, resultado que se multiplica por el factor microscópico lo que resultará en el número de células por mililitro.Ejemplo: 35 campos estudiados, con 70 células70/35= 2.0 células por campo2.0 X 300 300 = 600,600/ml célulasCélulas/ml = 600,600

Prueba de California para Mastitis (CMT)En las infecciones por bacterias, de los vasos localizados en el área afectada escapan leucocitos, siendo generalmente ésta, una respuesta celular proporcional a la severidad de la infección. Cullen (1966), menciona que las cuentas de células somáticas mayores a 500,000/ml indican mastitis subclínica.La prueba de CMT, identifica la presencia de ácido desoxirribonucléico de la células somáticas en la leche.

La prueba de reducción de azul de metileno consiste en teñir la leche con el colorante. Si la leche contiene alto contenido microbiano, se decolorará rápidamente, retomando su color blanco. Al contrario si existen pocos microorganismos el color azul se pierde lentamente. Esta prueba debe realizarse dentro de un lapso no mayor de 4 hrs desde la toma de la muestra. Si se toman muestras en un predio agrícola no debe exceder las 8 hrs. En ambos casos las muestras deben mantenerse hasta el inicio de la prueba en un baño de agua, a una temperatura entre 0-5ºc.- 4. Materiales, Equipos e Insumos.

Muestra de leche Paleta para Californian Mastitis Test Tubos de ensayo Baño serológico a 37 ºC Pipetas de 10 ml. Asas bactriologicas Agar Sangre Agar Mac Conckey Agar Muller Hinton

5. Reactivos Azul de metileno Purpura de Bromocresol Reactivo para Californian Mastitis Test

6. Procedimiento:

Prueba de CMT

Para hacer la prueba de CMT, se toma el instrumento (paleta para CMT) por el mango dirigido hacia la cola de la vaca, se descartan los dos primeros chorros de leche de cada pezón y seguidamente se colectan en cada una de las charolas de plástico (debiendo estar la superficie bien pulida y uniforme), 2 ml de leche de cada glándula y se anexan a cada uno de los compartimientos la misma cantidad del reactivo de California, cuidando que la proporción de reactivo a leche sea de 1:1. De inmediato se mezclan la leche y el reactivo mediante un movimiento rotatorio suave, haciendo la lectura de la reacción alrededor de los 7 segundos, momento en que alcanza el pico la reacción

Negativa Sin evidencia 0 a 200,000T Traza Precipitación leve 150,000 – 500,0001 Positivo leve Sin formación de gel, mezcla espesa 400,000-1,500,0002 Positiva Mezcla espesa cierta formación del gel 800,000-5,000,0003 Positiva fuerteEl gel causa formación de una superficie convexa > 5,000,000+ Leche alcalina Fuerte color morado Actividad secretora reducida++ Leche ácida Color amarillo pH 5.2, fermentación de lactosa por bacterias

Prueba de Acidez

Tomar 9 ml de leche y agregar 1m del reactivo Purpura de bromocresol al 0.5%, llevar a Incubación a 37 º C por 24 horas , esta prueba puede hacerse c on otros indicadores tales como

Prueba de Reduccion del Azul de metileno – Reductasa-

Se deben agregar asépticamente 10ml de leche cruda en 2 tubos de ensayo. Agregar 1ml de solución de azul de metileno, tapar, agitar y llevar a incubadora a 36ºc más menos 1ºc por 10 min. Pasado este tiempo invertir los tubos, para favorecer la mezcla. Registrar este momento como inicio de la incubación. Se debe verificar el color a los 60 min. de iniciado el tiempo de incubación. Si ha perdido color, registrar el TRAM a los 60 min. Verificar por segunda vez a las 3 hrs. de iniciada la incubación. Si las muestras pierden el color registrar el TRAM menor que 3 hrs. Continuar registrando los resultados hasta la 5 hora desde el inicio de la incubación

Pruebas microbiológicasPara esta prueba se utilizará inicialmente una caja de Agar sangre y una de Agar Mac Conckey. Con un hisopo esteril realice una siembra masiva en la mitad de la caja a partir de la muestra sospechosa, posteriormente con el asa curva realice un agotamiento en la otra mitad de la caja, marque apropiadamente y lleve a incubación a 37 ºC x 24 horas

7. Nivel de Riesgo

Bajo

CUESTIONARIO.1.Consulte, estudie y anexe un articulo referente a prevalencia de mastitis en explotaciones lecheras en nuestro pais.2. Consulte un algoritmo de identificación para Streptococcus y Staphylococcus.3. Investigue acerca de las mastitis endógenas y iatrogénicas4. Cuales son los agntes etiológicos que causan las mastitis clínicas de mayor gravedad.

8. Bibliografía

http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n090907/090702.pdf

http://kepler.uag.mx/uagwbt/microbiologia/ciencias/sesiones/tema3.2.1.pdf

Brooks, Geo F. Jawetz, Melnick, & Adelberg's medical microbiology / Geo F. Brooks, Janet S. Butel, Stephen A. Morse New York [etc.] : Lange, cop. 2001

Koneman [et. al.] Diagnóstico microbiológico : texto y atlas color / Elmer W Buenos Aires : Ed. médica panamericana, 1992