SCREENINGUL FITOCHIMIC ŞI ACTIVITATEA ANTIOXIDANTĂ A UNUI EXTRACT USCAT OBŢINUT DIN FRUNZE DE BETULA PENDULA ROTH. (MESTEACĂN)

Teodora Costea1, Viorica Istudor1, Maria Lidia Popescu1, Cerasela Elena Gîrd1, Laurian Vlase2, Andreea Roxana Lupu3, Radu Claudiu Fierăscu4, Irina Fierăscu4

1UMF ,,Carol Davila’’, Facultatea de Farmacie, Bucureşti, România; 2UMF ,,Iuliu Haţieganu’’, Facultatea de Farmacie, Cluj-Napoca, România; 3Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie şi Imunologie ,,Cantacuzino’’, Bucureşti, România; 4Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare pentru Chimie şi Petrochimie, Bucureşti, România

MATERIAL ŞI METODE

Material: extract uscat (BE) obţinut prin refluxarea a 300 g p.v. (recoltat în luna mai 2011 din localitatea Morăreşti, Jud. Argeş) cu etanol 40% timp de 30 min. într-un raport p.v./solvent de 1:20 (I extracţie) respectiv 1:10 (a-II-a extracţie); concentrarea soluţiei la rotavapor, liofilizare (~ 50 g extract).

Metode: a) spectrofotometrice - flavone (g% hiperozidă), acizi fenolcarboxilici = AFC (g% acid clorogenic), proantociani (g% clorură de cianidol), taninuri (g% acid tanic), polifenoli totali (g% acid tanic), saponozide triterpenice (g% acid betulinic); b) HPLC-MS pentru polifenoli – soluţie etanolică 40% (SBE) şi hidrolizată (SBEH); c) spectrometrice (ICP-AES, F-AAS) – elemente minerale; d) antioxidante în sistem acelular (ORAC, ABTS, FRAP) - IC50 (mg/mL); echivalenţi trolox şi mmoli Fe+2/mg extract/standarde (curbe trolox pt ABTS, ORAC şi FeSO4 pentru FRAP) şi sistem celular (celule HepG2) – evaluarea producţiei intracelulare de specii reactive de oxigen = SRO (cu DCFH-DA) în prezenţa co-tratamentului BE + aloxan (agent oxidant); e) testul MTT – determinarea viabilităţii celulare (VC) în prezenţa BE (verificarea unui potenţial efect citotoxic) şi stabilirea dozei de aloxan care reduce cu 50% VC. Analiza statistică: Excel 2010, GraphPad Prism 5 (media ± SD, n = 3).

OBIECTIVE

Caracterizarea fitochimică a extractului

Determinarea activităţii antioxidante în sistem acelular

şi celular (linia HepG2)

REZULTATE

calciu

potasiu

magneziu

sodiu

zinc

mangan

crom

0 10000 20000 30000 40000

2601

32252

3764

2881

94.5

1059

14.96 mg/kg

 Compus

HPLC-MSSBE SBEH

mg%

acid gentisic + +acid clorogenic + +

acid cafeic + -acid ferulic - 28,20

acid p-cumaric - 155,18acid sinapic - 6,69hiperozidă 1227 -

quercitrozidă 55,90 -isoquercitrozidă 78,54 -

quercetol 20,73 807,82kaempferol - 19

apigenol 9,843 11,83

miricetol 188,2 192

 Extract/standard

ABTS   FRAP    ORAC μM trolox/g BEIC50

(mg/mL)

mg trolox/mgBE/standard

IC50 (mg/mL) mmoli Fe/mg BE/standard

BE 0,1730 ± 0,027 0,1504±0,045 0,1031±0,024 0,0040±0,0013 1985,3±212,2vitamina C 0,0511±0,0017 1,056±0,2975 0,0141±0,002 0,0211±0,0029 -acid galic 0,0211±0,0005 3,0613±0,218 0,0044±0,0023 0,0636±0,0071 -

Prin HPLC-MS au fost identificaţi noi compuşi - acizii gentisic şi sinapic. Conţinutul de hiperozidă, isoquercitrozidă, apigenol este mai scăzut comparativ cu rezultatele lui Germano M.P. & al. (asupra unui extract etanolic), dar cel de quercetol, miricetol, quercitrozidă este superior. Activitatea antioxidantă a BE este inferioară vitaminei C/acidului galic.

0

50

100

150

Via

bil

itat

e (%

)

La 72 h de la incubarea celulelor cu 0,1 mg/mL BE se observă un efect citotoxic (VC ~`70%), datorat probabil saponozidelor şi/sau efectului pro-oxidant al polifenolilor. BE scade producţia de SRO doză-depent, probabil datorită compuşilor fenolici (care traversează membrana celulară printr-un mecanism pasiv/ activ) şi elementelor minerale .

CONCLUZII

Extractul uscat obţinut din frunze de Betula pendula Roth. prezintă potenţial antioxidant şi ar putea fi utilizat în tratamentul adjuvant al unor afecţiuni hepatice în care este implicat stresul oxidativ.

Soluţie analizată Producţie (%) SRO

Martor M1 (celule netratate) 100

Martor M2 (celule + 50 mM aloxan) 140,086

BE 0,001 mg/mL + aloxan 138,228 BE 0,005 mg/mL + aloxan 125,610

BE 0,01 mg/mL + aloxan 119,435 BE 0,05 mg/mL + aloxan 101,252

50 mM aloxan

1. Vlase L. & al. – Determination of phenolic compounds from Geranium sangvineum by HPLC, J. of Liquid Chromatography and Related Tehnologies, 2005, 28(19): 3109-3117.2. Germano M.P. & al. – Betula pendula leaves – polyphenolic characterization, potential innovative use in skin whitening products, Fitoterapia, 2012, 83(5): 877-882.3. Pandey K.B & al. – Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease, Oxid Med and Cell Long., 2009, 2(5):270-278.

REFERINŢE

0510152025

22.794

9.9213.088

8.0592

2.01445.1468

g%

Legendă: control = celule netratate (menţinute doar în mediu de cultură)