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MINISTERIO DE EDUCACIÓN Y CIENCIA INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y TECNOLOGÍA AGRARIA Y

ALIMENTARIA CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL

MEMORIA DE ACTIVIDADES 2003-2004

CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL (CISA)

Carretera de Algete a El Casar, Valdeolmos

28130 MADRID

Teléfono: 91 620 23 00

Fax: 91 620 22 47

CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL

El Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA-INIA) está situado en Valdeolmos, a 40 km de Madrid, ubicado en una finca de 34 hectáreas, con acceso controlado y restringido. Está dotado de una instalación de “Alta Seguridad Biológica", diseñada, construida y equipada para trabajar con enfermedades infecciosas exóticas y de alto riesgo para la Sanidad Animal. En él se desarrollan diferentes actividades de investigación y desarrollo tecnológico, formación científico-técnica, y de cooperación internacional. El Centro, se inauguró el 3 de Febrero de 1993. El CISA es “Gran Instalación Científica española” desde 1995.

INSTALACIÓN DE ALTA SEGURIDAD BIOLÓGICA .: La zona de alta seguridad biológica de 10.824 m2, posee unas características arquitectónicas y funcionales reconocidas internacionalmente para la consecución de la bioseguridad. La hermeticidad del edificio se consigue gracias a su estructura de hormigón armado, sellado de sus juntas externas, aire acondicionado con diferentes niveles de presiones negativas, filtración del aire a través de filtros HEPA, descontaminación de efluentes e incineración de residuos. En el interior, todas las superficies se encuentran revestidas de resinas especiales, que les proporciona aislamiento y protección. Todas las conducciones que atraviesan las paredes, suelos y techos están selladas de forma independiente. La comunicación con el exterior se realiza a través de sistemas de descontaminación de doble puerta air-locks, autoclaves de barrera y sistemas de barrera de descontaminación superficial.

Esta Instalación, con nivel de seguridad biológica 3 y 3+ , dispone de 26 Laboratorios y 14 salas comunes de nivel 3, y 2 Laboratorios de nivel de contención 3+ habilitados para trabajar y almacenar agentes infecciosos animales que eventualmente pudieran afectar al ser humano, de acceso restringido con puerta neumática y equipado con ducha convencional y química. Los trabajos realizados en los laboratorios de nivel 3+ se realizan utilizando trajes especiales con respiración autónoma, que aseguran el aislamiento y seguridad del personal. También existe un Animalario constituido por 21 estancias individuales y polivalentes diseñadas para albergar distintas especies animales, desde peces hasta ganado mayor, con medidas de bioseguridad que garantizan el trabajo in vivo incluso con patógenos transmisibles por aerosol.

El CISA coopera con el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación como laboratorio Nacional de Referencia para algunas enfermedades de la antigua Lista A de la Oficina Internacional de Epizootías (OIE). Gracias a la labor desarrollada desde su creación en investigación y desarrollo y en la lucha contra las enfermedades de mayor impacto económico y sanitario, es Centro Mundial de Referencia de la OIE para la Peste porcina africana y Peste equina africana, y Centro colaborador de la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) en varias enfermedades como Peste porcina clásica y Fiebre aftosa, así como en materia de Bioseguridad. Por estas mismas razones fue nombrado Laboratorio de Referencia de la UE de Peste porcina africana en 2002.

COMPONENTES DEL GRUPO:

• Juan María Torres Trillo Investigador A3 INIA • Alejandro Brun Torres Investigador A4 • Joaquín Castilla Castrillon Titulado Superior de Investigación y Laboratorio • Juan Carlos Espinosa Titulado Superior de Investigación y Laboratorio • Ester Martín Titulado Superior de Investigación y Laboratorio • Sergio Francisco Martín Titulado Superior de Investigación y Laboratorio • Mónica Morales Camarzana Titulado Superior de Investigación y Laboratorio • Beatriz Parra Arrondo Titulado Superior de Investigación y Laboratorio • María Eugenia Herva Becario Predoctoral INIA • José Rodríguez Benito Becario Predoctoral INIA • Rubén Agudo Torres Becario “Fundación Ramón Areces” • Fayna Díaz Sansegundo Becario Predoctoral INIA • Ana Villa Funcionario – Técnico Especialista Grado Medio • María Jesús Cano Auxiliar de Investigación y Laboratorio • Aroa Relaño Auxiliar de Investigación y Laboratorio • Helena Garuti Rodríguez Auxiliar de Investigación y Laboratorio • Nuria de La Losa Román Auxiliar de Investigación y Laboratorio • Ana María Toledo Ayudante de Mantenimiento y Oficios

OBJETIVOS DEL GRUPO

El grupo liderado por el Dr. Juan María Torres “Biología Molecular y Celular de priones” del CISA-INIA se creó en 1998. Desde su creación, el objetivo general del grupo ha sido el desarrollo de modelos de encefalopatía espongiforme transmisible basados en ratones transgénicos y cultivos celulares que permitan estudiar los elementos moleculares implicados en la replicación, en la patogénesis y en la barrera de especie de los priones. Durante estos años hemos desarrollado una serie de herramientas de gran interés en el estudio de los priones. Se han desarrollado una serie de modelos de ratones transgénicos capaces de reproducir las enfermedades producidas por priones en sus diferentes manifestaciones.

Tanto los modelos basados en ratones transgénicos como los modelos celulares nos han permitido realizar avances considerables en las diferentes líneas de investigación que se citan a continuación. Además, estos modelos se están convirtiendo en referentes de trabajo en la comunidad científica. Esto no ha permitido establecer un gran número de colaboraciones con más de 50 grupos de investigación de todo el mundo.

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR DE PRIONES

PRINCIPALES LINEAS DE I+D DEL GRUPO (2003 – 2004)

• Desarrollo de bioensayos de alta sensibilidad para la detección de priones y el

diagnostico de las enfermedades producidas por estos agentes infecciosos.

• Estudio de los elementos moleculares que determinan la transmisión y la barrera

de especie de los priones.

• Estudio de los elementos moleculares implicados en la replicación y en la

patogénesis de los priones

• Diseño y evaluación de nuevas estrategias terapéuticas contra los priones

PROYECTOS / CONVENIOS (2003 – 2004)

PROYECTOS UE FAIR5-CT97-3306 New approaches to the diagnosis and control of transmissible spongiform encephalopathies. (1998-2003)

RESUMEN DE OBJETIVOS -Desarrollar métodos de ensayo prácticos que permitan diagnosticar la encefalopatía

espongiforme bovina. -Generar nuevos anticuerpos dirigidos contra epítopos conformacionales que puedan

discriminar las formas patógena y celular de la proteína del prion PrP. -Construir ratones transgénicos que contengan el gen PrP de las especies bovina, y/o

porcina. Estos ratones transgénicos, además de permitirnos profundizar en el estudio de las barreras interespecíficas de los priones, será herramientas útiles como modelos biológicos en bioensayos.

EQUIPO INVESTIGADOR

Juan María Torres; Joaquín Castilla; Alejandro Brun; José Manuel Sánchez-Vizcaíno; Belén Pintado; Alfonso Gutiérrez; Beatriz Parra

PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS)

Se han obtenido una serie de anticuerpos monoclonales específicos para la PrP. Entre estos hay que destacar el anticuerpo monoclonal 2A11 que presenta una serie de características interesantes para su utilización en inmunohistoquimica y en western blot. Además, en este momento se están evaluando otras posibles aplicaciones comerciales en colaboración con empresas del sector.

Se han desarrollado una serie de modelos de ratones transgénicos que expresan la PrP de las especies bovina o porcina demostrando ser altamente susceptible a la infección con priones, de forma especifica de especie, desarrollando una encefalopatía espongiforme con signos clínicos característicos y con tiempos de incubación reducidos. Estos animales infectados con priones presentan alteraciones histopatológicas características en el Sistema Nervioso Central (SNC) y en ellos se detecta la presencia de PrPres resistente a proteasas. Estos modelos nos han permitido desarrollar bioensayos para estudios de detección de infectividad. De igual forma, éstos están siendo de gran utilidad para el estudio de la transmisibilidad entre especies (ovina, bovina, porcina y humana).

Algunos de estos resultados han sido incluidos en las publicaciones 1 y 2 (ver lista de publicaciones ).

• BIO2000-0578-C02-02. Funcionalidad génica y mecanismos de replicación del

virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (2001-2003)

RESUMEN DE OBJETIVOS Los objetivos en este proyecto se enfocaron a una mayor comprensión de las estrategias de transcripción y replicación de los calicivirus, las cuales se conocen muy pobremente debido sobre todo a la falta de un sistema de cultivo in vitro para la mayoría de estos patógenos. Los objetivos globales de este proyecto son: 1) El entendimiento de la replicación del genoma del RHDV desde un punto de vista molecular. 2) El establecimiento de sistemas in vitro que permitan obtener cDNAs o transcritos infectivos del virus. Estos objetivos globales deben alcanzarse a través del abordaje de otras metas concretas que de una forma esquemática se indican a continuación: 1.1) Disponer de sistemas de expresión individualizados de cada producto viral así como de anticuerpos específicos frente a los mismos. 1.2) Caracterizar estructural y funcionalmente la RNA polimerasa viral, así como el papel de la VPg en la iniciación de la síntesis de RNA mediante ensayos in vitro, in situ e in vivo. 1.3) Determinar las interacciones moleculares existentes entre los productos virales y/o del hospedador.

2.1) Investigar la infectividad de los RNAs virales in vitro e in vivo así como el papel de la VPg en este proceso. 2.2) Sintetizar cDNAs completos, tanto del genoma viral como del mensajero subgenómico del RHDV, a partir de clones parciales de cDNA o por amplificación directa del RNA aislado de los viriones. 2.3) Analizar el requerimiento de promotores y/o sistemas de transfección/hospedador necesarios para obtener transcritos sintéticos infectivos capaces de iniciar y/o completar un ciclo de replicación viral utilizando cultivos celulares o inoculación intrahepática de conejos.

EQUIPO INVESTIGADOR -Juan María Torres; -Mónica Morales PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS)

Hemos desarrollado un sistema, “in vitro”, para estudiar el mecanismo de síntesis del RNA subgenómico (sgRNA) de este virus, utilizando preparaciones de la polimerasa del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV) expresada en el sistema de baculovirus y diferentes RNAs sintéticos de polaridad negativa que contienen distintas regiones localizadas “upstream” del sitio de iniciación del RNA subgenómico. Nosotros presentamos evidencias de que el RNA subgenómico del RHDV es sintetizado “in vitro” por un mecanismo de iniciación interna de la replicación (a partir de un promotor subgenómico) presente en el RNA genómico de polaridad negativa. El análisis de este promotor, muestra que una secuencia de 50 nucleótidos “upstream” del sitio de iniciación (+1) del RNA subgenómico es suficiente para que este promotor sea activo “in vitro” en reacciones con la polimerasa recombinante del virus.

Este estudio representa la primera evidencia de un promotor subgenómico en un miembro de la familia Caliciviridae.

En cuanto a la infectividad del RNA viral, se ha estudiado la infectividad del RNA viral in vivo. Se han desarrollado DNAs completos bajo el control de los promotores T7 o CMV para generar RNAs sintéticos, tanto del genoma viral como del RNA mensajero subgenómico del virus RHDV. La capacidad de infectividad in vivo de éstos fue analizada mediante inoculación intrahepática en conejos. De los resultados obtenidos en este trabajo se pueden extraer conclusiones sobre el papel de la VPg en la replicación del RHDV y la necesidad de esta proteína para la infectividad del virus.

Algunos de estos resultados han sido incluidos en las publicaciones 5 y 7 (ver lista de publicaciones ).

SC00-055 Desarrollo de métodos de diagnóstico prácticos para la detección precoz y control de las encefalopatías espongiformes transmisibles (TSEs). (2000-2003) RESUMEN DE OBJETIVOS

El objetivo de este proyecto se ha dirigido hacia la creación de modelos animales susceptibles a la enfermedad como sistema de diagnóstico y de estudio de los priones.

EQUIPO INVESTIGADOR

Belén Pintado (Coordinador); -Juan María Torres; -Joaquín Castilla; -Alejandro Brun; -Alfonso Gutiérrez


En el último año del proyecto se terminaron de generar las líneas transgénicas con la mutación de 5 octarepeticiones y se finalizaron los procesos de caracterización de expresión y de infectividad de las portadoras de 7 y 10 repeticiones. Como avance mas destacado queremos reseñar la obtención y caracterización de una línea con un octapéptido extra en la secuencia de la proteína PrP , que logra acortar drásticamente el periodo de incubación de la enfermedad de forma proporcional a la infectividad del inóculo utilizado. Se ha demostrado también que la expresión de la mutación consistente en la presencia de 10 octarepeticiones da lugar a sintomatología en los ratones transgénicos que no está ligada a la presencia de prion infectivo, no habiendo en ningún caso resistencia a proteinasa K.

Algunos de estos resultados han sido incluidos en la publicación 4 (ver lista de publicaciones) y otra en preparación.

CAL01-018 Determinación de la Infectividad de Diferentes Tejidos de Interés Alimentario Procedentes de Animales Infectados con BSE utilizando un Modelo Basado en Ratones Transgénicos. (2001-2005) RESUMEN DE OBJETIVOS

El objetivo principal de este proyecto fue determinar la presencia de priones infectivos

en diferentes tejidos, fluidos u órganos, que pueden estar introducidos en la cadena alimenticia humana y pueden suponer un potencial riesgo de infección para el hombre. Para ello, se decidió utilizar un modelo basado en ratones transgénicos que expresan la PrPC bovina en lugar de la murina, desarrollados previamente en nuestro laboratorio (Castilla et al., 2003). Estos ratones fueron inoculados por vía oral con homogeneizados de cerebro de vacas afectadas de EEB para posteriormente estudiar la distribución de la infectividad en diferentes tejidos, a diferentes tiempos post-inoculación. Seguidamente, la infectividad en estos tejidos se determinaría mediante el bioensayo desarrollado en nuestro laboratorio basado en la inoculación intracerebral de los homogeneizados de estos tejidos en el mismo tipo de ratones transgénicos que expresan la PrPC bovina.

Paralelamente, en este proyecto proponemos desarrollar un nuevo bioensayo de alta sensibilidad, basado en ratones transgénicos que expresan PrPC bovina fusionada a un marcador. Concretamente nos proponíamos producir ratones transgénicos que, en lugar de la PrPC murina, expresaran la PrPC bovina fusionada a un marcador (luciferasa o ß-glucuronidasa).

EQUIPO INVESTIGADOR

Juan María Torres; -Joaquín Castilla; -Belén Pintado; -Alfonso Gutiérrez; -Beatriz Parra Arrondo; -Mónica Morales; -Adela Jiménez Jiménez; -José Antonio Rodríguez


Se han finalizado la mayor parte de los análisis y se han obtenido los resultados de infectividad para cada tejido a cada uno de los tiempos estudiados.

Estos resultados van a ser publicados (articulo en preparación) en breve. Estos datos están siendo de gran utilidad para profundizar en el conocimiento de las vías de diseminación de los priones durante la infección por vía oral, a la vez que nos proporcionan información sobre el riesgo asociado al consumo de ciertos tejidos procedentes de animales infectados. La extrapolación de estos resultados obtenidos en el modelo de ratón transgénico a la vaca hay que hacerla con la debida cautela, ya que las grandes diferencias entre ambas especies podrían influir significativamente en la diseminación del agente infeccioso. Aunque somos conscientes de esta realidad, la dificultad de realizar este tipo de estudios en la especie bovina, la aproximación mediante el uso de modelo de ratón transgénico PrP bovina se convierte en el sistema más adecuado y práctico para este tipo de estudios

Por otra parte se han generado dos líneas de ratones transgénicos que expresan la PrP fusionada a un marcador: - ratones transgénicos que expresan la β- glucuronidasa fusionada a la PrP-bovina - ratones transgénicos que expresan la luciferasa fusionada a la PrP-bovina.

Ambas líneas han sido inoculadas por vía intracerebral con homogeneizados de cerebro de vacas afectadas de EEB para determinar, a diferentes tiempos postinoculación, si esta PrP fusionada se transforma en PrPSC y valorar si el bioensayo con estos animales es más sensible y rápido que el utilizado de forma rutinaria en el laboratorio basado en ratones PrP bovina.

RTA02-033 Desarrollo de Líneas Celulares Susceptibles a la Infección con Priones como Modelo para el Estudio de la Replicación de los Priones y como Bioensayo de Alta Sensibilidad. (2002-2004)

El objetivo general del proyecto es establecer líneas celulares en las que el agente infeccioso de la encefalopatía espongiforme bovina (BSE) replique eficientemente, con el fin de establecer un modelo celular que permita estudiar los mecanismos moleculares implicados en la interacción prión-célula y que además pueda servir como bioensayo para la detección de infectividad en productos potencialmente contaminados con priones bovinos. Para ello se abordarán los siguientes objetivos particulares:

1. Desarrollo de líneas celulares que sobreexpresen el gen de la PrP bovina (bo-PrP).

2. Estudio de la capacidad de replicación de los priones bovinos en las líneas celulares desarrolladas en el objetivo 1.

3. Desarrollo de un nuevo bioensayo de alta sensibilidad, basado en líneas celulares que sobrexpresan PrPC bovina fusionada a un marcador.

EQUIPO INVESTIGADOR Juan María Torres; -Alejandro Brun; -Beatriz Parra Arrondo; -Mónica Morales; -María Eugenia Hervá


En este proyecto se han obtenido varias líneas de células epiteliales RK13 que expresan la PrPc bovina con 6, 7 ó 10 octapéptidos o fusionada al gen de la luciferasa o glucuronidasa. Estas células nos han permitido llegar a las siguientes conclusiones: - La expresión de la PrPc bovina en la línea celular epitelial RK13 no altera significativamente la

viabilidad celular, el fenotipo o el crecimiento celular. Lo mismo ocurre con la expresión de la PrPc bovina con una inserción mutacional en la región de los octapéptidos repetidos.

- La PrPc bovina, con 6 ó con 7 octapéptidos repetidos, expresada en la línea celular RK13 se encuentra en la superficie celular anclada por un grupo GPI; está glicosilada en los aspárticos 181 y 197 y se localiza en los dominios ricos en colesterol de la membrana plasmática, igual que la PrPc bovina salvaje.

- Resultados preliminares de la PrPc bovina fusionada al gen de la luciferasa o de la β- glucuronidasa en la línea celular epitelial RK13 parecen no alterar significativamente la viabilidad celular, el fenotipo o el crecimiento celular.

- Las células RK13 que expresan niveles elevados de PrP bovina con 6 ó con 7 octapéptidos repetidos son incapaces de amplificar los priones después de una inoculación con extractos de cerebro procedentes de vacas o de ratones transgénicos afectados de EEB. Este resultado, junto con el hecho de que células RK13 que expresan la PrPc ovina han demostrado ser altamente eficientes en la replicación de los priones ovinos, sugiere que el agente causal de la EEB tiene unos requerimientos celulares adicionales o diferentes a scrapie para su replicación en cultivos celulares. Algunos de estos resultados se han incluido en una publicación en preparación

QLRI-CT-2002-81333 Development, of Improved Bioassays for the detection and Characterization of TSE Agents Based on the Bank Vole, A Wild Rodent Species Highly Susceptible To Scrapie, and Investigation on Its Posible Role in Scrapie Epidemiology. (2002-2005) RESUMEN DE OBJETIVOS

Estudios recientes indican que el campañol (Clethrionomys glareolus), un roedor silvestre es

un modelo animal mucho más sensible a la infección por scrapie que ratones convencionalespor lo que puede representar un sistema muy prometedor para mejorar los modelos actualesbasados en la utilización de ratones de laboratorio (Mus musculus).

Por otra parte, la susceptibilidad de el campañol a priones procedentes de animales afectados por la encefalopatía espongiforme bovina (EEB), es mucho menor, por lo que esta discrepancia con respecto a la susceptibilidad a priones de scrapie contiene elementos de interés para discernir qué factores genéticos a nivel de la secuencia del gen PrP están influyendo en la mayor o menor susceptibilidad a la infección. En el presente proyecto coordinado, nuestro grupo se propone determinar aquellas regiones dentro de la secuencia del gen de la proteína del prión del ratón de campo que limitan la capacidad de infección de los priones procedentes de animales afectados de EEB. Otro abordaje, una vez identificadas las secuencias implicadas será el de generar ratones transgénicos que expresen estas proteínas mutantes capaces de transformarse Los animales generados serán infectados experimentalmente con priones EEB con el objeto de comprobar si los tiempos de incubación disminuyen sensiblemente frente a la infección de campañol o de raton trasngénico que expresan la PrP bovina

EQUIPO INVESTIGADOR -Juan María Torres; -Joaquín Castilla; -Alejandro Brun; -Belén Pintado; -Alfonso Gutiérrez -Juan Carlos Espinosa; -Sergio Francisco Martín PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS) Hemos podido confirmar que la PrP del campañol es mucho menos susceptible a la transformación con Priones de la BSE que otras PrPs de otras especies. Aunque aun no hemos podido localizar los elementos implicados en esta susceptibilidad diferencial, hemos conseguido desarrollar ratones transgénicos que expresan el gen de la PrP del campañol. Estos ratones están siendo analizados en relación a su susceptibilidad a BSE y a scrapie lo que nos permitirá concluir si los elementos determinantes de la susceptibilidad diferencial a BSE mapean en el gen de la PrP o si por el contrario son elementos no asociado a la secuencia de la PrP.

EET2001-4217-C02-02 Inmunoterapia aplicada a enfermedades producidas por priones. (2002-2005) RESUMEN DE OBJETIVOS

El objetivo general de este proyecto es el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de las enfermedades producidas por priones en los seres humanos. Estas estrategias se basarán en la estimulación del sistema inmunitario (respuesta humoral y celular) frente a la aparición de formas aberrantes de la proteína del prión tanto en infecciones experimentales, como en modelos que desarrollen la enfermedad espontáneamente. Para poder valorar in vivo las diferentes estrategias inmunotérapeuticas desarrolladas, se propone el desarrollo de modelos biológicos experimentales. Para conseguir este último objetivo, obtendremos ratones transgénicos que expresen el gen de la PrP humana con mutaciones asociadas a patología con el fin de desarrollar modelos biológicos que mimeticen las diferentes formas etiológicas de las encefalopatías espongiformes descritas en humanos.

EQUIPO INVESTIGADOR -Juan Maria Torres; -Joaquín Castilla; -Alejandro Brun PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS) En colaboración con el grupo del Dr. Fernando Rodríguez, hemos podido demostrar que la inmunización con DNA rompe la tolerancia inmunitaria contra la PrP, induciendo una respuesta inmune celular y humoral específica para la PrP. En estas condiciones hemos podido demostrar que la inmunogenicicidad de la PrP se ve incrementada cuando se presenta fusionada al peptido señal de transporte al lisosoma (LIMPII). Además los ratones inmunizados con vacuna DNA PrP-LII mostraron un significativo retraso en la aparición de signos cuando se desafiaron por vía intracerebral con priones. Algunos de estos resultados han sido incluidos en las publicaciones 3 (ver lista de publicaciones) y otra enviada a publicar).

Paralelamente se han generado ratones transgénicos que expresen el gen de la PrP con mutaciones asociadas a patología con el fin de desarrollar modelos biológicos que mimeticen las diferentes formas etiológicas de las encefalopatías espongiformes descritas en humanos. - Ratones transgénicos expresando la PrP humana con la mutación E200K (asociada a CJD) -Ratones transgénicos expresando la PrP humana con la mutación D178N (asociada a FFI) -Ratones transgénicos expresando la PrP humana con la mutación A117V (asociada a GSS).

QLK3-CT-2002-01309 European project to study of BSE strain in sheep (2003-2007) RESUMEN DE OBJETIVOS

En el presente proyecto se pretende estudiar cuál es el comportamiento de los priones que originan la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) después su adaptación o “pase” por otras especies. En otras palabras, se trata de conocer si el prión responsable de la EEB representaría un riesgo real para el consumo humano tras su pase a través de diferentes especies. Nuestro grupo se propone determinar la infectividad de priones procedentes de animales afectados de EEB tras su adaptación o “pase” en oveja y cerdo. Por razones obvias el empleo de estos animales dificultaría enormemente la tarea. Por esta razón se emplearán ratones trangénicos que expresan el gen de la proteína del prión ovino o porcino. Los priones obtenidos en estos modelos se emplearán para efectuar infecciones experimentales en ratones transgénicos que expresan la proteína del prión humano con diferentes polimorfismos en el codón 129. Como control positivo de estos experimentos se emplearán priones bovinos procedentes de ganado afectado de EEB y pasados en ratones que expresan la PrP bovina. Como controles negativos se utilizarán priones de scrapie procedentes de casos de campo y pasados en ratones transgénicos que expresan la PrP ovina.

EQUIPO INVESTIGADOR -Juan Maria Torres; -Juan Carlos Espinosa; -Alejandro Brun; -Belén Pintado; -Alfonso Gutiérrez


Nuestro grupo ha generados los ratones transgenicos que expresan la PrP humana M129M y V129V. Estos animales se han inoculado con diferentes aislados de BSE, BSE pasado por oveja y scrapie para su caracterización. Los primeros resultados no se obtendrán previsiblemente hasta dentro de un año.

EET-2002-05140 Estudio de la Transmisiblidad de la EEB y del Scrapie a la Especie Porcina. (2003-2006) RESUMEN DE OBJETIVOS

Teniendo en cuenta que el ganado porcino fue alimentado con los mismos piensos contaminados que dieron origen a la EEB cabe la posibilidad de que esta especie se haya infectado de igual forma. Dado que inicialmente se presupone que los dos agentes priónicos responsables del inicio y mantenimiento de la epidemia fueron el scrapie y la EEB, en este proyecto se propone estudiar si ambos agentes patógenos tienen capacidad para infectar al cerdo. Todas las EETs son enfermedades que cursan con largos periodos de incubación, por lo que para realizar los estudios de transmisibilidad es necesario mantener un gran número de animales durante un largo espacio de tiempo. Por ello, para la realización de estos estudios se hace necesario la utilización de modelos basados en ratones transgénicos que al expresar la PrPC porcina en lugar de la PrP murina mantienen un comportamiento similar al que tendría la especie porcina en un estudio de transmisión. En el presente proyecto se pretende realizar un estudio de la transmisibilidad de los agentes responsables de la EEB y del scrapie en el cerdo utilizando modelos de ratones transgénicos generados previamente por los investigadores responsables del proyecto.

EQUIPO INVESTIGADOR -Juan Maria Torres; -Joaquín Castilla; -Juan Carlos Espinosa; -Maria Eugenia Hervá PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS)

Como se mencionó en el informe de seguimiento del primer año, el único inoculo que resultó infeccioso en estos ratones transgénicos porcinos, fue BSE2 (de alta carga priónica), demostrándose la patología por la presencia de rasgos clínicos compatibles con patología priónica, así como la detección de PrP resistente a la digestión con PK, tanto por inmunohistoquímica como por inmunoblot. Si bien, la baja proporción de animales positivamente infectados (en torno al 15%), junto con la ausencia de detección de animales positivos inoculados con EEB pero con baja carga priónica (inóculo BSE1) sugieren la existencia de una elevada barrera de especie. Como resultado de la realización del segundo pase de BSE2 en poPrPTg001 se observa una muy elevada infectividad con una notable reducción de los tiempos de incubación de la enfermedad, lo que demuestra la adaptación del prión del agente causal de la EEB al genotipo porcino en el modelo de ratón transgénico que expresa la PrP porcina. Estos resultados han dado lugar a una importante publicación en J Neurosci. (6) -Ver lista de publicaciones.

Hasta el momento, ninguno de los animales inoculados con los diferentes inóculos de Scrapie utilizados ha resultado positivo para la detección de PrP resistente a la digestión con PK por inmunoblot, inmunohistoquímica y ELISA. Una alta barrera de especie parece evidente para Scrapie, pero no podemos descartar que en los próximos meses aparezca algún positivo, aunque con tiempos de incubación muy largos.

EET2001-4814-C02-01 Excreción y Transmisión de Proteínas Priónicas a Través de Aguas Residuales y Contaminación Fecal. (2003-2005) RESUMEN DE OBJETIVOS El objetivo global de este proyecto es conocer los niveles de excreción de las proteínas priónicas por parte de animales y del hombre, así como hacer un estudio del comportamiento de estas proteínas en el ambiente y su estabilidad frente a los procesos de descontaminación que se aplican a las aguas residuales y lodos de depuradora. Los datos que se obtendrán permitirán conocer los niveles de contaminación por priones que pueden afectar a través de la contaminación fecal, al agua, alimentos y al ambiente, así como aportar datos sobre los mecanismos de transmisión de las enfermedades EET animales y humanas y de la presencia de proteínas priónicas en otros animales de granja

EQUIPO INVESTIGADOR En este proyecto Juan Maria Torres participa como investigador de otras entidades en el grupo de la Dra. Rosina Girones de la Universidad de Barcelona PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS) Se ha hecho importantes avances en el desarrollo de técnicas que puedan detectar la presencia de priones en aguas residuales aunque hasta el momento no tenemos resultados sobre la presencia de estos en aguas residuales

EET2002-05168-C04-02 Estudio Neuropatológico en un Modelo Experimental Murino de la Encefalopatia Espongiforme Bovina. (2003-2006) RESUMEN DE OBJETIVOS

La finalidad de este proyecto de investigación es contribuir al conocimiento de la patogenia de la Encefalopatía Espongiforme Bovina (EEB), comparándolas con los estudios realizados en otras especies y en la especie humana, determinando cómo los priones una vez atravesados el epitelio tonsilar y la barrera intestinal, acceden al tejido nervioso asociado al tubo digestivo (Sistema Nervioso Entérico, SNE), que vías de diseminación y elementos celulares utilizan para llegar al sistema nervioso central (Sistema Nervioso Periférido y Autónomo, SNP y SNA) y los cambios que inducen en el mismo. Para ello, determinaremos el cuadro lesional que produce dicha enfermedad en un modelo murino, utilizando ratones transgénicos que expresan el gen de la PrP bovina, inoculándolos con el agente de la EEB. Asimismo, se estudiarán los cambios celulares implicados en el establecimiento de los cambios morfológicos y clínicos que caracterizan a la EEB. Se determinará la participación de las vías nerviosa en el proceso de neuroinvasión: la difusión de los priones desde el intestino hasta el sistema nervioso central, determinando los elementos celulares y los mediadores químicos implicados. Se estudiará en particular, el sistema nervioso central, tanto el patrón lesional, focalizado en los cambios que afectan a neuronas (la muerte celular y la pérdida neuronal, cambios en citoesqueleto y transporte axonal, proteínas sinápticas), a la matriz extracelular, la implicación de las células gliales y los cambios relacionados con el estrés celular que pùedan afectar a dichas poblaciones celulares. Por último, también se estudiarán los posibles genes alterados en la EEB y su participación en esta enfermedad para entender la patogenia de las EETs, estudiando genes involucrados en la muerte neuronal y en la proliferación glial, ampliando este estudio a genes ralacionados con el metabolismo energético, transducción de señal y transcripción

EQUIPO INVESTIGADOR Juan Maria Torres; Alejandro Brun PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS)

Se han obtenido muestras a los diferentes tiempos de inoculación y se está procediendo a su análisis mediante técnicas histopatológicas e inmunohistoquímicas. Igualmente a partir de muestras tomadas a diferentes tiempos se ha procedido a la extracción de RNA tisular para la obtención de cDNAs y su posterior marcaje con sondas Cy3 fluorescentes. Estos cDNAs marcados serán en un momento posteior empleados para la hibridación de microarrays comerciales Debido a los largos tiempo de incubación, característicos de estas enfermedades, aún no se tienen resultados dignos de mención aunque el proyecto transcurre conforme a lo previsto en lo que respecta al subproyecto desarrollado por el equipo investigador del CISA..

PRO-CT2004-506579 NoE Neuroprion (Prevention, control and treatment of prion diseases) (2004-2008)

RESUMEN DE OBJETIVOS

El objetivo general de la Red de Excelencia “Neuroprión” es estructurar e integrar los esfuerzos de investigación de los principales grupos de investigación europeos involucrados en enfermedades producidas por los priones. El programa conjunto de actividades de investigación está enfocado en Prevención (diagnostico y descontaminación), control (epidemiología y definición de Standard), tratamiento (especialmente diseño de nuevas estrategias terapéuticas) y análisis de riesgo de las TSEs.

Dentro de la Red de Excelencia “Neuroprión” nuestro grupo recibe financiación para el desarrollo de cuatro actividades u objetivos:

1.- Desarrollo de un método de diagnóstico ante-morten de las enfermedades de priones mediante proteómica.

2.- Desarrollo de bioensayos celulares susceptibles a la infección con priones.

3.- Estudio y evaluación de estrategias terapéuticas contra priones basadas en células madre del sistema nervioso central de ratones nulos para el gen de la PrP. 4. Desarrollo de nuevos sistemas de tipado de estirpes de priones

EQUIPO INVESTIGADOR

Juan M. Torres; Juan C. Espinosa; Mónica Morales; Belen Pintado; Alfonso Gutierrez; María E. Hervás

PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS) Este proyecto, además de permitirnos afianzar nuestras relaciones con el resto de los 52 grupos de investigación europeos integrados en la Red, nos ha permitido realizar importantes avances en los 4 temas en los que nuestro grupo está implicado. 1.- Utilizando nuestro modelo de ratones transgenios PrP-bovina, hemos determinado dos marcadores en suero que parecen específicos de ratones infectados. En la actualidad estamos procediendo a su identificación. 2.-Hemos obtenido neuroesferas de los diferentes modelos de ratones transgénicos generados previamente en el laboratorio y estamos estudiando su susceptibilidad a la infección con priones. 3.- Hemos obtenido células madre neurales y embrionarias de ratones nulos para el gen de la PrP y estamos evaluado su capacidad neuroregenerativa tras su implantación en el cerebro de ratones afectados de EEB. 4.-Hemos determinado algunas características bioquímicas y biológicas de BSE que solo son dependientes de cepa y que son independientes de la secuencia de la PrP de cada especie. Esto nos ha permitido proponer un sistema de diagnostico diferencial de EEB en otras especies (especialmente en oveja y humanos). Algunos de estos resultados han sido incluidos en una publicación en preparación.

CONVENIOS CC04-001 INIA-INGENASA Generación selección y caracterización diagnóstica de anticuerpos monoclonales frente a la proteína del prión (PrP)


Mediante técnicas inmunológicas convencionales se pretende obtener anticuerpos monoclonales capaces de reconocer específicamente a la proteína del prión (PrP). Para maximizar la afinidad (la fuerza de unión del complejo antígeno-anticuerpo) de los anticuerpos obtenidos y, por tanto, aumentar la sensibilidad en la detección de la proteína del prión, se emplearán células de mieloma previamente seleccionadas por carecer de expresión endógena de PrPC. Los anticuerpos obtenidos, se caracterizarán bioquímicamente y se emplearán en la puesta a punto de ensayos para la detección de priones ovinos (scrapie) y bovinos (BSE) en muestras de campo empleando una colección de muestras positivas y negativas confirmadas. Para la realización de estos ensayos se contará con personal de la empresa biotecnológica INGENASA especializado en el desarrollo de anticuerpos monoclonales.

EQUIPO INVESTIGADOR Juan María Torres (INIA); Alejandro Brun (INIA) PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS) Se ha obtenido una colección de 20 anticuerpos monoclonales específicos de la proteína del prión (PrP) de diversas especies de mamíferos. Se está procediendo a su caracterización en más detalle. Asimismo se ha obtenido y estabilizado una línea celular de mieloma carente de expresión de PrP

PUBLICACIONES (2003 – 2004)

ARTICULOS EN REVISTAS SCI

1. J Castilla, A Gutiérrez Adán, A Brun, B. Pintado, MA. Ramírez, B Parra, D Doyle, M Rogers, FJ. Salguero, Carmen Sánchez, JM Sánchez-Vizcaíno, and J. M. Torres. Early Detection of Prpres in Bse-Infected Bovine Prp Transgenic Mice. Archives of virology 148: 677-691. (2003)

2. A Brun, J Castilla, MA. Ramírez, K Prager, B Parra, FJ. Salguero , D Shiveral, Carmen Sánchez, JM Sánchez-Vizcaíno, A Douglas and JM Torres Proteinase K enhanced immunorreactivity of the prion protein specific monoclonal antibody 2A11. Neuroscience Research 48(1): 75-83. (2004) 37(7): 648-653. (2003)

3. A Brun, J Castilla, B Parra, F. Rodríguez, and JM Torres. Implicación del sistema inmune en la patogénesis de las encefalopatías espongiformes transmisibles. Rev. Neurol; 37 (7): 648-653. 2003

4. J Castilla, A Gutiérrez Adán, A Brun, B. Pintado, B Parra, MA. Ramírez, FJ. Salguero, F. Díaz San Segundo, A. Rabano, MJ Cano and JM Torres Differential behaviour to BSE infection in bovine PrP transgenic mice with one extra repeat octapeptide insert mutation. Journal of Neuroscience. The Journal of Neuroscience,24 (9) :2156-2164 (2004)

5. J. Bárcena, N. Verdaguer, R. Roca, M. Morales, I. Angulo, C. Risco, J.L. Carrascosa, J. M. Torres and J. R. Castón “The coat protein of Rabbit hemorrhagic disease Virus contains a molecular switch at the N-terminal region facing the inner surface of the capsid”. Virology (2004), 322, 118-134

6. J. Castilla, Alfonso Gutiérrez-Adán, Alejandro Brun, Deirdre Doyle, Belén Pintado, Miguel A. Ramírez, Francisco J. Salguero, Beatriz Parra, Fayna Díaz San Segundo, José M. Sánchez-Vizcaíno, Mark Rogers, and Juan M. Torres* “Subclinical BSE infection in transgenic mice expressing porcine PrPC” Journal of Neuroscience. V.24 (21:5063-5069). 2004

7. M. Morales, Boga, J.A., J. Bárcena, M.A. Ramírez, F. Parra y J.M. Torres "Synthesis in vitro of rabbit haemorrhagic disease virus subgenomic RNA by internal initiation on sense genomic RNA. Mapping of a subgenomic promoter" J. Biol. Chem. 279, 17013-1701 (2004).

OTROS ARTICULOS

1. J.C. Espinosa, F. Díaz-San Segundo, B. Parra, J.A. Rodríguez, M.E. Herva, A. Relaño-Ginés, A. Brun, M. J. Cano, M. Morales y J. M. Torres. Susceptibilidad y resistencia al Scrapie. Mundo Ganadero. Nº 169: 65- 70. Septiembre 2004.

2. J.C. Espinosa, M. Morales, R. Agudo, M.E. Herva, B. Parra, A Brun y JM Torres. Biología de las enfermedades asociadas a la proteína del prion (PrP) (Revisión). Actualizaciones en Neurología, Neurociencias y envejecimiento 1(3): 172-179 (2003).

3. M. Morales, J. Bárcena, M. A. Ramírez, J. A. Boga, F. Parra, J. M. Torres. Detection of a calicivirus subgenomic promoter.” In “Proceedings of the 6th International Congress of the European Society for Veterinary Virology”. (2003).

4. J. Bárcena, M. Morales, R. Estévez, M. Ramírez and J.M. Torres. Amplification of the full-length Feline Calicivirus genome by “long RT-PCR” and transcription of infectious RNA directly from the amplicon”. In “Proceedings of the 6th International Congress of the European Society for Veterinary Virology”. (2003).

PONENCIAS PUBLICADAS

-Seminario Internacional Fundisa. “Epizotias: Riesgos para el consumidor” Juan M. Torres. Auditorio Mapfre (Octubre 2003).

TESIS DOCTORALES, DIPLOMAS DE ESTUDIOS AVANZADOS

Directores de Tesis: Juan María Torres y Juan Barcena Doctorando: Miguel Angel Ramírez Título: “Desarrollo de una vacuna recombinante y transmisible frente a la mixomatosis y la enfermedad hemorrágica del conejo para su aplicación en conejo silvestre”. Universidad: Complutense de Madrid Facultad / Escuela: Facultad de Veterinaria. Presentación: 17 de Noviembre de 2003: Directores de Tesis: José Manuel Sánchez-Vizcaíno y Alejandro Brun Doctorando: Fayna Díaz San Segundo Título: Estudios de transmisibilidad de la EEB al ganado porcino Universidad: Complutense de Madrid Facultad / Escuela: Departamento de Sanidad Animal de la Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid (UCM). Presentación (DEA): julio de 2003

OTRAS ACTIVIDADES DEL GRUPO: SERVICIOS, INFORMES, CURSOS

SERVICIOS

Juan Maria Torres y Mónica Morales. Seguimiento y participación en el desarrollo del convenio CC03-034 (INIA-FEDENCA-FUNDACIÓN BIODIVERSIDAD-SYVA)

INFORMES

Juan María Torres. Evaluación de proyectos de investigación: -Varias convocatorias del Plan Nacional de I+D+I -Varias convocatorias de NoE neuroprion - Convocatoria “TSE Research requirements” DEFRA (UK)

CURSOS

• Juan M. Torres. Tutor Externo de la asignatura de “Estancias” tutelando 200 horas de practicas a alumnos de 2º ciclo de la Fac . Veterinaria de la Univ. Complutense.

• Juan M. Torres.Profesor del Curso de Enfermedades Exóticas del CISA-INIA • Juan M. Torres. Profesor del:”Master de Salud Pública” Escuela Nacional de Sanidad. • Juan M. Torres. Profesor del curso de doctorado “Curso de Ingeniería de genomas

virales como vectores para vacunas y terapia génica” Universidad Autónoma de Madrid.

• Juan M. Torres. Profesor del “Titulo de especialista universitario en Sanidad Ambiental” de la Universidad S.E.K. Impartiendo los Temas: -“Organismos modificados geneticamente, tecnología, utilidad”.

-“Organismos modificados genéticamente, riesgos para la salud y el medio ambiente”. • Beatriz Parra. Profesor del Curso de Enfermedades Exóticas del CISA-INIA. • Mónica Morales. Profesor del Curso de Enfermedades Exóticas del CISA-INIA

OTRAS

Juan Maria Torres. Member of the executive committee of NoE neuroprion

ESTANCIAS EN EL GRUPO DE PERSONAL DE OTRAS ENTIDADES: 1. Dr. Olivier Andréoletti UMR959 INRA-ENVT Institut de la Recherche Agronomique

Toulouse-France (Julio a Septiembre 2004) 2. Carlos Maluquer de Motes Porta. Dep. Microbiology, Faculty of Biology. University of

Barcelona ( Agosto 2004). 3. Dr. Gustavo Farias. Universidad de Santiago de Chile. Estancia de 5 meses desde

Septiembre de 2003. Beca AECI. 4. Paula Saa Prieto. Becaria de Serono (Enero a Agosto de 2003). 5. Mónica Morales Camarzana. SYVA (2004). 6. Julia García Miguet INGENASA. (Septiembre a Diciembre 2004). 7. Acogida de varios grupos en el marco del programa Acces.

COLABORACIÓN CIENTÍFICA CON OTROS ORGANISMOS

El grupo mantiene una estrecha colaboración científica con un total de 52 grupos de entidades públicas europeas y 4 de entidades privadas.


• Alejandro Brun Investigador titular • Rosa María Montón Becaria Finnova-CAM (1/05/2004-1/05/2005) • Andrés García Estudiante Facultad de Veterinaria (agosto

2004)

OBJETIVOS DEL GRUPO

Investigación dirigida al estudio de diversos aspectos de la enfermedad de la Fiebre del Valle del Rift, en particular la puesta a punto de métodos para el diagnóstico molecular, serológico y/o antigénico así como el diseño de nuevas vacunas más eficaces frente a la enfermedad. Asimismo, profundizar en la patogenia de la infección tanto en modelos murinos como de pequeños rumiantes.


Clonación molecular en vectores de expresión eucariota y procariota de diferentes genes estructurales del virus y estudio de su expresión en sistemas heterólogos. Purificación de antígenos virales para la puesta a punto de ensayos inmunoenzimáticos para el diagnóstico serológico (ELISA). Desarrollo de herramientas para el diagnóstico antigénico (anticuerpos monoclonales) Adaptación a tiempo real de técnicas de detección molecular del virus (one sep RT-PCR) Establecimiento de modelos murinos de infección y estudio de la respuesta inmunológica frente a nuevos desarrollos vacunales

ENFERMEDADES EMERGENTES (FIEBRE DEL VALLE DEL RIFT)


PROYECTOS GR/SAL/0466/2004 “Valoración de la respuesta inmunológica inducida frente a antígenos del virus de la Fiebre del Valle del Rift mediante inmunización con DNA en ovinos.” (2004-2005)

RESUMEN DE OBJETIVOS • El objetivo concreto que se pretende en este proyecto es el de valorar la eficacia

de la inmunización con DNA de antígenos del virus de la fiebre del valle del Rift en la inducción de respuestas inmunológicas en el modelo ovino. Para ello el proyecto se desarrollará con el ánimo de completar los siguientes objetivos específicos:

1.-Obtención de construcciones genéticas para la expresión de antígenos del virus de la fiebre del valle del Rift (RVFV) bajo el control de los promotores del citomegalovirus murino (CMV) y T7/lac 2.-Comprobación de la expresión de antígenos del RVFV en cultivos celulares y purificación de proteínas recombinantes expresadas en sistemas procarióticos. 3.-Ensayos de Inmunización con DNA en ovejas y valoración de la respuesta inmunológica obtenida EQUIPO INVESTIGADOR Alejandro Brun (CISA); Belén Borrego (CISA); Javier Salguero (CISA); Investigador contratado (a incorporar en 2005);Fernando Rodríguez González (CReSA)

PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS) Se han obtenido diversas construcciones genéticas con antígenos del virus en diferentes sistemas, en particular plásmidos de expresión eucariótica codificando la preglicoproteína G2/G1 del virus, las glicoproteínas G1 y G2 y la nucleoproteína N bajo control del promotor del citomegalovirus murino CMV. Por otra parte idénticas construcciones se han obtenido en vectores de expresión bacteriana para generar proteínas recombinantes fusiónadas a GST. En el momento actual nos encontramos analizando la expresión de dichos antígenos en sistemas celulares eucariotas (BHK, COS, RK13) y bacterianos (BL21) así como la capacidad inmunogénica de los mismos mediante administración intramuscular de DNA en ratones.

CONVENIOS Proyecto de colaboración entre el CISA y el International Livestock Research Institute (ILRI) “Development of new diagnostic assays and epidemiological surveillance of viral pathogens of livestock in Sub-Saharan and North Africa.” (acuerdo de 31 octubre 2003). (2004 – 2007)

RESUMEN DE OBJETIVOS Se enumeran a continuación los objetivos que se persiguen • Desarrollo de un ensayo RT PCR en un solo paso para la detección temprana del virus

en el Ganado y estudiar la prevalencia del virus en vectores en Africa subsahariana.

• Desarrollar y validar test de detección de anticuerpos para la enfermedad basadoe en la expresión de antígenos recombinantes

• Apoyar el desarrollo por parte de Kenyan Agriculture Research Institute de una vacuna

basada en evectores capropox recombinantes a través del análisis de la respuesta inmunológica.

• Aplicación de las técnicas de detección moleculares en el estudio de la prevalencia en

mosquitos en colaboración con instituciones de Senegal EQUIPO INVESTIGADOR Alejandro Brun Torres (CISA); Richard Bishop (ILRI) PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS) Se ha optimizado la técnica de aislamiento de RNA a partir de cultivos celulares y se trabaja en su aplicación a partir de muestras de sangre. Se ha comprobado las condiciones para un ensayo convencional de RT-PCR para su aplicación a RT-PCR de un solo paso. Simultáneamente se está comenzando a aplicar una serie de standards para control en RTPCR a tiempo real. Del mismo modo se han obtenido construcciones genéticas para el análisis de la expresión de antígenos recombinantes.


CURSOS

Universalia. 2003 (Vitoria-Gasteiz, 27-31 de octubre de 2003) Ponencia: Enfermedades emergentes: la amenaza global

OTRAS First EDEN workshop (Montpellier, 28- 29 de enero de 2003). Discusión de cuestiones científicas relevantes para la implementación del proyecto integrado EDEN (Epizootic Diseases European Network) Second Meeting EPIZONE (Amsterdam 25 de noviembre de 2004) Reunión para la organización de la red de excelencia de laboratorios europeos especializados en control e investigación de epizootias.


• Margarita Saiz Ramón y Cajal • Mónica Gutiérrez Rivas Juan de la Cierva • Gema Alcaraz Auxiliar de Investigación y Laboratorio • Miguel Rodríguez Pulido Becario Tecnólogo INIA • Manuel Navarro Álvaro Becario FINNOVA

OBJETIVOS DEL GRUPO

Caracterización de los mecanismos de control de la expresión génica del virus de la fiebre aftosa implicados en virulencia


• Caracterización funcional de regiones no codificantes del genoma viral

• Desarrollo de nuevos modelos de infección in vivo de RNA de FMDV

• Estudios de tropismo de FMDV

REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GENICA E INFECTIVIDAD DEL VIRUS DE LA FIEBRE

AFTOSA


PROYECTOS QLK2-CT-2002-01719 “Foot-and-mouth disease virus: the molecular basis of tissue tropism (FMD tropsim)” (2002-2005)

RESUMEN DE OBJETIVOS Determinar el uso de integrinas por el virus y su correlación con la secuencia aminoacídica de la región de la cápsida implicada en la interacción. EQUIPO INVESTIGADOR M. Sáiz; Mónica Gutiérrez; F. Sobrino; J.I. Núñez

PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS) Se ha generado una batería de mutantes en el entorno RGD con distinto fenotipo en relación a su interacción con el receptor in vitro. Se está estudiando la preferencia de integrinas de la familia RGD-dependientes en células mediante transfección. RTA03-201 Identificación y estudio de regiones reguladoras en el genoma del virus de la fiebre aftosa: implicaciones en virulencia y respuesta inmune. (2003-2005) RESUMEN DE OBJETIVOS Identificar determinantes de atenuación viral y su posible aplicación al diseño de vacunas. EQUIPO INVESTIGADOR M. Sáiz ; Ana Canals PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS) Se ha estudiado la funcionalidad de las regiones 5´y 3´del genoma y se está analizando la posible atenuación de mutantes con deleciones en estas regiones.



1. Baranowski, E., Molina, N., Núñez, J.I. Sobrino, F. and Sáiz, M. Recovery of infectious foot-and-mouth disease virus from suckling mice after direct inoculation with in vitro

transcribed RNA. J. Virol. 77, 11290-11295 (2003).

2. M.Sáiz, De la Morena, E.Blanco, JI.Nuñez, Fernández y JM Sánchez-Vizcaino. Detection of Foot and Mouth Disease Virus from Culture and Clinical Samples by Reverse-Transcription Pcr and Restriction Analysis. Veterinary Research. 34, 26-28 (2003)


• Francisco Sobrino Investigador titular • Belén Borrego Titulado Superior de Investigación y Tecnología • Lilliane Ganges Titulado Medio de Investigación y desarrollo • Horacio Serrano Rivera Colaboración científica • Paloma Fernández Pacheco Técnico de Investigación y Laboratorio


• Respuesta inmune frente al virus de la fiebre aftosa en cerdo: desarrollo de nuevas

vacunas • Estudio de las bases moleculares de la patogenia del virus de la fiebre aftosa

BIOLOGÍA MOLECULAR DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA


PROYECTOS • FAIR-CT98-4032 Development of improved methods for the diagnosis of foot and

mouth disease. (1999 – 2003) • BIO2002-04091-C03-02 Nuevas estrategias vacunales frente al virus de la fiebre aftosa

y estudio de los mecanismos implicados en la patogenicidad viral (2002-2005) • CAM 09/139/2003 Desarrollo de una vacuna frente a la fiebre aftosa basada en

subuniades víricas. (2003-2005)

• QLK2-CT-2002-01304 Optimizing DNA based vaccination against FMDV in sheep and pigs. (2002 – 2005)

PRINCIPALES RESULTADOS DEL GRUPO 2003 - 2004:

Se ha continuado avanzando en el desarrollo de nuevas vacunas basadas en subunidades virales, empleando tanto péptidos sintéticos como vacunas DNA, para dos enfermedades de importancia ganadera como la fiebre aftosa y la peste porcina clásica. Paralelamente, se han proseguido los estudios encaminados a entender los mecanismos que median la patogenicidad de virus RNA en sus hospedadores naturales.


ARTÍCULOS EN REVISTAS SCI

1. Baranowski, E., Molina, N., Núñez, J.I. Sobrino, F. and Sáiz, M. Recovery of infectious foot-and-mouth disease virus from suckling mice after direct inoculation with in vitro transcribed RNA. J. Virol. 77, 11290-11295 (2003).

2. Domingo, E., Escarmis, C., Baranowski, E., Ruíz-Jarabo, C., Núñez, J.I. and SobEvolution of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 91, 47-63 (2003).

3. Domingo, E., Escarmís, C., Baranowski, E., Ruiz-Jarabo, C.M., Carrillo, E., Nuñez, J.I. and Sobrino, F. Evolution of foot-and-mouth disease virus. Virus Research, 91, 47-63. R (2003).

4. M.F., Rosas, E. Martínez-Salas, and F. Sobrino, Stable expression of viral antisense RNAs from both 5' and 3' non-coding regions confers heterotypic inhibition to foot-and-mouth disease infection. J. Gen. Virol. 84, 1-10 (2003).

5. Tami, C., Taboga, O., Berinstein, A., Núñez, J.I., Palma, E.L., E. Domingo, F. Sobrino, and Carrillo, E. Co-evolution of antigenicity and host cell tropism of foot-and-mouth disease virus in vivo. J. Virol. 77, 1219-1226 (2003).

6. Judit Villén, Eliandre de Oliveira, Jose Ignacio Núñez, Nicolás Molina, Francisco Sobrino, David Andreu. Towards a multi-site synthetic vaccine to foot-and-mouth disease: addition of discontinuous site peptide mimic increases the nuetralization response in immunized animals. Vaccine 22 3523-3529 (2004)

7. M.M. García-Briones, E. Blanco, C. Chiva, D. Andreu, V. Ley and F.Sobrino. Immunogenitity and T cell recognition in swine of foot-and-mouth disease virus polymerase 3D. Virology 322 264-275 (2004)

OTROS ARTÍCULOS

1. Sobrino, F. and Domingo, Eds. Foot-and-mouth Disease. Current perspectives. Horizon Biosciences. UK 2004

2. B. Borrego, L Ganges, P. Fernández-Pacheco, F. Sobrino and F. Rodríguez. “DNA vaccines against FMDV based on minigenes” En: Proceedings of the II European Congress of Eurovirology (Madrid, Spain, September 5-9, 2004) Medimond S.r.l. - Monduzzi Editore International Proceedings Division, Bolonia (Italia). Pags. 161-166.

3. B. Borrego, P. Fernández-Pacheco, L. Ganges, F.Sobrino and F. Rodríguez. “Immunogenicity and protection conferred by DNA vaccines based on FMDV minigenes in a mouse model” En : REPORT of the Open Session of the Research Group of the Standing Technical Committee of the European Commission for the control of foot-and-mouth disease (EUFMD) held at Chania, Crete (Greece) 12-15 october 2004 . Appendix 61 - pg 385-390. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Rome, 2004. On line: EUFMD site on www.fao.org

4. J. I. Núñez, P. Fusi, B. Borrego, E. Brocchi, M.L. Pacciarini and F. Sobrino “Genetic and antigenic analysis of Italian 1993 FMDV isolates” En : REPORT of the Open Session of the Research Group of the Standing Technical Committee of the European

Commission for the control of foot-and-mouth disease (EUFMD) held at Chania, Crete (Greece) 12-15 october 2004 . Appendix 26 - pg 179-187. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Rome, 2004. On line: EUFMD site on www.fao.org

LIBROS, CAPÍTULOS DE LIBROS, PONENCIAS PUBLICADAS (2003 – 2004)

LIBROS:

1. F. Sobrino and E. Domigo. Editotes del libro. Foot-and-mouth disease virus. Invitación

de la Editorial. Horizon Scientific Press, UK. (2004).

CAPÍTULOS DE LIBROS:

L. Carrasco y F. Sobrino. Picornaviridae. En: L. Carrasco y J.M. Almendral (eds.). Virus patógenos. Editorial Hélice. (2004).

McCullough, K. and Sobrino, F. Imunology of foot-and-mouth disease virus. In: Foot-and-mouth disease virus. F. Sobrino and E. Domingo (eds.). Horizon Scientific Press, UK. (2004).


• Desarrollo de una vacuna de ADN frente a la glicoproteína E2 del virus de la peste porcina clásica”. Lliliane Ganges Espinosa. Universidad Autónoma de Madrid. Octubre 2004. Calificación: Apto "Cum Laude", por unanimidad


• José Ignacio Nuñez Garrote Ramón y Cajal

OBJETIVOS DEL GRUPO

Realización de estudios de epidemiología molecular de enfermedades de relevancia en sanidad animal Análisis de la variabilidad del síndrome reproductivo y respiratorio porcino


• Epidemiología molecular de virus RNA de importancia en sanidad animal

• Virus de la fiebre aftosa

• Virus de la peste porcina clásica

• Caracterización genómica del VSRRP

SINDROME REPRODUCTOR Y RESPIRATORIO PORCINO


PROYECTOS AGL2004-06850-C02-02/GAN Variabilidad genómica de cepas del virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino (VSRRP) aisladas en España a lo largo del tiempo.

RESUMEN DE OBJETIVOS El objetivo principal consiste en el estudio de la variabilidad genómica del VSRRP con dos aspectos innovadores: se realizará un estudio de la evolución de las cepas del VSRRP a lo largo del tiempo, y se basará en la secuenciación completa del genoma, no solo en las dos proteínas estructurales estudiadas hasta la fecha. Finalmente se estudiará la interrelación entre la variabilidad genómica, antigénica y patogénica

EQUIPO INVESTIGADOR PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS)

En esta etapa inicial del proyecto se han diseñado parejas de primers para la amplificación de regiones del genoma que codifican proteínas no estructurales, como la ORF 1a, en las que existe una alta variabilidad genómica entre los distintos aislados. Se han puesto a punto las condiciones de amplificación por RT-PCR y secuenciación.



1. Saiz, M., De la Morena, D.B., Blanco, E., Núñez, J.I., Fernández, R. and Sanchez-Vizcaíno, J.M., (2003) Detection of foot-and-mouth disease virus from culture and clinical samples by reverse transcription-PCR coupled to restriction enzyme and sequence analysis. Vet Res. Jan-Feb;34(1):105-17

2. Tami C, Taboga O, Berinstein A, Nuñez JI, Palma EL, Domingo E, Sobrino F, Carrillo

E.(2003) Evidence of the coevolution of antigenicity and host cell tropism of foot-and-mouth disease virus in vivo. Journal of Virology. Jan;77(2):1219-26.

3. Domingo E, Escarmis C, Baranowski E, Ruiz-Jarabo CM, Carrillo E, Nuñez JI, Sobrino

F.(2003) Evolution of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. Jan;91(1):47-63.

4. Baranowski E, Molina N, Núñez JI, Sobrino F, Saiz M. Recovery of infectious foot-and-mouth disease virus from suckling mice after direct inoculation with in vitro-transcribed RNA.J Virol. 2003 Oct;77(20):11290-5.

5. Villen J, de Oliveira E, Nunez JI, Molina N, Sobrino F, Andreu D. Towards a multi-site

synthetic vaccine to foot-and-mouth disease: addition of discontinuous site peptide mimic increases the neutralization response in immunized animals. Vaccine. 2004 Sep 9;22(27-28):3523-9.

OTROS ARTICULOS

JI Núñez, P. Fusi, B. Borrego, E. Brocchi, M.L. Pacciarini and F. Sobrino. “Genetic and antigenic analysis of Italian 1993 FMDV isolates” Report of the Open Session of the Research Group of the Standing Technical Committee of the European Commission for the control of foot-and-mouth disease (EUFMD) Appendix 26 - pg 179-187. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Rome, 2004. On line: EUFMD site on www.fao.org


CURSOS

Profesor del curso: “Enfermedades emergentes en animales de producción” con la clase “Epidemiología Molecular de las Enfermedades Emergentes”. Organizado por la Consejería de Agricultura de Castilla-La Mancha, 13-16 de septiembre de 2004, Las Pedroñeras (Cuenca) Profesor del XII y XIII “Curso de enfermedades exóticas de los animales domésticos” organizado por el CISA-INIA, noviembre de 2003, 2004. con la clase “Epidemiología molecular I y II”

OTRAS Premio de la Academia de Ciencias de Cuba por el trabajo: Origen y evolución de los virus que causan la peste porcina clásica en Cuba.


Carolina Tafalla Ramón y Cajal

OBJETIVOS DEL GRUPO

- Determinación de los factores inmunes que se desatan frente a rabdovirus en peces, y que determinan la resistencia natural frente al virus. - Determinación de los factores inmunes que confieren resistencia en una vacunación en peces. - Estudio del papel de citoquinas en peces. - Mejora de vacunas DNA frente a virus en peces.


Estudio de la respuesta inmune de trucha arcoiris (ONCORHYNCHUS MYKISS) frente a rabdovirus, virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV) y virus de la necrosis hematopoiética infecciosa (IHNV), así como frente a vacunas: expresión de citoquinas y optimización de vacunas DNA mediante la utilización de citoquinas.

ESTUDIOS DE RESPUETA INMUNE DE PECES TELEOSTEOS


PROYECTOS AGL2004-07404-C02-02/ACU Mejora de las vacunas DNA frente a virus en acuicultura: analisis de la respuesta inmune protectiva no específica y específica en el modelo trucha/ rabdovirus y modificación de las construcciones genéticas utilizadas hasta el momento. RESUMEN DE OBJETIVOS .-ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE PROTECTIVA FRENTE VHSV INDUCIDA POR LA VACUNACIÓN DNA CON EL GEN DE LA pG DEL VHSV. Se estudiarán mecanismos relacionados tanto con la respuesta no específica como específica, ya que está ampliamente descrito en la literatura, que los altos niveles de protección obtenidos en peces frente a rabdovirus con las vacunas DNA que codifican para el gen de su pG, están directamente relacionados con su capacidad para inducir también una eficiente respuesta inmune protectiva inespecífica. 1.1.-Respuesta inmune no específica, centrándonos en el estudio de mecanismos moleculares relacionados con la actividad anti-VHSV (interferencia en las etapas tempranas de la replicación viral) que es orquestada por el interferon (IFN), y genes inducidos por esta citoquina, como la proteína Mx, a partir de la expresión de su cDNA en células transfectadas. Así mismo se analizará la activación del mecanismo de acción antiviral IFN/ eIF2α/PKR en respuesta a una infección con VHSV 1.2-Respuesta inmune específica: Se analizará el papel que la inmunidad celular y los anticuerpos no neutralizantes frente a diferentes zonas de la pG, como por ejemplo los dominios de fusión, tienen en la protección conferida por la vacunación DNA frente a VHSV dado que hasta el momento no se ha encontrado una correlación entre la protección conferida por la vacuna y el título de anticuerpos neutralizantes. 1.3.-Citoquinas implicadas en ambas respuestas. Principalmente de citoquinas relacionadas con la respuesta linfocitaria Th1 (interleuquinas 12 y 15) cuyos cDNAs serán cedidos por el Profesor. C.J. Secombes (Univ. de Aberdeen, Escocia). 2.-OPTIMIZACIÓN DE LAS CONSTRUCCIONES GENÉTICAS A USAR COMO VACUNA, modificando las utilizadas hasta ahora mediante, 2.1.-Sustitución de los promotores de origen vírico por otros de origen piscícola, .Ya que con esta vacuna se obtiene los niveles más altos de protección cuando se inyecta intramuscularmente, se propone como promotor modelo el de la β-actina 2.2.-Utilización de genes mutantes de la pG de VHSV atenuados en fusión 2.3.-Incorporación de las citoquinas (IL12, IL15 e IFN) como adyuvantes en los propios plásmidos vacunales o coadministrándolos al mismo tiempo que la vacuna. EQUIPO INVESTIGADOR Este es un proyecto coordinado entre la Dr. Carolina Tafalla (subproyecto 2) y el grupo de la Dr. Amparo Estepa (Universidad se Elche, Alicante) (subproyecto 1).


ARTICULOS EN REVISTAS SCI A. Rocha, S. Ruiz, C. Tafalla & J. Coll (2004) Characterisation of the syncitia formed by the VHS salmonid rhabdovirus G gene transfected cells. Veterinary Immunology and Immunopathology 99 (3-4): 143-152. A. Rocha, S. Ruiz, C. Tafalla, J. Coll (2004) Conformation- and fusion-defective mutations in the hypothetical phospholipid-binding and fusion peptides of viral hemorrhagic septicemia salmonid rhabdovirus protein G. Journal of Virology 78(17): 9115-9122.

COMPONENTES DEL GRUPO

• Juan Barcena del Riego Ramón y Cajal • Alicia Llorente Titulado Superior de Investigación y Laboratorio • Iván Angulo Becario Predoctoral INIA. • Carolina Cubillos Becario Predoctoral FPI. • Rodolfo Estévez Becario Tecnólogo INIA • Horacio Almanza Becario Predoctoral (Conacyt, Méjico)

OBJETIVOS DEL GRUPO

Desarrollo de vectores vacunales basados en calicivirus.

El objetivo principal del grupo es el desarrollo de vectores vacunales basados en calicivirus. De forma general existen dos abordajes para el empleo de virus RNA como vectores vacunales frente a patógenos de interés en sanidad animal. La primera estrategia consiste en el empleo de cápsidas vacías (VLPs) producidas en sistemas de expresión (baculovirus), como presentadoras de epítopos B y T heterólogos (VLPs quiméricas). La segunda estrategia se basa en el empleo de vectores virales con capacidad de replicación (replicones), para la expresión de polipéptidos inmunogénicos heterólogos. Los calicivirus presentan características biológicas que los hacen atractivos para el desarrollo de vectores vacunales empleando ambos abordajes descritos. Así pues, los objetivos generales del grupo son:

• Desarrollo de vectores vacunales basados en clones infectivos de calicivirus. • Desarrollo de vectores vacunales basados en VLPs quiméricas de calicivirus.

Por otro lado, el grupo participa en otros proyectos de acuerdo con las necesidades del centro (véase más abajo, proyectos relacionados con pestivirus o patógenos virales aviares).

BIOLOGÍA MOLECULAR DE CALICIVIRUS


• Vectores vacunales basados en VLPS quiméricas de calicivirus

• ·Bases moleculares del tropismo celular del calicivirus felino

• Análisis de la reactividad cruzada entre pestivirus.

• Caracterización genética de cepas virales aviares presentes en España para las

enfermedades de Gumboro, bronquitis infecciosa y rinotraqueitis aviar”


PROYECTOS SC00-045 Análisis de la reactividad cruzada entre pestivirus. Desarrollo de sistemas alternativos de diagnóstico diferencial de peste porcina clásica”. (2000-2003)

RESUMEN DE OBJETIVOS Los objetivos planteados en el proyecto fueron el estudio de la posible implicación del virus de la enfermedad de Border (VBD) en la aparición de falsos positivos con las técnicas que actualmente se vienen utilizando para el diagnóstico de la PPC, así como el desarrollo de métodos de diagnóstico diferencial entre ambos pestivirus. En concreto, se proponían los siguientes objetivos específicos: 1. Análisis de la reactividad cruzada entre Pestivirus, empleando sueros de animales infectados con VPPC o con VBD. 2.- Clonaje de la proteína E2 de la cepa Alfort/187 de VPPC y la cepa X818 de VBD en el sistema de ex-presión de proteínas recombinantes basado en baculovirus. 3.- Producción de anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de los péptidos sintéticos y la proteína E2 recombinante. 4.- Desarrollo de sistemas alternativos de diagnóstico diferencial empleando las proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales específicos seleccionados.

EQUIPO INVESTIGADOR Juan Bárcena, Marisa Arias, Montserrat Agüero, Belén Borrego, Carmina Gallardo, Iván Angulo. PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS)

En este estudio se ha comprobado que los ensayos de ELISA que se usan en las campañas de vigilancia epidemiológica para el control de la PPC son capaces de discriminar adecuadamente los sueros positivos a PPC de los sueros negativos, pero presentan problemas para diferenciar serología positiva a PPC de serología positiva a otro Pestivirus como el VBD. Esto implica que en aquellas zonas donde exista una prevalencia apreciable de VBD circulante en las poblaciones de cerdo doméstico, se producirán problemas de falsos positivos debidos a la reactividad cruzada entre ambos pestivirus, durante los controles serológicos para PPC. Las técnicas de confirmación que se utilizan actualmente, basadas en el uso de cultivos celulares infectados, requieren el manejo de virus infectivo y son lentas y laboriosas, obligando a la inmovilización de los animales durante varios días hasta que se efectúan los ensayos.

Con objeto de contribuir a minimizar los problemas ocasionados por dicha reactividad cruzada entre pestivirus, a lo largo del proyecto se ha generado una colección de reactivos (antígenos recombinantes, sueros y anticuerpos monoclonales) que a su vez han permitido el desarrollo en el laboratorio de sistemas alternativos de diagnóstico diferencial de peste porcina clásica.

BIO2002-04091-C03-03 Nuevas estrategias vacunales frente al virus de la fiebre aftosa y estudio de los mecanismos implicados en la patogenicidad viral” (2003-2005) RESUMEN DE OBJETIVOS

Este proyecto coordina líneas de trabajo complementarias con el objetivo de desarrollar nuevas vacunas marcadoras seguras contra el virus de la fiebre aftosa (VFA), empleando el cerdo como especie modelo de gran relevancia ganadera. Para ello se pretende: 1) Desarrollar nuevas vacunas basadas en péptidos sintéticos que mimetizan diversos sitios antigénicos del VFA y son capaces de estimular eficientemente linfocitos B y T porcinos. Se emplearán, también, combinaciones de estos péptidos inmunogénicos, formuladas como construcciones dendriméricas (MAP). 2) Caracterizar antigénica e inmunogénicamente VLPs quiméricas del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (VEHC) que expresen sitios antigénicos B y T del VFA. 3) Caracterizar la respuesta inmune humoral y celular, y la protección inducida en el cerdo por los distintos péptidos y VLPs, seleccionados en los apartados anteriores.

EQUIPO INVESTIGADOR Juan Bárcena, Esther Blanco, Ana Canals, Carolina Cubillos, Horacio Almanza PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS)

Se ha preparado una colección de VLPs quiméricas de RHDV que expresan epítopos B y T del virus VFA. El epítopo B empleado es el llamado sitio antigénico A, que contiene el motivo RGD (crítico para la unión del virus a su receptor celular) e induce la producción de anticuerpos neutralizantes. El epítopo T utilizado procede de la proteína 3A de VFA. Una primera serie de inserciones se realizó en el extremo C-terminal de la proteína VP60. Se insertaron diversas versiones de epítopos B ó T (así como secuencias contenidendo ambos epítopos), de diferentes tamaños (entre 14 y 30 aminoácidos) para evaluar el efecto de la longitud de la secuencia insertada sobre la capacidad de la proteína quimérica resultante para formar VLPs. El resultado obtenido indica que el extremo carboxi-terminal de la proteína VP60 de RHDV es bastante tolerante a la inserción de secuencias heterólogas, puesto que admite la inserción de diversas secuencias de hasta 30 aminoácidos, sin perder la capacidad de formar VLPs (de siete construcciones ensayadas sólo una perdió la capacidad de formar partículas).Los inmunogenicidad de las VLPs quiméricas generadas se evaluó en ratones. Varias construcciones mostraron capacidad para inducir títulos de anticuerpos neutralizantes, así como la proliferación de linfocitos T cooperadores. Estos estudios proseguirán a lo largo del presente año, y las construcciones más prometedoras se evaluarán posteriormente en relación a su capacidad para inducir protección en cerdos.

FIT-010000-2003-163 Caracterización genética y antigénica de cepas virales aviares presentes en España para las enfermedades de Gumboro, bronquitis infecciosa y rinotraqueitis aviar” (2003 – 2004) RESUMEN DE OBJETIVOS

La importancia económica del sector avícola en nuestro país no se refleja en la existencia de un adecuado estudio y seguimiento de la incidencia de las distintas enfermedades virales aviares en campo. A este respecto es necesario destacar que el control de las enfermedades infecciosas aviares es un aspecto esencial para garantizar el desarrollo de una industria avícola económicamente rentable. Tanto las gallinas ponedoras como los pollos se someten a pautas de vacunación intensivas frente a diversas enfermedades virales como: enfermedad de Gumboro, bronquitis infecciosa, rhinotraqueitis aviar, enfermedad de Newcastle, enfermedad de Marek, etc. En algunos casos se ha detectado que las vacunas aplicadas muestran una efectividad limitada, debido a que dichas vacunas no resultan adecuadas para conferir protección frente a las variantes antigénicas de los virus circulantes en campo. Por todo ello, el proyecto se plantea el desarrollo de un estudio de caracterización genética y antigénica de las cepas virales circulantes en España de los virus causantes de tres de las

enfermedades aviares de mayor incidencia: el virus de la enfermedad de Gumboro (IBDV), el virus de la bronquitis infecciosa (IBV) y el virus de la rhinotraqueitis aviar (APV). Este estudio permitirá evaluar la efectividad de las vacunas disponibles, y en su caso la elaboración de nuevas vacunas más efectivas, que permitan un control eficaz de dichas enfermedades.

EQUIPO INVESTIGADOR Juan Bárcena, Alicia Llorente, Esther Blanco, Gustavo del Real PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS)

El Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA-INIA) e INPROVO han puesto en marcha un estudio de caracterización genética y antigénica de las cepas virales circulantes en España causantes de tres de las infecciones aviares de mayor incidencia: el virus de la enfermedad de Gumboro (IBDV), el virus de la bronquitis infecciosa (IBV) y el virus de la rinotraqueitis aviar (APV). Se han desarrollado metodologías para la detección (RT-PCR) y aislamiento de los 3 virus objeto de estudio, así como técnicas de secuenciación para la caracterización genética de las cepas. Se ha distribuido información sobre el proyecto y un cuestionario epidemiológico entre las explotaciones avícolas para promover su implicación en el suministro de muestras. Durante al primera fase de este estudio se han recibido más de un centenar de muestras, de provincias pertenecientes a cinco comunidades autónomas. Los resultados de la caracterización genética de los aislados obtenidos hasta el momento han permitido identificar, en el caso del IBV, cepas pertenecientes a los serotipos Massachusetts y UK/793. El análisis de secuencias puso de manifiesto una alta homología con cepas recientemente aisladas en países próximos como Italia. Con respecto al IBDV, la secuenciación de la región hipervariable del gen de la proteína VP2 permitió la identificación de aislados del serotipo I. En cuanto al APV, los aislados detectados pertenecieron al serotipo B.



1. J. Bárcena, N. Verdaguer, R. Roca, M. Morales, I. Angulo, C. Risco, J.L. Carrascosa,

J. M. Torres and J. R. Castón “The coat protein of Rabbit hemorrhagic disease Virus contains a molecular switch at the N-terminal region facing the inner surface of the capsid”. Virology (2004), 322, 118-134

2. M.Morales, Boga, J.A., J. Bárcena, M.A. Ramirez, F. Parra y J.M. Torres "Synthesis in vitro of rabbit haemorrhagic disease virus subgenomic RNA by internal initiation on sense genomic RNA. Mapping of a subgenomic promoter" J. Biol. Chem. (2004), 279, 17013-1701


1. M. Morales, J. Bárcena, M. A. Ramírez, J. A. Boga, F. Parra, J. M. Torres Detection of a calicivirus subgenomic promoter.” 6th International Congress of the European Society for Veterinary Virology.Ploufragan (France).24-27 de Agosto de 2003. 2.- J. Bárcena, M. Morales, R. Estévez, M. Ramírez and J.M. Torres. Amplification of the full-length Feline Calicivirus genome by “long RT-PCR” and transcription of infectious RNA directly from the amplicon. 6th International Congress of the European Society for Veterinary Virology. Ploufragan (France). 24-27 de Agosto de 2003. 3.- I. Angulo, J. Bárcena, M. Agüero, M. Arias, L. Romero and B. Borrego Antigenicity of synthetic peptides representing specific regions of E2 protein of classical swine fever virus. 6th International Congress of the European Society for Veterinary Virology. Ploufragan (France). 24-27 de Agosto de 2003. 4.- J. Bárcena, N. Verdaguer, R. Roca, I. Angulo, M. Morales, C. Risco, J. M. Torres y J.R. Castón. Análisis estructural de la cápsida del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo. VIII Congreso Nacional de Virología. Barcelona. 12-15 de Octubre de 2003. 5.- Iván Angulo, Rodolfo Estévez, Carolina Cubillos, Mónica Morales y Juan Bárcena. Análisis del rango de huesped del calicivirus felino: adaptación y crecimiento del virus en lineas celulares de origen no felino. VIII Congreso Nacional de Virología. Barcelona.12-15 de Octubre de 2003. 6.- M. Morales, J. Bárcena, M. A. Ramírez, J.A. Boga, F. Parra, J. M. Torres. Detección de un promotor subgenómico en calicivirus. VIII Congreso Nacional de Virología. Barcelona. 12-15 de Octubre de 2003. 7.- I. Angulo, Juan Bárcena, M. Agüero, M. Arias, L. Romero y B. Borrego. Nuevas estrategias para el diagnóstico serológico del virus de la peste porcina clásica. VIII Congreso Nacional de Virología. Barcelona. 12-15 de Octubre de 2003. 8.- Juan Bárcena, M.A. Ramirez, M. Morales, J. M. Sánchez-Vizcaíno and J.M. Torres.

Recombinant transmissible vaccine against myxomatosis and rabbit hemorrhagic disease for wild rabbit populations. 3rd International Wildlife Management Congress. Christchurch (New Zealand). 1-5 December 2003. 9.- Touriño, A., Bárcena, J., Sánchez, F., Parra, F., Sánchez-Vizcaíno, J.M., Torres, J.M., and Ponz, F. “Production of RHDV capsid protein through a Turnip Mosaic Virus-derived vector: Towards oral protection of rabbits with forage cruciferous plants”. “Plant-derived vaccines and antibodies: potential and limitations” Fundación Mérieux. Annecy (Francia). 21-24 de Marzo de 2004 10.- I. Angulo, C. Cubillos, R. Estévez, H. Almanza, V. Martín, M. Morales and J. Bárcena. “Characterization of tissue-culture adapted Feline Calicivirus variants with expanded cell tropism”. IInd European Virology. Madrid. 5-9 de Septiembre de 2004 11.- C. Cubillos, A. Llorente, I. Avalos, I. Angulo, J. Bárcena and E. Blanco. “Analysis of the immune response induced by recombinant virus-like particles of Rabbit Hemorrhagic Disease Virus in BALB/c mice.” IInd European Virology. Madrid. 5-9 de Septiembre de 2004 12.- “M. Morales, J. Bárcena, M. A. Ramírez, J. A. Boga , F. Parra, J. M. Torres” . “Synthesis in vitro of rabbit haemorrhagic disease virus subgenomic RNA by internal initiation on (-)- sense genomic RNA. Mapping of a subgenomic promoter.” IInd European Virology. Madrid. 5-9 de Septiembre de 2004 13.- “C. Cubillos, A. Llorente, I. Avalos, I. Angulo, E. Blanco, J. Bárcena.” “Immune response induced by recombinant virus-like particles of Rabbit Hemorrhagic Disease Virus in BALB/c mice”. IInd International Calicivirus Conference. Dijon (France). 6-10 Noviembre 2004 14.- “I. Angulo, C. Cubillos, R. Estévez, H. Almanza, M. Morales and J. Bárcena”. “Tissue-culture adapted Feline Calicivirus variants with expanded cell tropism”. IInd International Calicivirus Conference. Dijon (France). 6-10 Noviembre 2004 15.- “A. Llorente, E. Blanco, B. Borrego, J. Bárcena, G. del Real”. “Caracterización genética y antigénica de cepas virales aviares presentes en España para las enfermedades de Gumboro, Bronquitis Infecciosa y Rinotraqueitis Aviar.” XLI Symposium Científico de Avicultura organizado por WPSA. Barcelona. 24-25 Noviembre 2004


Codirección de la Tesis Doctoral de Miguel Ángel Ramírez. Título: “Desarrollo de una vacuna recombinante y transmisible frente a la mixomatosis y la enfermedad hemorrágica del conejo para su aplicación en conejo silvestre”. Directores: Juan María Torres Trillo y Juan Bárcena. Centro de ejecución: CISA-INIA. Presentación: 17 de Noviembre de 2003 en el Departamento de Microbiología de la Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid (UCM).


CURSOS

Durante el año 2003: Tutor externo de Virginia Martín, alumna de 4º Curso de Veterinaria de la UCM, para el desarrollo de un proyecto de investigación (200 horas de trabajo de laboratorio). Esta actividad se encuadra en el marco de la colaboración establecida entre el CISA-INIA y la Facultad de Veterinaria de la UCM para el desarrollo de la asignatura “Estancias”, Curso 2002-2003.


Mª Begoña Ruiz Argüello

OBJETIVOS DEL GRUPO

El principal objetivo de este proyecto es la caracterización de receptores solubles de citoquinas y de proteínas de unión codificadas por los poxvirus. Los poxvirus son una familia de virus DNA de gran tamaño que codifican proteínas únicas que imitan a las moléculas del sistema inmune del hospedador o que van dirigidas a componentes clave del sistema inmune. Una estrategia frecuentemente utilizada por los poxvirus es la expresión de receptores solubles de citoquinas que son secretados al medio extracelular, donde se unen a distintas citoquinas celulares, bloqueando su actividad biológica. Así, se han identificado varios receptores solubles de TNF en miembros de la mayoría de los géneros de poxvirus, lo cual indica la importancia de la vía del TNF como estrategia antiviral. Además, el hecho de que virus de diferentes familias hayan desarrollado estrategias contra las mismas moléculas inmunomoduladoras demuestra la importancia de éstas en los mecanismos de defensa del hospedador. Los resultados obtenidos serán particularmente relevantes para determinar la adaptación de los mecanismos virales de inmunomodulación al hospedador y por tanto, para comprender mejor su sistema inmune. También podrían identificar nuevas moléculas inmunomoduladoras. Asimismo, estos resultados serán importantes para el desarrollo de nuevas estrategias para la generación de vacunas y tratamiento de enfermedades emergentes.


• Identificación y caracterización in vitro de receptores solubles de citoquinas y proteínas

de unión codificadas por los poxvirus.

•

• Estudio de la función de los inmunomoduladores virales durante la infección: Mousepox

como modelo de patogénesis viral.

MODULACIÓN DEL SISTEMA INMUNE POR VIRUS


PROYECTOS Modulación de la actividad de las citoquinas por los poxvirus (proyecto Ramón y Cajal)

RESUMEN DE OBJETIVOS El objetivo principal del proyecto es la caracterización de proteínas secretadas por poxvirus con el fin de determinar nuevos mecanismos inmunomoduladores virales.

EQUIPO INVESTIGADOR Mª Begoña Ruiz Argüello; Dr. Alí Alejo (perteneciente al grupo del Dr. Antonio Alcamí) (CNB, CSIC). El proyecto se realiza en estrecha colaboración con el laboratorio del Dr. Antonio Alcamí (Centro Nacional de Biotecnología, CSIC) quien proporciona tanto la experiencia científica como la infraestructura necesarias para la realización de muchos aspectos del mismo.

PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS) Se han caracterizado, in vitro, las proteínas virales CrmB y CrmD. Ambas contienen cuatro dominios ricos en cisteínas homólogos al dominio extracelular de los receptores de TNF y una región C-terminal de función desconocida que no se parece a ninguna proteína celular. Estudios previos del laboratorio del Dr. Alcamí demostraron, por primera vez, que estas proteínas no sólo bloquean la actividad biológica del TNF sino que además unen interleuquina-8. En colaboración con el Dr. A.Alejo y el Dr. A.Alcamí se ha realizado un screening completo (mediante SPR, BIAcore X) para determinar los posibles ligandos de estas proteínas y se ha demostrado que ambas unen e inhiben la actividad de algunas quimioquinas. Además, ambas pueden unir TNF y quimioquinas simultáneamente y por sitios independientes. Estos resultados identifican CrmB y CrmD como proteínas virales solubles de unión a quimioquinas y describen un nuevo dominio de interacción con quimioquinas (el dominio C-terminal). Por último, estudios preliminares in vivo demuestran que estas proteínas tienen un papel inmunomodulador en la patogénesis viral ya que ratones infectados con virus recombinantes a los cuales se les ha delecionado la proteína CrmD muestran un fenotipo atenuado.


CURSOS

EMBO Workshop on the Cell Biology of Virus Infection. Septiembre 2004, EMBL Heidelberg (Alemania)

OTRAS

Asistencia a Congresos y ponencias/posters presentados - II Jornadas Científicas CISA-INIA. Abril 2004. Valdeolmos, Madrid. - Vaccinia Vectors Mid-Term Review (MTR) EU Meeting. Junio 2004. Segovia. -M. B. Ruiz-Argüello, A. Alejo, V. P. Smith, M. Saraiva, Y. Ho y Antonio Alcami. Novel chemokine binding properties of the tumour necrosis factor receptor encoded by ectromelia and variola viruses. XVth International poxvirus and iridovirus meeting. Septiembre 2004. Oxford, Reino Unido. (Conferencia invitada). - A. Alejo, M. B. Ruiz-Argüello, M. Saraiva y Antonio Alcami. The ectromelia virus E12 protein: a novel viral chemokine binding protein family? XVth International poxvirus and iridovirus meeting. Septiembre 2004. Oxford, Reino Unido. (Póster).


• Marisa Arias Jefe de Servicio de Coordinación P3 (F) • Luis Romero (baja Junio 2003) Jefe de Sección de Diagnóstico (F) • Mercedes Moyano López

(baja 03/2004) Técnico de Laboratorio (F)

• María Jesús Zamora Escribano (baja Junio 2003)

T. Superior de Investigación y Laboratorio (C)

• Belén Vázquez Ruiz T. Superior de Investigación y Laboratorio (C) • Raquel Nieto Martínez Técnico Superior de Investigación y Laboratorio (C) • Esther Romero Almansa

(baja Marzo 2003) Técnico de Laboratorio (C)

• José María Vázquez Ruiz (baja Noviembre 2003

Técnico de Laboratorio (C)

• Mercedes Martín Lluch (alta Enero 2004)

Técnico de Laboratorio (C)

• Montserrat Agüero (baja Abril 2004)


• Jovita Fernández Pinero (baja Junio 2004)


• Ana Robles Suárez Técnico de Laboratorio (C)


• Desarrollo y estandarización de metodologías para el diagnóstico de Enfermedades infecciosas de la Lista A de la OIE y de impacto económico en acuicultura. Epidemiología molecular.

• Actividades como Centro de Referencia Nacional, Comunitario y Mundial para la Oficina Internacional de Epizootías (OIE) de Peste Porcina Africana (PPA).

• Actividades como Centro Nacional de referencia en Peste Porcina Clásica.

• Actividades como Centro Nacional de Referencia de Enfermedad Vesicular Porcina (EVP) (Hasta Julio 2003).

• Estudios sanitarios y de control de explotaciones.

• Evaluación de vacunas y otros biológicos.

UNIDAD DE DIAGNOSTICO I (INCLUYENDO GRUPO DE DESARROLLOS EN TÉCNICAS

MOLECULARES)


PROYECTO: QLK2-CT2000-00486 Development, standardisation and harmonisation of novel multiplex nucleic acid tests for the detection of economically important viruses of farm animals. (2000 – 2004).

RESUMEN DE OBJETIVOS • Desarrollo y estandarización de métodos de detección molecular de PCR múltiple para

la detección de patógenos virales que causan enfermedades de la Lista A de la OIE, que cursan con síntomas clínicos y lesiones similares, de tipo hemorrágico (Peste porcina Africana y peste Porcina Clásica) y vesicular (Fiebre Aftosa, Enfermedad vesicular porcina y Estomatitis vesicular).

EQUIPO INVESTIGADOR

CISA-INIA.: Dr. Marisa Arias Neira, Research co-ordinator; Dr. Ana Canals, Contract manager; Dr. Montserrat Agüero, Contracted researcher ; Jovita Fernández, Scientist employee; Dr. Luis Romero, Head of Exotic Disease section; Dr. Carmen Sánchez, Pathologist; Miguel A. Sánchez, Vet; Belén Vázquez, Scientist employee; Mercedes Moyano, Technician, Ana Robles, Technician.

PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS) - Desarrollo y estandarización para su empleo en laboratorios de diagnóstico de métodos

específicos y rápidos (menos de 6 horas), de técnicas de PCR individual de PPA, PPC y Estomatitis vesicular y de dos métodos de PCR múltiple para la detección simultanea y diferencial de patógenos virales que causan enfermedades de la Lista A de la OIE, de tipo hemorrágico (Peste porcina Africana y peste Porcina Clásica) y vesicular (F.Aftosa, Enfermedad vesicular porcina y Estomatitis vesicular).

PROYECTO: ACU00-004-C2-1 Desarrollo y estandarización de métodos de PCR múltiple para la detección rápida de patógenos en acuicultura. (2000 – 2002). Proyecto coordinado con el Dpto. Sanidad Animal (Prof. Lucas Domínguez) de la F. Veterinaria de la UCM..

RESUMEN DE OBJETIVOS • Desarrollo y estandarización de métodos de PCR múltiple para la detección simultánea

de IPNV (virus de la Necrosis Pancreática infecciosa), IHNV (virus de la Necrosis Hematopoyética infecciosa), VHSV(Virus de la Septicemia Hemorrágica) y Sleeping disease.

EQUIPO INVESTIGADOR

CISA-INIA.: Dr. Marisa Arias Neira, coordinadora del proyecto. Dr. Montserrat Agüero, investigadora, jefe de grupo técnicas moleculares; Jovita Fernández, investigador contratado; Dr. Luis Romero, Jefe sección de Enfermedades Exóticas; Dra. Carmen Sánchez, Patólogo; Mercedes Moyano, Técnico de lab; Ana Robles, Técnico de lab; Esther Blanco (baja en actividades del proyecto en Junio 2002).

PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS) - Desarrollo y estandarización para su empleo en laboratorios de diagnóstico de métodos

específicos y rápidos (menos de 6 horas), de técnicas de PCR Múltiple para la detección simultánea y diferencial de patógenos virales que causan enfermedades de interés económico en acuicultura.


PROYECTOS QLK2-2001-02216 African Swine Fever: Improved diagnostic methods and understanding of virus epidemiology and virus-host interactions (2001 – 2004)

RESUMEN DE OBJETIVOS: • Desarrollo y mejora de métodos de diagnóstico para la detección de la Peste Porcina

Africana (PPA). Utilización de proteínas recombinantes, capsómeros y cápsides vacías y otras estructuras que asemejan partículas virales como antígenos.

• Epidemiología molecular de Peste porcina Africana. Construcción de un banco de datos de secuencias.

• Desarrollo de un método de diagnóstico de PPA, basado en PCR sobre muestras de sangre y suero recogidas sobre filtros.

• Caracterización de la patogénesis viral y de la respuesta inmune de cerdos inoculados con mutantes de delección y virus wt de PPA.

• Evaluación de la infección del VPPA en Ornithodoros erraticus en áreas libres, donde el VPPA estuvo presente en el pasado .

EQUIPO INVESTIGADOR Dr. Marisa Arias Neira, researcher-coordinator at CISA;Dr. José Manuel Sánchez-Vizcaíno (Leave in 05/2002); Dr. Javier Salguero, Contracted researcher (2002)and scientific collaboration (2004); Ana de Avila, Contracted technician under the Project; Dr. Carmina Gallardo, Contracted researcher; Dr. Ana Canals, researcher. Luis Romero, Head of Exotic disease section, CISA (Leave CISA in May, 2003); Dr. Carmen Sánchez, researcher, pathologist (Leave CISA in May, 2003); Dr. Esther Blanco, Contracted researcher, (Since July, 2003);Belén Vazquez , Contracted (2004); Dr. Montserrat Agüero, Contracted (January April-2004);Jovita Fernández Contracted (April-June 2004). Raquel Nieto Contracted technician (Since June 2004) ; Subcontractor (s): Javier Lucientes, Vet.Faculty , Zaragoza (Spain); Cristiana Patta (IZS, Sassari,), Italy.

PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS) - Desarrollo de nuevos test de diagnóstico serológicos para la detección de anticuerpos

de PPA, empleando proteínas recombinantes. - Empleo de filtros para la recogida de muestras (sangre y suero) para el diagnóstico

molecular de PPA. - Construcción de una base de datos de secuencia de regiones variables del VPPA. Dirección web database: http://webainia.inia.es/cisa/asfv/index.asp. - Caracterización patológica, patogénesis y respuesta inmune de mutantes de delección

de VPPA.

CONVENIO: CC01-0037 CONTRATO INIA- FORT-DODGE-VETERINARIA, SA: Realización de estudios serológicos y virológicos en vacunas. (2001 – 2003)

RESUMEN DE OBJETIVOS • Detección de la presencia o ausencia de anticuerpos frente a peste porcina clásica,

fiebre aftosa, enfermedad vesicular porcina y Peste equina, en sueros bovinos, porcinos y equinos, obtenidos de animales previamente inoculados con distintas vacunas o diferentes componentes biológicos que se utilizaron en la producción de las mismas.

EQUIPO INVESTIGADOR Grupo Diagnóstico I: Marisa Arias; Luis Romero (baja Junio 2003); Mercedes Moyano (baja Marzo 2004); María Jesús Zamora Escribano (baja Junio 2003); Belén Vázquez; Raquel Nieto; Esther Romero (baja Marzo 2003); José María Vázquez Ruiz (baja Noviembre 2003); Mercedes Martín Lluch (alta Enero 2004).

PRINCIPALES RESULTADOS - Detección de la presencia o ausencia de anticuerpos frente a los agentes infecciosos reseñados, en biológicos.

PROYECTO: OT01-002 Desarrollo de metodologías para el control de la Peste porcina africana, diagnóstico de enfermedades exóticas y las actuaciones ante emergencias sanitarias.(2001 – 2005).

RESUMEN DE OBJETIVOS Unidad Diagnóstico 1 (Peste porcina africana y Peste porcina clásica) • Desarrollo de nuevas metodologías para el diagnóstico molecular de enfermedades

infecciosas y/o exóticas de alto riesgo para España. • Estudios epidemiológicos e Investigación diagnóstica de enfermedades de la Lista A. • Evaluación de reactivos biológicos y técnicas diagnósticas para su empleo en el plan de

vigilancia epidemiológica de la Peste porcina africana (PPA), Peste porcina clásica y Enfermedad vesicular porcina (EVP, hasta Julio 2003).

• Actividades de Laboratorio de Referencia de Peste porcina africana y Enfermedad vesicular porcina. Producción de reactivos biológicos y kits de diagnóstico para los programas de vigilancia epidemiológica de PPA y EVP.

EQUIPO INVESTIGADOR

Unidad Diagnóstico 1 : Marisa Arias; Luis Romero (baja Junio 2003); Mercedes Moyano (baja Marzo 2004); María Jesús Zamora Escribano (baja Junio 2003); Montserrat Agüero (baja abril 2004); Jovita Fernández (baja junio 2004); Belén Vázquez; Ana Robles; Raquel Nieto; Esther Romero (baja Marzo 2003); José María Vázquez Ruiz (baja Noviembre 2003); Mercedes Martín Lluch (alta Enero 2004).

PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS) - Estudio epidemiológico de brotes de enfermedad. - Desarrollo de metodologías diagnósticas para PPA. . - Confirmación de resultados de pruebas diagnósticas obtenidas en los Laboratorios de

Sanidad Animal de CC.AA. - Actividades como Centro de Referencia Nacional y para la OIE de Peste Porcina

Africana (PPA): Producción y distribución de reactivos y Kits de Diagnóstico. Envíos Nacionales en programas de vigilancia para más de 5 millones de determinaciones. Envíos Internacionales a distintos países de África y Europa no comunitaria. Análisis de muestras para vigilancia, exportación etc. PPA: 113. (2003-2004)

- Actividades en Peste porcina clásica (PPC): programa de vigilancia y análisis de muestras PPC: 70. (2003-2004)

- Actividades como Centro Nacional de Referencia de Enfermedad Vesicular Porcina (EVP): Producción y distribución de reactivos y Kits de Diagnóstico. Envíos Nacionales de Kits ELISA-EVP para más de un millón de determinaciones. Análisis de muestras: 1259. Otras vesiculares, Fiebre Aftosa: 416. (Hasta julio 2003).

CONTRATO UE: UE-LR PPA03 Laboratorio Comunitario de Referencia de Peste Porcina Africana (2003- actualidad)

RESUMEN DE OBJETIVOS • Actividades de Laboratorios de Referencia: Ensayos Interlaboratoriales; Asistencia

técnica a países UE; Preparación y distribución de reactivos para diagnóstico; Caracterización patológica y molecular de aislados virales; preparación del Manual de diagnóstico; preparación y distribución de protocolos de técnicas diagnósticas.

EQUIPO INVESTIGADOR

Unidad Diagnóstico 1: Marisa Arias; Luis Romero (baja Junio 2003); Belén Vázquez; Mercedes Moyano (baja Marzo 2004); María Jesús Zamora Escribano (baja Junio 2003); Raquel Nieto; Esther Romero (baja Marzo 2003); José María Vázquez Ruiz (baja Noviembre 2003); Mercedes Martín Lluch (alta Enero 2004).

PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS) - Organización de agenda y documentos de las reuniones anuales de laboratorios. - Preparación de un Manual de Diagnóstico (Directiva CEC SANCO/10037/2003)

estableciendo procedimientos de diagnóstico, toma de muestras y criterios para la evaluación de los métodos laboratoriales de confirmación de Peste porcina africana.

- Organización de Ensayo colaborativo interlaboratorial a países miembros y no

miembros de la UE, para harmonización de técnicas diagnósticas virológicas y serológicas.

- Transferencia de tecnología a países UE: preparación y distribución de protocolos.



1. Agüero, M; Fernández, J; Romero, L.J.; Sánchez-Mascaraque, C; Arias, M; and

Sánchez-Vizcaíno, JM. Highly sensitive PCR assay for Routine Diagnosis of African Swine fever virus in clinical samples. J.Clin. Microbiol. 41(9), 4431-4434. (2003).

2. Agüero, M; Fernández; Romero, L.J.; Zamora, MJ; Sánchez, C; Belak, S; Arias, M; and Sánchez–Vizcaíno, JM. A highly sensitive and specific gel-based Multiplex RT–PCR assay for simultaneous and differential diagnosis of swine haemorrhagic list A viral diseases in clinical samples. Veterinary Research. 35 PP.1-13 2004

OTROS ARTÍCULOS

1. Romero, LJ y Arias, M. “Diagnóstico de las enfermedades producidas por Circovirus porcinos tipo 2”. Revista Anaporc, 229, pp. 9-24. 2003.

2. Sanchez-Vizcaíno J.M.; Agüero M. European Commission. “Diagnostic Techniques and Vaccines for Foot-and-Mouth Disease, Classical Swine Fever, Avian Influenza and some other important OIE List A Diseases.” Report of the Scientific Committee on Animal Health and Animal Welfare. http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/scah/out93_en.pdf. Adopted 24-25th April 2003.

3. Arias M; Romero,L; Sánchez-Vizcaíno, JM. Classical swine fever: A constant threat to pig producing countries. In: http://www.feedinfo.com/asp/scientific/science_res.asp?id_sci=1679. Accesses 13 March 2003

4. Arias, M. y Sánchez-Vizcaíno, J.M. “Control and Eradication of Aujeszky`s disease in Europe. A review of the Spanish model”. Revista: M. Weterynaryjny S. swinie II 2004


LIBROS:

1. Arias, M.; Sánchez-Vizcaíno, J.M. La enfermedad de Aujeszky: Diagnóstico, control y erradicación. En cuadernos de campo, Merial L.. ISBN:84-688-6555-9. pp.1-149. 2004

PONENCIAS Y CONGRESOS

• Agüero, M; Sánchez-Vizcaíno, J.M; Fernández, J; Fernández-Garayzábal, J.F; Domínguez, L; Arias, M. “Detección de patógenos virales de importancia económica en acuicultura por técnicas de PCR múltiple”. IX Congreso Nacional de Acuicultura. Cádiz, 12-15 Mayo 2003.

• Romero L.J., Agüero M.,. Zamora, M.J, Vázquez, B., García, I. and M. Arias. Classical

Swine Fever situation in SPAIN ,2001-2002. Annual Meeting of National Classical Swine fever and African Swine Fever Laboratories. Mayo 12- 14, 2003. Brussels, Belgium.

• Fernandez, J; Agüero, M; Romero, L.J.; Vazquez, B; Belák, S; Arias, M; Sánchez-

Vizcaíno, J.M. “A highly sensitive and specific one-step multiplex RT-PCR assay for simultaneous and differential diagnosis of animal vesicular diseases” 6th International Congress of Veterinary Virology. Saint-Malo, Francia, 24-27 Agosto 2003.

• Angulo, I; Bárcena, J; Agüero, M; Arias, M; Romero, LJ; and Borrego, B. Antigenicity of

synthetic peptides representing specific regions of E2 protein of Classical swine fever virus.Virus Persistence and Evolution. 6th International Congress of Veterinary Virology. Saint-Malo, France, Agosto 24-27. 2003.

• Salguero,FJ; Carrascosa, AL; Díaz-San Segundo, F; Revilla, Y; De Ávila, A; Salas, ML;

Romero, LJ; Arias, M; Sánchez-Vizcaíno, JM. Estudio comparado de cerdos inoculados con el aislado E-70 del virus de la Peste porcina Africana y el Mutante E-70 – A-238L. XV reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria. Córdoba, España, 4-6 Junio. 2003.

• Fernández, J; Agüero, M; Romero, L.J.; Vázquez, B; Belák, S; Arias, M; Sánchez-

Vizcaíno, J.M. "Rapid and differential diagnosis of Foot-and-mouth disease virus, Swine vesicular disease virus, and Vesicular stomatitis virus by one-step multiplex RT-PCR assay in clinical samples". Session of the Research Group of the Standing Technical Committee of the European Commission for the Control of Foot-and-Mouth disease. Gerzensee, Berne, Suiza, 16-19 Septiembre 2003.

• Salguero, J; Carrascosa, A; Díaz-San Segundo, F; Revilla, Y; De Ávila, A; Salas, ML;

Romero, LJ; Arias, M; and Sánchez-Vizcaíno, JM. A comparative study of pigs inoculated with African swine fever (isolate E-70 and E-70 A-238L). 21th ESVP Annual Meeting. Dublin, Ireland, September, 2003.

• Salguero, F.J; Díaz-San Segundo, F; De Ávila, A; Sánchez, M.A; Núñez, A; Fernández

de Marco, M; Raya, A.I; Fernández, J; Carrasco, L; Agüero, M. “PCV 1 and PCV 2 in a case of porcine dermatitis and nephropathy syndrome from a PRRS free farm”. 12th Annual Meeting of the Portuguese Society of Animal Pathology jointly with 16th Annual Meeting of the Spanish Society of Veterinary Pathology. Vila Nova de Famalicao, Portugal, 2-4 Junio 2004.


Jovita Fernández Pinero: Diploma de Estudios Avanzados en 2003, Departamento de Biología Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid.

OTRAS ACTIVIDADES DEL GRUPO:

PARTICIPACIÓN EN CURSOS NACIONALES E INTERNACIONALES:

• B. Vázquez. Participación como ponente en el Curso sobre “Técnicas inmunológicas de aplicación en los laboratorios de sanidad animal”. Celebrado en León, del 29 de Septiembre al 6 de Octubre, 2003. Organiza Junta de Castilla y León.

• Participación del grupo en el XII y XIII Curso Internacional de Enfermedades Exóticas,

Ediciones 2003 y 2004. Reuniones internacionales:

• J. Fernández. “Primer Probe Energy Transfer Workshop”. Veterinary Institute, Lindholm, Dinamarca, 6-8 Enero 2003.

• Luis Romero. Annual Meeting of National Classical Swine fever and African Swine

Fever Laboratories. Mayo 12- 14, Brussels, Belgium, 2003.

• M. Arias. Asistencia a las reuniones de coordinación y seguimiento de Proyectos de Investigación financiados por la UE, QLK2-CT-2000-00486 (24-27 Abril, en Copenhague, Dinamarca y 28-29 Noviembre en Malaga, España) y QLK2-CT-2001-02216 ( 24-25 Octubre, en Lisbon, Portugal). 2003.

• M. Arias. Asistencia a las reuniones de coordinación y seguimiento del Proyecto de

Investigación financiado por la UE, QLK2-CT-2001-02216 ( Valdeolmos, Madrid). Enero 2004.

COLABORACIÓN CIENTÍFICA CON OTROS ORGANISMOS • Proyecto de Cooperación bilateral del Acta de la 9ª Comisión Mixta de Cooperación

Científico Técnica hispano-húngara con la Universidad de Medicina Veterinaria de Budapest, en materia de “Desarrollo de nuevas técnicas para el diagnóstico de enfermedades infecciosas de importancia económica” . 2001-2003. Fuente de financiación: Ministerio de Asuntos Exteriores.


• Esther Blanco Lavilla

Técnico Superior de Investigación (F)

• Carmina Gallardo T. Superior de Investigación (C) • Ana Izquierdo Auxiliar de Laboratorio (C) • María García Auxiliar de Laboratorio (C) • Rocío Martín Auxiliar de Laboratorio (C) • Raquel Martín Auxiliar de Laboratorio (C) • Concepción Gómez Auxiliar de Laboratorio (C) • Elena Martín Auxiliar de Laboratorio (C) • Alicia Llorente Auxiliar de Laboratorio (C) • Nieves Salgado Ayudante de Investigación (F) • Fernando González Camacho Investigador (C) • Bárbara Quintana Becaria Finnova


1.- Desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico del virus de la Fiebre aftosa (VFA) mediante la utilización de biosensores enzimáticos. 2.-Desarrollo y validación de métodos de diagnóstico serológico y virológico del virus de la Peste Porcina Africana (VPPA), para su utilización en diferentes situaciones epidemiológicas (vigilancia, importación / exportación, determinación de la prevalencia en países de África, diagnóstico de portadores, etc). 3.- Estudio de la respuesta inmune inducida frente al VFA y el VPPA en el cerdo. Caracterización de mecanismos inmunológicos relevantes en protección; desarrollo de nuevas estrategias de vacunación. 4.- Epidemiología molecular del VPPA: identificación de regiones del genoma viral cuya secuenciación permita establecer relaciones filogenéticas entre aislados virales y su clasificación en genotipos.

UNIDAD DE DIAGNÓSTICO II


PROYECTOS: CT 2003503603 SSPE Improvement of Foot and mouth disese control by ethically acceptable methods based on scientifically validated assays an new knowledge on FMD vaccines, including the impact of vaccination. RESUMEN DE OBJETIVOS

• Desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico y vacunas para el control y prevención de la Fiebre aftosa

EQUIPO INVESTIGADOR Dra. Esther Blanco; Dr. Francisco Sobrino; Rosa Ferraz (Auxiliar de laboratorio) PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS)

- Se han obtenido varias construcciones de biosensores enzimáticos que presentan una copia por monomero de un epítopo del VFA presente en la proteína no estructural 3B. La evaluación de de dicha construcción se ha realizado mediante ensayos colorimetricos utilizando sueros policlonales de conejo y un monoclonal frente a la 3B.

Contrato UE: UE-LR PPA03 African Swine fever reference laboratory for EU


• Caracterización molecular de nuevos aislados de PPA, producción y caracterización de anticuerpos monoclonales frente a proteínas pp62, pp46, y p15, incorporación de secuencias de diferentes regiones del DNA viral a la base de datos molecular creada para tal efecto.

EQUIPO INVESTIGADOR Unidad Diagnóstico 2: Dr. Esther Blanco, Dr. Carmina Gallardo, Raquel Martín Folgar (Auxiliar de laboratorio), Elena Marín (Auxiliar de laboratorio)


- Se han caracterizado molecularmente mediante PCR y secuenciacion, la región 9GL del DNA del VPPA, asi como otras regiones intergénicas. Dichas secuencias se han introducido en la base de datos y se han comparado con las disponibles en el Genebank. Los resultados indican que dicha región permite la clasificación del PPAV en 8 genotipos diferentes, entre los que se puede diferencias los aislados africanos del este y del oeste. En cuanto a la producción de monoclonales, se han generado las proteínas a utilizar como inmungenos, se han pristinizado e inmunizado ratones Balbc y se han realizado varias fusiones de las cuales se han obtenido varios hibridomas que están en proceso de análisis.

PROYECTOS AGL04-07857-CO3CO2/GAN “Caracterización de nuevos inmunógenos del virus de la Peste porcina africana: Estudio de la respuesta inmune inducida en cerdo" RESUMEN DE OBJETIVOS

• Estudio y caracterización de la respuesta inmune inducida en cerdo frente al VPPA, utilización de las dianas identificadas para el diseño y evaluación de vacunas de nueva generación

EQUIPO INVESTIGADOR Dr.Esther Blanco; Dr. Javier Salguero; Dr. Carmina Gallardo


- Se han puesto a punto ensayos de linfoproliferación para la evaluación de la respuesta inmune celular en animales infectados y vacunados. Se han producido monoclonales frente a la p30, que se han caracterizado parcialmente mediante ensayos de ELISA, Immunoblotting y fluorescencia. Se han obtenido sueros policlonales frente a la p30 y la p54. Se ha purificado DNA viral del aislado E75 virulento para la obtención de genotecas a partir del mismo.

PROYECTOS: BIO 2002-04 091-CO3-03. “Nuevas estrategias vacunales frente al virus de la fiebre aftosa y estudio de los mecanismos implicados en la patogenicidad viral" RESUMEN DE OBJETIVOS

• Diseño de nuevas estrategias de vacunación frente al VFA, evaluación de la respuesta inmune inducida en el hospedador natural, el cerdo, y análisis de su capacidad de protección. Selección de regiones inmunógenicas del virus, tras la infección experimental con el VFA.

EQUIPO INVESTIGADOR Dr. Juan Bárcena; Dr. Esther Blanco; Carolina Cubillos (becaria pre-doctoral)


- Los resultados obtenidos en relación con las estrategias diseñadas que implican VLPs se relatan en la memoria presentada por Dr.J.Bárcena. Además se ha llevado a cabo experimentos de inmunización con péptidos sintéticos que reproducen epítopos B lineares y conformacionales en combinación con un epítopo T identificado por nuestro grupo en estudios previos. Los resultados prometedores indican que la inclusion de ambos epítopos B junto con el T son capaces de conferir una protección parcial a los animales, evaluada tras el desafio con virus, son capaces de reducir la excrección de virus (reducción la transmisibilidad de la enfermedad) y no ejercen una presión inmune capaz de inducir mutaciones en el virus frente al que se desafia, algo que si sucede cuando el repertorio de epítopos empleado se reduce.

PROYECTOS Control of African Swine Fever Virus (ASFV) through improved understanding of the epidemiology of the disease and construction and testing of recombinant and attenuated virus vaccines. (Dpto. Biotecnología-INIA). RESUMEN DE OBJETIVOS

• Desarrollo de mejores métodos de diagnóstico y control, mediante el desarrollo de vacunas, para su utilización en África

EQUIPO INVESTIGADOR Dr.Jose Angel Martinez-Escribano (Dpt.Biotecnologia); Dr. Covadonga Alonso (Dpt.Biotecnologia); Dr. Esther Blanco

PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS) Puesto que el proyecto acaba de comenzar, por el momento durante el año 2004 no se ha obtenido ningún resultado destacable.

CONVENIOS INIA-ILRI (International Livestock Research Institute) “Diagnosis and epidemiological surveillance of viral pathogens of livestock in north africa and asia (NENA) and sub-saharan africa (SSA)” RESUMEN DE OBJETIVOS

• Estandarización y adaptación de los métodos de diagnóstico actualmente utilizados para el VPPA a su utilización en el continente africano. Además, realización de muestreos en diversos países del este de África con objeto de determinar la prevalencia de esta enfermedad y preparar una colección de muestras de campo que permitan evaluar los actuales y futuros ensayos de diagnóstico. Caracterización molecular y patológica de aislados de VPPA responsables de brotes en África.

EQUIPO INVESTIGADOR

Dr.Esther Blanco; Dr. Carmina Gallardo; Alicia Llorente (becaria predoctoral)


- Se han tomado muestras de sangre, suero, órganos y vectores, en dos zonas de kenia y en Tanzania. Estas muestras se han analizado mediante PCR, identificandose por una parte puntos débiles de los protocolos de PCR utilizados hasta el momento, en uso con muestras africanas, así como positivos. Algunas de estas muestras positivas se han conseguido aislar en leucocitos y caracterizar su fenotipo hemoaglutinante. La colección de vectores recogidos se ha clasificado por especies y se ha analizado por PCR. Se ha detectado la necesidad de mejorar la sensibilidad del protocolo utilizado con objeto de obtener positivos más fuertes que permitan realizar estudios de caracterización molecular. En el estudio serológico de las muestras se ha detectado que la proteína p30 utilizada en los ELISAS presenta una serie de cambios en su secuencia que hace que su utilización no sea la más conveniente para el diagnostico serológico. Estamos secuenciando esta proteína y preparando nuevos recombinantes con la secuencia africana homologa para poder utilizarla en ELISA e Inmunoblotting con niveles de sensibilidad y especificidad adecuados.



1. M. Saiz, D. De la Morena, E. Blanco, Jl. Núñez, R. Fernandez y JM Sánchez-Vizcaíno. Detection of Foot and mouth disease virus from culture and clinical samples by reverse-transcription PCR and restriction analysis. Veterinary Research. Volumen: 34. Página Inicial: 26. Página Final: 28. 2003

2. García-Briones MM, Blanco E, Chiva C, Andreu D, Ley V y F Sobrino “Immunogenicity and T cell recognition in swine of Foot and Mouth disease virus polymerase 3D.” Virology May 1;322(2):264-75. 2004

OTRAS ARTICULOS

1. Izquierdo Gil, A; Llorente, A; Gallardo, Carmina. “Peste Porcina Africana: control de reservorios en la fauna salvaje” . Linde y Ribera Pag 86-9110. Abril 2004 .

2. A.Izquierdo, A.Llorente y E. Blanco. “La fauna silvestre como reservoria del virus de la

Fiebre aftosa”. Linde y Ribera 2004.


• I. Avalos, M. Saiz, A. Canals, E.Blanco. “A real time RT-PCR assay for the

detection and quantitation of foot and mouth disease virus using sybr green and the light cycler”. Proceedings of the 6th International Congress of the European Society for Veterinary Virology”. p.184-185. A.Jestin and G.Clement (Eds.). AFSSA, Ploufragan 2003.

• C Gallardo, E. Blanco, A.L. Carrascosa and J.M. Sánchez-Vizcaíno. “Baculovirus

expressed proteins as diagnostic reagents for African Swine Fever Virus”. Proceedings of the 6th International Congress of the European Society for Veterinary Virology”. p.184-185. A.Jestin and G.Clement (Eds.). AFSSA, Ploufragan 2003.

• C. Gallardo, J.M. Sánchez- Vizcaino and E. Blanco. “Sequence analysis of tandem

repeats in gen i196l and the integenic regions i73r/i329 and i78r/i215l of different isolates of African Swine Fever Virus”. Proceedings of the 6th International Congress of the European Society for Veterinary Virology”. p.184-185. A.Jestin and G.Clement (Eds.). AFSSA, Ploufragan 2003.

• C. Gallardo, R. González., A. Llorente, E. Martín and E. Blanco. “Sequence

analysis of tandem repeats in different genes and intergenic regions of asfv isolates” Report of the Annual Meeting of EU National Swine Fever Laboratories. Commission of the European Community DG SANCO. Grange, Ireland (2004).

• Ivonne Avalos, Ana Canals, David Andreu , Francisco Sobrino, Esther Blanco.

“Caracterización de la respuesta inmune humoral y celular inducida en cerdos infectados con el virus de la Fiebre Aftosa e inmunizados con péptidos sintéticos que contienen epítopos B Y T” .VIII Congreso Nacional de Virología. Barcelona. 12-15 Octubre de 2003

• Carmina Gallardo, José Manuel Sánchez-Vizcaíno y Esther Blanco. “Caracterización de las proteínas P15, P35 y PP46 del virus de la Peste Porcina Africana”. VIII Congreso Nacional de Virología. Barcelona. 12-15 Octubre de 2003

• R.Martín-Folgar C.Gallardo, , N.Salgado y E.Blanco “Antigenicity of polyprotein

PP62 of African Swine Fever Virus” II European Virology Congress Madrid 5-9 Septiembre 2004.

• C.Gallardo, L.Dixon y E.Blanco “GENETIC DIVERSITY BETWEEN AFRICAN

SWINE FEVER VIRUS ISOLATES BASED ON VARIABLE NUMBERS OF TANDEM DNA REPEATS LOCATED IN THE B602L GENE.” II European Virology Congress. Libro de abstract. Madrid 5-9 Septiembre 2004.

• I.Avalos, A.Canals, C.Cubillos, H.Serrano, D.Andreu, E.Borras, F.Sobrino y

E.Blanco. “Immune response and protection of pigs immunised with synthetic peptides that reproduce B-and T-cell epitopes of Foot-and-Mouth disease virus” II European Virology Congress Madrid. 5-9 Septiembre 2004.

• C. Cubillos, A. Llorente, I. Avalos, I .Angulo, J. Bárcena y E.Blanco. “Analysis of the

immune response induced by recombinant virus-like particles of Rabbit Hemorrhagic Disease Virus in BALB/c mice”. II European Virology Congress Madrid. 5-9 Septiembre de 2004.

• Avalos, A. Canals, F. Sobrino y E.Blanco.“FMDV RNA detection in pig samples by

conventional and Real Time RT-PCR methods”.European Commission for the control of Foot-and-Mouth disease. Session of the Research group of the Standing Technical Committee

Chania, Creta (Grecia).11-15 Octubre 2004. • I. Avalos, C.Cubillos, H.Serrano,A.Canals, F.Sobrino y E.Blanco. “Immunogenicity

and protection conferred by synthetic peptides”.European Commission for the control of Foot-and-Mouth disease. Session of the Research group of the Standing Technical Committee.Chania, Creta (Grecia).11-15 Octubre 2004.


Tutora de la becaria pre-doctoral Carmina Gallardo Frontaura. Tesis presentada (18/6/03) Título de la Tesis: “Nuevas aportaciones al diagnóstico y patogenia del virus de la peste porcina africana” . Codirección de la Tesis Doctoral de Ivonne Avalos. Presentación del DEA (Oct-2004) Título: “Desarrollo de nuevas estrategias de vacunación frente al virus de la Fiebre Aftosa”.


SERVICIOS • Envío de reactivos de diagnóstico a programas nacionales de vigilancia de

enfermedades infecciosas: Enfermedad Vesicular: Julio-Diciembre 2003: 1.043.000 determinaciones. En 2004: 2.062.500 determinaciones

• Análisis de diagnóstico realizados para enfermedades de la lista A de la OIE:Total Análisis realizados frente a Enfermedad Vesicular, Fiebre Aftosa y Lengua Azul.

Julio a diciembre de 2003: 1370 análisis efectuados. Año 2004: 923 análisis. CURSOS

• Esther Blanco: Coordinadora del XII Curso de Enfermedades Exóticas, impartido en el CISA del 4-30 de Noviembre del 2003.Ponente en dicho curso con la presentación "Nuevas estrategias de diagnóstico para el control de la Fiebre aftosa".

• Carmina Gallardo: Coordinadora y ponente del Curso impartido en Nicaragua del 10-18 Agosto, sobre "Diagnóstico molecular de la Peste Porcina Clásica".

• Esther Blanco: Coordinadora del XIII Curso de Enfermedades Exóticas, impartido en el CISA del 4-30 de Noviembre del 2004.Ponente en dicho curso con la presentación "Nuevas estrategias de diagnóstico para el control de la Fiebre aftosa".

OTRAS

FORMACIÓN DE PERSONAL TÉCNICO-INVESTIGADOR EN MATERIA DE DIAGNOSTICO: 1.- Entrenamiento y formación en técnicas de diagnóstico de Peste Porcina Africana de las becarias de FAO Dr. Noelina Nantima y la Dr. A. Rose Ademun Okurut, del Laboratorio Central Veterinario de Entebbe, Uganda. 30 Junio - 14 Julio 2003. 2.- Entrenamiento y formación en aislamiento del virus de la Peste Porcina Africana en leucocitos porcinos de la investigadora Dra. Markowska, de Polonia. 19- 20 Noviembre 2003 3.- Entrenamiento y formación en técnicas de diagnóstico de Peste Porcina Africana del becario de FAO Sr. Stephen Rubanga, del Laboratorio Central Veterinario de Entebbe, Uganda. Septiembre 2004. ASISTENCIA A REUNIONES INTERNACIONALES:

• 8 de Enero de 2003. Commission of the European Communities (DG VI) Bruselas (Bélgica). Participación en reunión con representantes de los Estados Miembros de la UE, para presentar y discutir el Nuevo Manual de Diagnóstico de PPA elaborado por un grupo de expertos de Italia y España. Este Manual, tras introducir la modificaciones sugeridas por los representantes comunitarios se presentó al Comité Veterinario de la UE los días 2 y 3 de Febrero del 2003, donde fue definitivamente aceptado.

• 27 Marzo- 3 Abril de 2004. Seminario-Taller “Evaluación de la capacidad de los servicios de salud animal e inocuidad de los alimentos en Centroamérica”. Organizado por el Ministerio de Agricultura y Ganadería de Costa Rica y la FAO.

• 10-12 de Mayo de 2004. Annual Meeting of EU National Swine Fever Laboratories. (Grange- Irlanda). Participación en la reunión anual de los Laboratorios de referencia de la EU para la PPA.

• 11-15 de Octubre de 2004. European Commission for the control of Foot-and-Mouth

disease. Session of the Research group of the Standing Technical Committee. Chania, Creta (Grecia).


Carmen Sánchez Mascaraque Francisco Javier Salguero Bodes Miguel Ángel Sánchez Martín Isabel Blanco Gutiérrez Antonia González Guirado Emilio Viva Barroso Francisco Viva Álvarez Ángela Benavente Pintor Luis Zorrilla del Campo Modesto Mate Redondo Fayna Díaz Sansegundo

Investigador A3 (baja 2003) T. Superior de Investigación (2003). Colab. Científica (2004) T. Superior Veterinario T. Superior Veterinario Técnico de laboratorio Ayte. mantenimiento y oficios Ayte. mantenimiento y oficios Ayte. mantenimiento y oficios Ayte. mantenimiento y oficios Ayte. mantenimiento y oficios Becaria

OBJETIVOS DEL GRUPO

Realización de los experimentos “in vivo” derivados de los trabajos de los grupos de investigación y desarrollo del CISA-INIA y de otras instituciones (convenios con otros Ministerios y Administraciones Públicas, Empresas, etc.)

PRINCIPALES LÍNEAS DE I + D DEL GRUPO (2003 – 2004)

Los boxes de alto nivel de contención biológica (NCB3 y NCB3+) del animalario del CISA-INIA

son una pieza clave para el desarrollo de todos los proyectos de investigación y desarrollo que

se llevan a cabo en este Centro, como proyectos propios del INIA así como las colaboraciones

y convenios suscritos con otros Ministerios, Administraciones Autonómicas, Universidades y

Organismos Públicos de Investigación.

En este animalario se llevan a cabo un gran número de experimentos in vivo con diferentes

especies animales como el ratón, cerdo, cobaya, conejo, hámster, trucha arco iris, para realizar

importantes estudios de patología, patogenia, producción de reactivos para detección de

virus/anticuerpos en suero/sangre de animales, pruebas de desafío de vacunas de

enfermedades de gran importancia en la Sanidad Animal española y mundial, como son la

peste porcina africana, la lengua azul, la peste porcina clásica, enfermedades vesiculares, la

influenza porcina, las encefalopatías espongiformes transmisibles, etc., dando un servicio de

PATOLOGÍA ANIMAL Y ANIMALARIO

seguimiento clínico, inoculaciones, inmunizaciones, desafíos y evaluación/validación de

vacunas, toma de muestras de sangre periférica para estudios virológicos y serológicos,

realización de necropsias regladas para la toma de muestras de órganos y tejidos, estudios

anatomopatológicos postmortem macro y microscópicos, seguimiento del bienestar animal y de

la salud animal de los animales alojados en los 21 boxes del animalario NCB3 y NCB3+, etc.



1. J. Castilla, A. Gutiérrez-Adán, A. Brun, D. Doyle, B. Pintado, M.A. Ramírez, F.J. Salguero, B. Parra, F. Díaz San Segundo, J.M. Sánchez-Vizcaíno, M. Rogers, J.M. Torres. “subclinical bovine spongiform encephalopathy infection in transgenic mice expressing porcine prion protein”. The journal of Neuroscience. 24/5063-5069/ 2004

2. J. Castilla, a. Gutiérrez-Adán, A. Brun, B. Pintado, B. Parra, M.A. Ramírez, F.J. Salguero, F. Díaz San Segundo, A. Rábano, M.J. Cano, J.M. Torres. Different behaviour toward spongiform encephalopathy infection of bovine prion protein transgenic mice with one extra repeat octapeptide insert mutation. The Journal of Neuroscience: 24/2156-2164/ 2004

3. A.Brun, J. Castilla, M.A. Ramírez, K. Prager, B. Parra, F.J. Salguero, D. Shiveral, C. Sánchez, J.M. Sánchez-Vizcaíno, A. Douglas, J.M. Torres. Proteinase K enhanced immunoreactivity of the prion protein-specific monoclonal antibody 2a11. Neuroscience Research 48/75-83/ 2004 P.

4. J. Sánchez-Cordón, S. Romanini, F.J. Salguero, E. Ruiz-Villamor, l. Carrasco and J.C. Gómez-Villamandos. A histopathologic, immunohistochemical and ultrastructural study of the intestine in pigs inoculated with Classical Swine Fever virus. Veterinary Pathology 40/ 254-262 / 2003

5. J.C. Gómez-Villamandos, l. Carrasco, M.J. Bautista, M.A. Sierra, M. Quezada, J. Hervás, F. Chacón de Lara, E. Ruiz-Villamor, F.J. Salguero, P.J. Sánchez-Cordón, S. Romanini, A. Núñez, T. Mekonen, A. Méndez and A. Jover. African Swine Fever and Classical Swine: a review of the patogénesis. Deutsche Tierärztliche Wochenschrift, 110 / 165-169 / 2003

6. J. Castilla, A. Gutierrez-Adan, A. Brun, B. Pintado, M.A. Ramírez, B. Parra, D. Doyle, M. Rogers, F.J. Salguero, C. Sánchez, J.M. Sánchez-Vizcaíno, J.M. Torres. Early detection of prp in BSe-infected bovine prp transgenic mice. Archives of Virology. 148/677-691/ 2003.

7. I. Blanco, L. Galina-Pantoja, S. Oliveira, C.Pijoan, C. Sánchez, A. Canals. Comparison between Haemophilus parasuis infection in colostrums-deprived and sow-reared piglets. Veterinary Microbiology 103, 21-27 2004

OTROS ARTÍCULOS

1. F.J. Salguero, F. Díaz-San Segundo, M. Fernández de Marco, M. A. Sánchez-Martín, A. de Ávila, J Domínguez, J. C. Gómez- Villamandos, N. Sevilla. Depleción de linfocitos T durante la infección aguda en porcino con el virus de la fiebre aftosa. Póster IX Simposio de la Asociación de Veterinarios en Diagnóstico Laboratorial . Libro de resúmenes. Córdoba. España. 2004

2. F.J. Salguero, F. Díaz-San Segundo, M. Fernández de Marco, M.A. Sánchez-Martín,

A. De Ávila, J. Domínguez, J.C. Gómez-Villamandos, N. Sevilla. “Estudio histopatológico e inmunohistoquímico de las lesiones de piel y órganos linfoides en la fiebre aftosa en porcino”. Póster IX Simposio de la Asociación de Veterinarios en Diagnóstico Laboratorial . Libro de resúmenes. Libro de resúmenes. Córdoba. España. 2004

3. F. Díaz-San Segundo, F.J. Salguero, J. Castilla, A. Gutiérrez-Adán, B. Pintado, B. Parra, M.A. Ramírez, M.J. Cano, A. Rábano, A. Brun, J.M. Torres. Neuropathological findings in transgenic mice expressing a bovine prion protein with four extra octapeptide repeats. Comunicación oral. 22nd Meeting of the European Society of Veterinary Pathology. Abstract book.: Olsztyn (Polonia). 2004

4. M. Fernández de Marco, F.J. Salguero, P.J. Sánchez-Cordón, A. Núñez, J. Gutiérrez, J.C.. Gómez-Villamandos. Cytokine profile in sera from pigs inoculated with African swine fever virus (isolate E-70) and Classical swine fever virus (Alfort 187 strain). Poster. 22nd Meeting of the European Society of Veterinary Pathology. Abstract book: Olsztyn (Polonia). 2004

5. F.J. Salguero, F. Díaz-San Segundo, M. Fernández de Marco, M.A. Sánchez-Martín, A. de Ávila, J. Domínguez, N Sevilla. Changes in lymphocyte subsets in acute infection in swine with Foot and mouth disease virus. Poster. 22nd Meeting of the European Society of Veterinary Pathology. Abstract book: Olsztyn (Polonia). 2004

6. A. Lipowski, F. Díaz-San Segundo, A. de Ávila, F.J. Salguero. Clinical and pathological study of pigs experimentally inoculated with CSFV Glentorf strain. Póster. 22nd Meeting of the European Society of Veterinary Pathology. Abstract book: Olsztyn (Polonia). 2004

7. F.J. Salguero, F. Díaz-San Segundo, M. Fernández de Marco, M.A. Sánchez-Martín, A. de Ávila, J. Domínguez, N Sevilla. Pathological and immunohistochemical study of skin and lymphoid lesions in experimental foot-and-mouth disease virus infection in swine. Póster. Second European Congress of Virology Eurovirology 2004. Abstract book: Madrid (España). 2004

8. F. Díaz-San Segundo, F.J. Salguero, M. Fernández de Marco, M.A. Sánchez-Martín, A. de Ávila, J. Domínguez, N. Sevilla. Depletion of CD4+ and CD8+ cells during acute infection of swine foot and mouth disease virus (FMDV). Póster. Second European Congress of Virology Eurovirology 2004. Abstract book: Madrid (España). 2004

9. N. Sevilla, f. Díaz-San Segundo, M.A. Sánchez-Martín, A. de Ávila, F.J. Salguero. Foot-and-mouth disease virus (FMDV) causes an acute disease that can be lethal for adult laboratory mice. Póster. Second European Congress of Virology Eurovirology 2004. Abstract book: Madrid (España). 2004

10. Salguero, F.J., Núñez, A., Díaz-San Segundo, F., Gómez-Villamandos, J.C., García, A., Quezada, M. Apoptosis in lymphoid organs in experimental PRRS (South American isolate) infection. Póster. Congreso: 28th Annual Meeting and Symposium of the Nordic Society for Veterinary Pathology. Abstract book. Copenhague (Dinamarca). 2004

11. Salguero, F.J., Núñez, A., Díaz-San Segundo, F., Gómez-Villamandos, J.C., García, A., Quezada, M. PRRS virus infection induces apoptosis in lymphoid organs.. Póster. 12th Annual Meeting of the Portuguese Society of Animal Pathology jointly with 16th Annual Meeting of the Spanish Society of Veterinary Pathology. Abstract book. Vila Nova de Famalicão (Portugal). 2004

12. Salguero, Fernández de Marco, Núñez, A., Díaz-San Segundo, Gallardo, Gómez-Villamandos. Cytokine profile in sera from pigs inoculated with African swine fever (isolate E-70). Póster, 12th Annual Meeting of the Portuguese Society of Animal Pathology jointly with 16th Annual Meeting of the Spanish Society of Veterinary Pathology. Abstract book. Vila Nova de Famalicão (Portugal). 2004

13. Salguero, F.J., Díaz-San Segundo, F., de Ávila, A., Sánchez-Martín, M.A., Núñez, A., Fernández de Marco, M., Raya, A.J., Fernández, J., Carrasco, l., Agüero, M. PCV1 and PCV2 in a case of porcine dermatitis and nephropathy syndrome from a PRRS free farm. Póster. 12th Annual Meeting of the Portuguese Society of Animal Pathology jointly with 16th Annual Meeting of the Spanish Society of Veterinary Pathology. Abstract book. Vila Nova de Famalicão (Portugal). 2004

14. Díaz-San Segundo, F., Blanco, E., Sánchez-Martín, M.A., de Ávila, A., Fernández de Marco, M., Gómez-Villamandos, J.C., Ávalos, I., Sobrino, F., Salguero, F.J. Clinical signs and pathology of Foot and mouth disease infection in swine: a prelimiary study. Póster. 12th Annual Meeting of the Portuguese Society of Animal Pathology jointly with 16th Annual Meeting of the Spanish Society of Veterinary Pathology. Abstract book. Vila Nova de Famalicão (Portugal). 2004

15. Díaz-San Segundo, F., Salguero, F.J., Castilla, J., Gutiérrez-Adán, A., Pintado, B., Parra, B., Ramírez, M.A., Cano, M.J., Brun, A., Torres, J.M. Neuropathological findings of BSE-infected transgenic mice with one extra repeat octapeptide insert mutation. Póster. 12th Annual Meeting of the Portuguese Society of Animal Pathology jointly with 16th Annual Meeting of the Spanish Society of Veterinary Pathology. Abstract book. Vila Nova de Famalicão (Portugal). 2004

16. Fernández de Marco, M., Malguero, F.J., Sánchez-Cordón, P.J., de Ávila, A., Sánchez-Martín, M.A., Gómez-Villamandos, J.C. Cytokine profile in sera from pigs inoculated with Classical swine fever virus (Alfort 187 strain). Póster. 12th Annual Meeting of the Portuguese Society of Animal Pathology jointly with 16th Annual Meeting of the Spanish Society of Veterinary Pathology. Abstract book. Vila Nova de Famalicão (Portugal). 2004

17. Díaz-San Segundo, F., Salguero, F.J., Castilla, J., Gutiérrez-Adán, A., Pintado, B., Parra, B., Ramírez, M.A., Cano, M.J., Brun, A., Torres, J.M. Pathological characterization of a porcine-adapted BSE prion. Comunicación oral. 12th Annual Meeting of the Portuguese Society of Animal Pathology jointly with 16th Annual Meeting of the Spanish Society of Veterinary Pathology. Abstract book. Vila Nova de Famalicão (Portugal). 2004

18. Gutiérrez J., Bautista M.J., Salguero, F.J., Fernández M., Sierra M.A., Gómez-Villamandos J.C. Detección de la proteína tau hiperfosforilada en ratones transgénicos (Bo-Prp) con EEB experimental.Póster. 12th Annual Meeting of the Portuguese Society of Animal Pathology jointly with 16th Annual Meeting of the Spanish Society of Veterinary Pathology. Abstract book. Vila Nova de Famalicão (Portugal). 2004

19. Castilla J., Brun A., Díaz, F., Salguero F.J., Cano, M.J., Gutiérrez A., Pintado B., Torres J.M. Vertical transmission of BSE in Bo-Prp transgenic mice after intra-cerebral inoculation. Póster. Prion 2004. First international Conference of the European network of excellence neuroprion. Booklet of abstracts. París (Francia). 2004

20. Salguero F.J. Pathogenesis of ASF: cytokine profile in acute disease and experimental inoculation with gene deletd ASFV isolates. Ponencia. Annual Meeting of National African swine fever laboratories. Booklet of abstracts. Grange (Irlanda). 2004

21. Castilla J., Gutiérrez A., Pintado B., Brun A., Doyle D., Salguero F.jJ, Díaz-San Segundo F., Parra B., Espinosa J.C, Rogers M., Sánchez-Vizcaíno J.M., Torres J.M. Prion transmission to transgenic mice expressing porcine Prpc. Comunicación oral. Prion diseases: from basic research to intervention concepts. Booklet of abstracts. Gasteig, München (Alemania). 2003

22. Salguero FJ., Carrascosa A.L., Díaz San-Segundo F., Revilla Y., de Ávila A., Salas M.L., Romero L.J., Arias M.L., Sánchez-Vizcaíno J.M. A comparative study of pigs inoculated with African swine fever (isolate E-70 and E-70-A238l). Póster. Congreso: 21th Meeting of the European Society of Veterinary Pathology. Booklet of abstracts. Dublín

(República de Irlanda). 2003

23. Núñez A., Pedrera M., Fernández de Marco M., Salguero F.J., Sánchez-Cordón P.J., Carrasco l. “In vivo” expression of different cytokines by pulmonary macrophages of sheep. Póster. Congreso: 21th Meeting of the European Society of Veterinary Pathology. Booklet of abstracts. Dublín (República de Irlanda). 2003

24. Salguero F.J. Pathogenesis of African swine fever: the role of cytokines. Ponencia (invited speaker). Annual Meeting of National African swine fever laboratories. Booklet of abstracts. Bruselas (Bélgica). 2003

25. Parra B., Castilla J., Brun A., Gutiérrez A., Pintado B., Ramírez M.A., Cano M.J., Salguero F.J., Díaz-San Segundo F., Torres J.M. Ratones transgénicos que expresan un octapéptido repetido adicional en la proteína del prión (Prp) muestran un comportamiento diferencial respecto a aquellos que expresan la Prp wild type. Póster. XXVI Congreso de la Sociedad Española de bioquímica y biología molecular. Libro de resúmenes. A Coruña (España). 2003

26. Salguero F.J., Gómez-Villamandos J.C. Encefalopatías Espongiformes Transmisibles. Moderador de sesión. XV Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria. Córdoba (España). 2003

27. Sánchez-Cordón P.J., Bautista M.J., Núñez A., Salguero F.J., Ruiz-Villamor E., Gómez-Villamandos J.C. Expresión de IFN γ por las poblaciones de linfocitos de bazo y timo en la peste porcina clásica. Comunicación oral. Libro de resúmenes. XV Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria. Córdoba (España). 2003

28. Fernández de Marco M., Salguero F.J., Sánchez-Cordón, P.J., Núñez A., Carrasco L., Gómez-Villamandos J.C. Estudio inmunohistoquímico de la tonsila en la peste porcina africana aguda. Póster. XV Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria. Córdoba (España). 2003

29. Gutiérrez J., Bautista M.J., Salguero F.J., Fernández de Marco M., Díaz-San Segundo F., Sánchez-Vizcaíno J.M., Gómez-Villamandos J.C. Neuropatología ultraestructural de ratones transgénicos (Bo-Prp) con E.E.B. experimental. Póster. XV Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria. Córdoba (España). 2003

30. Salguero F.J., Carrascosa A.L., Díaz-San Segundo F., Revilla Y., de Ávila A., Salas M.L., Romero L.J., Arias M.L., Sánchez-Vizcaíno J.M. Estudio comparativo de cerdos inoculados con el aislado E-70 del virus de la peste porcina africana y el mutante E-70-

A238l. Póster. XV Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria. Córdoba (España). 2003


SERVICIOS

El Servicio de Animalario realiza una media de 25 experiencias cada año.

INFORMES

Informes anuales a ICLAS.

CURSOS

Profesores de los siguientes Cursos • XII Curso Internacional de Enfermedades Exóticas Animales (INIA-AECI) • XIII Curso Internacional de Enfermedades Exóticas Animales (INIA-AECI) • Curso de Formación sobre Experimentación Animal (INIA)

OTRAS


• Mª Jesús Muñoz Investigador A2 • Matilde Carballo Investigador A3 • Ana de la Torre Investigador A4 • Fernando Esperón Becario INIA • Susana Cámara Becario CICYT • Sonia Aguayo Becario UCM (baja 2004) • Miguel González Aux. de Laboratorio (baja 2004)

OBJETIVOS DEL GRUPO

Evaluación del estado sanitario de poblaciones animales. Ensayos de toxicidad subletales para valorar efectos específicos de tóxicos ambientales. Puntos críticos y análisis de riesgo en actividades agropecuarias. Valoración de riesgo ambiental de sustancias, productos fitosanitarios, farmacéuticos ,

vertidos, subproductos y suelos contaminados. Eco-epidemiología de enfermedades infecciosas.


Efectos eco/toxicológicos, Análisis de riesgo Eco-epidemiología

SANIDAD AMBIENTAL


PROYECTOS • Valoración de efectos sobre la reproducción en poblaciones piscícolas por contaminantes

de naturaleza de origen estrogénica. INIA SC00-040. 2000-2003.

• Investigación epidemiológica y diagnóstico molecular del brote de lengua azul en las islas Baleares. INIA 0T00-045-C2-1. 2000-2003.

• Valoración del estado sanitario de 3 especies de cetáceos residentes en el archipiélago

canario: Physeter macrocephalus, Tursiops truncatus y Globicephala macrorhynchus. CICYT (REM2002-04162-C02-02/MAR). 2002 – 2005

RESUMEN DE OBJETIVOS • Valorar la incidencia de efectos en la reproducción en poblaciones piscícolas

expuestas a diferentes vertidos agropecuario y/o agroindustrial mediante biomarcadores específicos .

• Determinación analítica de compuestos estrogénicos en diferentes efluentes. • Desarrollo y aplicación del modelos experimentales “in vivo” e “in vitro” para

valorar efectos en la reproducción. • Eco-epidemiología de la lengua azul. • Valoración de las fuentes potenciales de contaminación en la zona de distribución de

los cetáceos en el archipiélago canario. • Estudio de contaminantes ambientales en tejidos de cetáceos varados. • Valoración toxicológica de las concentraciones encontradas.

EQUIPO INVESTIGADOR

Carballo Santaolalla, Matilde Investigador A3 , CISA-INIA; Muñoz Reoyo, Mª Jesús Investigador A2 , CISA-INIA; De la Torre Reoyo, Ana, Investigador A4 , CISA-INIA; Roset Alvarez Alvarez, Jaime, Contratado- INIA; De la Peña de Torres, Eduardo. Científico Titular, CCMA- CSIC; Illera del Portal, Juan Carlos. Profesor Titular de Universidad. F. De Veterinaria. UCM;Silvan Granado, Gema. Profesor Titular de Universidad. F. De Veterinaria. UCM; Sánchez Vizcaíno, José Manuel. Catedrático. F. De Veterinaria. UCM


• Valoración de agentes estrogénicos en efluentes s: hormonas (estradiol y estrona) y compuestos orgánicos: metabolitos de detergentes alquilfenoles, bisfenol A, ftalatos y residuos de pesticidas.

• Biomarcadores de exposición a estrógenos ambientales en peces: vitelogenina en plasma de machos e histología de gónadas.

• Desarrollado un método ELISA para valoración de estradiol en plasma, para establecer los niveles de esta hormona en machos y hembras de carpa, estableciendo niveles básales y niveles en animales expuestos.

• Valoración de capacidad estrogenica de efluentes mediante la aplicación del ensayo de levadura (YES), ensayo in vitro especifico de este tipo de efecto.

• Aplicación del modelo de pez medaka para valorar efectos en la reproducción originados por extracto orgánico de efluentes de depuradoras.

• Variables agro-climáticas de distribución del mosquito transmisor de la lengua azul

• Identificación en la zona de estudio de efluentes y compuestos orgánicos e inorgánicos relevante desde el punto de vista medio ambiental.

• Identificación en muestras de grasa e hígado de compuestos clorados y hidrocarburos aromáticos policíclicos y detección de metales pesados en un total de 6 tejidos.

• Relación de patologías descritas en los animales varados con la concentración de determinados compuestos químicos analizados.



1. Aguayo, S; Muñoz, MJ, de la Torre, A; Roset, J; de la Peña, E; Carballo, M. 2004. Identification of organic compounds and ecotoxicological assessment of sewage treatment plants (STP) effluents. Sci Total Environ 328(1-3): 69-81.

2. Díez, JA; Hernaiz, P; Muñoz, MJ; de la Torre, A; Vallejo, A. 2004. Environmental impact of the pig slurry use as fertilizer in a long time field experiment: Agronomical effects. Soil Use and management, 20:444-450.

3. De la Torre, A; Domínguez, L; González, M; Aguayo, S; Roset, J; Muñoz, MJ. 2004 Impact from a cattle waste lagoon rupture on a fish farm: a case of study. Ecología Austral, 14:135-139.

OTROS ARTÍCULOS

1. De la Torre, A; Carballo, M; Muñoz, MJ, 2003. Bases para una valoración de riesgo ambiental del derrame del Prestige. Industria y Minería 351: 52-56.

2. Muñoz, MJ; Martínez-Almela, J; de la Torre, A, 2003. Evaluación global de los sistemas

de tratamiento de purines. Porci 77: 55-68.

3. De la Torre, A; Muñoz, MJ; Sarazá, ML. 2003. Un plan integral de residuos para una explotación de porcino. Porci 75: 71-82.

4. Carballo, M; de la Torre, A; Muñoz, MJ, 2003. Nuevas consideraciones en la valoración

ambiental de residuos ganaderos. Porci 77: 85-95.

5. De la Torre, A; Arce, A; Díez, JA; Carballo, M; Vallejo, A. 2003. La problemática de los estiércoles y purines desde el punto de vista de la emisión de gases y olores. Porci 77: 69-84.

6. Díaz JA, Vallejo A, Aguayo S, Muñoz MJ. 2003. Claves agronómicas para la aplicación

de purines de cerdo respetando el medio ambiente. Porci 75: 39-54.

7. De la Torre A, Carballo M, García E, Muñoz MJ. 2003. Ecotoxicología . Toxicología de Postgrado. ISBN 84-600-9848-6. CD. Área Toxicología de Sevilla. M. Repetto Ed. España.


“Valoración sanitario ambiental de efluentes y vertidos al medio ambiente”. Presentado por Sonia Aguayo Balsas en la Facultad de Biológicas (UCM), con la calificación de Cum Laudem por unanimidad


INFORMES

Revisión de la norma ISO 11268-2: Inhibition of reproduction of eisenia by soil pollutants. Mayo, 2003. Solicitado por: Pte. Comité Técnico de Normalización del AEN/CTN 77 Medioambiente SC Suelos. Comentarios a la norma ISO 20963: Effects of pollutants on insect larvae. Determination of acute toxicity. Noviembre, 2003. Solicitado por: Pte. Comité Técnico de Normalización del AEN/CTN 77 Medioambiente SC Suelos. Revisión de la norma ISO 11269-2: Determination of the effects of pollutants on soil flora. Noviembre, 2003. Solicitado por: Pte. Comité Técnico de Normalización del AEN/CTN 77 Medioambiente SC Suelos. Muñoz, M.J; de la Torre, A. 2003. Environmental fate and behaviour, B7. In: “Chlorotoluron”. (García-Baudín, J.M. y Alonso-Prados, J.L. coords.) Vol 3. Addendum B-7. 36 pg. Muñoz, M.J; de la Torre, A. 2003. Ecotoxicity, B8. In: “Chlorotoluron”. (García-Baudín , J.M. y Alonso-Prados, J.L. coords.) Vol 3. Addendum B-8. 35 pg.

Voto de la norma ISO 22030: Soil quality. Biological methods. Chronic toxicity in higher plants. Enero, 2004. Solicitado por: Pte. Comité Técnico de Normalización del AEN/CTN 77 Medioambiente SC Suelos.

Revisión de la norma ISO 15799: Guidance on the ecotoxicological characterization of soils and soil materials. Mayo, 2004. Solicitado por: Pte. Comité Técnico de Normalización del AEN/CTN 77 Medioambiente SC Suelos.

Comentarios a la norma ISO 2692-2: Determination of the effects of pollutants on soil flora. Julio, 2004. Solicitado por: Pte. Comité Técnico de Normalización del AEN/CTN 77 Medioambiente SC Suelos.

Revisión de la norma ISO 11268-3: Calidad del suelo—Efectos de los contaminantes sobre las lombrices. Parte 3: Líneas directrices sobre la determinación de los efectos en condiciones de campo. Julio, 2004. Solicitado por: Pte. Comité Técnico de Normalización del AEN/CTN 77 Medioambiente SC Suelos.

CURSOS

Máster Internacional “Experto Universitario en Toxicología”. Organizado por la Universidad de Sevilla, Área de Toxicolgía. Director: Dr. M.Repetto. “Ensayos de evaluación de la ecotoxicidad”. Coordinadora: M.J. Muñoz. Enero-Octubre 2004. 300 horas lectivas (30 créditos). Curso Nacional sobre Suelos contaminados. "Toxicología ambiental". Organizado por la Fundación para el Fomento de la Innovación Industrial. Impartido en Santiago. 22 mayo, 2003.

Curso Nacional sobre Suelos contaminados. "Toxicología ambiental". Organizado por la Fundación para el Fomento de la Innovación Industrial. Impartido en Guadalajara. 23 octubre, 2003. Curso Nacional sobre Suelos contaminados. "Toxicología ambiental". Organizado por la Fundación para el Fomento de la Innovación Industrial. Impartido en León. 21 noviembre, 2003.

Curso de doctorado: Bioseguridad. Departamento de Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria. UCM. Madrid, Marzo-Junio 2004. Curso de doctorado: Fundamentos de Toxicidad Celular y Molecular. Departamento de Nutrición, Bromatología y Toxicología. Facultad de Farmacia. U.Alcalá. Madrid, 19 Mayo 2004.

Curso de doctorado: Entradas de nitrógeno en el suelo. Departamento de Ecología. Facultad de Biología. UCM. Madrid, 1-2 Junio 2004.

OTRAS

Participación como Miembro vocal en el Subcomité Técnico de Normalización de Métodos de Ensayo. AEN/CTN 77. Miembros O (observador). Medioambiente y suelos: 2001-2003. Coordinación de la Sección de Toxicología Ambiental de la Asociación Española de Toxicología. 2001-2003. Crítico de la Revista Española de Toxicología: Evaluación del trabajo 2013/03. Septiembre 2003. Crítico de la Revista de Ecología Austral: Evaluación del trabajo M612. Octubre 2003. Participación en el Subcomité Técnico de Normalización de Métodos de Ensayo. AEN/CTN 77. Medioambiente y suelos. Miembro vocal.

Coordinación de la Sección de Toxicología Ambiental de la Asociación Española de Toxicología. 2001-2004.


• Argelia Castaño • Mª Luisa Cuellar (a tiempo parcial)

Investigador A-2 titular Colaborador Técnico

• Carlos Sánchez Nieto Técnico de Investigación y Laboratorio • Patricia García Maceira Becaria (baja 2004)

OBJETIVOS DEL GRUPO

• Desarrollo de metodologías alternativas al uso de animales vertebrados para la valoración de efectos adversos de los contaminantes físicos y químicos sobre la salud.

• Fomento y desarrollo del principio de las 3R: Reducción Refinamiento y Reemplazo de

los animales vertebrados en investigación, ensayos toxicológicos y docencia.


PPrriinncciippaalleess LLíínneeaass ddee IInnvveessttiiggaacciióónn

El área de investigación en la que me encuadro es la valoración y diagnóstico de los efectos adversos de los contaminantes ambientales sobre las poblaciones animales y mas concretamente:

• Desarrollo de métodos alternativos al uso de animales de experimentación para la

evaluación toxicológica y ecotoxicológica: alternativas a vertebrados acuáticos.

• Desarrollo metodológico de sistemas de valoración de efectos genéticos en poblaciones de

peces dulceacuícolas y marinos

• .Valoración de riesgo medioambiental, tanto destino y comportamiento medioambiental,

como efectos ecotoxicológicos de sustancias químicas y vertidos sobre el medio ambiente.

• Desarrollo de biosensores de control de la contaminación medioambiental

MÉTODOS ALTERNATIVOS A LA EXPERIMENTACIÓN ANIMAL


PROYECTOS BIO2002-01912 Aplicación y desarrollo de biomarcadores moleculares en células derivadas de peces como sistemas alternativos de valoración de alteraciones genomicas. (2002-2005)

RESUMEN DE OBJETIVOS 1º Validar los marcadores genómicos desarrollados mediante RAPDs, seleccionando para ello diferentes grupos de contaminantes orgánicos prioritarios: Hidrocarburos Aromáticos Policiclícos (PAH), Bifenilos Poli-Clorados (PCB), Disruptores Endocrinos (hormonas naturales y surfactantes alquilfosfónicos), Pesticidas (órgano-fosforados, órgano-clorados y carbamatos) y anilinas cloradas. 2º Desarrollo de marcadores genómicos para diagnóstico 2.1 Secuenciación: Una vez obtenidas las bandas diferenciales, resultado de la exposición a los diferentes grupos de contaminantes, se secuenciarán. 2.2 Tras conocer la secuencia de las bandas diferenciales se determinará si cada grupo de contaminantes actúa de manera específica o inespecífica sobre la molécula de ADN, es decir se estudiará si existen puntos calientes en el genoma para cada tipo de contaminante químico estructuralmente diferente, y de ser así, se diseñarán primers específicos de secuencia conocida que permita el diagnostico de poblaciones piscícolas expuestas a diferentes tipos de contaminantes.

EQUIPO INVESTIGADOR

Argelia Castaño (Investigador); Patricia Garcia Maceira (becaria FPI) PRINCIPALES RESULTADOS (MÁX. 150 PALABRAS)

Se han cumplido los objetivos enmarcados en el proyecto BIO2002-01912 para el año 2003. Se han valorado los alteraciones en el patron de bandas del DNA genómico de células RTG-2, derivadas de trucha, tras la exposición diferentes sustancias químicas. En concreto se han realizado exposiciones agudas (3 dias,) a medio plazo (15 dias ) y a largo plazo (30 dias) de biocidas, anilinas cloradas, pesticidas organofosforados, organoclorados, compuestos estrogénicos. El análisis de imagen comparativo de los patrones de bandas se concluirá previsiblemene antes de seis meses. Resultado de una estancia de colaboración entre la facultad de veterinaria de la UCM y el CISA, se ha puesto a punto un método rápido para medir daño masivo al DNA en células RTG-2 mediante un método fluorimétrico establecido para otros organismos. Resultado de otra estancia de colaboración, esta vez entre la Facultad de Farmacia de la universidad de Valencia y el CISA se ha ampliado la aplicabilidad de la técnica anteriormente puesta a punto con una gama de compuestos químicos mas amplia con el objetivo de validar el protocolo desarrollado.

Proyectos U. E. CONAM Consensus networking on alternative methods within Europe. VI Framework program. 2004-2006. 150.000 Euro. partner

RESUMEN DE OBJETIVOS The main objective of this project, CONAM, is to build, over a time span of 3 years, a solid

Con formato

consensus network on 3R-alternatives, ideally including national consensus platforms of all European countries (MS, AS, ACC) and with links to 3R-relevant organisations and institutes such as ECVAM (European Centre for the Validation of Alternative Methods), ICCVAM (The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods), OECD (Organisation for Economic Cooperation and Development), IVITIP (In Vitro Testing Industrial Platform), ZEBET (Zentralstelle zur Erfassung und Bewertung von Ersatz- und Engängzungsmethoden zu Tierversuchen-Databank), NCA (Netherlands Centre Alternatives to Animal Use), EURCA (European Resource Centre for Alternatives in higher Education), ESTIV (European Society of Toxicology in Vitro),… etc (http://www.altex.ch/links_d.htm). CONAM will deliver critical consensus expert opinions on 3R-issues and strategies; it will make the bridge between the European Parliament and the 4 parties involved in 3R-alternative methods. Furthermore, in this project, special attention will go to potential new alternatives and emerging new technologies, like genomics, proteomics and metabolomics, and what their value is in the development of new 3R-methods. Also their ethical, educational and socio-political impact will be studied. This information will be disseminated over the CONAM network and will be at the basis of active collaboration between the 4 parties with interest in 3R-alternatives within the different European countries (MS, AS, ACC). As such CONAM will play, throughout FP6, a key role in the networking capacity and information exchanging role on scientific, societal and technological matters in relation to the development and validation of 3R-alternatives. More specific objectives are situated in the fields, identified as priorities for immediate action within the run of FP6. These fields are (i) consensus networking on 3R-alternatives, (ii) legislative issues with respect to 3R-alternatives, (iii) education and training in 3R-alternatives and (iv) ethical issues in alternative methods.

EQUIPO INVESTIGADOR Argelia Castaño (como presidenta de REMA: Plataforma Nacional de Métodos Alternativos); Representatntes de cada una de las Plataformas Nacionales Coordinación V. Rogers presidenta de la Plataforma Europea (ECOPA)


Se han establecido nuevas plataformas nacionales ( Noruega, Dinamarca..) y mas concretamente se están empezando a constituir en los países de nueva incorporación en la U.E.



1. Castaño A, Bols NC, Braunbeck T, Dierick P, Halder P, Isomaa B, Kawahara K, Lee LEJ, Mothersill C, Pärt P, Repetto G, Sintes JR, Rufli H, Smith R, Wood C, Segner H. (2003). “The use of fish cells in ecotoxicology – an ECVAM Workshop Report”. ATLA 31:317-351.

2. A. Castaño and C. Becerril In vitro assessment of DNA damage after short and long-term exposure to benzo(a)pyrene using RAPD and the RTG-2 fish cell line. Mutation Research 552, 141-151. (2004)

OTROS ARTÍCULOS

Becerril, Acevedo, H; Lllorente, M.T. y A. Castaño. 2004. Detección in vivo mediante RAPD de alteraciones en el ADN producidas por Benzo (a)pyreno. Revista de Toxicología 21: 16-23.


CAPÍTULOS DE LIBROS:

1. Castaño, A. Becerril, C and Llorente,M.T. “Fish Cells to detect aquatic carcinogens and genotoxic agents”. In: Austin B, Motersill C (eds). In vitro methods in aquatic toxicology. Springer Praxis. Chapter 11, 241-278. 2003

2. Protocolos de Evaluación Toxicológica y Alternativas : Guillermo Repetto, Jorge Zurita, Argelia Castaño. En Búsqueda e Interpretación de la Información Toxicológica. Módulo 21. En: "Ampliación de Toxicología de Postgrado". M. Repetto, ed. Area de Toxicología. Universidad de Sevilla. CD-ROM. Sevilla, 2004. ISBN: 84-689-0404-X, Depósito legal: SE-190-05.


Castaño., A. Métodos Alternativos a la investigación con animales. I reunión de los Comités de Bioética de la Comunidad de Madrid. 29 Junio 2004.

Castaño, A. Alternativas en Toxicología y Ecotoxicología: Logros y Retos. Ponencia Invitada. VII Congreso de la Sociedad Española para las Ciencias del Animal de Laboratorio. Palacio de Miramar. San Sebastián. (2003), 5-8 Noviembre

TESIS DOCTORALES. DIPLOMAS DE ESTUDIOS AVANZADOS

Patricia García Maceira: “Desarrollo de RAPDs para el estudio de variaciones genéticas en Poblaciones” Universidad Complutense de Madrid: Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Ciencias Biológicas ( en preparación)

María Bravo Arranz: “Valoración toxicólogica de las aminas biógenas presentes en alimentos” Universidad Complutense de Madrid: Departamento de Bioquímica. Facultad de Farmacia. (presentada y se procederá a su defensa en Septiembre en la facultad de Farmacia de la UCM)


INFORMES

Elaboración del proyecto del Centro de Competencia en Bioseguridad Alimentaria (CECOBA- Plan estratégico INIA 2004-2007) a petición de la dirección Gral. de INIA. Organización de 3 reuniones con el equipo directivo de la AESA- Agencia Española de Seguridad Alimentaria ( La directora ejecutiva y El director científico) para la coordinación de actividades en la creación del Centro de Competencia en Bioseguridad Alimentaria (CECOBA)

CURSOS

2004 Curso sobre Protección de los Animales usados en experimentación y otros fines científicos. Ministerio de Agricultura Pesca y Alimentación. 11-12 Noviembre 2004 Curso de formación de personal IS Carlos III: cultivos celulares para la determinación de contaminantes químicos.18-22 Octubre. I.S.Carlos III. Centro Nacional de Sanidad Ambiental (15 horas) 2003.- Curso Internacional de postgrado a distancia: Experto Universitario en Toxicología. Área de Toxicología. Universidad de Sevilla.

OTRAS Asistencia a reuniones Nacionales e internacionales como Miembro de Comités Expertos

• 2 Reuniones del Comité Científico Asesor del Centro Europeo de validación de métodos Alternativos ( ESAC-ECVAM) JRC-U.E

• 4 Reuniones de Los Grupos Técnicos de trabajo para la elaboración de la Estrategia Europea de Salud y Medioambiente:

o Metales Pesados o Necesidades de Investigación

• 2 Reuniones como iembro de la ECVAM-Taskforce on Ecotoxicology. • 2 reuniones como miembro del Comité Nacional de IUTOX (International Union of

Toxicology) en el Mº de Ciencia y Tecnología. • 1 reunión como Miembro del Comité Nacional de ICLAS ( Internátional council of

Laboratory Animal Science) • 1 reunión como miembro del comité ConDE (Conferencia Nacional sobre Disruptores

Endocrinos ) Participación en reuniones institucionales 2004. Reunión para la elaboración del borrador del Real Decreto sobre protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos. Sub. Gral de Ordenación y

Buenas Practicas Ganaderas. MAPA. Septiembre 2004. Actividades de Divulgación Científica 2003 Y 2004 IV Semana de la ciencia. Madrid 10-14 Noviembre. Conferencia: La investigación como base de la Seguridad Alimentaria. Organización de reuniones Científicas 2004.-Organización de la II Jornada Nacional de REMA: Genómica, Proteómica y Citómica: Nuevas herramientas en el desarrollo de medicamentos. Madrid 1 Marzo2004.Salón de Actos del Centro de Ciencias Medioambientales (CSIC) c/ Serrano 115 dpdo 28006 Madrid Presidente del comité organizador. Congresos 1. Castaño, A. Eco–Genotoxicología : Utilización de Células de Peces en los Procedimientos

de Valoración de Riesgo Conferencia invitada. XIII Reunion Científica de la Sociedad Española de Mutagénesis Ambiental: SEMA2004. Universidad SEK. Segovia 6-8 Julio.

2. García, P. y A. Castaño Detección de Genotoxicidad en Células Expuestas a Diclorvos mediante la Tecnología RAPD. Comunicación Oral. XIII Reunion Científica de la Sociedad Española de Mutagénesis Ambiental: SEMA2004.Universidad SEK Segovia 6-8 Julio.

3. Castaño., A. Métodos Alternativos a la investigación con animales. I reunión de los Comités de Bioética de la Comunidad de Madrid. Conferencia Invitada. 29 Junio 2004.

4. Sistemas de Vigilancia de Riesgos para la Salud. Congreso Nacional de Medio Ambiente CONAMA. 22 Noviembre de 2004

5. ECETOC workshop on Alternatives in Ecotoxicology. Crezy La Chapelle. Paris Francia. 8-9 Julio 2004

Actividades como crítico en revistas y proyectos de investigación • Evaluador de proyectos como experto para la Comisión Europea DGResearch para el VI

programa Marco: Medioambiente y Sanidad Animal (2003-2006) • Crítico de la revista AQUATIC TOXICOLOGY (desde 2002) • Crítico de la revista ECOTOXICOLOGY and ENVIRONMENTAL SAFETY (2003) • Crítico de la revista Mutation Research.

memoria de actividades 2003-2004 - inia.es · se han desarrollado una serie de modelos de ratones...

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