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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ - CAMPUS DE

CASCAVELCENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM BIOCIÊNCIAS E

SAÚDE – NÍVEL MESTRADO

MAYARHA PATRICIA DEQUIGIOVANNI BAGGIO

SUSCEPTIBILIDADE DO PILORO DE Bombyx mori (LEPIDOPTERA, BOMBYCIDAE) AO BOMBYX MORI MULTIPLE NUCLEOPOLYHEDROVIRUS

CASCAVEL-PR

(AGOSTO/2013)

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SUSCEPTIBILIDADE DO PILORO DE Bombyx mori (LEPIDOPTERA,

BOMBYCIDAE) AO BOMBYX MORI MULTIPLE NUCLEOPOLYHEDROVIRUS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Biociências e Saúde – Nível Mestrado, do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, da Universidade Estadual do Oeste do Paraná, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Biociências e Saúde. Área de concentração: Biologia, processo

saúde-doença e políticas de saúde

ORIENTADOR: Rose Meire Costa Brancalhão CO-ORIENTADOR: Lucinéia de Fátima Chasko Ribeiro

CASCAVEL-PR

(AGOSTO/2013)

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FOLHA DE APROVAÇÃO


SUSCEPTIBILIDADE DO PILORO DE Bombyx mori (LEPIDOPTERA, BOMBYCIDAE) AO BOMBYX MORI MULTIPLE NUCLEOPOLYHEDROVIRUS

Esta dissertação foi julgada adequada para a obtenção do título de Mestre em

Biociências e Saúde e aprovada em sua forma final pelo Orientador e pela Banca

Examinadora.

_________________________________________________________________

Orientador: Prof. Dr. (a) Rose Meire Costa Brancalhão

UNIOESTE – Campus Cascavel

_________________________________________________________________ Prof. Dr. Hélio Conte

UEM – Maringá - PR

_________________________________________________________________ Prof. Dr. Luis Francisco Angeli Alves

UNIOESTE - Campus Cascavel - PR

CASCAVEL-PR

(AGOSTO/2013)

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Ao meu namorado Felipe.

Aos meus pais, José e Ivonete.

A minha irmã, Maikelli.

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AGRADECIMENTOS

A Universidade Estadual do Oeste do Paraná, e ao Programa de Pós-

Graduação em Biociências e Saúde pela oportunidade e infraestrutura, e a

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior pelo apoio

financeiro na realização do trabalho.

Ao meu namorado Felipe Salvador Weissheimer, primeiramente por todo o

apoio e incentivo em buscar novos conhecimentos. Pela paciência e por acalmar-me

sempre que as dificuldades nos deixam angustiados, ansiosos e até mesmo sem

forças para continuar. Seu amor e carinho foram essenciais e importantes neste

caminho ciêntífico.

À minha orientadora Profa. Dra. Rose Meire Costa Brancalhão, por ter me

recebido no laboratório e por confiar em mim na realização da pesquisa. Pelo apoio

incondicional em todas as horas, desde a parte experimental até a elaboração

textual da dissertação. Acredito que sou uma pessoa de muita sorte, por ter à

conhecido e sido sua primeira orientada deste programa, se há tivesse escolhido e

ela à mim, acredito que não teria dado tão certo. Seu apoio e seu incentivo me

fizeram perceber que posso alcançar tudo que almejo, enfim, só tenho a agradecer,

pois, seus ensinamentos enriqueceram muito minha vida acadêmica.

À minha co-orientadora Profa. Dra. Lucinéia de Fátima Chasko Ribeiro, por

todo o apoio concebido na parte de bancada, e toda a dedicação e ensinamento

sobre o objeto de estudo, e principalmente pelo companheirismo, pelas conversas,

por estar sempre sanando nossas mais variadas dúvidas com muita paciência e

carinho. Meu muitíssimo obrigado!

Ao amigo Sóstenez, colega do programa de mestrado e de laboratório, que

me direcionou nas rotinas de laboratório e nas disciplinas do mestrado, sendo meu

primeiro contato científico. No decorrer da pesquisa passamos por muitas

repetições, angústias, e o que nunca esquecerei é seu otimismo, “calma no final vai

dar tudo certo”.

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À Profa. Dra. Edinéia Fátima Brambilla Torquato por ter aceitado fazer parte

da minha banca de qualificação, onde suas contribuições enriqueceram ainda mais o

trabalho.

Aos colegas de laboratório e alunos de iniciação científica, em especial, a

Ketlin e ao Thiago, que foram os primeiros a nos ajudar na realização do trabalho,

pela parceria aos sábados, domingos e feriados, e pela grande amizade que

construimos ao longo do caminho.

Ao Welington, na recuperação de pendrives contaminados, ao Bruno, Juliana

e Adriana pelos momentos de esquecimentos, onde a ajuda dos mesmos foi

fundamental e de grande importância.

As colegas e amigas de mestrado e laboratório, Jessica e Regina pelo

companheirismo e ajuda ofertada na realização desta pesquisa. E a Marilucia,

ingressante recente do mestrado que além de uma grande amiga, sempre se

mostrou prestativa e disposta a ajudar no melhoramento deste estudo.

À Celeste, por sempre nos ajudar a encontrar as coisas no laboratório e

também chamar nossa atenção sempre que necessário.

À bibliotecária Janete pelo grande auxílio na busca de artigos científicos

indisponíveis que foram fundamentais no entendimento dos resultados obtidos e na

construção da dissertação.

À secretária do programa de mestrado, Graselha que muito nos auxiliou na

parte burocrática, com muita dedicação e paciência.

À amiga Sama, pelo acolhimento em sua casa, para participação de

Congressos e realização de processamentos eletrônicos na Universidade de

Maringá - PR.

À técnica da Central de Microscopia Eletrônica da Universidade de Maringá,

Cintia, que nos auxíliou no processamento das amostras e aquisição das imagens.

Aos Profs. Drs. Hélio Conte e Luis Francisco Angeli Alves por aceitarem

participar da banca examinadora do nosso trabalho.

Á todos que direta ou indiretamente contribuíram para o desenvolvimento

desta etapa importante do meu projeto de vida.

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RESUMO GERAL

Bombyx mori multiple nucleopolyedrovirus (BmMNPV) é um vírus entomopatogênico da família Baculoviridae, gênero Alphabaculovirus, que infecta o bicho-da-seda (Bombyx mori) e causa a doença poliedrose nuclear. Este vírus é poliorganotrófico e uma série de tecidos são conhecidos como alvos; contudo, a literatura não apresenta informações sobre o piloro, segmento do intestino posterior, presente na transição com o médio e responsável pela regulação da passagem do alimento em direção ao ileo. O órgão é assim de fundamental importância na finalização do processo digestório, afetando o equilíbrio metabólico do inseto e, o presente estudo objetivou analisar sua susceptibilidade e citopatologia frente ao BmMNPV, isolado geográfico do Paraná, Brasil. Ainda, devido a complexidade deste segmento, também será analisada sua morfologia geral. Para tanto, lagartas híbridas de B. mori no 5° instar foram inoculadas experimentalmente com uma suspensão viral de BmMNPV. Em diferentes dias pós-inoculação (dpi), do 2° ao 9° dpi, segmentos do intestino, contendo o piloro, com suas subdivisões (anel intersticial posterior, cone pilórico e válvula pilórica), foram dissecados, seguindo o processamento histológico de rotina para emblocamento em parafina e colorações em hematoxina e eosina, na análise da morfologia geral, e em Azan modificado, para a citopatologia. Segmentos também foram processados em microscopia eletrônica de varredura para análise de detalhes morfológicos. Assim, a morfologia geral do piloro das lagartas da B. mori foi semelhante à observada em outros insetos. A citopatologia mostrou que a área anterior do anel intersticial posterior é alvo secundário de infecção pelo BmMNPV, a partir do 5° dpi, e seu ciclo infeccioso é semelhante ao descrito em literatura. No núcleo hipertrófico houve a formação do viroplasma, local de produção dos nucleocapsídeos envelopados ou virions, seguindo a formação e o desenvolvimento dos poliedros. Posteriormente, ocorreu a citólise, promovendo a liberação dos poliedros e disseminação da doença, principalmente nos barracões de criação de B. mori. A área posterior do anel intersticial posterior, o cone pilórico e a válvula pilórica não revelaram quaisquer indícios de infecção pelo BmMNPV e, desta forma, mecanismos de resistência envolvendo fatores genéticos poderiam estar atuando. Os conhecimentos obtidos irão contribuir no estabelecimento do ciclo infeccioso deste importante vírus entomopatogênico, cuja conseqüência de uma epizootia pode afetar negativamente toda a cadeia produtiva da seda. Palavras-chave: Válvula pilórica; Cone pilórico; Alphabaculovirus; Intestino posterior; Anel intersticial posterior.

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GENERAL ABSTRACT

Bombyx mori multiple nucleopolyedrovirus (BmMNPV) is an entomopathogenic virus of the Baculoviridaefamily, genera Alphabaculovirus, which infects the silkworm (Bombyx Mori) and causes nuclear polyhedrosis disease. This virus is poliorganotrophic and a series of tissues are known as targets; however, literature does not present information in regards to the pylorus, segment of the hindgut, present in the transition with the midgut and responsible for regulating the passage of food towards the ileum. The organ is, thus, of fundamental importance in the ending of the digestive process, affecting the insect’s metabolic balance and, the present study sought to analyze its susceptibility and cytopathology in regards to BmMNPV, geographic isolate of Paraná, Brazil. Moreover, due to the complexity of this segment, its general morphology will also be analyzed. In order to do so, hybrid B.mori caterpillars at 5º instar were inoculated experimentally with a viral suspension of BmMNPV. On different day post-inoculation (dpi), from 2º to 9ºdpi, segments of the intestine, containing the pylorus, with its subdivisions (posterior interstitial ring, pyloric cone and pyloric valve), were dissected, following the routine histological processing for paraffin wax blockage and dyes in haematoxylin and eosin, for general morphology analysis, and in modified Azan staining, for cytopathology. Segments also processed to form scanning electronic microscope for analized of morphological details. So the pylorus general morphology the caterpillars of B. mori, was similar to that observed in other insects. The cytopathology showed that the anterior area of the posterior interstitial ring is a secondary target of infection for the BmMNPV, after 5º dpi, and its infectious cycle is similar to that described in literature. In the hypertrophic nucleus one there the formation of viroplasm, place for production of enveloped nucleocapsids or virions, following the formation and development of the polyhedra. Later on, cytolysis occurred, promoting the liberation of polyhedra and the spreading of the disease, mainly in the B. mori creation sheds. The posterior area of the posterior interstitial ring, the pyloric cone and the pyloric valve did not reveal any traces of infection by BmMNPV and, thus, resistance mechanisms involving genetic factors could be acting. The knowledge obtained from this work will contribute in the establishment of the infectious cycle of this important entomopathogenic virus, which may lead to an epizootic that can negatively affect the whole productive chain of silk. KEYWORDS: pyloric valve; pyloric cone; alphabaculovirus; hindgut; posterior interstitial ring.

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO................................................................................................12

2. REVISÃO GERAL DE LITERATURA...........................................................15

2.1 SERICICULTURA............................................................................................15

2.2 BACULOVÍRUS...............................................................................................19

2.3 Bombyx mori.................................................................……...........................26

2.4 SISTEMA DIGESTÓRIO……………………………………………………….... 29

3. REFERÊNCIAS...............................................................................................33

ARTIGO CIENTÍFICO 1. Morphology of the pylorus of Bombyx mori (Linnaeus) (Lepidoptera: Bombycidae).................................................................................... 47

ARTIGO CIENTÌFICO 2. Bombyx mori Pylorus infection by Alphabaculovirus.................................................................................................... 62

4. ANEXO A. Normas da Revista Neotropical

Entomology...................................................................................................... 72

5. ANEXO B. Normas da Revista Genetic and Molecular

Resarch............................................................................................................78

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Árvore filogenética dos quatro gêneros da Família Baculoviridae .......... p. 19 Figura 2. Ilustração dos fénotipos virais do BmMNPV: BVs e poliedro viral contendo

os ODVs ................................................................................................. p. 21 Figura 3. Ciclo infeccioso do Alphabaculovírus ..................................................... p. 23 Figura 4. Fotomicrograficas dos tecidos alvos de B. mori ao BmMNPV. .............. p. 24

Figura 5. Ciclo reprodutivo de B. mori ................................................................... p. 28 Figura 6. Canal alimentar de B. mori contendo os Intestinos anterior, médio e

posterior ................................................................................................. p. 30

Figura 7. Montagem de fotomicrografia em coloração Hematoxilina e eosina contendo o intestino posterior de B. mori com suas respectivas subdivisões: piloro, íleo, colon e reto.. .................................................... p. 32

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LISTA DE ABREVIATURAS

AlphaBv: Alphabaculovirus

AIP: Anel intersticial posterior

BV: “Budded virus” ou vírus broto

BmNPV: Bombyx mori nucleopolyhedrovirus

COPRASEDA: Cooperativa dos Produtores Rurais de Artesanato em Seda

CP: Cone pilórico

DNA: Ácido desoxiribonucléico

Dpi: Dia pós-inoculação

EMATER: Empresa de Assistência técnica e Extensão Rural

GV: Granulovírus

HE: Hematoxilina- Eosina

Kpb: Kilo pares de base

Kb: Kilo base

MNPV: Nucleopoliedrovírus múltiplo

mL: Mililitros

NPV: Nucleopoliedrovírus

OB: “Occlusion bodies”

ODV: “Ocludded vírus” ou vírus derivado do poliedro

pH: Potencial de hidrogênio

PBS: Tampão fosfato salino

PIBs: Corpos de oclusão poliédricos

PRONAF: Programa Nacional de Fortalecimento da Agricultura Familiar

SNPV: Nucleopoliedrovírus simples

TM: Túbulos de Malpighi

VP: Válvula pilórica

µm: Micrômetros

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1. INTRODUÇÃO GERAL

Baculoviridae é uma extensa e importante família de vírus

entomopatogênicos que vem sendo muito estudada pelo seu potencial uso no

controle biológico de insetos, e por causar doenças em insetos úteis, como Bombyx

mori (Lepidoptera, Bombycidae) (DOURADO et al., 2011). Taxonomicamente os

baculovírus são divididos em quatro gêneros Alphabaculovirus, Betabaculovirus,

Gammabaculovirus e Deltabaculovirus. Alphabaculovirus (AlphaBV) compreende os

nucleopoliedrovírus (NPV) específicos de lepidópteros que são constituídos por DNA

circular fita dupla e tamanho entre 80-180 kb. Este DNA se associa com proteínas

do capsídeo constituindo o nucleocapsídeo, que é envolto por um envelope

membranoso e forma o nucleocapsídeo envelopado ou vírion. Nos AlphaBV vários

nucleocapsídeos são agrupados em um corpo de oclusão protéico ou poliedro, cujo

tamanho varia de 0,6 a 15 µm de diâmetro. O poliedro confere proteção aos vírions,

em especial, contra as condições adversas do meio ambiente (HORI et al., 2012;

IKEDA et al., 2013; JEHLE et al., 2006; ROHRMANN, 2011).

AlphaBV pode conter apenas um nucleocapsídeo por envelope, sendo

denominado single nucleopolyhedrovirus – SNPV, ou vários, denominado multiple

nucleopolyhedrovirus – MNPV variando de 1 a 15 nucleocapsídeos por envelope

(ROHRMANN, 2011). De acordo com literatura MNPV são mais virulentos que os

SNPV e verifica-se a existência de variabilidade genética para NPVs da mesma

espécie, mas de localização geográfica diferente, o que pode afetar sua virulência

(ADAMS; McCLINTOCK, 1991; FAN et al., 2007; LIANG et al., 2013). Uma das

principais características dos AlphaBV é seu ciclo infeccioso, que apresenta 2

formas fenotipicamente distintas, embora seus vírions sejam genotipicamente

idênticos. A occlusion derived bodies (ODV) ou vírus derivado do poliedro e a

budded vírus (BV) ou vírus broto. Nos ODV os vírions se apresentam ocluídos no

poliedro e são responsáveis pela transmissão horizontal da doença e também atuam

na infecção primária nas células do epitélio do intestino médio do inseto. Os BV não

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se apresentam ocluídos e são responsáveis pelo estabelecimento da infecção

sistêmica ou secundária, ou seja, transmissão célula-a-célula (ROHRMANN, 2011;

SATADAL et al., 2012).

O ciclo infeccioso dos AlphaBV tem sido estudado em inúmeros insetos

(ADAMS; McCLINTOCK, 1991), como B. mori (BRANCALHÃO,1998;

BRANCALHÃO; SOUZA; SOARES, 2002; BRANCALHÃO; RIBEIRO, 2003;

BRANCALHÃO; TORQUATO; FERNANDEZ, 2009; PEREIRA et al., 2008; RIBEIRO

et al., 2009; TORQUATO; MIRANDA NETO; BRANCALHÃO, 2006; VESSARO-

SILVA et al., no prelo). Estes autores identificaram e analisaram a infecção causada

pelo AlphaBV em lagartas de B. mori no Estado do Paraná, Brasil, sendo a espécie

viral identificada como Bombyx mori multiple nucleopolyhedrovirus (BmMNPV), por

apresentar poliedros contendo tanto nucleocapsídeos envelopados únicos, como

múltiplos. Entretanto, Hu et al. (1999) e Rohrmann (2011) colocam que a base

genética para o entendimento do envelopamento de um ou mais nucleocapsídeos

ainda é desconhecida.

Quando BmMNPV infecta B. mori causa a doença poliedrose nuclear,

popularmente conhecida como “amarelidão” ou flacidez infecciosa, que representa

mundialmente um sério problema para a sericicultura, pois uma vez doentes as

lagartas não se curam e devem ser eliminadas, para evitar a disseminação e

propagação da doença no ambiente (LIANG et al., 2013; QIN et al., 2012).

A sericicultura se desenvolve predominantemente em pequenas comunidades

rurais, onde predomina o trabalho familiar e, ao possibilitar um meio de subsistência

econômica aos trabalhadores, contribui de forma significativa na diminuição do

êxodo rural. Soma-se o aspecto ecológico, uma vez que não se devem utilizar

agrotóxicos na propriedade. Com isso, verifica-se que a sericicultura é uma atividade

de baixo impacto no meio ambiente e contribui para o desenvolvimento sustentável

do país (BRANCALHÃO, 2002). Estas características possibilitaram a inserção da

sericicultura no programa de agricultura familiar do estado do Paraná, Brasil (SEAB,

2013).

Diante do exposto, o grupo de pesquisa da Universidade Estadual do Oeste

do Paraná vem estudando a susceptibilidade de tecidos e órgãos de B. mori frente

ao BmMNPV, isolado geográfico do Paraná, de forma a se estabelecer o ciclo

infeccioso no corpo do inseto (BRANCALHÃO; RIBEIRO, 2003; BRANCALHÃO;

SOUZA; SOARES, 2002; BRANCALHÃO; TORQUATO; FERNANDEZ, 2009;

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DOURADO et al., 2011; PEREIRA et al., 2008; RIBEIRO et al., 2009; TORQUATO;

MIRANDA NETO; BRANCALHÃO, 2006; VESSARO-SILVA et al., no prelo).

No que concerne ao trato digestório, em especial o piloro, a literatura não

apresenta informações referentes à sua susceptibilidade ao BmMNPV. O piloro é um

segmento do intestino posterior, responsável por regular a passagem do alimento do

intestino médio ao íleo. E que apresenta grande complexidade morfológica, devido

especialmente às atividades de contração e relaxamento desenvolvidas, que podem

obscurecer características morfológicas importantes (MACGOWN; SIKOROWSKI,

1982). Este fato justifica a divergência de nomenclatura encontrada em literatura

(BARBEHENN; KRISTENSEN, 2003; CHI et al., 1975; EATON, 1939; JUDY;

GILBERT, 1969 e 1970; LEVY et al., 2004 e 2008; MACGOWN; SIKOROWSKI,

1982; MARANHÃO, 1972; SRIVASTAVA, 1959), bem como a necessidade de se

analisar a morfologia geral de espécies específicas.

Neste sentido, o conhecimento da susceptibilidade do piloro, bem como sua

citopatologia, representará um ganho científico que contribuirá no estabelecimento

do ciclo infeccioso deste importante vírus entomopatogênico, cuja conseqüência de

uma epizootia pode afetar negativamente toda a cadeia produtiva da seda, em

especial, o produtor rural; pois, segundo Panucci-Filho, Chiau, Pacheco (2011) a

sericicultura tem influenciado a permanência de famílias proprietárias de pequenas

propriedades nas zonas rurais. Assim, esta atividade agrícola objetiva a diminuição

da pobreza, de forma a minimizar as desigualdades sociais, permitindo e

assegurando o contato com a “terra” e a aproximação do ser humano em atividades

interdisciplinares de inclusão na sociedade (GUANZIROLI et al., 2001; PANUCCI-

FILHO;CHIAU; PACHECO,2011).

No entanto, como qualquer atividade agrícola existe problemas que precisam

ser resolvidos, como: as condições de trabalho do sericicultor que, com o tempo,

podem ocasionar doenças ocupacionais; o baixo valor agregado ao produto no

Paraná; a detenção do banco de germoplasma por empresas privadas; a espera por

resultados de pesquisas que envolvam melhoramento genético de B. mori; a

dispersão de agrotóxicos a partir de culturas circunvizinhas a barracões de criação

das lagartas; e, conforme colocado anteriormente, as doenças que acometem B.

mori (BRANCALHÃO, 2002; MARGATHO et al., 2012).

A presente dissertação é composta por dois artigos científicos, o artigo 1 foi

intitulado: Morphology of the pylorus of Bombyx mori (Linnaeus) (Lepidoptera:

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Bombycidae e encaminhado a Revista Neotropical Entomology, e o artigo 2 ficou

intitulado como: Bombyx mori Pylorus infection by Alphabaculovirus e aceito pelo

Conselho Editorial da Revista Genetics and Molecular Research.

2. REVISÃO GERAL DE LITERATURA

O presente estudo envolve temas de sericicultura, virologia e entomologia.

Objetivando otimizar a forma de apresentação, a revisão foi organizada em tópicos.

2.1 SERICICULTURA

A sericicultura é um ramo da agroindústria que envolve a criação do bicho-da-

seda, produção e preparo dos ovos, e o cultivo da amoreira, objetivando a produção

de casulos verdes1, que são transformados em fios e tecidos de seda (BARBOSA,

2006; INCEOGLU et al., 2001). A atividade exige trabalho intenso, onde se utiliza

mão-de-obra própria e cuidados técnicos adequados (PANUCCI-FILHO; CHIAU;

PACHECO, 2011). Zanetti (2007) coloca que a sericicultura proporciona um grande

número de empregos diretos e indiretos, no campo gera aproximadamente 13,9 mil

empregos diretos, na indústria mais 2 mil e no setor de serviços 3 mil empregos

indiretos.

A cadeia produtiva da seda é bastante estruturada e conta com a participação

de empresas e institutos de sementagem. Nestes ocorre à seleção e produção de

ovos de raças puras de B. mori, sendo no Brasil utilizadas as raças chinesa e

japonesa, que são cruzados entre si, produzindo os híbridos comerciais. Esses ovos

são mantidos em chocadeiras e, após eclosão, as larvas permanecem neste

ambiente até o 3º ínstar. Posteriormente, as larvas são encaminhadas aos

entrepostos, local onde são distribuídas aos sericicultores e também é o local de

entrega dos casulos pelos produtores (BARBOSA, 2006).

As raças puras são de domínio exclusivo das empresas sericícolas, que têm

total controle na reprodução e cruzamento da espécie. Com relação ao casulo, seu

1Casulos verdes são os que apresentam crisálidas vivas no seu interior. Eles são coletados pelo

produtor rural, nos barracões de criação do bicho-da-seda, e são encaminhados aos entrepostos de compra das indústrias de fiação; onde serão, posteriormente, desidratados em um secador que mata as crisálidas.

16

preço é estabelecido através de negociações entre o sericicultor e a indústria,

considerando fatores, que vão desde os custos de produção da atividade no campo,

a condições do mercado internacional do fio de seda (BARBOSA, op. cit.).

Historicamente, os registros da atividade sericícola datam de cerca de 5 mil

anos atrás, com sua origem no Norte da China, expandindo-se para o Oriente e

Ocidente. No Brasil, a sericicultura foi introduzida no século XIX, mais precisamente

no Estado do Rio de Janeiro, em Itaguai, com a Imperial Companhia Seropédica

Fluminense (HANADA; WATANABE, 1986).

A China lidera o mercado internacional de exportação de seda, com

aproximadamente 76,7% da produção mundial, em segundo lugar a Índia (GUO-

PING; XI-JIE, 2011; RAJU et al., 2012), seguido do Vietnã, Uzbequistão e Tailândia,

com menos de 5% da produção. O Brasil ocupa o 6º lugar no ranking mundial, com

cerca de 0,86% da produção (SEAB, 2011).

No Brasil, a atividade está ligada há pequenas comunidades rurais,

gerenciadas por famílias proprietárias que atuam na agricultura familiar,

possibilitando um meio de subsistência econômica (PANUCCI-FILHO; CHIAU;

PACHECO, 2011). A sericicultura nacional tem se desenvolvido nos estados do

Paraná, Mato Grosso do Sul, São Paulo e Santa Catarina. São Paulo foi destaque

na década de 80, como maior produtor; entretanto, dados da Seab (2011), revelaram

que o Estado detém apenas 4,3% da produção, com 189 toneladas, nas cidades de

Bastos e Gália, e atualmente, preços desestimulantes, a falta de incentivo do

governo e amoreiral antigo, têm reduzido ainda mais a produção (SEAB, 2013).

O Estado do Paraná, por outro lado, é destaque na atividade sericícola, com

98% da produção nacional de fios de seda, o Governo apóia a produção e fornece

recursos ao pequeno produtor, através do Programa Nacional de Fortalecimento da

Agricultura Familiar (PRONAF), cujo objetivo é possibilitar financiamentos ao

produtor que se utiliza da força de trabalho familiar (TSUKAMOTO, 2011). Este

programa, portanto, é considerado por Denardi (2001) como a primeira política

publica diferenciada em favor dos produtores familiares.

Além disso, as condições edafoclimáticas do estado facilitam o

desenvolvimento da sericicultura, que nos últimos 10 anos se tornou responsável por

quase 100% da produção nacional. O Estado conta com 191 municípios produtores

e 2.240 sericicultores, que recebem R$ 11,90 por quilograma de casulos verdes,

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chegando a uma produtividade de 441,77 mil quilos de casulos verdes por safra

(SEAB, 2013).

O maior produtor de casulos verdes no Paraná é Nova Esperança, com 232

produtores, que correspondem a 10% da produção total do Estado, detendo 382 mil

quilos de casulos verdes, representando 15% da produção paranaense (SEAB,

2013). Quando comparada com as últimas safras 2009/2010, 2010/2011 observou-

se uma redução no número de produtores, número de municípios, área de amoreira

plantada, e produção de casulos; no entanto, a produtividade aumentou.

O incentivo que a indústria sericícola paranaense recebe dos órgãos

governamentais, somado aos conhecimentos científicos e tecnológicos, garantem

que a seda do Brasil é de qualidade superior, quando comparada a de outros países

(GUANZIROLI et al., 2001; PANUCCI-FILHO; CHIAU; PACHECO, 2011). Sendo

considerada por Thomas (2009) como a melhor do mundo. Por estas circunstâncias,

em 2012, as contribuições da seda brasileira somaram US$ 27,60 milhões em

exportações (SEAB, 2013).

Ainda, no Estado do Paraná, mais precisamente na comunidade da Vila Rural

Esperança foi desenvolvido, o projeto Seda Justa, que envolve artesãs de seda da

comunidade, com apoio da EMATER-PR (Empresa de Assistência Técnica e

Extensão Rural). Este faz uso de tecnologia social, que hoje é uma cooperativa, a

Artisans Brasil – Seda Justa – COPRASEDA (Cooperativa dos Produtores Rurais de

Artesanato em Seda). A finalidade é proporcionar mais uma alternativa de renda as

famílias sericicolas através do aproveitamento dos fios do bicho-da-seda para

confecção de cachecóis e echarpes que serão vendidos no exterior (BONILHA;

SACHUK, 2011; MONTIPÓ, 2011).

Assim, a sericicultura apresenta algumas vantagens, diante de outras

culturas, pois permite que famílias de sericicultores recebam renda quase que

mensal, podendo atingir 65% da renda total, durante grande parte do ano (KURIN,

2002). Esta característica é bastante importante, pois as mantêm no seu local de

origem, ou seja, no meio rural, diminuindo assim o contingente urbano, de forma a

promover uma melhoria social e econômica para o país (PANUCCI-FILHO; CHIAU;

PACHECO, 2011).

Outros fatores relevantes e favoráveis aos produtores são: as pequenas

extensões de terras utilizadas na plantação da amoreira, para alimentação de B.

mori; a possibilidade de se desenvolver, de forma paralela, outras culturas; o baixo

18

custo de insumos; giro rápido do capital empregado; e a produção em sistema de

parceria, entre o dono da propriedade e o arrendatário (TAKAHASHI, R;

TAKAHASHI, K; TAKAHASHI, L, 2001). Entretanto, o estudo de Tsukamoto (2009)

apresenta algumas limitações e problemas da sericicultura, quando se refere às

condições do trabalhador sericícola. A criação do inseto no 5º instar larval é mais

intensa, no qual, o sericicultor acaba centralizando maior atenção as lagartas,

ocupando cerca de 14 horas de trabalho diário. Isto pode ocasionar doenças

ocupacionais. Outra limitação importante é a impossibilidade de uso de tecnologia

no decorrer de todo o processo produtivo, uma vez que o inseto é muito sensível e

delicado a qualquer manipulação inadequada, podendo comprometer toda produção

de casulos (PANUCCI-FILHO; CHIAU; PACHECO, 2011).

Além disso, esta atividade é influenciada por vários outros fatores, muitas

vezes por variáveis não controláveis e imprevisíveis, tais como, condições

climáticas, cotação do dólar (PANUCCI-FILHO; CHIAU; PACHECO, 2011) e

principalmente por uma série de doenças em B. mori, desencadeadas por

microorganismos patogênicos, como protozoários, bactérias, fungos e vírus. Estas

podem levar a um potencial risco, com prejuízos aos criadores. Estes patógenos são

capazes de infectar o inseto em todos os estágios do seu ciclo de vida (DOURADO

et al., 2011). Em destaque, as doenças de etiologia viral podem ser responsáveis

por mais de 70% das perdas nos barracões de criação, representando um sério

problema para a sericicultura mundial (POTRICH et al., 2007).

Vários estudos moleculares e genéticos com B. mori estão sendo

desenvolvidos, buscando raças puras e híbridos mais resistentes ou tolerantes a

patógenos, como o vírus entomopatogênico, BmMNPV (DAIMON; KATSUMA;

SHIMADA, 2007). Para maior qualidade de seda e aumento na produção, a mistura

de características genéticas de raças japonesas e chinesas vem sendo bastante

utilizada, visto que as raças japonesas apresentam alto teor de seda no casulo, e as

raças chinesas apresentam uma maior resistência ao cultivo no campo (SEAB,

2009).

19

2.2 BACULOVÍRUS

A família Baculoviridae é composta por vírus que infectam mais de 700

espécies de artrópodes, os quais pertencem às ordens Lepidoptera, Himenoptera,

Diptera, Coleoptera, Orthoptera, Neuroptera, Siphonaptera, Trichoptera, bem como

aracnídeos e crustáceos. Por mais que a diversidade das ordens vulneráveis a

infecção seja grande, a maioria dos vírus conhecidos foi isolada de organismos da

ordem Lepidoptera (CASTRO et al., 1999; WANG et al., 2008).

Taxonomicamente os baculovírus eram divididos em dois gêneros, NPV e

granulovirus (GV) (ROHRMANN, 2008); entretanto, Jehle et al. (2006) propuseram

uma nova classificação para a família Baculoviridae, baseada primeiramente na

morfologia do corpo de oclusão e na análise filogenética comparativa de 29

genomas de baculovírus, dividindo-as em quatro gêneros: AlphaBV,

Betabaculovirus, Gammabaculovirus e Deltabaculovirus. AlphaBV compreende os

NPVs específicos de lepidópteros, com 25 espécies; Betabaculovirus compreendem

os GVs de lepidópteros, com 14 espécies; Gammabaculovirus comporta os SNPVs

de himenópteros, com duas espécies, e os Deltabaculovirus os NVPs de dípteros,

com apenas uma espécie.

Figura 1: Árvore filogenética dos quatro gêneros da Família Baculoviridae, baseada no alinhamento de 29 genes comuns identificados em 29 genomas de baculovírus sequenciados (Jehle, 2006).

20

As características de especificidade e a proteção dos vírions do AlphaBV em

cristais protéicos (poliedros), possibilitam seu uso como agente no controle

biológico; além de ser um excelente vetor na expressão de proteínas heterólogas,

destinado a pesquisa básica, biotecnológica e a medicina e, ainda, como vetores de

terapia gênica (CORDEIRO et al., 2008; DOURADO et al., 2011; RATY et al., 2008).

AlphaBV é constituído por DNA circular de dupla fita, super enovelado, com tamanho

entre 80-180 kb e um genoma entre 80 a 200 Kbp. O DNA se associa com proteínas

do capsídeo, constituindo os nucleocapsídeos, que são envoltos por um envelope

membranoso, que tem origem a partir da presença de microvesículas oriundas da

membrana nuclear interna, formando o nucleocapsídeo envelopado ou vírion. Um ou

vários nucleocapsídeos envelopados podem se agrupar em um corpo de oclusão

protéico ou poliedro, cujo tamanho varia de 0,6 a 2 µm (ROHRMANN, 2011). Sua

principal proteína, a poliedrina, com massa molecular em torno de 30 kDa,

corresponde a 95% do seu conteúdo protéico (MARUNIAK, 1986). O poliedro atua

na proteção dos vírions, contra as condições adversas do meio ambiente e contra

proteólise no final do estágio infeccioso e, ainda, serve como uma espécie de

veículo de sobrevivência do vírus no meio externo promovendo a disseminação da

doença a outros insetos (BRANCALHAO; TORQUATO; CASTRO, 2002; HU et al.,

1999; LIANG et al., 2013).

Baseando-se em estudos filogenéticos de baculovírus, utilizando o gene da

poliedrina, os NPVs foram classificados em grupo I e grupo II (ZANOTTO;

KESSING; MARUNIAK, 1993). E os grupos diferem na presença ou ausência de um

gene, no qual, o grupo I possui a proteína de fusão GP64 e o grupo II a proteína F

(ROHRMANN, 2008).

AlphaBV pode conter apenas um nucleocapsídeo por envelope, sendo

denominado single nucleopolyhedrovirus – SNPV, ou vários, denominado multiple

nucleopolyhedrovirus – MNPV (ROHRMANN, 2011). Hu et al. (1999), Rohrmann

(2011) e Washburn et al. (2003) colocam que a base genética para o entendimento

do envelopamento de um ou mais nucleocapsídeos ainda é desconhecida. De

acordo com literatura MNPV são mais virulentos que os SNPV e verifica-se a

existência de variabilidade genética para NPVs da mesma espécie, mas de

localização geográfica diferente, o que pode afetar sua virulência (ADAMS;

McCLINTOCK, 1991; FAN et al., 2007; HONG et al., 2000).

21

Uma das principais características dos AlphaBV é seu ciclo infeccioso, que

apresenta 2 formas virais fenotipicamente distintas nos aspectos morfológicos,

composição protéica, origem dos envelopes virais, forma de penetração na célula

hospedeira e infectividade; mas genotipicamente idênticas: a occlusion derived virus

(ODV), ou vírus derivado do poliedro; e a budded vírus (BV) ou vírus broto

(OLIVEIRA, 2010).

Nos occlusion bodies (OB) um ou vários vírions estão imersos em uma matriz

protéica cristalina, que livres constituem os ODV. Estes vírions ocluídos são

responsáveis pela transmissão horizontal da doença, de inseto para inseto, e atuam

na infecção primária das células do epitélio do intestino médio. Os BV compreendem

vírions com um envelope lipoprotéico e que não se encontram ocluídos,

estabelecendo a infecção sistêmica ou secundária, ou seja, transmissão célula-a-

célula (ROHRMANN, 2011; SATADAL et al., 2012; VOLKMAN et al., 1995).

Figura 2: Ilustração das partículas virais dos AlphaBv. Os OB ocluídos numa matriz cristalina, que quando livres constituem os ODVs, responsáveis pela transmissão horizontal e infecção das células intestinais do médio. E os BVs, não se apresentam ocluídos e são responsáveis pela infecção célula-a-célula. Fonte: http://www.google.com.br/imgres?imgurl=http://wpcontent.answcdn.com/wikipedia/en/thumb/c/c1/Nucleopolyhedrovirus.jpg/428px-Nucleopolyhedrovirus.jpg&imgrefurl=http://www.answers.com/topic/baculovirus&usg=__oHFN1WfCjL7tODqLKxbgLXelHWk=&h=321&w=428&sz=41&hl=pt-BR&start=11&zoom=1&tbnid=3PtSpefOjJXkBM:&tbnh=94&tbnw=126&ei=BJ9ZUvGoIpHGkQexw4H4Aw&itbs=1&sa=X&ved=0CEEQrQMwCg

22

O ciclo infeccioso dos AlphaBV tem sido estudado em inúmeros insetos

(ADAMS; McCLINTOCK, 1991), como B. mori. Os primeiros dados relatados sobre

infecções causadas por baculovírus foram datadas no século XVI, quando criadores

do bicho-da-seda relataram a liquefação de suas lagartas (ARIF, 2005). Com o

advento do microscópio de luz, por volta do século XIX, corpos refráteis foram

identificados em amostras de lagartas doentes, mas a natureza e o significado

destes corpos só foram compreendidos no início do século 20.

Por volta de 1907, Von Prowazek, identificou partículas dentro dos poliedros,

mas foi em 1939 que Gratia, durante a dissolução dos poliedros em pH alcalino,

sugeriu que estas partículas poderiam ser os agentes de infecção. Com o

surgimento da microscopia eletrônica, no ano de 1947, foi possível através do

isolamento das partículas virais, identificá-las como o agente causador da liquefação

das lagartas do bicho-da-seda (STEINHAUS; RICHARDS, 1963).

No Brasil, estado do Paraná, foi identificado um isolado geográfico do NPV

infectando lagartas de B. mori e pertencente ao tipo múltiplo, o BmMNPV, que

desenvolve a doença poliedrose nuclear (BRANCALHÃO; TORQUATO; CASTRO,

2002).

O ciclo infeccioso do BmMNPV em B. mori inicia quando o inseto se alimenta

de folhas de amoreira (Morus alba) contaminadas com o vírus. Os nucleocapsídeos

envelopados (vírions), presentes na matriz cristalina dos OB, são liberados quando

submetidos ao pH alcalino do intestino médio (pH 9,5 a 11,5) e proteínas do suco

digestivo, como a serina protease e a vermelho fluorescente, que digerem a

poliedrina e liberam os ODVs no lúmen intestinal (HORTON; BURAND, 1993; LIANG

et al., 2013). Estes atravessam a matriz peritrófica, produzida ao longo do intestino

médio, e penetram nas células epiteliais colunares, via fusão de membranas,

promovendo a infecção primária. Os ODVs podem, através de filamentos de actina,

atravessarem os poros nucleares e se instalarem no núcleo, para reprodução. Neste

momento, genes virais são expressos e com a replicação do DNA, novas progênies

virais são montadas e liberadas, na forma de BV, na região basolateral da célula. Os

BV alcançam, desta forma, a hemolinfa e sistema traqueal e dispersam a infecção

no corpo do inseto, estabelecendo a infecção secundária (ADAMS; McCLINTOCK,

1991; BRANCALHÃO; TORQUATO; CASTRO, 2002; LIMA, 2013).

23

A infecção em B. mori pelo BmMNPV, despertou interesse da comunidade

científica em investigar os tecidos alvos, bem como suas alterações citopatológicas.

Assim, se revelaram susceptíveis o tegumento (BRANCALHÃO; RIBEIRO, 2003), o

tecido gorduroso (BRANCALHÃO; SOUZA; SOARES, 2002), a região média e

posterior da glândula da seda (BRANCALHÃO; TORQUATO; FERNANDEZ, 2009),

o reprodutor masculino (PEREIRA et al., 2008), a cárdia (RIBEIRO et al., 2009), o

tecido nervoso (TORQUATO; MIRANDA-NETO; BRANCALHÃO, 2006) e as células

do canal anal VESSARO-SILVA et al. (no prelo).

Figura 3: Ciclo infeccioso do Alphabaculovirus. Em A, folhas de amoreira contendo poliedros. Em B, lagarta ingerindo folhas de amoreira contaminadas pelo vírus. Em C, D e E, o poliedro é dissolvido pela ação do Ph alcalino e de enzimas do suco digestivo no intestino médio, liberando assim, os ODV que atingem as células colunares e promovem a infecção primária. Em seguida, os vírions se replicam no núcleo das células e brotam na forma de BV, atingindo a hemolinfa e a traqueia infectando outras células alvos, caracterizando a infecção secundária. Após, em F, G e H, os BVs se ocluem novamente no corpo de oclusão, o qual são liberados no ambiente, tonarndo-se fonte de infecção para outras lagartas (Rychlowska et al., 2011).

A B C D

24

A citopatologia revelou o surgimento de uma estrutura eletrodensa na área

central do núcleo, o viroplasma ou estroma virogênico. Este é o local onde são

produzidos os nucleocapsídeos, constituídos pelo DNA viral e proteínas do

capsídeo. Posteriormente, eles são envoltos por um envoltório membranoso,

originado possivelmente de microvesículas oriundas da membrana nuclear interna,

constituindo os nucleocapsídeos envelopados ou vírions. No citoplasma celular

inicia-se a produção de poliedrina e P10, aquela se acumula no núcleo, na região

entre o viroplasma e o envoltório nuclear. Os vírions se agrupam concentricamente

ao redor da poliedrina, originando os poliedros virais. Estes são liberados da célula,

através de citólise, graças a ação da proteína viral P10. Assim, os poliedros são

liberados no meio extracelular, alcançando a hemocele e o lúmen intestinal (HONG

et al., 2000; LIANG et al., 2013; ROHRMANN, 2011).

No tecido gorduroso de B. mori, que atua na síntese de proteínas e

armazenamento de metabólitos, os primeiros indícios de infecção aparecem no 4°

dia pós inoculação (dpi) e a lise dos adipócitos ocasiona um aumento do conteúdo

de fosfolipídios, colesterol e ácidos graxos livres na hemolinfa. Isto, somado à

presença dos poliedros na hemocele, fazem com que a hemolinfa se apresente

leitosa; como consequência, o tegumento tem um aspecto branco-amarelado, sinal

característico da infecção por BmMNPV. Sintomas e sinais da infecção pelo vírus

envolvem, além da mudança na coloração do tegumento, a diminuição da

alimentação, inchaço das membranas intersegmentais, comportamento alterado,

busca de lugares mais altos, deslocamento aleatório, rastro líquido leitoso,

fragilidade e ruptura do tegumento, atraso no encasulamento e produção de casulos

defeituosos (BRANCALHÃO; SOUZA; SOARES, 2002).

Na glândula da seda foi constatado a infecção pelo BmMNPV no 4° dpi,

Figura 4: Fotomicrografica de tecidos alvos do BmMNPV de B. mori em coloração de Azan modificado para corpos de oclusão poliédricos. Em A, células do tegumento. Em B, tecido gorduroso. Em C, região média e posterior da glândula da seda. Em D, reprodutor masculino. Em E, células da cárdia. Em F, tecido nervoso. E, em G, células do canal anal.

E F G

25

apenas nas regiões média e posterior, sendo que a anterior não infecta. As áreas de

infecção se apresentavam próximas às inserções da traquéia, que atravessa a

lâmina basal, considerada uma barreira, e facilita a penetração dos BV. Isto

demonstra o papel da traquéia na dispersão do patógeno. Esta inserção da traquéia

não é visualizada na região anterior do órgão (BRANCALHÃO; TORQUATO;

FERNANDEZ, 2009).

No tegumento, Brancalhão e Ribeiro (2003), mostraram sua infecção no 5° dpi

e ao final do ciclo infeccioso o órgão sofre rupturas, ocasionadas pela ação das

enzimas quitinase e catepsina (codificadas pelo genoma viral), isto proporciona o

extravasamento da hemolinfa leitosa, rica em poliedros virais e restos de células

lisadas, que ao alcançarem o meio ambiente, promovem a dispersão viral no

barracão de criação.

Torquato, Miranda-Neto, Brancalhão (2006) analisaram a infecção pelo

BmMNPV no sistema nervoso central, que ocorre a partir do 5° dpi. Os autores não

verificaram a lise das células nervosas infectadas; contudo, poliedros maduros foram

evidenciados em espaços nos gânglios e conectivos nervosos. Estes são

provenientes, possivelmente, das traquéias, que penetram no sistema e são alvos

conhecidos do vírus e sofrem lise.

Ainda, VESSARO-SILVA et al. (no prelo) verificaram um comportamento

diferenciado das regiões do reto na infecção experimental com BmMNPV. Assim,

poliedros foram observados em células do canal anal no 5° dpi, já na região anterior

do órgão, o epitélio criptonéfrico não se apresentou susceptível. Entretanto, mesmo

não sendo alvo, a infecção de tecidos circunvizinhos, como traquéia e gorduroso,

ocasiona desorganização tecidual, promovendo um acúmulo de poliedros no espaço

perinéfrico. Este espaço é importante no equilíbrio hidroeletrolítico e o sistema como

um todo atua na reciclagem de água e, uma vez infectado, sua reciclagem é

prejudicada e o inseto produz pellets fecais hidratados, com aspecto pastoso.

Dourado et al. (2011) analisaram a glândula salivar e não verificaram infecção

nas suas células epitéliais. Os autores colocam que a distribuição das traquéias

apenas na periferia do órgão, possa ser um fator determinante da não infecção, já

que os BV não teriam acesso ao tecido, que se apresenta envolto pela lâmina basal.

Adams e McClintock (1991) acreditam que a ausência de infecção em certos tipos

de células pode ser causada pela expressão diferencial de genes virais, inseridos no

genoma da célula hospedeira, uma vez que o BmMNPV apresenta replicação

26

assincrônica. Rohrmann (2011), em cultura de células de inseto, coloca que a

proteína Beta-N-acetylglucosaminidase-2 pode atuar na resistência, por alterar a

ligação de glicanos à proteína de fusão do envelope viral, a GP64, reduzindo a

capacidade infectiva dos BV.

Assim, a literatura específica revela que há diversos tecidos de B. mori alvos

do BmMNPV, cuja infecção promove um desequilíbrio metabólico no inseto,

resultando em comprometimento na produção de casulos de qualidade.

2.3 Bombyx mori

Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae), popular bicho-da-seda da amoreira,

foi domesticado na China, provavelmente a partir da linhagem selvagem B.

mandarina. Vários são os insetos produtores de seda no mundo, mas apenas sete

espécies são criadas para fins comerciais, entre elas: Antheraea yamamai Guerin,

Antheraea pernyi Guerin, Antheraea mylitta Drury, Antheraea assama Helfer, Atlacus

ricini Boisduval e Philosamia cynthia Drury, incluindo B. mori, que contribui com 95%

da produção total de seda comercial (DINGLE et al., 2005).

B. mori é assim um inseto de grande relevância econômica ao homem e,

também, considerado um organismo modelo em estudos científicos nas áreas de

entomologia, biotecnologia, biologia molecular, microbiologia, fisiologia e genética.

Um exemplo é sua utilização como biorreator para produção de biomoléculas

clinicamente importantes (FENG et al., 2012; QIN et al., 2012; STAYKOVA et al.,

2012).

Outro exemplo é sua utilização em pesquisa biomédica, na qual estudos

revelam que a proteína friboína, que constitui 65% da seda, apresenta propriedades

importantes em processar e minimizar a reação inflamatória, sendo muito utilizado

em cultura de células, em curativos, na administração de medicamentos, em

imobilização de enzimas e também como estrutura para engenharia de tecido ósseo

(KIM et al., 2011; LI et al., 2010; WANG; RAJKHOWA; TSUZUKI, 2010).

Cao, Wang, Zhang (2013) relatam que a proteína sericina, apresenta

propriedades de biocompatibilidade e também vem sendo muito utilizada em cultura

de células. Contudo, ainda destacam seu importante papel na composição de

cosméticos, para cuidado da pele e dos cabelos, por apresentar peptídeos

27

hidrolisados. A sericina ainda possui propriedades antioxidante e anticoagulante,

que previnem o câncer de pele; bem como resistência a radiação ultra-violeta,

absorvendo e liberando a umidade facilmente.

B. mori vem ganhando forte destaque em estudos de combate a obesidade

cujas proteínas presentes na seda, especialmente a fibroina e sericina podem

promover inibição de adipogêneses, causar bloqueio de expressão de genes

específicos nos adipócitos e ainda provocar efeito no aumento da expressão gênica

em células de osteoblastos (JUNG et al., 2011; QIN et al., 2012).

Concomitantemente, estudos de Seo et al. (2011) comprovaram que as proteínas da

seda, especialmente a sericina, melhoraram o metabolismo lipídico, por aumentar a

oxidação e a supressão da lipogênese do fígado e adipócitos. Esta ação promoveu

redução da gordura corporal, colesterol, triglicérideos e o aumento de peso. Estes

fatores têm levado os autores a acreditarem que as proteínas da seda, podem ser

utilizadas como um biomaterial no desenvolvimento de alimentos funcionais ou

agentes terapêuticos contra a obesidade e suas doenças associadas.

B. mori apresenta quatro estágios de desenvolvimento distintos, durante seu

ciclo de vida: ovo, lagarta, pupa ou crisálida e adulto ou mariposa. Durante a sua

fase larval se alimenta exclusivamente de folhas de amoreira (Morus sp.), passando

por quatro ecdises ou mudas de exoesqueleto e por cinco ínstares ou estádios

larvais, que duram entre 20 a 24 dias. No final do 5° instar, o inseto cessa a

alimentação e começa a tecer o casulo, onde no seu interior sofre metamorfose se

transformando em pupa ou crisálida, entre 10 a 12 dias, emergindo como inseto

adulto ou mariposa, em aproximadamente 3 a 6 dias (FONSECA; FONSECA, 1986;

PANUCCI-FILHO; CHIAU; PACHECO, 2011). Nesta fase adulta o inseto não se

alimenta, vivendo de nutrientes acumulados nas fases anteriores do ciclo,

dedicando-se apenas a reprodução em virtude do excelente desenvolvimento dos

seus órgãos reprodutores, finalizando a metamorfose em 30 a 48 dias (FONSECA;

FONSECA, 1986).

28

Estes insetos apresentam como principal característica a capacidade de

síntese de proteína da seda, trabalho desenvolvido por um par de glândulas

sericígenas. Essas glândulas secretam, de forma líquida, a fibroína, a sericina e a

p25. Estas, ao entrarem em contato com o ar, se solidificam formando um fio longo e

único com aproximadamente 1.000 a 1.500 metros, usado para construir o casulo

(MONDAL; TRIVEDY; KUMAR, 2007). Este possui alto valor comercial e

características únicas, conforme colocado anteriormente, sendo o fio de seda

adequado a todos os climas, pois é considerado mau condutor de calor e, quando

misturado com outros fios produz tecidos mais resistentes que as fibras sintéticas de

nylon e poliéster (FERNANDEZ et al., 2005).

B. mori, de acordo com a sua origem geográfica, pode ser classificado como

Japonês, Indiano, Europeu ou Chinês, com características morfológicas e

fisiológicas distintas de acordo com esta origem, o que, inclusive, pode afetar o

rendimento de seda. Desse modo, raças de procedências diferentes vêm sendo

utilizadas em cruzamentos para seleção de caracteres favoráveis a sericicultura,

como maior produção, qualidade de seda e menos perdas em virtude de doenças

por patógenos (DAIMON; KATSUMA; SHIMADA, 2007; PORTO et al., 2004).

Figura 5: Ciclo reprodutivo de B. mori. Disponível em: http://www.suekayton.com/Silkworms/images/Manyee/Sillkworm%20life%20cycle.jpg. Acesso em: 15/08/2013.

29

Pesquisas nesta área iniciaram antes de 1900 com o suporte da indústria da

seda. Em 1930, várias pesquisas na área da genética já haviam sido reportadas,

reconhecendo mais de 400 mutações que afetam diretamente o inseto (NAGARAJU;

GOLDSMITH, 2002). Após 12 anos de trabalho, no ano de 2000, equipes francesas

e grupos japoneses e americanos, conseguiram o transgênico do bicho-da-seda,

após a transformação com um vetor contendo o transposon piggyBac. Importante

por inserir genes exógenos no patrimônio genético do inseto, genes esses, úteis

para a produção de seda e também para a indústria farmacêutica, na síntese de

substâncias protéicas e como fonte de biomateriais (TAMURA et al., 2000).

No ano de 2002 foi criado o primeiro consórcio genômico internacional, com o

intuito de promover a cooperação no seqüenciamento de B. mori e outros

lepidópteros de interesse econômico. E, em 2004, foram publicados os primeiros

rascunhos das sequências genômicas do bicho-da-seda, abrangendo mais de 90%

dos genes conhecidos deste inseto (FERNANDEZ et al., 2005; MITA et al., 2004).

Apesar de existirem vários estudos envolvendo o bicho-da-seda e sua base

genética, ainda existem muitos genótipos que não se tem informação disponível, por

haver pouco investimentos nestes processos, limitando assim, o uso dos mesmos na

produção de raças puras e híbridos comerciais, cuja finalidade é melhorar a

qualidade e produtividade da seda, e também aumentar sua resistência a doenças

(CARVALHO et al., 2008; FERNANDEZ et al., 2005).

Com o aumento de estudos na área de biotecnologia foi possível a partir da

obtenção de raças puras, realizar cruzamentos resultando em insetos híbridos

capazes de produzir casulos com alto percentual de seda, adaptação a diferentes

regiões geográficas e resistência a patógenos (FERNANDEZ et al., 2005).

Estudos têm sido conduzidos com o objetivo de avaliar a eficiência de

diversos produtos, de forma a ampliar as opções para controle de doenças na

sericicultura. Novas alternativas vêm sendo descobertas e testadas, destacando os

extratos vegetais, que apresentam inibidores naturais para determinados

microrganismos. O estudo de Porto et al. (2005) demonstrou a eficiente ação da

pulverização de folhas de amoreira por extrato de Mirabilis jalapa, planta que

apresenta uma proteína, com potente ação antiviral, não sendo observado alteração

na biologia e produção de casulos pelo bicho-da-seda.

2.4 SISTEMA DIGESTÓRIO

30

O trato digestório de larvas de B. mori é caracterizado como um tubo longo,

cilíndrico e muscular. Este anatomicamente é dividido em intestinos anterior, médio

e posterior (BARBEHENN; KRISTENSEN, 2003; CHAPMAN, 1998; CHI et al., 1975;

GALLO et al., 2002; GILLOT, 1995; JUDY; GILBERT, 1969 e 1970; LEVY et al.,

2004 e 2008; MARANHÃO, 1972; MACGOWN; SIKOROWSKI, 1982; WOKE, 1941),

e suas transições,a cárdia (RIBEIRO et al., 2009) e o anel intersticial posterior

(JUDY; GILBERT, 1969 e 1970; LEVY, et al., 2004). Estas regiões de forma geral

são formadas por uma camada de células que assenta sobre uma lâmina basal e

uma face luminal revestida por uma estrutura a qual é sintetizada e secretada pelo

próprio epitélio (SNODGRASS; EICKWORT, 1993). Funcionalmente é responsável

pelo transporte, absorção e digestão do alimento ao longo do lúmen e controle dos

níveis de água e sais (CHAPMAN, 1998).

O intestino anterior ou estomodeu é a primeira região do trato digestivo, de

origem ectodérmica. Apresenta um epitélio com células laminares, sob uma lâmina

basal, que é envolto por uma parede muscular com camadas de músculos circulares

e longitudinais, respectivamente. Na sua fase luminal é revestido por uma cutícula

mais espessa, denominada de íntima que sua função está relacionada com a

proteção mecânica das células epiteliais adjacentes (CHAPMAN, 1998;

SNODGRASS; EICKWORT, 1993). Na região de transição ocorre uma

especialização do epitélio, a cárdia, presente na base da válvula cardíaca ou

estomodeal. Seu epitélio é simples envolvido pela íntima com espessura reduzida, e

aproximadamente catorze células cúbicas, com núcleos centrais, apoiados sobre

uma lâmina basal. Esta transição atua na regulagem da passagem do alimento do

anterior ao médio (RIBEIRO et al., 2009; SNODGRASS; EICKWORT, 1993).

Figura 6: Canal alimentar de B. mori. Intestino anterior (IA), intestino médio (IM) e intestino

posterior (IP).

31

A maior região do trato digestório é compreendida pelo intestino médio

(CHAPMAN, 1998), de origem endodérmica, com formato cilíndrico e retilíneo,

devido ao hábito alimentar dos lepidópteros (GILLOTT, 1995). É responsável pelos

principais eventos de digestão e absorção, além de atuar como barreira contra a

invasão de microrganismos patogênicos (LEHANE; BILLINGSLEY, 1996). Seu

epitélio é caracterizado pela presença de 4 tipos celulares: as colunares, são as

mais abundantes, e atuam na secreção de enzimas digestivas, bem como, na

absorção de nutrientes; as caliciformes, estão distribuídas entre as colunares e são

responsáveis pela homeostase iônica e absorção de metabólitos (CHIANG; YEN;

PENG, 1986; LEHANE; BILLINGSLEY, 1996); as regenerativas são indiferenciadas,

e atuam na renovação do epitélio, substituindo as células que se desgastam, além

de garantir o crescimento do canal alimentar a cada ecdise (BRANCALHÃO, 1998;

CHAPMAN, 1998); e por último as endócrinas, que regulam a síntese e secreção de

enzimas (CHAPMAN, 1998).

Na sua face luminal, o intestino médio secreta um delicado envelope

peritrófico que envolve o alimento, a matriz peritrófica. Quimicamente, esta estrutura

é constituída por quitina, proteínas, glicoproteínas e proteoglicanas (LEHANE, 1997),

e pequenas quantidades de hexosamina, glicose e ácido urônico (PETERS, 1992),

sendo responsável pela proteção do epitélio contra efeitos abrasivos do alimento e

enzimas digestivas, além de servir como uma barreira física contra patógenos

(CHAPMAN, 1998; HEGEDUS et al., 2009).

O intestino posterior, de origem ectodérmica é considerado como a região de

maior complexidade e poucas são as informações morfológicas disponíveis. É

formado por piloro, íleo, cólon e reto (BARBEHENN; KRISTENSEN, 2003; CHI et al.,

1975; EATON, 1939; JUDY; GILBERT, 1969 e 1970; LEVY et al. 2004 e 2008;

REINECKE; COOK; ADAMS, 1973), e atua na absorção de água e sais minerais,

formando e eliminando as fezes (CHAPMAN, 1998). O epitélio é simples com

bastante variação morfológica e envolvido em sua face luminal, pela íntima. O íleo

geralmente é formado por apenas um tipo celular com dobras na membrana apical e

muitas mitocôndrias. O reto se apresenta como um saco alargado, com células

colunares e uma cutícula mais fina que o restante da estrutura. As extremidades

distais dos túbulos de Malpighi atravessam as paredes do reto constituindo o

sistema critptonefridial, que é típico de Lepidoptera (CHAPMAN, 1998; LEVY et al.,

2004 e 2008).

32

O piloro, objeto de estudo, é anatomicamente dividido em três segmentos:

anel intersticial posterior (AIP) que marca a transição com o médio (JUDY;

GILBERT, 1969; LEVY et al., 2004), o cone pilórico (CP) e a válvula pilórica (VP)

como em Amathes c-nigrum e Pseudaletia unipuncta (Lep.), e em Manduca sexta

(Lep.) (BYERS; BOND, 1971; REINECKE; COOK; ADAMS, 1973). Como em outros

lepidópteras, os túbulos de Malpighi (TM) se inserem na VP (BARBEHENN;

KRISTENSEN, 2003; BYERS; BOND, 1971; JUDY; GILBERT, 1969 e 1970; LEVY et

al., 2004 e 2008; REINECKE; COOK; ADAMS, 1973; WOKE 1941).

Levy et al. (2004) e (2008) estudando Anticarsia gemmatalis (Lep.) colocam

sobre a complexidade desta região e a dividem em AIP, que marca a transição com

o médio, e piloro, propriamente dito, o qual apresenta duas áreas, a anterior e a

posterior. Na área anterior o epitélio é pavimentoso simples, envolvido por uma

camada quitinosa, a ìntima. Na posterior o epitélio é irregular com células cubóides,

recobertas por uma ìntima com espículas. Essa região apresenta uma musculatura

espessa, constituída por duas camadas, uma circular interna e uma longitudinal

externa com funções similares, caracterizando a VP.

Barberend e Kristensen (2003) estudando lepidópteras colocam a presença

do piloro e da VP compondo esta região de transição com o médio, não

mencionando o AIP e o CP.

Da mesma forma que os estudo de Levy et al. (2004) e (2008), Judy e Gilbert

(1969) e (1970) estudando Hyalophora cecropia (Lep.), subdividem esta região de

transição em anel e piloro, considerando anel como a transição entre o médio e o

Figura 7: Montagem de fotomicrografia em coloração Hematoxilina e eosina contendo o intestino

posterior de B. mori com suas respectivas subdivisões: piloro, íleo, colon e reto.

33

posterior, em continuidade ocorre o piloro, dividido em área anterior, com uma íntima

lisa, e posterior, com a VP,e ainda presença de ìntima espiculada que atua como um

esfíncter.

Woke (1941), estudando Southern armyworm (Lep.) e Snodgass e Eickort

(1993) estudando insetos em geral colocam que o piloro é a região de transição, do

médio e o posterior, sendo subdividido em parte anterior, em forma de cálix ou cone,

e parte posterior, mais comprimida. Menciona, ainda que a VP se encontra entre o

piloro e o íleo.

No que concerne a localização anatômica dos segmentos do piloro Chi et al.

(1975) colocam, em estudo com Heliothis Virescens e zea (Lep.), a presença do AIP,

na transição com o médio, com tipos celulares diversos e íntima, segue a câmara

pilórica, formada por epitélio simples, e o piloro, dividido em anterior, médio e

posterior com características celulares, ìntima e músculos bem diferenciados.

Macgown e Sikorowski (1982) em Heliothis zea (Lep.) subdividem o piloro em

AIP, CP e VP. O AIP é caracterizado pela presença de três dobras com função de

separar o médio do posterior. Já o CP é um esfíncter anterior e, posteriormente,

ocorre a VP, próxima ao íleo. Para Eaton (1939), em lepidópteros, a transição é

subdividida em piloro, região anterior do IP, CP, local de inserção dos TM e VP, que

se abre no íleo.

Em estudo morfológico de insetos em geral, realizado por Maranhão (1972), o

piloro compreende a VP, a qual é responsável pela passagem do alimento do médio

para o posterior. Com isso, verifica-se que a morfologia do piloro apresenta

particularidades em relação ao inseto estudado e dúvidas ainda persistem sobre sua

organização.

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http://ac.els-cdn.com/S0022201183710906/1-s2.0-S0022201183710906-main.pdf?_tid=79ce459c-0537-11e3-8e7e-00000aab0f01&acdnat=1376522337_5c7b09b07aaccb588cb86f6aae7e21dc



47

ARTIGO CIENTÍFICO 1

MORPHOLOGY OF THE PYLORUS OF Bombyx mori (LINNAEUS)

(LEPIDOPTERA: BOMBYCIDAE)

48

COMPROVANTE DE ENCAMINHAMENTO DO ARTIGO

From: Neotropical Entomology<[email protected]> Date: 2013/7/25 Subject: Submission Confirmation To: Rose Meire Costa Brancalhao <[email protected]> Dear Rose, Thank you for submitting your manuscript, "Morphology of the pylorus of Bombyx mori (Linnaeus) (Lepidoptera: Bombycidae)", to Neotropical Entomology During the review process, you can keep track of the status of your manuscript by accessing the following web site: http://nent.edmgr.com/ Your username is: rose Your password is: brancalhao437433 Springer offers authors the option of making their articles available with open access via our Open Choice programme. We advise you to familiarise yourself with the details of Springer Open Choice in advance, to be able to decide quickly should your paper be accepted for publication. Further information can be found at www.springer.com/openchoice. With kind regards, Journals Editorial Office NENT Springer

mailto:[email protected]


http://nent.edmgr.com/

http://www.springer.com/openchoice

49

Sections: Systematics, Morphology and Physiology

Morphology of the pylorus of Bombyx mori (Linnaeus) (Lepidoptera: Bombycidae)

MPD BAGGIO, SA VESSARO-SILVA, LFC RIBEIRO, RMC BRANCALHÃO

State University of West Paraná (UNIOESTE), Cascavel campus, Paraná, Brazil.

Rose Meire Costa Brancalhão, Center for Biological and Health Sciences, UNIOESTE,

Cascavel campus, Rua Universitária, 2069. Bairro: Jardim Universitário Cascavel, Paraná,

Brazil, 85819-110, Phone:(045)3220-3237, Fax:(045)3324-4590; [email protected]

Running title: Silkworm pylorus morphology

Abstract The pylorus is a segment of the hindgut of great morphological diversity that is subdivided

into the posterior interstitial ring, pyloric cone and pyloric valve. There is little morphological

information about Bombyx mori (Linnaeus), which is an insect of scientific and economic

interest. Consequently, this study aimed to analyse the morphology of the pylorus of hybrid

larvae of fifth instar B. mori. These were anesthetised and the pylorus was fixed in Dubosq-

Brasil, and 4% glutaraldehyde and PBS 0.15 M [1:1], pH 7.0, for analysis by light microscopy

and scanning electron microscopy, respectively. As regards the analysis by light microscopy,

the material followed routine histological processing for embedment in paraffin. The slides

were stained by hematoxylin and eosin for general tissue analysis. The pylorus presented as a

separate compartment, consisting of a simple epithelium, with large variation in cell

morphology, covered on the luminal side by an inner chitin with specialisations in some areas,

the spicules. The musculature was formed by bundles of striated muscle fibres in longitudinal

and circular arrangement. These fibres were multinucleated with central and peripherals

nuclei, operating in peristalsis. The morphology of the pylorus is a reflection of functional

dynamism and this study provided a better understanding of its physiology, which promotes

the regulated movement of the bolus, preventing reflux and directing it towards the ileum in

the formation of fecal pellets.

Keywords: insect, hindgut, spicules, posterior interstitial ring, pyloric cone, pyloric valve

Introduction

The digestive tract of Lepidoptera larvae such as Bombyx mori (Linnaeus)

(Lepidoptera: Bombycidade) is a muscular, cylindrical, hollow tube that runs longitudinally

along the body from mouth to the colon. Its structure varies in size and diameter in the

50

different regions that are anatomically identified as foregut, midgut and hindgut. (Chapman

1998, Barbehenn & Kristensen 2003, Levy et al 2004 and 2008).

The foregut is the location of the intake and transport of food into the midgut, where it

is digested and absorbed. The hindgut receives the undigested material, together with urine,

and promotes the absorption of water, mineral salts and other important molecules (Chapman

1998, Gullan & Cranston 2010). Many authors divide the hindgut into the pylorus, ileum,

colon and rectum. (Eaton 1939, Judy & Gilbert 1969 and 1970, Reinecke et al 1973, Chi et al

1975, Barbehenn & Kristensen 2003, Levy et al 2004 and 2008).

Studies have revealed that the lepidopteran pylorus is one of the segments of the

hindgut of greater morphological complexity and it is often subdivided into posterior

interstitial ring (PIR), pyloric cone (PC) and pyloric valve (PV) (Byers & Bond 1971,

Reinecke et al 1973). MacGowan & Sikorowski (1982) state that such complexity is a

reflection of the activities of contraction and relaxation, which may obscure some important

morphological features. Thus, according to the functional state, the pylorus exhibits specific

morphological aspects that explain the differences in nomenclature found in the literature for

its various subdivisions (Eaton 1939, Srivastava 1959, Judy & Gilbert 1969 and 1970,

Maranhão 1972, Chi et al 1975, MacGowan & Sikorowski 1982, Barbehenn & Kristensen

2003, Levy et al 2004 and 2008).

The pylorus regulates the passage of food from the midgut to the ileum, impacting on

the finalisation of the digestive process, especially in the formation of fecal pellets, and thus it

helps in maintaining the metabolic balance of the insect (Judy & Gilbert 1969 and 1970,

Snodgrass & Eickort 1993, Landim 2009). In the case of B. mori, which is a model organism

in scientific and technological studies and recognised for its importance in the silk industry,

we were unable to locate studies of the morphology of the pylorus in the literature.

51

Consequently, this study analysed the morphology of the pylorus of B. mori larvae to

provide a basis for future studies of this important holometabolous.

Materials and Methods

Hybrid larvae of fifth instar B. mori were obtained from a sericulture company in the

state of Paraná, Brazil and bred in polyethylene boxes, being fed twice a day with fresh

mulberry leaves (Morus sp.). The larvae were kept in the breeding environment without

regulation of temperature and humidity, similar to what occurs in the wild, in the laboratory

of cell biology at the State University of West Paraná, Cascavel Campus.

On the fourth day of the fifth instar twenty larvae of the thirty that were in the

breeding box were randomly selected, anesthetized with ether, and then dissected by a ventral

opening from the integument of the thorax to the colon. The intestine was exposed and ten

segments containing the pylorus were collected and fixed in Dubosq-Brasil (Junqueira &

Junqueira 1983), for 24 hours at 4°C for analysis by light microscopy, while the other ten

segments were fixed in a mixture of 4% glutaraldehyde and 0.15M PBS buffer in the ratio

[1:1], pH 7.0, for analysis by scanning electron microscopy.

In the light microscopy process, the intestinal segments were washed with 70%

ethanol three times, for five minutes each, to remove the excess of picric acid fixation.

Subsequently, embedding in paraffin was performed in accordance with Brancalhão et al

(2002). Paraffin blocks were sectioned with an Olympus CUT4055 microtome, cuts of 7

micrometers. The slides thus obtained were stained by hematoxylin and eosin (Beçak &

Paulette 1976) to understand more about the intestinal morphology. All slides were examined

under an Olympus CBA light microscope and photomicrographed using an Olympus BX60

light microscope.

52

The scanning electron microscopy procedure followed the protocol of Scipio et al

(2008), and in this case the intestinal segments were post-fixed in 2% osmium tetroxide and

diluted in PBS buffer in the ratio 1:1, pH 7 0, for 1 hour. Then, the segments were washed in

the same buffer and dehydrated in ascending series of acetone, 30, 50, 70, 80, 90, 95 and

100%, for 10 minutes for each concentration.

Subsequently, the segments were placed on the stub, previously coated with carbon

tape, and taken to the critical point CPD-030 Bal-Tec, positioned in the stub. The plating was

performed on a Shimadzu apparatus for 3 minutes, where the segments were coated with 10

nm of gold dust. The data were analysed in a SS-550-Shimadzu scanning electron

microscope.

Results and Discussion

The morphological analysis of the pylorus of the B. mori larvae demonstrated that the

pylorus is a separate compartment of the hindgut and is linked to the ileum through a

sphincter muscle (Fig. 1a). Three subdivisions were confirmed: the PIR, which marks the

transition between the midgut and hindgut; the PC, to the rear of the PIR; and the PV,

between the PC and the ileum (Figs 1a, 2a). Such subdivisions are similar to those observed in

other Lepidoptera, such as Amathes c-nigrum and Pseudaletia unipuncta (Linnaeus)

(Lepidoptera: Noctuidae) (Byers & Bond 1971) and Manduca sexta (Linnaeus) (Lepidoptera:

Sphingidae) (Reinecke et al 1973) and they functionally act to regulate the passage of food

from the midgut to the hindgut, as will be discussed.

The pylorus consists of a simple epithelial lining, with variation in its cell morphology

and with the luminal face covered by an inner luminal chitin containing specialisations in

some areas - spicules in the form of cuticular expansions. The inner covering of this segment

was similar to that found in foregut, but thinner due to the role of the hindgut in the

53

absorption of water, salts and other molecules of interest (Snodgrass & Eickort 1993, Gillot

1995, Chapman 1998, Rohrmann 2011). Underlying the epithelium, the presence of the

muscle layer was verified, formed by bundles of striated fibres arranged in a circular and

longitudinal form (Fig. 1a). The muscle fibres were multinucleated, with central and

peripheral nuclei (Figs 1e and 1f); according to Byers & Bond (1971), Reinecke et al (1973)

and Levy et al (2004) the muscle acts in peristalsis, promoting the movement of the bolus

along the intestine and the removal of fecal pellets. This segment was also richly aerated by

branches of the tracheal system, with Malpighian tubules, abundant in the PV, where they are

located, and adipose tissue (Fig 1a) (Woke 1941, Judy& Gilbert 1969 and 1970, Byers &

Bond 1971, Reinecke et al 1973, Barbehenn & Kristensen 2003, Levy et al 2004 and 2008).

The PIR showed as a constriction of the intestinal wall, the result of the projection of

epithelial and muscle layers into the lumen. The muscles appeared formed by bundles of

small diameter circular fibers located below the epithelium (Fig. 1b) and longitudinal fibers

coming from the midgut, of external disposition, and extending along the PIR and inserted

into the epithelium of the initial region of the PC (Reinecke et al 1973).

The morphological variation of cells and the intima of the PIR led to the distinction of

two areas, the anterior and posterior. In the anterior, the epithelium was composed of low

cuboidal cells with a spherical nucleus, central, unique, intimate and smooth (Fig. 1b) (Byers

& Bond 1971, MacGowan & Sikorowski 1982, Levy et al 2004). In the posterior, the

epithelial cells were high and cylindrical in the region that protruded into the lumen, with a

gradual decrease in height until the beginning of the PC (Fig. 1c). The intima of this area was

spiculated with a posterior orientation (Figs. 1d, 2b) in the same way as observed in other

Lepidoptera (Judy & Gilbert 1970, Byers & Bond 1971, Reinecke et al, 1973, Chi et al, 1975,

Levy et al 2004). The spicules were presented in a spaced aligned manner, grouped in series,

or forming piles (Figs. 1d, 2b); such variations are reflective of the intense peristalsis altering

54

the length of the PIR so as to regulate the passage of the bolus of the midgut to the hindgut

(Eaton 1939, Judy & Gilbert 1970, Byers & Bond 1971, Snodgrass & Eickort 1993, Landim

2009).

As well as this function, the intima acts as an important protective barrier against the

entry of microorganisms and foreign substances that may be ingested with food (Srivastava

1959, Byers & Bond 1971, Reinecke et al 1973, Chi et al 1975, MacGowan & Sikorowski

1982, Levy et al 2004, Correia et al 2009). It is worth emphasising that the presence of

spicules adds to the function of this acellular structure and according to Byers & Bond (1971)

it assists in slowing the movement of food, resulting from peristaltic waves along the

intestine. This function is important because of the rate of production of the peritrophic

matrix, which is believed to be slower than the passage of food. The peritrophic matrix is a

multifunctional structure that surrounds the bolus (Lehane 1996, Chapman 1998, Bolognesi et

al 2005), and because of the rapid metabolism of the larvae it could cause breaks in its

structure, compromising the completion of digestion, in particular the formation of fecal

pellets, which are enclosed by the peritrophic matrix (Wigglesworth 1965, Peters 1992,

Chapman 1998, Barbehenn & Kristensen 2003).

The operating mechanism functions when the spicules of the posterior region of the

PIR are held in the peritrophic matrix (Fig. 1e) at the moment when this segment is distended

and move it towards the slit located between the PIR and the wall of the PC (Fig. 3a) when

the PIR is in the contracted position. This mechanism prevents the contents of the PC being

forced over the peritrophic matrix so that it returns to the midgut (Byers & Bond 1971). In

addition, Levy et al (2004) have commented regarding Anticarsia gemmatalis (Hübner)

(Lepidoptera: Noctuidae) that the spicules may serve as an anchoring site for symbionts,

which are common in the hindgut.

55

In the PC, the epithelial cells were squamous with numerous nuclei that often

accompany cell morphology (Fig. 3b) (Chi et al 1975). On the apical surface, the intima

showed spicules without specific arrangement and evenly distributed throughout its length in

polygonal arrangement (Fig. 2c). Functionally, as in the PIR, they act in the retention of the

peritrophic matrix (Byers & Bond 1971, Reinecke et al 1973). The musculature of the PC was

mostly organised in circular inner layers and longitudinal outer layers (Reinecke et al 1973)

but in some points it appeared that the circular muscle was surrounded by longitudinal

muscles. The organisation of the musculature showed variation according to the insect (Judy

& Gilbert 1970, Reinecke et al 1973, Chi et al 1975, MacGowan & Sikorowski 1982, Levy et

al 2004).

The presence of a highly muscular tube was observed continuous to the PC - the PV -

whichis organised into two distinct regions: the anterior (also known as the pyloric sphincter)

and the posterior (also known as the posterior pyloric sphincter) (Fig. 2a). Several authors

have noted the presence of PV in Lepidoptera (Judy & Gilbert 1969 and 1970, Mathur 1972,

Reinecke et al 1973, Barbehenn & Kristensen 2003, Levy et al 2004 and 2008), and their

regions were also found by Byers & Bond (1971) and Reinecke et al (1973).

The PV had several layers of circular and longitudinal muscles that were organised in

a complex way and were inserted in some areas of the epithelium (Fig. 3c). The PV, in the

same way as the PIR and PC, showed variable cellular morphology that was squamous and

high cubed, with a large centrally positioned nucleus. The cell limits were defined, as

observed by Srivastava (1959), in Leucinodes Orbonalis (Guenée) (Lepidoptera: Pyraustidae).

This organisation of the PV wall allows it to adapt quickly to the contraction and distension of

the organ, in response to the amount and distribution of fecal material in the lumen (Woke

1941). Thus, the contraction of the PV produces folds in the epithelium, which obstruct the

56

lumen of the posterior region of the PC, creating grooves in the fecal pellet (Reineckeet al

1973).

Spicules in the intima were observed in the anterior and posterior regions of the PV.

The spicules were arranged in plates with polygonal shape and anterior orientation (Figs 2d,

3c), in the same manner as observed in other insects (Woke 1941, Byers & Bond 1971). In the

posterior region, the spicules had a posterior orientation (Fig. 2e) and according to a study of

Hemiptera by Landim (2009), this orientation enables the adhesion of the peritrophic matrix

to the epithelium, being pulled back through the muscular action of the PV that moves the

fecal bolus toward the ileum, which provides the initial formation of fecal pellets. The

presence of a thick intima without spicules and the insertion of longitudinal muscles in the

epithelium mark the boundary between the PV and the ileum (Fig 3d).

Furthermore, the PV has the ventrolateral insertion of the common ampoule of the

Malpighian tubules (not shown), which has also been observed in other Lepidoptera (Woke

1941, Judy & Gilbert 1969 and 1970, Byers & Bond 1971, Reinecke et al 1973, Barbehenn &

Kristensen 2003, Levi et al 2004 and 2008). However, this insertion appears to vary

according to the insect group (Eaton 1939, Maranhão 1972, MacGowan & Sikorowski 1982).

Thus, the pylorus of B. mori larvae is a distinct functional compartment of the hindgut,

linked with the midgut by the PIR, and with the ileum by the PV. The morphological

diversity, especially in the epithelium and the associated intima, is a result of the dynamism of

this important region of the hindgut.

57

PC

PIR

MI

He

C

Lu ★

0,25µm

Cm

Lm

PV

1a

MI

1b

Nu

In Ci

Lu Cm

1c

Nu

Lu

Ci

Cm

1d

Nu

Lu

Ci

1e

Lu

Nu

PM

In Ci

Cm

58

2e

2d

2c

2b

MI

2a

A

PC

PIR

PV

PVA

PVP

59

Fig 3 Photomicrographs of the pylorus of fifth instar Bombyx mori (Linneaus) larvae,

longitudinal section HE staining. In (a), the site of the slit (black star) between the PIR

and the PC, peritrophic matrix (black arrow). Midgut (MI). In (b), the PC, cytoplasm

and nucleus of epithelial cells, smooth intima (In), and circular muscles (Cm). In (c),

part of the epithelium (Ep) of the PV, the circular muscles, longitudinal muscles (Lm),

and plates of spicules in the intima (hollow arrow). In (d), the transition is shown from

the posterior area of the PV, with speculated intima (hollow arrow), the ileum and

thickened intima without spicules, insertion of longitudinal muscle (thin arrow) in the

epithelium. Hemocoel (He) and intestinal lumen (Lu).

Acknowledgements

The authors would like to thank the Coordination of Improving Senior Staff (CAPES)

for the scholarship opportunity, the State University of West Paraná (UNIOESTE) campus

Cascavel campus, Paraná, and the MA programme in Bioscience and Health for infrastructure

and assistance.

References:

Am

Vp

Ep

Lm

Cm Lu

3c

He

In

E

p

3d

Lu

Nu

Ci

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Cm

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Lu

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62

ARTIGO CIENTÍFICO 2

Bombyx mori PYLORUS INFECTION BY ALPHABACULOVIRUS

63

COMPROVANTE DE ENCAMINHAMENTO E ACEITE PELO CONSELHO EDITORIAL

64

Bombyx mori Pylorus Infection by Alphabaculovirus

M.P.D. Baggio, L.F.C. Ribeiro, S.A. Vessaro-Silva and R.M.C. Brancalhão

Laboratório de Biologia Celular, Mestrado de Biociências e Saúde, Centro de Ciências

Biológicas e da Saúde, Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Cascavel, Paraná, Brasil

Corresponding author: R. M. C. Brancalhão

E-mail: [email protected]

Rua: Universitária, nº 2069 – CEP 85819-110 – Telefone: (45) 3220-3237 - Cascavel - Paraná

ABSTRACT. Alphabaculovirus is an entomopathogenic virus genus that infects Bombyx

mori, the Bombyx mori multiple nucleopolyedrovirus (BmMNPV). This virus is

poliorganotrophic and a series of tissues are known as targets; however, literature does not

present information in regards to the pylorus, segment of the hindgut, present in the transition

with the midgut and responsible for the control of the food passage. Thus, the present paper

had as its goal to analyze the infection of B. mori pylorus by BmMNPV. To do so, hybrid B.

mori larvae were inoculated with a viral suspension of 2.4 x 107 polyhedral occlusion

bodies/mL. On different post inoculation days (dpi), segments of the intestine, containing the

pylorus and its subdivisions, posterior interstitial ring (PIR), pyloric cone and pyloric valve,

were dissected and processed for light microscopy, with Azan cytopathology staining. The

results showed that B. mori pylorus subdivisions respond differently to infection and the

anterior area of PIR is susceptible, being their cells secondary targets of infection. Cytological

analysis revealed the presence of the hypertrophic nucleus with viroplasm, following the

formation and development of viral polyhedra. At the end of the infectious cycle occurred

cytolysis, releasing polyhedra and enabling the spread of the disease. The posterior area of the

PIR, cone and pyloric valve revealed no evidence of BmMNPV infection. The knowledge

obtained will contribute to the establishment of the virus infectious cycle, which consequence

of an epizootic disease can negatively impact the creation of this insect, which in Brazil is

used in the production of silk.

KEYWORDS: Insect; Baculovirus; Lepidoptera; Hindgut

INTRODUCTION

Alphabaculovirus (AlphaBV) is a genus of entomopathogenic virus from the Baculoviridae

family that can cause disease in beneficial insects, such as Bombyx mori (Lepidoptera,

Bombycidae) (Dourado et al., 2011). AlphaBV comprises the specific nucleopolyhedrovirus

(NPV) of lepidopteran, consisting of double strand circular DNA that associates itself with

proteins, constituting the nucleocapsid. This is surrounded by a membranous envelope and

forms the enveloped nucleocapsid or virion. In AlphaBV, several nucleocapsids are grouped

in an occlusion body protein or polyhedron, which provides protection to virions (Rohrmann,

2011; Liang et al., 2013; Ikeda et al., 2013).

AlphaBV may contain only one nucleocapsid per envelope, being referred as a "single

nucleopolyhedrovirus" - SNPV, or several, "multiple nucleopolyhedrovirus" - MNPV.

According to literature, MNPV are more virulent than the SNPV and there is evidence for

geographical viral variability to NPVs of the same species, which may affect their virulence

(Adams and McClintock, 1991; Hong et al., 2000; Fan et al., 2007; Liang et al., 2013).

However, Hu et al. (1999) and Rohrmann (2011) state that the genetic basis for understanding

the enveloping of one or more nucleocapsids is still unknown. One of the main characteristics

of the AlphaBV is their infectious cycle, which presents two phenotypically distinct viral


65

forms, the occlusion-derived virus (ODV), and the budded virus (BV). The ODV are virions

that were released from occlusion bodies and act on primary infection being responsible for

the horizontal transmission of the disease. The BV never became occluded and was released

into haemolymph, has an envelope distinct from ODV and is responsible for the establishment

of systemic infection or secondary infection, that is, the transmission cell-to-cell (Rohrmann,

2011; Satadal et al., 2012).

The infectious cycle of baculoviruses has been studied in numerous insects (Adams and

McClintock, 1991) and, in B. mori, analysis was performed of the infection caused by a

BmNPV geographic isolate in the State of Paraná, Brazil; and the viral species identified as

Bombyx mori multiple nucleopolyhedrovirus (BmMNPV), for presenting polyhedra

containing both single enveloped nucleocapsids as well as multiple (Pereira et al., 2008).

BmMNPV is poliorganotrophic and various target organs are known, as the integument, the

trachea, fat body, nerve ganglion and testicles (Brancalhão et al., 2002; Brancalhão and

Ribeiro, 2003; Torquato et al., 2006a; Pereira et al., 2008). Regarding the digestive tract,

especially the pylorus, literature does not provide information about their susceptibility and

infection. The pylorus is a segment of the hindgut of great morphological complexity, which

presents itself subdivided into posterior interstitial ring (PIR), pyloric cone and pyloric valve

(Byers and Bond, 1971; Reinecke et al., 1973), and it is responsible for controlling the food

passage from the midgut to the hindgut, assisting in the finalization of the digestive process

(Judy and Gilbert, 1969; MacGown and Sikorowski, 1982; Snodgrass and Eickort, 1993;

Landim, 2009). The morphology of the pylorus reveals a simple lining epithelium, covered on

the luminal side by a chitinous intima, which has specializations in some areas, the spicules

(Judy and Gilbert, 1969; Byers and Bond, 1971; Reinecke et al., 1973; Levy et al., 2004).

Underlying the epithelium occurs the muscle layer, formed by bundles of striated fibers,

which act in peristalsis (Judy and Gilbert, 1969; Byers and Bond, 1971; Reinecke et al., 1973;

Levy et al., 2004, 2008).

In this sense, the present study aimed to analyze the susceptibility and infection of the B. mori

pylorus, against the isolated geographic BmMNPV, whose knowledge add up to others in the

establishment of the infectious cycle of this important entomopathogenic virus, responsible

for nuclear polyhedrosis disease, popularly known as grasserie or milky diseases. This is a

serious worldwide problem for sericulture, for once the larvae are sick, they must be

eliminated, to prevent the spread and propagation of the disease in the environment (Sengupta

et al., 1990; Qin et al., 2012; Satadal et al., 2012; Liang et al., 2013).

MATERIAL AND METHODS

Insect

In the experiments, were used 5th instar hybrid B.mori larvae, obtained from silk spinning

companies, which produce silkworms for commercial purposes in the State of Paraná, Brazil.

Larvae were bred in polyethylene boxes and kept in a breeding room, fed with fresh mulberry

leaves (Morus sp.) twice a day.

Virus and Inoculation

The Bombyx mori multiple nucleopolyhedrovirus, BmMNPV, (GenBank Accession No.

EU251694.1) was beforehand obtained from infected larvae (Brancalhão et al., 2002) and

kept in the freezer at a temperature of -4°C. Viral suspension was quantified, in a Neubauer

chamber at a concentration of 2.4 x 107 polyhedral occlusion bodies/mL.

The inoculation was performed in 25 silkworms after ecdysis from the 4th to the 5th instar,

and in this case, the silkworms were fasted for 24 h and, then, were fed with leaf disks of

mulberry (2 cm³ in diameter), which was previously dripped with 10 µL of viral quantified

suspension. An equal number of larvae were fed with leaf discs containing only water,

constituting the control group.

66

During feeding, the silkworm remained confined individually until feeding on the entire leaf

disc, ensuring, in the case of the group inoculated, ingestion of viral suspension. At the end of

feeding, larvae were transferred to the boxes, remaining until the end of the experiment,

receiving daily mulberry leaves, without BmMNPV. Simultaneously, the symptoms

manifested by the larvae were monitored daily (Ribeiro et al., 2009), being used as an

additional parameter for confirmation of infection with BmMNPV.

Pylorus Microscopy

In microscopic analysis, silkworms, control and inoculated, were anesthetized with ether,

dissected and the intestinal segment containing the pylorus was removed and fixed in Dubosq

Brazil (Beçak and Paulete, 1976) for 24 h, at 4ºC. This procedure was performed on the 2nd

to 9th post inoculation day (dpi), at intervals of 24 h.

After fixation, the intestinal segment following routine histological techniques for embedment

in paraffin (Brancalhão et al., 2002). The cuts were made on a microtome Olympus

CUT4055, in thickness of 5 and 7 µm, and the slides were stained with modified Azan

technique for viral occlusion bodies (Hamm, 1966), for cytopathology. Control slides were

subjected to the same preparations used for the inoculated material.

RESULTS AND DISCUSSION

The pylorus subdivisions of B. mori larvae showed differences in susceptibility to isolated

geographic BmMNPV. Thus, the anterior area of the PIR is susceptible to the virus and the

first signs of infection were observed from 5th dpi (Figures 1A and 1B). Ribeiro et al. (2009),

studying the cardia, another transition region of the intestine and of the same embryonic

origin as the PIR, also found its susceptibility to BmMNPV. The other subdivisions, ie, the

posterior area of the PIR, pyloric cone and pyloric valve did not show any evidence of

infection with BmMNPV in any of the times analyzed (Figures 1C, D and E).

The anterior area of the PIR presented itself as a secondary target of infection, caused by viral

phenotype BV; this occurs because the cover provided by the intima, present on the luminal

surface of the epithelium, represents a barrier to primary infection, caused by ODVs (Ribeiro

et al., 2009; Satadal et al., 2012; Liang et al., 2013). Moreover, the very action of digestive

juice proteins, such as serine protease and fluorescent red, and the alkaline pH present in the

midgut, responsible for the ODVs release from the polyhedron, also degrade it, inactivating

them, if they remain too long in its lumen (Rohrmann, 2011; Sunagar, 2011; Qin et al., 2012;

Liang et al., 2013). Thus, ODVs with infective potential do not reach the pylorus. Still, due to

the time of infection in the anterior PIR, 5th dpi being greater than that of the surrounding

tissues, such as fat body (4th dpi), reinforces infection by BVs from the hemolymph and

tracheal system, organs responsible for the dispersion of infection in the insect's body

(Brancalhão et al., 2009; Rohrmann, 2011).

Cytopathology revealed infection in susceptible epithelial cell nucleus, being possible to

analyze the various stages of the infectious cycle, initially, takes place the formation of the

virogenic stroma or viroplasm (Figure 2A), where are produced enveloped nucleocapsids or

virions. These are grouped concentrically around a protein matrix, consisting of polyhedrin,

originating the viral polyhedron. At this stage of infection the nucleus appeared hypertrophic

(Figures 2A and 2B), so as noted by other authors (Brancalhão et al., 2009; Ribeiro et al.,

2009; Rohrmann, 2011). Figure 2C shows control material, for comparison.

The polyhedron develops between the viroplasm and the nuclear envelope, initially, it is

smaller and without a defined geometric shape, identifiable for the green coloration (Figure

2A) and, subsequently, it presents itself bigger and with a characteristic geometric shape,

being present in the nucleus and in the extracellular environment, displaying red color

(Figures 1B and 2B), created from chemical interactions with the dye (Hamm, 1966).

Brancalhão et al. (2009) classifies them as immature and mature, respectively, where the

67

immature do not present them selves enveloped and the mature contain the envelope.

Geometrical shape of BmMNPV is defined by Torquato et al. (2006b) as a truncated

octahedron. However, other geometric forms such as cuboids, hexahedral, dodecahedral,

triangular or tetrahedral may also be present and may be the result of genetic variation and

that this is specific for each viral strain, or even polyedrin mutations (Katsuma et al., 1999,

Hong et al., 2000; Ribeiro et al., 2009; Brancalhão et al., 2009; Liang et al., 2013).

In the nucleus of infected cells, variations in the polyhedron’s amount and size were observed

(Figure 2B), according to the literature, such variations are common and may be related to the

number of occluded nucleocapsids, the development stage of the polyhedron, infected cell

metabolism, genetic variation of the virus and the positions occupied by polyhedra in the

infected nucleus should be considered, for they cause different angulations in histological

sections (Brancalhão et al., 2009).

At the end of the infectious cycle, cytolysis occurred (Figure 2B), due to the action of a

multifunctional viral p10 protein, which is involved in the nuclear membrane disintegration

and cell lysis, providing the release of mature polyhedra in the extracellular environment and

in the hemocoel, as well as in the intestinal lumen (Hong et al., 2000; Rohrmann, 2011; Liang

et al., 2013). This behavior of cell lysis is characteristic of BmMNPV infections, having been

observed in adipose tissues (Brancalhão et al., 2002), the integument (Brancalhão and

Ribeiro, 2003), the male reproductive system (Pereira et al., 2008), in the silk gland

(Brancalhão et al., 2009), and in the cardia (Ribeiro et al., 2009). At this stage, it was found,

by symptom analysis, leakage of hemolymph, due to frequent integument injuries, caused by

the action of chitinase and cathepsin enzymes, encoded by the viral genome (Brancalhão and

Ribeiro, 2003; Brancalhão et al., 2009). Thus, hemolymph containing viral polyhedra reaches

the environment.

Viral polyhedra are resistance structures that may persist in the environment from one season

to another, where they can ad here mulberry leaves, food for the B. mori. These, when taken

to the silkworm rearing rooms, can infect healthy silkworms, restarting the infectious cycle, in

the new host (Brancalhão et al., 2002; Liang et al., 2013). Thus, it is essential that, when the

presence of this virus is noticed, prophylactic measures for control are adopted, such as the

discard of diseased silkworms, as they are a potential focus of the pathogen (Potrich et al.,

2007; Brancalhão et al., 2009).

The non-infection of the posterior area of PIR, pyloric cone and pyloric valve may be related

to defense mechanisms, whose genetic bases are little known (Ponnuvel et al., 2003; Qin et

al., 2012; Feng et al., 2013). Adams and McClintock (1991) believe that the absence of

infection of certain cell types may be caused by differential expression of viral genes, inserted

into the genome of the host cell, once the BmMNPV presents asynchronous replication.

Rohrmann (2011), in a study of insect cell culture, offers that the beta-N-

acetylglucosaminidase 2 can act in resistance, altering the binding of glycans to the fusion

protein of the viral envelope, the GP64, reducing the infective capacity of BV.

In this sense, infection of the anterior area of PIR, added to other known BmMNPV targets,

affect the functioning of the hindgut, especially, in food passage into the ileum, for the

formation of fecal pellets. With this, the disease affects the metabolism of the insect,

compromising the production of quality cocoons, with losses to producers and to the

sericultural industry.

68

Figure 1. Photomicrographs of the pylorus of B. mori larvae, 5th instar, infected by BmMNPV,

7th dpi, longitudinal cutting, modified Azan staining. In A, the overview of the pylorus with its

subdivisions, posterior interstitial ring (PIR), pyloric cone (PC) and the pyloric valve (PV).Part

of the midgut (Im), Malpighian tubules (black star), hemocoel (He), muscles (hollow star), and

intestinal lumen (Lu). In B, the anterior area of PIR with mature polyhedra (in red) in the cell

nucleus and in the extracellular environment (black arrow), part of the posterior area of PIR

(bracket), no polyhedra in the nucleus (Nu), cytoplasm (Ci). In C, the posterior area of PIR,

intima spicules (hollow arrow). In D, CP showing epithelial cell nucleus, smooth intimate (In).

Polyhedra in the extracellular environment (black arrow). In E, anterior area of the VP showing

cytoplasm’s and nucleus.

0,25µm

He

VP

★

CP

A

IM

Lu

AIP

B

Ci

Lu

Nu

C

Nu

Ci

Lu

Nu

Lu E

Ci

He

D

★

In

Nu

Lu

He

69

ACKNOWLEDGEMENTS

To CAPES, for the opportunity of a scholarship and the Masters of Bioscience and Health,

from State University of West of Paraná, Brasil, for granting the infrastructure.

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Figure 2. Photomicrographs of the anterior area of the posterior interstitial ring of B. mori

larvae, 5th instar, longitudinal cutting, modified Azan staining. In A and B, inoculated

material at 5th and 7th dpi, respectively, and C, control material, for comparison. In A,

viroplasms (black arrow) in the hypertrophied nuclei and immature polyhedra (hollow

arrow). Nuclear envelope (arrowhead), cytoplasm (Ci) and intima (In) facing the lumen. In

B, mature polyhedra (in red) in the nucleus and in the extracellular environment. In C,

epithelial cell nucleus (Nu) and cytoplasm.

B

Ci

Ci

C

Nu

Lu

In

A

Ci In

Lu

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72

ANEXO A:

Normas da Neotropical Entomology

73

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Tables All tables are to be numbered using Arabic numerals. Tables should always be cited in text in consecutive numerical order. For each table, please supply a table caption (title) explaining the components of the table. Identify any previously published material by giving the original source in the form of a reference at the end of the table caption. Footnotes to tables should be indicated by superscript lower-case letters (or asterisks for significance values and other statistical data) and included beneath the table body.

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Line Art Definition: Black and white graphic with no shading. Do not use faint lines and/or lettering and check that all lines and lettering within the figures are legible at final size. All lines should be at least 0.1 mm (0.3 pt) wide. Scanned line drawings and line drawings in bitmap format should have a minimum resolution of 1200 dpi.

Vector graphics containing fonts must have the fonts embedded in the files.

Halftone Art Definition: Photographs, drawings, or paintings with fine shading, etc. If any magnification is used in the photographs, indicate this by using scale bars within the figures themselves. Halftones should have a minimum resolution of 300 dpi.

Combination Art Definition: a combination of halftone and line art, e.g., halftones containing line drawing, extensive lettering, color diagrams, etc. Combination artwork should have a minimum resolution of 600 dpi.

Color Art Color art is free of charge for online publication. If black and white will be shown in the print version, make sure that the main information will still be visible. Many colors are not distinguishable from one another when converted to black and white. A simple way to check this is to make a xerographic copy to see if the necessary distinctions between the different colors are still apparent. If the figures will be printed in black and white, do not refer to color in the captions. Color illustrations should be submitted as RGB (8 bits per channel).

Figure Lettering To add lettering, please use Calibri font only. Keep lettering consistently sized throughout your final-sized artwork, usually about 2–3 mm (8–12 pt). Variance of type size within an illustration should be minimal, e.g., do not use 8-pt type on an axis and 20-pt type for the axis label. Avoid effects such as shading, outline letters, etc. Do not include titles or captions within your illustrations.

Figure Numbering All figures are to be numbered using Arabic numerals.

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Figures should always be cited in text in consecutive numerical order. Figure parts should be denoted by lowercase letters (a, b, c, etc.). If an appendix appears in your article and it contains one or more figures, continue the consecutive numbering of the main text. Do not number the appendix figures, "A1, A2, A3, etc." Figures in online appendices (Electronic Supplementary Material) should, however, be numbered separately.

Figure Captions Each figure should have a concise caption describing accurately what the figure depicts. Include the captions in the text file of the manuscript, not in the figure file. Figure captions begin with the term Fig followed by a space and the figure number, both in roman type (e.g., Fig 1). No punctuation is to be included after the number. Identify all elements found in the figure in the figure caption; and use boxes, circles, etc., as coordinate points in graphs. Identify previously published material by giving the original source in the form of a reference citation at the end of the figure caption.

Figure Placement and Size When preparing your figures, size figures to fit in the column width. Figures should be 39 mm, 84 mm, 129 mm, or 174 mm wide and not higher than 234 mm.

Permissions If you include figures that have already been published elsewhere, you must obtain permission from the copyright owner(s) for both the print and online format. Please be aware that some publishers do not grant electronic rights for free and that Springer will not be able to refund any costs that may have occurred to receive these permissions. In such cases, material from other sources should be used.

Accessibility In order to give people of all abilities and disabilities access to the content of your figures, please make sure that: oAll figures have descriptive captions (blind users could then use a text-to-speech software or a textto- Braille hardware) oPatterns are used instead of or in addition to colors for conveying information (color-blind users would then be able to distinguish the visual elements) oAny figure lettering has a contrast ratio of at least 4.5:1

Electronic Supplementary Material Springer accepts electronic multimedia files (animations, movies, audio, etc.) and other supplementary files to be published online along with an article. This feature can add dimension to the author's article, as certain information cannot be printed or is more convenient in electronic form.

Submission Supply all supplementary material in standard file formats. Please include in each file the following information: article title, journal name, author names; affiliation and e-mail address of the corresponding author. To accommodate user downloads, please keep in mind that larger-sized files may require very long download times and that some users may experience other problems during downloading.

Audio, Video, and Animations Always use MPEG-1 (.mpg) format.

Text and Presentations Submit your material in PDF format; .doc or .ppt files are not suitable for long-term viability. A collection of figures may also be combined in a PDF file.

Spreadsheets Spreadsheets should be converted to PDF if no interaction with the data is intended. If the readers should be encouraged to make their own calculations, spreadsheets should be submitted as .xls files (MS Excel).

Specialized Formats Specialized format such as .pdb (chemical), .wrl (VRML), .nb (Mathematica notebook), and .tex can also be supplied.

Collecting Multiple Files It is possible to collect multiple files in a .zip or .gz file.

Numbering If supplying any supplementary material, the text must make specific mention of the material as a

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citation, similar to that of figures and tables. Refer to the supplementary files as “Online Resource”, e.g., "... as shown in the animation (Online Resource 3)", “... additional data are given in Online Resource 4”. Name the files consecutively, e.g. “ESM_3.mpg”, “ESM_4.pdf”.

Captions For each supplementary material, please supply a concise caption describing the content of the file.

Processing of supplementary files Electronic supplementary material will be published as received from the author without any conversion, editing, or reformatting.

Accessibility In order to give people of all abilities and disabilities access to the content of your supplementary files, please make sure that: oThe manuscript contains a descriptive caption for each supplementary material. oVideo files do not contain anything that flashes more than three times per second (so that users prone to seizures caused by such effects are not put at risk).

After acceptance Upon acceptance of your article you will receive a link to the special Author Query Application at Springer’s web page where you can sign the Copyright Transfer Statement online and indicate whether you wish to order OpenChoice, offprints, or printing of figures in color. Once the Author Query Application has been completed, your article will be processed and you will receive the proofs.

Open Choice In addition to the normal publication process (whereby an article is submitted to the journal and access to that article is granted to customers who have purchased a subscription), Springer provides an alternative publishing option: Springer Open Choice. A Springer Open Choice article receives all the benefits of a regular subscription-based article, but in addition is made available publicly through Springer’s online platform SpringerLink. We regret that Springer Open Choice cannot be ordered for published articles.

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Color Illustrations Online publication of color illustrations is free of charge. For color in the print version, authors will be expected to make a contribution towards the extra costs.

Proof Reading The purpose of the proof is to check for typesetting or conversion errors and the completeness and accuracy of the text, tables and figures. Substantial changes in content, e.g., new results, corrected values, title and authorship, are not allowed without the approval of the Editor. After online publication, no further changes can be made to the article. Scientific errors can be corrected by means of an Erratum, which will be hyperlinked to the article.

Online First The article will be published online after receipt of the corrected proofs. This is the official first publication citable with the DOI. After release of the printed version, the paper can also be cited by issue and page numbers.

http://www.springer.com/journal/13744

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ANEXO B:

Norma da Revista Genetics and Molecular Resarch - (GMR)

mayarha patricia dequigiovanni baggiotede.unioeste.br/bitstream/tede/635/1/mayaha.pdf · partir do...

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