Seminar - 1. letnik, II. stopnja

Mehanika rakastih tkiv

Avtor: Daniel Groselj

Mentor: doc. dr. Primoz Ziherl

Povzetek

Studij mehanike rakastih tkiv je razmeroma novo podrocje. Zanimanje fizikov je pri-tegnilo z eksperimenti, ki kazejo velik vpliv zunanjih napetosti na rast rakastih tkiv.Trenutno razpolagamo ze z nekaterimi teoreticnimi modeli, ki znajo zadovoljivo opisatidinamiko rasti tkiv in s stalisca mehanike pojasniti razloge za hitrejso in ucinkovitejsorast tumorjev v primerjavi z zdravim okoliskim tkivom. V tem seminarju bomo naj-prej kvalitativno predstavili glavne znacilnosti rakastih tkiv, cemur bo sledil teoreticenopis dinamike rasti ter zveze med napetostjo in deformacijo. Na koncu bomo povzelinekatere zadnje rezultate simulacij in eksperimentov s tega podrocja.

4. april 2012

Kazalo

1 Uvod 1

2 Masna bilanca in mehansko ravnovesje 3

3 Zveza med napetostjo in deformacijo 6

4 Vpliv napetosti na rast tumorjev 10

5 Mehanski vidiki tvorbe metastaz 12

6 Zakljucek 13

Literatura 14

1 Uvod

Onkoloske raziskave so bile do nedavnega tradicionalno v domeni bioloskih znanosti. Predkratkim so se za to podrocje zaceli zanimati tudi fiziki. Njihov skupen cilj je uporabitifizikalne vescine (teoreticne in eksperimentalne) za izboljsanje razumevanja rakastih obolenjin morebiten razvoj novih terapevtskih metod.

Enega od vecjih prispevkov k napredku tovrstnih raziskav obeta pred kratkim ustanovljenamreza dvanajstih raziskovalnih centrov za fizikalne raziskave raka pod okriljem ameriskeganacionalnega onkoloskega instituta (angl. National Cancer Institute – NCI). V projekt sovkljucene mnoge ugledne ustanove, med drugim npr. MIT, ter univerze Princeton, Berkeleyin Cornell. K odlocitvi o ustanovitvi centrov so pripomogle zivahne razprave o novih metodahzdravljenja raka med raziskovalci z razlicnih podrocji, ki jih je v letu 2008 organiziral NCI.Nekateri glavni zakljucki, do katerih so prisli raziskovalci, so naslednji [1]:

• Onkoloske raziskave so potrebne novih idej in inovacij ter vkljucitve interdisciplinarnihznanstvenih ekip na to podrocje.

• Za nadaljnje poglobljeno razumevanje raka in novih terapevtskih metod bo potrebno vraziskave vkljuciti fizikalne znanosti.

• Glede na relativno pocasen dosedanji napredek na tem podrocju je sedaj pravi cas, daposkusimo z novimi alternativnimi pristopi.

Zgornje ugotovitve kazejo na morebitno kljucno vlogo fizike pri raziskavah raka v pri-hodnosti. Nekatere raziskave, ki se ukvarjajo z mehanskim opisom rakastih tkiv, so ze porodileobilico zanimivih rezultatov. Tem se nameravamo posvetiti v nadaljevanju seminarja. Predenlahko zacnemo, je potrebno razjasniti nekaj osnovnih bioloskih pojmov, ki jih bomo pogostosrecali.

Ko govorimo o mehanskih opisih rakastih tkiv, mislimo na makroskopske modele, ki za-jemajo skupne lastnosti vecjega stevila rakastih celic. Z izrazom tkivo oznacujemo skupekistovrstnih celic in medcelicnega prostora. Zivalska tkiva delimo na stiri glavne skupine [2]:

• krovno tkivo ali epitelij: pokriva notranje in zunanje povrsine organizma;

1

• vezivno ali oporno tkivo: povezuje organe in daje telesu strukturo;

• misicno tkivo: gradijo ga celice, ki so zmozne opravljati mehansko delo;

• zivcno tkivo: sestavljajo ga celice, specializirane za prenos zivcnih impulzov po telesu.

Kot je splosno znano, imajo celice precej zapleteno notranjo zgradbo. Na tem mestu bomoomenili le strukturo, ki igra pomembno vlogo, ko so celice izpostavljene raznim napetostim indeformacijam. To je celicni skelet. Celicni skelet ali citoskelet je celicno ogrodje, ki daje celiciobliko in trdnost ter omogoca spreminjanje oblike celice in gibanje organelov (slika 1). Pravtako sodeluje pri celicni delitvi. Delimo ga v tri skupine: aktinske filamente, intermediarnefilamente in mikrotubule [3]. Za trdnost celice so najbolj pomembni aktinski in intermediarnifilamenti. Celice tudi dejavno sodelujejo pri preoblikovanju in rasti tkiva prek procesov celicnedelitve (mitoze) in smrti (apoptoze). Za celicno rast je bistvena prisotnost hranilnih snovi, kijih celice crpajo iz okolice, na celicno delitev in smrt pa vplivajo razlicni kemijski dejavniki.

Slika 1: Shematski prikaz razlicnih struktur, ki dajejo celici obliko in trdnost [4].

Pomembno vlogo pri mehaniki tkiv igra tudi medcelicni prostor. To je prostor okrogcelic, zapolnjen s snovmi, katere celice potrebujejo za rast, prepleten pa je tudi z vlakni medseboj povezanih proteinov (elastin, kolagen in proteoglikan), ki sestavljajo ekstracelularni(zunajcelicni) matriks – ECM [5]. Zdrave celice morajo biti prirascene na ECM, da prezivijo.Po drugi strani interakcija rakastih celic z ECM ni bistvena za njihovo prezivetje, ker sole-te zmozne napadanja okoliskega tkiva, lahko pa se tudi odcepijo od ECM in prek zilnegasistema zaidejo v druge dele telesa.

Kot sopomenka za rak se pogosto uporablja izraz tumor, ceprav termina nista povsemekvivalentna. Izraz tumor se nanasa na abnormalno povecane dele dolocenega tkiva v telesu,ki nastanejo kot posledica pretirane rasti celic. Tumorje delimo na benigne (manj nevarne) inmaligne oziroma rakaste (nevarne), pri cemer je kriterij za tovrstno delitev zmoznost tvorbezasevkov (metastaz) [6]. V zaporedju korakov, ki sestavljajo metastatski proces morajorakaste celice opraviti pot od primarnega tumorja skozi zilni sistem do sekundarnega mesta,kjer se zasidrajo v tkivo in namnozijo (slika 2). Rakasto tkivo je tisto, ki povzroca metastaze,t.j. prenasa zasevke obolelega tkiva v druge dele telesa in napada okolisko tkivo.

V zdravem tkivu se razrascanje celic upocasni, ko celice pridejo v kontakt. To lastnostpoznamo pod imenom kontaktna inhibicija [5]. Rakaste celice ne posedujejo te lastnosti inupocasnijo svojo rast sele, ko so izpostavljene mocno povecanemu tlaku oz. ko jim zacne pri-manjkovati hranilnih snovi. Gruce tumorskih celic sprejemajo hranilne snovi prek zunanjih

2

sten tumorja. Ko se tvorba poveca, postanejo celice na sredini tumorske kepe podhranjene.Ce tkivo se ni prepredeno z zilami, taksni tumorji po dolocenem casu dosezejo ravnovesjein se ustalijo, ko merijo ≈ 2 mm v premeru. Takrat zacne nekaterim tumorskim celicamprimanjkovati kisika, na kar se odzovejo z izlocanjem razlicnih rastnih faktorjev, ki vzpod-budijo nastanek kapilar in tvorbo zilnega sistema. V kasnejsi fazi potem sledi se malignatransformacija in tvorba metastaz.

Primarni tumor Vaskularizacija

Prirašcanje na žilne stene

Odcepitev Prehod skozi žilno steno

Celica vPrehod v tkivo

krvnem obtoku tumorjaRast sekundarnega

Slika 2: Sirjenje metastaz. Proces poteka vec stopnjah in se zacne z izgradnjo krvnega sistemav tumorju (vaskularizacijo) in pridobitvijo rakastih lastnosti. Nato morajo odcepljene celiceopraviti pot od primarnega tumorja do sekundarnega mesta. Med potjo so izpostavljenespremenljivim mehanskim obremenitvam. Prirejeno po [7].

Zadnje ugotovitve [8] so potrdile, da so biomehanske lastnosti rakastih celic ugodne zanjihovo rast in povecujejo uspesnost procesa zasevanja. Med drugim so opazili, da so aktinskifilamenti rakastih celic mehkejsi, kar je bolj ugodno za hitro rast in delitev celic. Po drugistrani se pri vecjih deformacijah okrepijo intermediarni filamenti [9], ki ublazijo povecanezunanje nepetosti, s katerimi okolisko tkivo deluje na tumor med rastjo. Eksperiment, ki soga leta 1997 izvedli G. Helmlinger in sodelavci [10], lepo demonstrira vpliv zunanjih napetostina rast tumorja in je predstavljal eno od motivacij za fizikalne raziskave na tem podrocjuv kasnejsih letih. Kljucna ugotovitev eksperimenta je ta, da dovoljsna zunanja obremenitevrakastega tkiva ucinkovito omeji rast tumorja ne glede na njegov tip in razvitost krvnegasistema. Omenjena lastnost je bila ze dolgo znana pri studijah rasti zdravega tkiva, ni pabila pred tem potrjena za tumorje. Poskus je bil izveden in vitro. Za medij, v kateregaso namestili vzorce, so izbrali agarozni gel s primesanimi hranilnimi snovmi (slika 3). Zrazlicnimi kolicinami primesane agaroze (polisaharida) v vrelo vodo je mozno regulirati trdotogela, kar so avtorji uporabili za spreminjanje obremenitev zunanjih sten rakastega tkiva.Hranilne snovi so dodali, preden se je gel do konca strdil, zato se je zaradi difuzije lahkovzpostavila homogena koncentracija hranil po celem mediju. Med rastjo je tumor odrivalokoliski gel, kar je povzrocilo izotropno obremenitev zunanjih sten tkiva. Raziskovalci so pritem ugotovili, da je s povecanim tlakom mozno efektivno regulirati koncno velikost tkiva.Taksne obremenitve je za enkrat mogoce doseci le in vitro.

2 Masna bilanca in mehansko ravnovesje

Vecina dinamicnih procesov v tkivu je v osnovi povezanih z oddajanjem in sprejemanjemkemijskih signalov (npr. rastnih faktorjev). Kljub temu je mogoce bistveno dinamiko zajetiz izkljucno mehanskim opisom. Konec koncev se morajo spremenjene mehanske okoliscine

3

Slika 3: Posnetki rasti vzorca tumorja v hidrogelu. Slike so narejene ob razlicnih starostihvzorca: 2 dni (a), 11 dni (b) in 27 dni (c). Ker agorozni gel ne more prehajati skozi zunanjestene tumorja, je koncna velikost celicne gmote odvisna od maksimalne zunanje obremenitve,ki jo tkivo lahko prenese. Ta vrednost znasa priblizno 10 kPa [9].

prej ali slej odraziti tudi v kemijskih lastnostih celic in obratno [5]. V tem in naslednjempoglavju se bomo ukvarjali s kontinuumskimi modeli tumorjev. Pri zveznih opisih ne moremoeksplicitno upostevati lastnosti posameznih celic in interakcij med njimi. Taksen opis pridezato v postev pri makroskopskih skalah, kjer posameznih celic ne moremo vec lociti med sabo.Tipicna velikost evkariontskih celic je nekaj deset µm, tako da povsem zvezno sliko vidimosele na milimetrski skali. Sama diskretnost celicnih struktur torej ni povsem zanemarljiva,vseeno pa dajejo zvezni modeli v mnogih prakticnih primerih rezultate, ki se dovolj dobroujemajo z meritvami. Tudi pri zveznih opisih hitro naletimo na celo vrsto tezav. Glavniproblem je v tem, da se rastocemu tkivu masa ne ohranja. Ves cas se dodajajo nove celice,medtem ko nekatere stare odmirajo. Tezave nastajajo tudi pri povezavi med napetostjo indeformacijo tkiva, ker ni mogoce enolicno definirati nekega referencnega stanja, glede nakatero merimo odmike od ravnovesja [11].

Za zacetek si poglejmo, kaj lahko povemo o masni bilanci rastocega tkiva. V snovi, kini zmozna samopreoblikovanja, se masa vsake komponente posebej ves cas ohranja. Prirastocem tkivu to ne velja. Iz prakticnih razlogov je mnogokrat tudi bolj prikladno govoritio stevilski gostoti celic1 kot pa o masni gostoti. Ker je tkivo sestavljeno iz vec komponent,moramo v principu obravnavati vsako izmed njih posebej. Najpreprostejsi modeli obrav-navajo tkivo kot eno samo homogeno snov, podrobnejsi pa locijo tri komponente (celice,ECM in medcelicna tekocina). Prostornina, ki jo zasedajo krvni in limfni sistemi, se obicajnozanemari oz. se tumor modelira samo v zgodnjih fazah rasti, ko krvni in limfni sistemi seniso razviti. Za spremembo mase Mα komponente α znotraj nekega (mirujocega) kontrolnegavolumna V imamo enacbo [11]

dMα

dt=

∫∂Vραvα · dS +

∫VραΓα dV, (1)

kjer je ρα lokalna masna gostota komponente, vα njena hitrost, Γα pa predstavlja masne izvireoziroma ponore, ki so posledica celicnih delitev ter smrti. Iz zgornje enacbe po Gaussovemizreku takoj sledi kontinuitetna enacba za maso

∂ρα∂t

+∇ · (ραvα) = ραΓα. (2)

Ce obravnavamo trofazni model (celice, ECM in medcelicna tekocina), si lahko mislimo, da jesistem zaprt in se celotna mesanica nahaja v posodi z nepropustnimi stenami, celice pa crpajo

1Tako je lazje simulirati celicno delitev in celicno smrt. Vsak dogodek nam na izbranem mestu poveca oz.zmanjsa stevilo celic v povprecevalnem (hidrodinamicnem) volumnu za 1.

4

hranilne snovi iz medcelicne tekocine v posodi. Potem moramo upostevati le izmenjavanjemase med posameznimi komponentami, tako da velja [11]

ρcΓc + ρmΓm + ρlΓl = 0 (3)

Z indeksi c,m in l smo po vrsti oznacili celice, ECM in medcelicno tekocino. V primeru,da racunamo samo z eno komponento, moramo sistem obravnavati kot odprt in upostevatiizmenjavanje mase z okolico. Takrat pogoj (3) ni izpolnjen. Pri najpreprostejsih enokompo-nentnih modelih imamo za stevilsko gostoto celic n kontinuitetno enacbo oblike [12, 13]

∂n

∂t+∇ · (nv) = (kd − ka)n, (4)

kjer je v lokalna hitrost tkiva in vkljucuje gibanje vseh sestavnih delov tkiva. Clen kd opisujeprirastek celic zaradi delitev, ka pa uposteva celicno smrt.

Sedaj bi radi opisali se dinamiko rastocega tkiva, ki jo pri zveznih sredstvih doloca Cauchy-jeva enacba

ρd

dtv = ρ

[∂

∂t+ (v · ∇)

]v = ∇·σ, (5)

kjer je d/dt snovni (substancialni) odvod in σ celoten napetostni tenzor, ki je vsota nape-tostnih tenzorjev posameznih komponent tkiva. Zunanjih sil nismo upostevali, ker pri opisihdinamike tkiv niso relevantne. Spremembe gibalne kolicine ρdv/dt so lahko posledica kon-taktnih napetosti med molekulami zaradi zunanje obremenitve in notranjih sil, ki jih zenejokemijski procesi. Vsi ti prispevki so v resnici zelo majhni in jih v prvem priblizku lahkozanemarimo [14], tako da nam na koncu ostane ravnovesni pogoj

∇ · σ = 0. (6)

Ravnovesje v zivih organizmih moramo razumeti na drugacen nacin kot obicajno ravnovesjev mehaniki. Mislimo si za zacetek, da tkivo zapremo v neko posodo s koncno prostornino,skozi stene katere lahko prosto prehajajo voda, kisik, kemijski signali in hranilne snovi.Ob neomejeni zalogi hranilnih snovi in rastnih faktorjev bo tkivo prej ali slej zapolnilo vesrazpolozljiv prostor. Takrat se bodo makroskopske spremenljivke sistema ustalile in dosezenobo stabilno (ravnovesno) stanje. To stanje v zivih organizmih imenujemo homeostaticnostanje in je se najbolj podobno stacionarnemu stanju v hidrodinamiki. Tlak, ki ustrezaopisanemu ravnovesnemu stanju v tkivu, imenujemo homeostaticen tlak ph. Definiran je nanaslednji nacin [12]:

Vzemimo, da je posoda, v kateri raste tkivo, na eni strani zamejena s premicnim batom,ki je pritrjen na vzmet (slika 4A). Ko tkivo raste, pocasi odriva bat. To se dogaja, dokler nidosezeno ravnovesno stanje, v katerem sila skrcene vzmeti natanko uravnovesi silo, s katerorastoce tkivo deluje na bat. To stanje doloca dobro definiran tlak ph, s katerim tkivo delujena premicni bat.

Polozaj vzmeti je stabilen, ker nadaljnja rast poveca tlak, kar omogoca ugodnejse pogojeza celicno smrt, medtem ko majhen razteg vzmeti tlak zmanjsa, kar pomeni ugodnejse pogojeza celicno delitev. Vrednost homeostaticnega tlaka je za doloceno tkivo odvisna od interakcijmed delci tkiva in od razlicnih kemijskih dejavnikov, ki vplivajo na rast. Homeostaticnegatlaka ne smemo zamenjevati s hidrostaticnim tlakom. Prvi izvira izkljucno iz notranjih sil,ki so povezane z rastjo tkiva, obenem pa stene posode v nasi definiciji omogocajo transporttekocin.

5

Nekateri avtorji zagovarjajo, da je razlika homeostaticnih tlakov kljucen parameter pripreucavanju tekmovanja med dvemi tkivi, ki ju zapremo v posodo s koncno prostornino(slika 4B) [12]. Rezultati analiticnih modelov kot tudi simulacij [15] kazejo, da tkivo z vecjimhomeostaticnim tlakom na koncu povsem prevlada. Izid eksperimenta torej ni neposrednoodvisen od hitrosti celicnih delitev, pac pa od kombinacij razlicnih dejavnikov, ki jih z enimparametrom lahko zajamemo v homeostaticnem tlaku. Taksen opis je nekoliko pomanjkljiv,ker ne uposteva, da je rast lahko odvisna od relativnih velikost posameznih tkiv. Prav takosmo tukaj zanemarili stohasticno naravo celicnih procesov. Kot bomo videli v nadaljevanju, jehomeostaticen tlak tudi ob upostevanju omenjenih pomankljivosti, se vedno najpomembnejsiparameter invazivnosti tkiva.

Slika 4: Ilustracija koncepta homeostaticnega tlaka (A) in prikaz tekmovanja med dvemirazlicnimi tkivi v posodi (B). Zaradi rasti pritiskata tkivi drug na drugega. Tkivo z vecjimhomeostaticnim tlakom bo vsililo to stanje tudi tkivu z manjsim tlakom. Posledicno sev drugem tkivu poveca pogostost celicne smrti, zato se zacne delez tkiva z manjsim phzmanjsevati, dokler le-to popolnoma ne izgine [12].

3 Zveza med napetostjo in deformacijo

Preoblikovanje tkiv razsirja pojem konstituitivne relacije za zvezo med napetostjo in deforma-cijo. Na spremembe zunanjih napetosti se celice odzovejo s spremembo mase, metabolizmain notranje strukture. Med temi procesi se lahko spremenijo mehanske lastnosti celic, njihovavelikost in medsebojna interakcija [16]. V splosnem je gostota tkiva ob danem casu odvisnaod predhodne zgodovine njegove rasti, odziv tkiv na zunanje obremenitve pa je viskoelasticen.

Kot preprost model viskoelasticnega materiala, katerega posplositev bomo srecali v nada-ljevanju, si poglejmo enodimenzionalni model vzmeti s koeficientom k, ki je povezana zblazilcem z viskoznostjo η (slika 5a). Napetost σ je sorazmerna z deformacijo vzmeti uvin hitrostjo blazilca ub. Celotna deformacija je vsota premikov vzmeti in blazilca, tako daimamo

u = uv + ub = σ/k + σ/η. (7)

Ce uvedemo relaksacijski cas sistema τ = η/k, lahko v poenostavljeni obliki zapisemo(1 + τ

d

dt

)σ = ηu. (8)

Zgornji model nosi ime po fiziku J. C. Maxwellu. Pri stopnicasti motnji deformacije[u(t) =

6

u0 za t > 0], dobimo iz zgornje zveze za odvisnost napetosti σ izraz [17]

σ(t) = ku0 exp(−t/τ). (9)

Od tukaj lahko razberemo pomen karakteristicnega casa τ . To je cas, po katerem se odziv nazunanjo motnjo pocasi ustali. Velja tudi, da se pri motnjah s frekvencami, ki so dosti daljseod 1/τ , sistem obnasa kot navadna viskozna tekocina. Kot bomo videli, so pri 3D modelustvari nekoliko bolj zapletene, ker so lahko prisotne strizne obremenitve in deformacije vrazlicnih smereh, kljub temu pa se vedno obstajata dva limitna rezima glede na hitrostzunanjih obremenitev. Za tkiva so tipicni relaksacijski casi reda nekaj minut, medtem koznasa tipicen cas delitve celice priblizno 1 dan [13]. Pri opisu rasti rakastih tkiv se zatonajpogosteje uporabljajo priblizki, ki obravnavajo tkivo kot viskozno tekocino. Opis tumorjakot Maxwellove tekocine je prikladen tudi zato, ker v konstituitivni relaciji nastopa hitrostdeformacije in ne sama deformacija.

(a) (b)

Slika 5: Maxwellov model, ki ga sestavljata povezana vzmet in blazilec (a) ter odziv nastopnicasto motnjo deformacije (b) [17]. Na sliki (b) je zgoraj prikazan casovni potek defor-macije, spodaj pa odziv napetosti.

V nadaljevanju bomo sledili izpeljavi iz [13] in privzeli, da se na dovolj kratkih casovnihskalah in pri majhnih obremenitvah rakasto tkivo obnasa kot elasticen medij. To nam bosluzilo samo kot izhodisce za nadaljno razpravo. Procesi rasti tkiva, ki nas najbolj zanimajo,se odvijajo na skalah reda nekaj dni, zato nasa predpostavka v tem primeru ni upravicena.

Za obicajno elasticno sredstvo je zveza med napetostnim tenzorjem σ in deformacijo upodana z

σij = Cijklukl, (10)

kjer je C tenzor elasticnih konstant z najvec 21 neodvisnimi komponentami. V zapisu smouporabili Einsteinov sumacijski dogovor, ki se ga bomo drzali tudi v nadaljevanju. Zaradilazje obravnave bomo predpostavili, da je pri majhnih in hitrih obremenitvah odziv snoviizotropen in homogen, tako da nam zadoscata le dve elasticni konstanti.

Deformacijski tenzor u je v nasem primeru smiselno napisati kot vsoto deformacij podvplivom zunanjih napetosti u(z) in deformacij zaradi notranjih procesov celicne delitve insmrti u(n)

u = u(z) + u(n). (11)

Napetostni tenzor σ, ki nastopa v enacbi za mehansko ravnovesje (6), je lahko odvisen samood gostote zunanjih sil na telo in robnih pogojev, ne more pa biti odvisen od notranjih sil, kijih ustvarja sam material. To pomeni, da je σ v linearni zvezi zgolj z u(z). Ce zelimo imeti

7

linearno zvezo med celotno deformacijo in napetostjo, moramo od σ odsteti tenzor izvirovnapetosti Q, ki jih generirajo celicne delitve in smrti. Ti izvori so v splosnem anizotropni.Za σ lahko uvedemo naslednjo dekompozicijo

σij = σelij +Qij , (12)

kjer je σelij ”elasticni” del napetosti in je v linearni zvezi s celotno deformacijo u (10).

Tkivo se med rastjo nenehno spreminja, zato je nemogoce definirati neko referencno stanje,glede na katerega bi lahko merili deformacijo. Po drugi strani je vseeno se vedno smiselnogovoriti o zvezi med casovno spremembo deformacije in napetosti. Relacijo (10) bomo zatoposplosili. Namesto tenzorja σel bom uporabili njegov casovni odvod, tenzor u pa bomozamenjali s hitrostjo deformacije u. Ko govorimo o casovnem odvodu σel, moramo biti pa-zljivi, ker imamo opravka z zveznim sredstvom, pri cemer uporabljamo Eulerjev opis (gibanjeopazujemo v neki fiksni tocki in ne sledimo trajektorijam posameznih delcev). Odvod pocasu mora zato vsebovati snovni (substancialni) odvod, ki pa ne sme biti edini clen opera-torja. Substancialni odvod je namrec implicitno vezan na gibanje posameznih delcev gledena izbran koordinatni sistem. Potemtakem bi bila zveza med spremembo napetosti in de-formacije odvisna od izbire referencnega sistema, kar je seveda nesmisel. Odziv materialana napetosti mora biti neodvisen od koordinatnega sistema. To je eno od pomembnih nacelmehanike kontinuov in se imenuje princip objektivnosti [18]. Iz vsega povedanega sledi, damoramo substancialni odvod popraviti tako, da bo tudi odvod napetostnega tenzorja ob-jektivna kolicina2. To lahko storimo na tri nacine z uporabo t.i. zgornjega in spodnjegakonvekcijskega ter korotacijskega odvoda [18]. Uporabili bomo korotacijski (Jaumannov)odvod, ki je podan z [19]

D

Dtσel =

∂

∂tσel + (v · ∇)σel − ωσel + σelω, (13)

kjer je v hitrostno polje in ω tenzor vrtincnosti (antisimetricni del gradienta hitrosti). Zgornjaoperacija predstavlja casovni odvod v koordinatnem sistem, katerega osi se vrtijo skupaj zdelci tekocine [19]. Na ta nacin se znebimo odvisnosti od laboratorijskega sistema. S pomocjopravkar definiranega operatorja zapisemo zvezo med spremembo napetosti in deformacije kot[13]

D

Dtσelij = Cijklvkl, (14)

kjer je vij hitrost deformacije, podana z vij = uij =(∂vi/∂j +vj/∂i

)/2. Z ∂/∂xi smo oznacili

odvod po i-ti koordinati. Zgornja relacija med napetostjo in deformacijo spada v razredt.i. modelov prirastnega tipa (angl. rate-type models). Zveza je nelinearna zaradi clenov, kivsebujejo produkt med σel in ω.

Elasticni napetostni tenzor σel se izplaca napisati kot vsoto izotropnega dela σ in sime-tricnega brezslednega dela σ. Ob predpostavki, da σ ni odvisen od predhodne zgodovine,temvec zgolj od trenutne celicne konfiguracije in je enoznacna funkcija stevilske gostote n,lahko ob upostevanju (4) zapisemo zvezo [13]

d

dtσ =

(∂

∂t+vl

∂

∂xl

)σ = K

[vll − (kd − ka)

], (15)

kjer je K reciprocna stisljivost tkiva, definirana v limiti majhnih raztezkov in hitrih zunanjihobremenitev. Koeficienta kd in ka opisujeta hitrost celicnih delitev in smrti, enako kot venacbi (4).

2Za poljuben tenzor 2. ranga A to pomeni, da se mora pri transformacij koordinatnega sistema, ki jepodana z matriko Q, A transformirati kot A = QAQT [20].

8

Pri brezslednem delu napetostnega tenzorja moramo upostevati anizotropnost celic, kidoloca preferencno smer osi celicnih delitev. Anizotropnost je lahko posledica zunanjihnapetosti, interakcije med celicami in kemijskih faktorjev. Na tem mestu se raje ne bomospuscali prevec v podrobnosti, povejmo le, da je tenzor izvirov napetosti v tesni zvezi spovprecno orientacijo osi celicne anizotropije. Ob predpostavki, da je relaksacijski cas variacijcelicne anizotropije krajsi od tipicnih casov celicne delitve in smrti, se da pokazati, da lahkozvezo med brezslednim delom napetostnega tenzorja in deformacijo predstavimo v obliki(

1 + τD

Dt

)σij = 2ηvij , (16)

ki ustreza posplositvi Maxwellovega modela viskoelasticnega materiala. Relaksacijski cassistema τ je funkcija stevilske gostote in razlicnih koeficientov, ki opisujejo celicno rast inanizotropijo. V homeostaticnem rezimu je τ sorazmeren casu celicne delitve k−1

d . Viskoznikoeficient je enak η = τµ, kjer je µ strizni modul tkiva. Koeficient η ustreza limiti, ko grefrekvenca zunanjih motenj proti nic. Tipicna vrednost η je za tkiva reda 104 Pa s [21]. Zaprimerjavo povejmo, da je viskoznost medu npr. reda 5 Pa s. V splosnem je pri Maxwellovemmodelu viskoznost odvisna od frekvence in je kompleksna kolicina. Podana je z [15]

ηc =η

1 + iωτ, (17)

kjer je ω krozna frekvenca motnje. Na podlagi enostavnega zgleda iz zacetka poglavja lahkougotovimo, da se bo po dolgem casu odziv brezslednega dela napetosti ustalil. Zato lahko nadolgih casovnih skalah rastoce tkivo obravnavamo kot viskozno tekocino. Potrebno je pouda-riti, da je ta lastnost predvsem posledica procesov celicne delitve in smrti ter reorganizacijetkiva.

Predstavljeni rezultati so konsistenti tudi z nekaterimi drugimi modeli, ki izhajajo izdrugacnih zacetnih predpostavk ([11], poglavje 1.8). Prav tako se napovedi modela solidnoujemajo z rezultati simulacij in eksperimentov [12, 15, 22]. V [15] so avtorji npr. meriliviskoznost rastocega tkiva v odvisnosti od frekvence zunanje motnje s pomocjo delcnih simu-lacij. Izmerjene vrednosti so pri razlicnih vrednostih kd = ka primerjali s teoreticno krivuljoza viskoznost (17). Rezultati so prikazani na sliki 6.

Slika 6: Absolutna vrednost kompleksne viskoznosti |ηc| v odvisnosti od frekvence (A) in fazaδ = Im ηc/Re ηc (B). Prikazani so rezultati za razlicne vrednosti koeficientov celicne delitvein smrti k∗d = k∗a. Ujemanje z enacbo (17) ni optimalno, vseeno pa teoreticna krivulja zajameglavne znacilnosti. Faza δ = 0 ustreza odzivu obicajne tekocine. Iz tega lahko zakljucimo, daje odziv rastocega tkiva, pri vecjih hitrostih celicne delitve in smrti, vse bolj podoben odzivunavadne tekocine [15].

9

4 Vpliv napetosti na rast tumorjev

Pri tumorjih, ki niso izpostavljeni zunanjim napetostim, je v zgodnjih fazah moc opazitieksponentno rast. Kasneje raste velikost linearno s casom. Prehod med enim in drugimrezimom je pogojen z difuzijo hranilnih snovi skozi zunanje stene tkiva v notranjost [14]. Zrastjo tkiva dobivajo celice na sredini gmote vse manj hranil in se njihova rast zato upocasni.Tkivo takrat raste pretezno samo se na povrsju, medtem ko v notranjosti rast stagnira. Trebaje poudariti, da to velja samo, dokler se znotraj tkiva ne vzpostavi krvno omrezje.

Ko je tumor izpostavljen zunanjim napetostim in pri rasti tekmuje z okoliskim tkivom, jedinamika rasti odvisna od razlike homeostaticnih tlakov rakastega in zdravega tkiva ter odizmenjave rastnih faktorjev in povrsinske napetosti na stiku med obema tkivoma [12]. Priizmenjavi rastnih faktorjev mislimo na lokalno zmanjsanje homeostaticnega tlaka invazivnegatkiva zaradi sproscanja kemijskih signalov s strani zdravega tkiva, povrsinska napetost papovzroca dodatno obremenitev zunanjih sten tumorja. Zveza med razliko tlaka ∆p na stikumed dvema tkivoma in povrsinsko napetostjo γ je v sfericni geometriji podana z Laplaceovoformulo [12]

∆p =2γ

r, (18)

kjer je r radij tumorskega sferoida, obdanega z zdravim tkivom. Povrsinske napetosti lahkoizvirajo iz preoblikovanja celicnega citoskeleta in vlaken izvencelicnega matriksa na stikumed tkivi. Vpliv povrsinske napetosti in izmenjave rastnih faktorjev ima lahko pomembneposledice [12]. Lahko se zgodi, da se pri tekmovanju vzpostavi ravnovesno stanje, v kateremnobeno izmed tkiv ne prevlada, ceprav je razlika homeostaticnih tlakov razlicna od 0. Vdolocenih okoliscinah, ki jih bomo komentirali v naslednjem poglavju, lahko tkivo z manjsimhomeostaticnim tlakom celo zmaga. V nadaljevanju se bomo omejili samo na rast v zgodnjihfazah, ko lahko zanemarimo heterogeno sestavo tumorjev. Vselej bomo privzeli, da imarakasto tkivo vecji homeostaticni tlak od zdravega tkiva.

Slika 7 prikazuje rast tumorja v sfericni geometriji znotraj sferoida iz zdravega tkiva. Primodeliranju dinamike rasti so tkivo obravnavali kot viskozno tekocino s konstantno razlikomed delitvijo in odmiranjem celic. Vpliv relativnih velikosti na rast, ki je povezan s povrsinskonapetostjo med tkivi in izmenjavo rastnih faktorjev ni bil upostevan. V tem primeru tkivo zvecjim tlakom zmaga in zapolni ves razpolozljiv prostor.

Ko upostevamo prispevek povrsinske napetosti k dinamiki rasti, je slika nekoliko drugacna.Koncni rezultat je prikazan na sliki 8. Prispevek povrsinske napetosti so avtorji clankaupostevali tako, da so prvotnemu modelu dodali tanko membrano, ki obdaja tumor in katerepovrsinska napetost se povecuje, ko tumor raste. Ce raste povrsinska napetost hitreje odradija sferoida, se rast tumorja ustali pri neki kriticni vrednosti.

Za konec povzemimo se nekaj rezultatov eksperimenta [22], katerega postavitev se zelodobro sklada z zgoraj opisanim modelom. Pri poskusu so vzorce tkiva (20000 celic na vzorec)namestili v vdolbinice znotraj agaroznega gela. Zunanje stene tumorjev so obremenili skonstantnim tlakom, ki ga je generiral osmozni tlak polimerne raztopine, primesane v gel.Prostornina tumorja, normaliziranega na zacetno prostornino, so merili z metodo opticnemikroskopije. V odsotnosti osmoznega tlaka so dosegli sferoidi tipicne velikosti reda 900 µm.Pri dodajanju polimerne raztopine je bila opazena upocasnitev hitrosti rasti ter zmanjsanjekoncnega premera (slika 9a). Izvedli so tudi poskus, pri katerem so po dolocenem casu zunanjestene tumorja nenadoma razbremenili. Zanimivo je, da se je na tem mestu rast nadaljevala,dokler ni bila dosezena enaka ravnovesna velikost, kot pri poskusu brez zunanjih obremenitev(slika 9b). To dejstvo kaze, da je tudi pri relativno velikih napetostih odziv tumorjev elasticen

10

in je efekt zunanjih obremenitev reverzibilen proces. Omenjen rezultat se dobro ujema z [8],kjer so avtorji primerjali plasticnost deformacije zdravih in invazivnih celic. Na podlagimeritev so ugotovili, da se invazivne celice bistveno bolj priblizajo zacetnemu stanju preddeformacijo, ko niso vec podvrzene zunanjim napetostim3. Ta lastnost je ugodna za rakastecelice v kontekstu metastatskega procesa, med katerim so rakaste celice lahko podvrzenevelikim deformacijam, zlasti pri prehodu iz zilnega endotelija v krvni sistem.

Slika 7: Numericna resitev za rast tumorja, obdanega z zdravim tkivom v sfericni geometriji.Sliki prikazujeta celicno gostoto (A) in hitrost (B) kot funkciji casa in radija. Radij sferein integracijski cas teceta od 0 do 1. Crna crta oznacuje polozaj meje med obema tkivoma(zgoraj je rakasto, spodaj zdravo). Ob zacetnem casu (spodnji rob grafa) zavzema zdravotkivo skoraj ves prostor, na koncu pa povsem prevlada rakasto tkivo (zgornji rob grafa) [12].

Slika 8: Rast tumorja, zavitega v tanko membrano znotraj zdravega tkiva v sfericni ge-ometriji. Sliki prikazujeta celicno gostoto (A) in hitrost (B) kot funkciji casa in radija. Do-dana membrana generira povrsinsko napetost na stiku med tkivoma. V tem primeru rakastotkivo ne prevlada, temvec se ustali pri neki kriticni vrednosti radija [12].

3Invazivne celice so pridobile nazaj priblizno 78 % premera, izgubljenega med deformacijo, neinvazivnecelice pa le 55 % [8].

11

(a) (b)

Slika 9: Rast tumorskih vzorcev v agaroznem gelu. Na abscisi je prikazan cas rasti v dnevih,na ordinati pa prostornina tumorja. Slika (b) prikazuje rast pri razlicnih vrednostih os-moznega tlaka in nadaljni potek rasti pri nenadni razbremenitvi vzorcev po 12 dneh (crtkanacrta). Zacetni premer je znasal 350 µm. Graf na sliki (a) opisuje casovni potek rasti prirazlicnih vrednostih zunanjega tlaka. Zacetni premer je znasal 200 µm. Pri napetostih nad10 kPa se efekt zunanjega tlaka ustali in krivulje rasti se skorajda prekrivajo [22].

5 Mehanski vidiki tvorbe metastaz

Proces zasevanja poteka v vec stopnjah in je zasluzen za vec kot 90 % vseh smrtnih zrtev prirakastih obolenjih [7]. Kot kazejo zadnje ugotovitve, imajo spremembe mehanskih znacilnostirakastih celic in njihove fizicne interakcije z okolico pri tem eno od kljucnih vlog [8, 12]. Zauveljavitev novih diagnosticnih in terapevtskih metod je zato kljucno razumevanje osnovnihprocesov, ki regulirajo invazivnost rakastih celic. Uspesnost sirjenja metastaz je med drugimpogojena z zmoznostjo prilagajanja celic na razlicno kemijsko okolje in spremenljive mehanskeobrementive, katerim so le-te izpostavljene med migracijo do sekundarnega mesta rasti. Boljkonkretno je za prehod iz primarnega mest v tkivu do krvnih zil kljucna fizicna interakcijamed ECM in rakasto celico. V naslednjem koraku, pri prehodu skozi stene krvnih zil, morajobiti celice zmozne relativno velikih elasticnih deformacij, tako da se lahko zrinejo med stike en-dotelijskih celic. Te deformacije so posledica preoblikovanja celicnega citoskeleta. V krvnemobtoku je kljucnega pomena povezava med lokalno hitrostjo krvnega obtoka in adhezijskimsilami, s pomocjo katerih se celice prirascajo na stene krvnih zil. Kot kaze, so za uspesenprehod skozi ECM in endotelij potrebne optimalne mehanske lastnosti. Celice morajo bitidovolj toge, da lahko odrivajo proteinska vlakna zunajcelicnega matriksa in obenem ravnodovolj deformabilne, da se lahko zrinejo cez endotelijski pas. V tem kontekstu bi bilo smiselnoposkusiti z razvojem novih oblik terapije, ki bi vplivale na mehanske lastnosti invazivnih celic,npr. prek aktivacije dolocenih proteinov, ki vplivajo na omenjene znacilnosti. Ena od moznihtezav pri tem pristopu je ta, da zaenkrat ni mogoce izkljuciti moznosti, da so rakaste celicemed migracijo zmozne spreminjanja in prilagajanja mehanskih lastnosti glede na okolje, vkaterem se znajdejo4. Te spremembe naj bi povzrocale npr. lokalne variacije v elektricnempolju in razlicni biokemijski gradienti [7].

Metastatski proces je zelo neucinkovit, saj priblizno zgolj en promil vseh celic, ki se odcepiod maticnega tumorja, uspe nadaljevati z rastjo na sekundarnem mestu [12]. Po drugi stranipa je migracija celic do sekundarnega mesta zelo ucinkovita. Preko 80 % vseh celic uspe

4Problem tici pravzaprav v tem, da dolocen nabor mehanskih lastnosti ne more biti optimalen za vsestopnje procesa zasevanja.

12

priti prek krvnega sistema do drugega organa. Glavna neucinkovitost metastatskega procesaje tako povezana z nezmoznostjo rasti rakastih celic na sekundarnem mestu in mora bitiodvisna od interakcij med invazivnimi celicami in napadenim tkivom. Kot ena od razlag[12] za neucinkovitost zasevanja se omenja obstoj morebitne kriticne velikosti, ki jo morajodoseci metastaze, da se invazivne celice lahko razrastejo na sekundarnem mestu in dosezejomakroskopsko velikost. Pojav je mogoce razloziti z upostevanjem ze omenjene povrsinskenapetosti in izmenjave kemijskih signalov na stiku med invazivnim in zdravim tkivom. Vobeh primerih obstaja dolocena kriticna velikost invazivnega tkiva, pod katero se metastazene uspejo razrasti, temvec odmrejo (slika 10a). To se zgodi zato, ker zunanje napetostipresegajo homeostaticni tlak v znatnem delu rakastega tkiva. Tukaj se poraja vprasanje,kako je potem mozno, da nekateri zasevki vseeno zrastejo in dosezejo makroskopske velikosti,pri cemer vemo, da v splosnem izvirajo iz delitev ene same celice na sekundarnem mestu.Odgovor se najbrz skriva v stohasticni naravi celicnih procesov. Procesi celicnih delitev insmrti v resnici niso deterministicni, ceprav smo jih tu tako obravnavali. Zato je kljub obstojukriticne velikosti, vseeno mozno, da nekateri zasevki dosezejo makroskopske velikosti. Taksenpremislek lahko najdemo v [12], kjer so prikazani tudi rezultati simulacij tipa Monte Carloza rast ene same invazivne celice v zdravem tkivu (slika 10b). Dobljene distribucije velikostizasevkov se ujemajo z nekaterimi eksperimentalnimi opazanji.

(a) (b)

Slika 10: Casovna odvisnost rasti rakastega tkiva v sfericni geometriji ob prisotnostipovrsinske napetosti na stiku z zdravim tkivom (a) in rezultati Monte Carlo simulacij zarast ene same celice (b). Na sliki (a) so krivulje narisane za razlicne vrednosti zacetnegaradija, ki je blizu kriticni vrednosti rc = 0.5. Pri zacetnih vrednostih pod rc tkivo odmre, vobratnem primeru pa okupira celoten razplozljiv prostor. Zgornji graf na sliki (b) prikazujedelez tumorskih sferoidov, z radijem nad rc v odvisnosti od casa. Spodnji graf predstavljaporazdelitev velikosti tumorjev po 10 dneh [12].

6 Zakljucek

Zadnji tu predstavljeni rezultati kazejo, da so vse glavne znacilnosti rakastih celic (nekontroli-rana rast, napadanje okoliskega tkiva in zasevanje) povezane s spremembami biomehanskihlastnosti tkiv. Taksne spremembe zato lahko razumemo kot predpogoj za nastanek rakastihtvorb [7]. Posledicno se analiza biomehanskih lastnosti tkiv ponuja kot nova oblika zgodnjega

13

diagnosticiranja nekaterih vrst raka (npr. ustnega). Obetajo se tudi nove moznosti terapijes selektivnim vplivanjem na mehanske lastnosti rakastih tkiv. Taksna zdravila verjetno nebi unicevala rakastih celic, bila pa bi zmozna zavirati njihovo nenadzorovano razrascanje. Vvsakem primeru si upamo trditi, da je studij mehanike rakastih tkiv zelo obetavno podrocjein bo v prihodnosti verjetno delezno vse vec pozornosti.

Literatura

[1] http://physics.cancer.gov (17. 3. 2012).

[2] http://sl.wikipedia.org/wiki/Tkivo (5. 3. 2012).

[3] http://sl.wikipedia.org/wiki/Celi%C4%8Dni_skelet (7. 3. 2012).

[4] http://www.sparknotes.com/biology/cellstructure/intracellularcomponents/

section1.rhtml (25. 3. 2012).

[5] L. Graziano in L. Preziosi, v F. Mollica, K. R. Rajagopal in L. Preziosi (ur.), Modeling ofBiological Materials (Birkhauser, Boston-Basel-Berlin, 2007).

[6] http://sl.wikipedia.org/wiki/Tumor (17. 3. 2012).

[7] D. Wirtz, K. Konstantopoulos in P. C. Searson, Nat. Rev. Cancer 11, 512 (2011).

[8] O. Jonas, C. T. Mierke in J. A. Kas, Soft Matter 7, 11488 (2011).

[9] A. Fritsch, M. Hockel, T. Kiessling, K. D. Nnetu, F. Wetzel, M. Zink in J. A. Kas, Nat. Phys.6, 730 (2010).

[10] G. Helmlinger, P. A. Netti, H. C. Lichtenbeld, R. J. Melder in R. K. Jain, Nat. Biotechnol. 15,778 (1997).

[11] L. Preziosi in V. Vitale, v M. Ben Amar, A. Goriely, M. M. Muller in L. F. Cugliandolo (ur.),New Trends in the Physics and Mechanics of Biological Systems (Oxford University Press, NewYork, 2011).

[12] M. Basan, T. Risler, J.-F. Joanny, X. Sastre-Garau in J. Prost, HFSP J. 3, 265 (2009).

[13] J. Ranft, M. Basan, J. Elgeti, J.-F. Joanny, J. Prost in F. Julicher, Proc. Natl. Acad. Sci. USA107, 20863 (2010).

[14] D. Ambrosi in F. Mollica, J. Math. Biol. 48, 477 (2004).

[15] M. Basan, J. Prost, J.-F. Joanny in J. Elgeti, Phys. Biol. 8, 026014 (2011).

[16] Y. C. Fung, Biomechanics: Mechanical Properties of Living Tissues (Springer, New York, 1993).

[17] http://web.mit.edu/course/3/3.11/www/modules/visco.pdf (25. 3. 2012).

[18] F. Irgens, Continuum Mechanics (Springer, Berlin-Heidelberg, 2008).

[19] K. Kruse, J.-F. Joanny, F. Julicher, J. Prost in K. Sekimoto, Eur. Phys. J. E 16, 5 (2005).

[20] M. O. Deville in T. B. Gatski, Mathematical Modeling for Complex Fluids and Flows (Springer,Heidelberg-Dordrecht-London-New York, 2012).

[21] G. Forgacs, R. A. Foty, Y. Shafrir in M. S. Steinberg, Biophys. J. 74, 2227 (1998).

[22] F. Montel, M. Delarue, J. Elgeti, L. Malaquin, M. Basan, T. Risler, B. Cabane, D. Vignjevic, J.Prost, G. Capello in J.-F. Joanny, Phys. Rev. Lett. 107, 188102 (2011).

14