MEDIOS DE CULTIVOS Y CLASIFICACINUno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es elMedio de Cultivoy el crecimiento de los microorganismos es elCultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes.Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes.El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l.En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.CLASIFICACINLos medios de cultivo pueden clasificarse segn diferentes criterios, pero los ms importantes son aquellos que se basan en: Su consistencia Su utilizacin Su composicin Su origenSEGN SU ESTADO FSICO (CONSISTENCIA).1) Medios lquidos:Son los que se presentan en este estado, denominndose por esta razn caldos. El medio lquido ms utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtencin de una suspensin bacteriana de una determinada concentracin.2) Medios slidos:Se preparan a partir de los medios lquidos, agregndoles un agente gelificante. Los ms utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una protena animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y adems su uso est muy limitado porque su punto de fusin es bajo (lica a temperatura ambiente) razn por la que no puede utilizarse para cultivos a 37C, que es la tempera ptima de crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar:Es un polmero de azcares obtenido de algas marinas. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiolgico, por lo que es importante la ausencia de metales txicos.3) Medios semislidos:Se preparan a partir de los medios lquidos, agregando a stos un agente solidificante en una proporcin menor que para preparar medios slidos. Uno de sus usos es la investigacin de la movilidad de las bacteriasSEGN SU UTILIZACIN.1) Medios comunes:Son aquellos que poseen los componentes mnimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio ms conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar comn, que resulta de la adicin de agar al caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo son el agar triplicase de soja, el agar Columbia, etc.2) Medios de enriquecimiento:Son aquellos que, adems de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adicin de sangre u otros productos biolgicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible aadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo. El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cistena para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar chocolate).3) Medios selectivos:Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una poblacin poli microbiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una poblacin microbiana especfica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias.4) Medios inhibidores:Cuando las sustancias aadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una poblacin microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podran considerarse como una variante ms restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adicin de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una poblacin determinada. 5) Medios diferenciales:Se utilizan para poner en evidencia caractersticas bioqumicas que ayuden a diferenciar gneros o especies. La adicin de un azcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los grmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. Tambin lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemlisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc.6) Medios de identificacin:Son los destinados a comprobar alguna cualidad especfica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato especfico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya aadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificacin. 7) Medios de multiplicacin:Sirven para obtener una gran cantidad de clulas a partir de un microorganismo ya aislado. Se emplean en la obtencin de vacunas, en la investigacin y en la industria. Los medios ms adecuados para la multiplicacin suelen ser lquidos. El caldo-infusin cerebro-corazn (BHI), es un ejemplo tpico de estos medios.8) Medios de conservacin:Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en el laboratorio de Microbiologa. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas: a) haciendo pases peridicos de placa a placa, b) mediante liofilizacin de una suspensin bacteriana, y c) congelando las cepas en leche descremada estril al 0,1%.9) Medios de transporte:Se usan para el transporte de muestras clnicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Su utilizacin debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior delmedio (generalmente en un tubo). ATENDIENDO A SU COMPOSICIN.Segn las sustancias que entren a formar parte en su composicin, los medios de cultivo pueden ser clasificados en:1) Medios complejos:Fueron los primeros utilizados, y los ms empleados se preparan a partir de tejidos animales, y ms raramente de vegetales. Su composicin no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podr ser exacta. En la prctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los ms empleados.2) Medios sintticos:Son aquellos que contienen en su composicin exclusivamente sustancias qumicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composicin perfectamente definida.3) Medios semisintticos:El gran nmero de factores de crecimiento exigidos para ciertos grmenes hace que la fabricacin de un medio sinttico para estos grmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos grmenes no crecen en ningn medio por muy enriquecido que est ste, hacindolo exclusivamente en clulas vivas con unas caractersticas determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc.SEGN SU ORIGEN:

a) NATURALES:son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composicin qumica no se conoce exactamente.b) SINTTICOS:son los medios que contienen una composicin qumica definida cualitativamente y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.c) SEMISINTTICOSson los sintticos a los que se les aaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgnico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

MTODOS DE ESTERILIZACIONSe denominaesterilizacinal proceso por el cual se obtiene un producto libre de microorganismos viables. El proceso de esterilizacin debe ser diseado, validado y llevado a cabo para asegurar que es capaz de eliminar la carga microbiana del producto o un desafo ms resistente.Dado que la esterilidad no puede demostrarse de manera absoluta sin causar la destruccin completa de todas las unidades del lote de producto terminado, se define la esterilidad en trminos probabilsticos, en donde la probabilidad de que una unidad de producto est contaminada es aceptablemente remota. Se considera que un producto crtico es estril cuando la probabilidad de que un microorganismo est presente en forma activa o latente es igual o menor de 1 en 1.000.000 (coeficiente de seguridad de esterilidad 10^-6).Los mtodos trmicos de esterilizacin son comnmente los ms utilizados para eliminar los microorganismos, incluyendo las formas ms resistentes como lo son las endoesporas.MtodosQumicosEstos mtodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos.Con oxido denetileno: Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrgenos lbiles como los que tienengruposcarboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc. Es utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en laindustriafarmacutica. Destruye todos los microorganismos inclusovirus. Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable (goma,plastico, papel, etc.), equipos electrnicos,bombascardiorrespiratorias, metal, etc. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, y adems cancerigeno.Con aldehdos:Son agentes alquilantes que actan sobre lasprotenas, provocando una modificacin irreversible enenzimase inhiben la actividad enzimtica. Estos compuestos destruyen las esporas.Glutaraldehdo:Consiste en preparar una solucin alcalina al 2% y sumergir el material a esterilizar de 20 a 30 minutos, y luego un enjuague de 10 minutos.Estemtodotiene la ventaja de ser rpido y ser el nico esterilizante efectivo fro. Puede esterilizarplstico, goma,vidrio, metal, etc.Formaldehdo:Se utilizan las pastillas de paraformaldehido, las cuales pueden disponerse en el fondo de una caja envueltas en gasa oalgodn, que despus pueden ser expuesta al calor para un rpida esterilizacin (accindel gas formaldehdo). Tambin pueden ser usadas en Estufas de Formol, que son cajas de doble fondo, en donde se colocan las pastillas y se calienta hasta los 60 C y pueden esterilizar materiales de ltex, goma,plsticos, etc.Las pastillas de formalina atemperaturaambienteesterilizan en 36 hs.Esterilizacin por gas-plasma de Perxido de HidrgenoEsprocesode esterilizacin a baja temperatura la cual consta en la transmisin de perxido dehidrgenoen fase plasma (estado entre lquido y gas), que ejerce la accin biocida.Posee como ventajas:No deja ningn residuo txico.Se convierte enaguayoxgenoal final del proceso.El material no precisa aireacin.El ciclo de esterilizacin dura entre 54 y 75 minutos.Desventajas:No se pueden esterilizar objetos que contengancelulosa, algodn, lquidos, humedad,maderao instrumental con lmenes largos y estrechos.Es el mtodo de esterilizacin ms caro de entre los descritos.Mtodos fsicosCalorLa utilizacin de este mtodo y sueficaciadepende de dos factores: eltiempodeexposiciny la temperatura.Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la accin del calor. El calor provoca desnaturalizacin de protenas,fusiny desorganizacin de las membranas y/oprocesosoxidantes irreversibles en los microorganismos.Calor Hmedo:El calor hmedo produce desnaturalizacin y coagulacin de protenas. Estos efectos se debe principalmente a dos razones:*El aguaes una especiequmicamuy reactiva y muchasestructurasbiolgicas son producidas por reacciones que eliminan agua.*El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho ms elevado que elaire.AutoclaveSe realiza la esterilizacin por el vapor de agua apresin. Elmodeloms usado es el de Chamberland.Esteriliza a 120 a unaatmsfera de presin (estas condiciones pueden variar)y se deja el material durante 20 a 30 minutos.Equipo:TyndalizacinEsterilizacin por accin discontinua del vapor de agua, se basa en el principio de Tyndal Lasbacteriasque resisten una sesin de calefaccin, hecha en determinadas condiciones, pueden ser destruidas cuando la misma operacin se repite con intervalos separados y en varias sesiones.Se efecta por medio del autoclave de Chamberland, dejando abierta la vlvula de escape, o sea funcionando a la presin normal. Puede tambin realizarse a temperaturas ms bajas, 56 u 80 ocpara evitar la descomposicin de las sustancias a esterilizar, por las temperaturas elevadas.Ventajas del calor hmedo:Rpido calentamiento y penetracinDestruccin de bacterias y esporas en corto tiempoNo deja residuos txicosHay un bajo deterioro del material expuestoEconmicoDesventajas:No permite esterilizarsolucionesque formen emulsiones con el aguaEs corrosivo sobre ciertos instrumentos metlicos

Calor seco:El calor seco produce desecacin dela clula, es esto txicos por niveles elevados de electrolitos, fusin de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que estn en contacto con stos.La accin destructiva del calor sobre protenas y lipidos requiere mayor temperatura cuando el material est seco o la actividad de agua del medio es baja.EstufasDoble cmara, el aire caliente generado por una resistencia, circula por la cavidad principal y por el espacio entre ambas cmaras, a temperatura de 170 C para el instrumental metlico y a 140 C para el contenido de los tambores.Se mantiene una temperatura estable mediante termostatos de metal, que al dilatarse por el calor, cortan el circuito elctrico.Ventajas del calor seco:No es corrosivo parametalese instrumentos.Permite la esterilizacin de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no voltiles.Desventajas:Requiere mayor tiempo de esterilizacin, respecto al calor hmedo, debido a la baja penetracin del calor.RadiacionesSu accin depende de:El tipo de radiacinEl tiempo de exposicinLa dosisIonizantes:Producen iones y radicales libres que alteran las bases de loscidosnucleicos, estructuras proteicas y lipdicas, y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos.Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar materiales termolbiles (termosensibles) como jeringas descartables, sondas, etc. Se utilizan aescalaindustrial por suscostos.Rayos Ultravioletas:Afectan a las molculas de DNA de los microorganismos. Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies, se utilizan para la esterilizacin en quirfanos.Rayos Gamma:Suempleoesta basado en los conocimientos sobre laenergiaatomica. Este tipo de esterilizacin se aplica aproductoso materiales termolbiles y de gran importancia en el campo industrial. Puede esterilizar antibiticos,vacunas,alimentos, etc.FiltracinSe usan membranas filtrantes con poros de un tamao determinado. El tamao del poro depender del uso al que se va a someter lamuestra. Los filtros que se utilizan no retienen virus ni micoplasmas, estos ltimos estn en el lmite de separacin segn el dimetro de poro que se utilice.La filtracin se utiliza para emulsiones oleosas o soluciones termolbiles. Su usa para esterilizar aceites, algunos tipos de pomadas, soluciones oftlmicas, soluciones intravenosas,drogasdiagnsticas, radiofrmacos,mediospara cultivos celulares, y soluciones de antibiticos yvitaminas.Existen tres tipos bsicos de filtros: Filtros profundos o Filtros de profundidad:Consisten de un material fibroso o granular prensado, plegado, activado, o pegado dentro de los canales de flujo. En este tipo de filtros la retencin de las partculas se produce por una combinacin de absorcin y de retencinmecnicaen lamatriz.Membranas filtrantes:Tienen unaestructuracontinua, y la retencin se debe principalmente al tamao de la partcula. Partculas ms pequeas al tamao del poro quedan retenidas en la matriza del filtro debido a efectos electrostticos.