MCA Metabolic Control Analysis

MCAMetabolic Control AnalysisPeltzer DraDulcska rpdEnzimek fiziolgiai kontextusbanAz enzimolgia trtnetnek legnagyobb rszben a kinetikai mrsek sorn keveset foglalkoztak a tanulmnyozott enzimek fiziolgiai szerepvel: azonostsizolls s tisztts; elvlaszts az in vivo fiziolgiai krnyezettl.Teht kzel minden kinetikai vizsglat a krnyezetbl kiszaktott enzimekkel trtnik! ez szksges ahhoz, hogy megrtsk s vizsgljuk az enzimes katalzis mechanizmustviszont gy nem kaphatunk teljes kpet arrl, hogy hogyan tltik be a szerepket az egyes enzimek a metabolikus utakonHonnan tudhatjuk, hogy egy E-re gyakorolt hats meg fog jelenni az anyagcsereton tfoly metabolit fluxus megvltozsban?el kell szakadnunk az egy idben egy E-mel val trdstl! rendszerszer trgyals fel kell elmozdulnunk, azt kell vizsglnunk, hogy a rendszer komponensei hogyan hatnak egymsra!

Azt fogjuk tanulmnyozni, hogy mi az sszefggs az anyagcseret kinetikja s az abban mkd komponens enzimek kinetikai viselkedse kztt! Metabolit Kontroll Analzisszmos tfed metabolikus rendszer analizl rendszert fejlesztettek ki az elmlt vtizedekben MCA: Metabolic Control Analysis Kacser & Burns (1973)Heinrich & Rapoport (1974)legismertebb s leggyakrabban hasznlt az sszes kzlLegegyszerbb formja:az E-ek rendszernek llandsult llapotaival foglalkozikamelyek egy sor metabolitot ktnek ssze amelyekben >2 metabolit REZERVOR van: koncentrcija lland s fggetlen a rendszer enzimeitl (gy azokhoz kpest externlisnak/klsnek tekinthet)a rezervorok legalbb 1 FORRST s legalbb 1 NYELT tartalmaznakAz rbn lthat metabolitt az X0 forrstl (amelybl metabolitok folynak ki) az X5 nyelig (amelybe a metabolitok befolynak) tart.FONTOS! Megllaptani minden elemzsnl, hogy melyik metabolitok a klsk, s melyek a belsk:X: externlis metabolitS: internlis metabolitEz a plda azt vizsglja, hogy E2 aktivitsa hogyan fgg a klnbz metabolitokkal val klcsnhatsoltl:

Az enzimek ltal sszekapcsolt metabolitokon kvl lehet akrhny fixlt koncentrcij kls effektor is.

(Termszetesen az l sejt esetn nagyon kevs reaktns kls, de a sok reakci miatt az egsz rendszert nagyon nehz egyidejleg tekinteni a kezelhetsg rdekben csak egy rszt tekintjk az egsznek ezen rsz szln lv metabolitokat klskknt tekintjk.)Az MCA legegyszerbb verzija estn:minden sebessg szigoran csak egy E koncentrcijval arnyos nincs olyan enzim, amely a rendszer 1-nl tbb reakcijra hatna7Elaszticits8Reverzibilis Michaelis-Menten egyenlet rtelmben (termk mindig jelen van)

A s P metabolitok kztt reverzibilis talakulsra vonatkozik s jelen van egy kompetitv inhibtor is I koncentrciban

Dimenzija: t -1A relatv vltozsok fontosabbak az abszoltaknl a/v szorzs (vonatkoztats a-ra s v-re):V-nek az A ltal kivltott hatst, hanem hogyan fog v megvltozni ha fellp egy kis vltozs az A-ban ;)

8Elaszticits

9

Michaelis, inhibcis llandkTmeghats trtnem egyenslyisgEnzim teltettsge a vizsglt reaktnssalMCA nem az algebrai formjval, hanem a numerikus megoldsval foglalkozik: ha 0: nem fgg v az a-tl ha pozitv: akkor v n ha negatv: akkor cskken az a nvekedtvel9Elaszticits10

REAKCIREND-klnbsg: itt lehet hasznlni trt szm rtketElaszticits koefficiens

1 ha E katalizlja a reakcit0 ha E nem katalizlja a reakcit

Az enzimnek zrus (0) az elaszticitsa ha azt a reakcit nem katalizljaElaszticits alapvet tulajdonsgai

11Reaktnsok:

-elaszticitsa pozitv (+): nem egyenslyi helyzet olyan, hogy a reaktns egy szubsztrt (normlis krlmnyek kztt)-elaszticits negatv (-): ha az egy termkMegjegyzs: az egyensly az egyik oldalrl a msikba billen t, nem a nulln keresztl vezet, hanem a vgtelenen () t: a reaktnsok elaszticitsa egyenslyban vgtelen! Irreverzibilis sebessgi egyenletek hasznlatnak veszlyes voltt jelentik a szimulcikban

2. Enzimek: elaszticitsa a sajt reakciikban 1 (s ms reakcikban: 0)3. Nemreaktns inhibitorok elaszticitsa mindig negatv (-) s fordtva a nemreagl aktivtorok mindig pozitv (+).

Enzimkinetika a kontroll analzis fell nzveAzok a mrsek, amelyeket a hagyomnyos ksrleteknl vgeznek, az MCA-ra nem tl hasznlhatak.Az MCA szintn az E kinetikai viselkedsre kvncsi, de a cl nem a mechanizmus megrtse, hanem a kinetikai lers integrlsa a rendszer kinetikai viselkedsnek lersba.A legegyszerbb esetben nhny E-bl felpl anyagcseret, de vgs soron egy egsz sejt, szerv vagy szervezet lersa. Nem elhanyagolhatk azok a metabolitok, amelyek befolysoljk a kinetiktminden reaktnsnak s effektornak a sejtekben lvkhz a lehet legkzelebbi koncentrciban kell jelen lennik (termkeknek is).Reverzibilis feltteleket kell biztostani!E teljes rendszerre vonatkoz hangslyok ellenre az elaszticits mrsek termszetellenesek maradnak legalbb 1 szempontbl: olyan E-re vonatkoznak, amelyet kiragadtunk a metabolittjbl gy kezeljk a metabolitokat, amelyek r hatnak, mintha konstansok lennnek (pedig a metabolitt tbbi E-e is hathat ezen metabolitok koncentrcijra).1212Sebessgek s koncentrcik: hatsok s nem okok

13

Sebessgek s az intermedier koncentrcik a teljes metabolikus rendszer tulajdonsgai s egyikk sem tekinthet fggetlen vltoznak, csak ha explicit mdon gy vannak definilva. Spektrofotomterben alkalmazottnak ppen az ellenkezjt vegyk felGondolatksrlet: E kveti a Michaelis-Menten kinetiktsebessget mi lltjuk beszubsztrtkoncentrci mrseSzubsztrt hogyan fgg a sebessgtl!?Sebessgek s koncentrcik: hatsok s nem okok

14a/Kma/Kmv/Vv/V 4 Km 0,8V12,6%2,5%0,54%2,5%llandsult llapot alakul kinem lehetsges llandsult llapotValsgban sem a sem v nem manipullhatk egymstl fggetlenl.

Sok, anyagcsere t kzepn elhelyezked enzim gy alaktja t a szubsztrtot, ahogy megkapja az ilyen E-ek olyan sebessggel mkdnek, ahogy szksges, a krlttk lv S konc.-t megfelelen mdostva. Sebessgek s koncentrcik: hatsok s nem okok

15

kompetitvunkompetitvi-nek lineris hatsa van az a-ra, de i nagy vltozsa az a-t csak arnyosan kisebb mrtkben vltoztatja meg.Az i jelenlte negatv nevezi tagban azt jelenti, hogy lehetetlen elrni egy llandsult llapotot.Ez csekly inhibtor koncentrciknl elfordulhat mrKontrol koefficiensekEgy metabolitutat felpt E sor kinetikai viselkedse hogyan magyarzhat az egyes kln E-ek tulajdonsgainak fnyben?lland: rezervorok (X0 s X5) konc., E-ek kinetikai tul.Vltozhat: E-ek meghatrozta sebessgek (vi-k), az egyes internlis koncentrcik

Sovny Csongor, Magos Zoltn, Horvth Anna, Kirsch Klra16

Externlis p paramter vltozsa hat a v-re s gy J-re

Mi lesz a megfelel vltozs a J-ben, amikor az E-et a rendszerben bennlvnek tekintjk?

llandsult llapot fel tart a rsz. a koncentrcik rtkei gy fognak vltozni, hogy steady-state-et rjenek el: pl. S1 ha v1-gyel kpzdik, ugyanakkor v2-vel fog tovbb alakulni ha minden metabolit st. state-ben van, akkor az sszes E-es sebessgnek azonosnak kell lennie: J (FLUXUS)(ha a metabolit utak elgaznak, akkor komplexebb az sszefggs: minden elgazsi pontba befut fluxus=kimen fluxus)

Loklis tulajdonsgok: E sebessgek, elaszticitsokRendszertulajdonsgok: st.st. fluxusok, metabolit koncentrcik, KONTROL KOEFFICIENSEK

A koncentrci kontrol koefficiens az a megfelel mennyisg, amely definilja a metabolit koncentrcikra gyakorolt hatst:

sszegzsi szablyok:

Kacser s Burns (1973): fluxus kontrol koefficiensek szummja 1. Heinrich and Rapoport (1975) koncentrci kontrol koefficiensek sszege zrus

n a rendszer enzimeinek a szma sj valamely bels metabolit koncentrcija Ha valamennyi fluxus kontrol koefficiens pozitv, ez a kontrol megoszls teljesen nyilvnval: egy enzim sem lehet 1-nl nagyobb s ha valamelyik megkzelti az egyet, a tbbinek szksgkppen kicsiknek kell lennie. Ez a normlis helyzet a nem elgaz reakciutak esetben (kvtelek lehetnek, ha szubsztrt inhibci vagy termk aktivls befolysolja valamely enzim viselkedst).Elgaz reakciutaknl ez a megoszls nem annyira vilgos mivel a fluxus kontrol koefficiensek sokszor negatvok s ugyancsak lehetnek nagyobbak is mint egy.

A kvetkez ltalnostsok ltalban igazak: *minden enzim + fluxus kontroll koefficienssel rendelkezik a sajt maga ltal katalizlt reakci fluxusra; *numerikusan szignifikns - fluxus kontrol koeficiensek nem igazn gyakoriak, fleg elgazsok esetben kzvetlenl az elgazsi pont utn jelentkeznek.egy lineris t fluxus kontrol koefficienseinek sszege krlbell 1 mg akkor is, ha az adott reakcit a tanulmnyozott teljes rendszernek csak egy rsze.

Egy metabolitt fluxus kontrolja megoszlik a rendszer sszes enzime kztt.

Bizonyts: T. f., hogy egy kis vltozst idznk el minden enzim koncentrciban, dei, (a reakcik sebessgei arnyosak az ket katalizl enzim koncentrcijval). Az ered hats brmely fluxusra az individulis hatsoknak az sszege:*(e/e) :JT. f., hogy mindegyik E koncentrcija ugyanolyan arnyban vltozik meg,vagyis valamennyi dei/ei ugyanakkora, . egy ilyen vltozs ekvivalens a mrsek idskljnak megvltoztatsval: gy a st. st. J a rendszeren t ppen az faktorral kell, hogy megvltozzon:

Ugyangy igazolhatis.2. rszAZ ELASZTICITSOK S A KONTROLL KOEFFICIENSEK KZTTI SSZEFGGSEK

VLASZ KOEFFICIENS

KONTROL S REGULCI

A REGULCI MECHANIZMUSA

1. A konnektivitsi tulajdonsgA konnektivitsi tulajdonsg lnyege, hogy a koncentrci kontroll koefficiensek illetve a fluxus kontroll koefficiensek s az elszticitsok kztt matematikai kapcsolat rhat fel.Mirt van erre szksg?A konnektivitsi egyenletek hasznaA konnektivitsi egyenletek hasznaTeht (n-1)+1=n db egyenletet szolgltat az n+n(n-1)=n2 db ismeretlennk.Ha ezek alapjn ki akarjuk szmolni az sszes ismeretlent tovbbi n(n-1) egyenletre van szksgnk.Ezek pedig a konnektivitsi tulajdonsgokbl fognak addni.A konnektivitsi egyenletekA konnektivitsi egyenletekA konnektivitsi egyenletekA konnektivitsi egyenletekA konnektivitsi egyenletekA konnektivitsi egyenletekA konnektivitsi egyenletek2. Feedbackben nem rintett metabolitra vonatkoz konnektivitsi sszefggsMinden metabolitnak legalbb kt nem nulla elszticitsa van, mivel minden metabolit befolysolja azt a reakcit aminek a szubsztrtja s azt a reakcit aminek a termke.Teht ha egy metabolit nem rendelkezik feedback vagy feedforward hatsokkal s nem szubsztrtja vagy termke egynl tbb enzimnek akkor pontosan kett nem nulla elaszticitssal fog rendelkezni.Feedbackben nem rintett metabolitra vonatkoz konnektivitsi sszefggsFeedbackben nem rintett metabolitra vonatkoz konnektivitsi sszefggsFeedbackben nem rintett metabolitra vonatkoz konnektivitsi sszefggsEzen az sszefggs segtsgvel egy reakciton pronknt teremthetnk sszefggseket az egymst kvet reakcik kztt.A kontroll koefficiensek nehezen mrhetek mint az elaszticitsok. Ezen sszefggsnek ksznheten az elaszticitsok ismeretvel a fluxus kontroll koefficiensek knnyebben meghatrozhatv vlnak.Vlasz koefficiensVlasz koefficiensVlasz koefficiensVlasz koefficiensAz MCA elfogadsaAz MCA-t lassan fogadtk el, mg ma sem teljesen.A klasszikus regulcis koncepcik lenzsnek tartottk,kevs haszonnal fontos elgondolsokra (vgtermk feedback inhibci, kooperatv s allosztrikus klcsnhatsok)

A kontrol fogalma mr elfogadott, a regulci fogalma (szablyozs) kevsb:Metabolizmus vlasz a kls hatsok vltozsra?Valami, amit a regultor enzimmel kell csinlni?

A regulci fogalmapl. jl regullt htgp:tartja az elhatrozott bels hmrskletet, ha nagyra trjuk az ajtt, vagy a kls hmrsklet vltozik.(nagy hfluxus vltozs)A metabolizmus a bels metabolit koncentrcikat tartja, a metabolikus fluxusok vltozsa ellenre.

pl. jl regullt gazdasgban:a javak termelse sszhangban van a szksglettel.Organizmusban (fehrjeszintzis prekurzorainak) termelse: nem csak a tpllktl fgg,hanem amilyen temben szksg van r.A vgtermk fogalma (MCA)Nyel, amibe a metabolikus fluxus ramlikMsik reakcit kiindulsi anyaga

S3 : kls/bels paramternek is tekinthetjk,milyen a hatsa a supply fluxusra?Hatkony regulci: S3 supply elaszticitsa lehet legnagyobb abszolt rtkt tekintve, mert negatv, < -2

Hatkony regulciA fluxus rzkenyen reagl a szksgletek vltozsaira.A vgtermk koncentrcija csak kicsit vltozik, amikor a fluxus vltozik.A kooperci fontos, de szerepe ms.A fluxus- s a koncentrci regulci egytt fontos.

A regulci mechanizmusaiMetabolit chanelling,

Enzim kaszkdok,

Adenilt kinzMetabolit chanellingDinamikus chanelling,kombinci

Tkletes chanelling

Szabad diffzi

S2 metabolit egyik enzimrl taddik a kvetkezre, nem szabadul ki az oldatba, vagy az oldatban lv szabad metabolittal nem r el egyenslyt.Ltezse felttelezs, hatsa tl kicsi a regulcira.Interkonvertibilis enzim kaszkdEnzimek kooperatv klcsnhatsai a feedback inhibcit, mint regulci teszik hatkonyabb.Gtja: a kooperativits Hill egytthatja ltalban < 4Az enzim - metabolit klcsnhatsok elaszticitsa is < 4,ez tl kicsi, hogy kapcsol lehessen.allosztrikus aktivci, enzim kaszkd: nagyobb elaszticitsa lehetpl. glutaminszintetz,E.coli-ban

Enzim kaszkdNagy rzkenysg kls jelekre, megfelel krlmnyek, paramterek esetn.A modifikcis reakcik energit, szubsztrtokat ignyelnek, (hogy irreverzibilisek legyenek).

Foszfatzok, kinzok vgzikKrdsekMit jelent az MCA s milyen igny vezetett a megalkotshoz?Milyen tulajdonsgokkal rendelkezik egy rezervor?llnyben a termels a tpllk mellett mitl fgghet?A vgtermk (MCA-ban) tovbb alakul-e?Mik a hatkony regulci jellemzi?Dinamikus chanellingnl van-e talaktand metabolit az oldatban?Mik az enzim kaszkd elnyei?Az adenilt kinz mit erst fel?