MOLEKÜLER BİYOLOJİDE MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN KULLANILAN YÖNTEMLER IYÖNTEMLER I

DERS 2DERS 2

Prof. Dr. Şule ARIProf. Dr. Şule ARIMoleküler Biyoloji ve Moleküler Biyoloji ve

Genetik BölümüGenetik Bölümü

2005-20062005-2006

Ökaryotik Kromozomal Ökaryotik Kromozomal DNA İzolasyonuDNA İzolasyonu

Ökaryotlardan DNA izolasyonunun zorluğu: Ökaryotlardan DNA izolasyonunun zorluğu: organel organel ((mitokondri, kloroplastmitokondri, kloroplast) ) DNA’larının varlığı DNA’larının varlığı

Total hücresel DNA izolasyonu için; Total hücresel DNA izolasyonu için; modifiye modifiye alkali-lizisalkali-lizis yöntemi kullanılır yöntemi kullanılır

(Alkali-lizis yöntemi: plazmit DNA’sı izolasyonu için kullanılır)(Alkali-lizis yöntemi: plazmit DNA’sı izolasyonu için kullanılır)

Ökaryotik Kromozomal Ökaryotik Kromozomal DNA İzolasyonuDNA İzolasyonu

1. 1. Hücre zarının lizisiHücre zarının lizisi2. 2. Parçalanmamış organellerin izolasyonuParçalanmamış organellerin izolasyonu3. 3. Boyut, yoğunluk, deterjan duyarlılık Boyut, yoğunluk, deterjan duyarlılık

farklarına göre nukleus ve organel farklarına göre nukleus ve organel DNA’larının ayrılmasıDNA’larının ayrılması

4. 4. Organeller için;Organeller için; organel zarı lizisiorganel zarı lizisi RNA ve RNA ve proteinlerden arındırmaproteinlerden arındırma

(organel DNA’ları plazmit DNA’sı gibi halkasal, (organel DNA’ları plazmit DNA’sı gibi halkasal, kapalıdır ve izolasyonları plazmit DNA kapalıdır ve izolasyonları plazmit DNA izolasyonuna benzer)izolasyonuna benzer)

Bitki Hücre DNA’sı Bitki Hücre DNA’sı izolasyonuizolasyonu

İzolasyonda en önemli ayırıcı İzolasyonda en önemli ayırıcı özellik; özellik; kalın hücre çeperikalın hücre çeperidirdir

Çeperin parçalanması için genellikle Çeperin parçalanması için genellikle HomojenizasyonHomojenizasyon Sıvı nitrojenle dondurup parçalamaSıvı nitrojenle dondurup parçalama

Bunun dışındaki aşamalar diğer Bunun dışındaki aşamalar diğer ökaryotik hücrelerden DNA ökaryotik hücrelerden DNA izolasyonuna benzerizolasyonuna benzer

Sıvı Fazdan DNA’nın Sıvı Fazdan DNA’nın Saflaştırılması ve Konsantre Saflaştırılması ve Konsantre edilmesi Yöntemleriedilmesi Yöntemleri

Fenol ekstraksiyonu, etanolle Fenol ekstraksiyonu, etanolle çöktürme:çöktürme:

Küçük hacimlerden (0.4 ml’den az) Küçük hacimlerden (0.4 ml’den az) 1mg/ml’den az konsantrasyonlarda 1mg/ml’den az konsantrasyonlarda DNA izolasyonu içinDNA izolasyonu için

(çoğunlukla tercih edilen yöntem)(çoğunlukla tercih edilen yöntem) İzopropanolle çöktürme:İzopropanolle çöktürme:DNA solusyonu ile eşit hacimde DNA solusyonu ile eşit hacimde

kullanılarak çöktürme yapılırkullanılarak çöktürme yapılır

Sıvı Fazdan DNA’nın Sıvı Fazdan DNA’nın Saflaştırılması ve Konsantre Saflaştırılması ve Konsantre edilmesi Yöntemleriedilmesi Yöntemleri

Cam boncukla saflaştırma:Cam boncukla saflaştırma:Süspansion halindeki cam boncuklar DNA, Süspansion halindeki cam boncuklar DNA,

RNA ve protein çöktürmede hızlı ve RNA ve protein çöktürmede hızlı ve etkin yöntemdiretkin yöntemdir

Oligonükleotidlerin ve trifosfatların Oligonükleotidlerin ve trifosfatların etanolle çöktürülerek uzaklaştırılması:etanolle çöktürülerek uzaklaştırılması:

30 bç’den kısa oligonükleotidler ve 30 bç’den kısa oligonükleotidler ve nükleotidlerin DNA solüsyonundan nükleotidlerin DNA solüsyonundan uzaklaştırılması için uzaklaştırılması için amonyum asetatamonyum asetat ile ile etanol çöktürmesi etanol çöktürmesi (2 aşamalı)(2 aşamalı) uygulanır. uygulanır.

Anyon Değiştirici Anyon Değiştirici Kromatografi ile DNA Kromatografi ile DNA saflaştırmasısaflaştırması

Seçici olarak nükleik asitlere Seçici olarak nükleik asitlere bağlanan anyon değiştirici reçine bağlanan anyon değiştirici reçine içeren kolon kullanılıriçeren kolon kullanılır

DNA’nın RNA, protein, DNA’nın RNA, protein,

karbohidrat ve metabolitlerden karbohidrat ve metabolitlerden

hızlı olarak ayrılması sağlanır.hızlı olarak ayrılması sağlanır.

Kolon dolgu maddesi

RNA İzolasyonuRNA İzolasyonu

Bakteri hücresinin %6’sıBakteri hücresinin %6’sı Memeli hücresinin %1.1’i Memeli hücresinin %1.1’i

Total 10-15Total 10-15g RNA’nıng RNA’nın

RNA’dır

%85’irRNA

%15-20’sitRNA

%1-5’imRNA

RNA İzolasyonuRNA İzolasyonu Gen anlatımıGen anlatımı Gen anlatımının analiziGen anlatımının analizi Gen anlatımının düzenlenmesiGen anlatımının düzenlenmesi İşlenmeİşlenme KlonlamaKlonlamaçalışmalarının önemli kısmı RNA izolasyonuna çalışmalarının önemli kısmı RNA izolasyonuna

dayanırdayanır Klonlama çalışmalarında cDNA kitaplığının Klonlama çalışmalarında cDNA kitaplığının

kurulması ve kitaplıktan istenen genin kurulması ve kitaplıktan istenen genin izolasyonu için total RNA’dan izolasyonu için total RNA’dan mRNA izolasyonumRNA izolasyonu gereklidir.gereklidir.

RNA İzolasyonuRNA İzolasyonu

BAŞARILI BİR RNA BAŞARILI BİR RNA İZOLASYONUİZOLASYONU, diğer moleküllerle , diğer moleküllerle kontamine olmamışkontamine olmamış ve ve yıkılmamışyıkılmamış RNA’ların saflaştırılması demektirRNA’ların saflaştırılması demektir

RNA saflaştırılmasının en güç yanı RNA saflaştırılmasının en güç yanı endojen RNaz’ların RNA’yı endojen RNaz’ların RNA’yı parçalamalarıdırparçalamalarıdır !!! !!!

Başarılı RNA İzolasyonu Başarılı RNA İzolasyonu için;için;

Kelatörler (EDTA, EGTA)Kelatörler (EDTA, EGTA) Deterjanlar (SDS)Deterjanlar (SDS) Guanidium izotiosiyanatGuanidium izotiosiyanatkullanılmalıdır.kullanılmalıdır.CAM EŞYA İÇİN;CAM EŞYA İÇİN; DEPC (dietilpirokarbonat)’ın %0.002’lik solusyonuDEPC (dietilpirokarbonat)’ın %0.002’lik solusyonu DEPC’den geçişilmiş cam eşyanın otoklavlanmasıDEPC’den geçişilmiş cam eşyanın otoklavlanması Çok temiz çalışma koşullarıÇok temiz çalışma koşulları

(İzolasyon sırasında da solusyonlar için %0.005’lik DEPC (İzolasyon sırasında da solusyonlar için %0.005’lik DEPC kullanılır)kullanılır)

RNA deterjan varlığında -20RNA deterjan varlığında -20ooC -80C -80ooC’ da saklanırC’ da saklanır

RNaz inhibitörler

i

RNA İzolasyonuRNA İzolasyonu

Örnek prosedür (bitki total RNA izolasyonu – Fenol Örnek prosedür (bitki total RNA izolasyonu – Fenol yöntemi)yöntemi)

1)1) HomojenizasyonHomojenizasyon2)2) Fenol-kloroform (proteinlerin uzaklaştırılmasıFenol-kloroform (proteinlerin uzaklaştırılması3)3) NaOAc ile nükleik asitlerin çöktürülmesiNaOAc ile nükleik asitlerin çöktürülmesi4)4) NaOAc ile RNA’nın çöktürülmesiNaOAc ile RNA’nın çöktürülmesi5)5) Polisakkaritlerin uzaklaştırılması için CsClPolisakkaritlerin uzaklaştırılması için CsCl22

derecelenme santrifüjlemesiderecelenme santrifüjlemesi6)6) mRNA izolasyonu için oligo dT / poli U sefaroz ile mRNA izolasyonu için oligo dT / poli U sefaroz ile

kromatografi kromatografi (yüksek tuz konsantrasyonunuda poliA kuyruğu (yüksek tuz konsantrasyonunuda poliA kuyruğu bağlanır, tuz konsantrasyonu düşürüldüğünde mRNA bağlanır, tuz konsantrasyonu düşürüldüğünde mRNA kolonda elde edilir)kolonda elde edilir)