memoria prácticas

UNIVERSIDAD DE CRDOBA | Sandra Pinto Gonzlez

ESTANCIAS

LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS

LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS

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ESTANCIAS Laboratorio Agroalimentario Gmez-Beser

Sandra Pinto Gonzlez

Licenciatura en Ciencia y Tecnologa de los Alimentos

UNIVERSIDAD DE CRDOBA

FACULTAD DE VETERINARIA


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NDICE

1. Aspectos generales ..................................................................................... 4

1.1. Laboratorio de Microbiologa ............................................................. 5

1.2. Laboratorio Fsico qumico .............................................................. 6

1.3. Laboratorio Enolgico......................................................................... 7

1.4. Laboratorio Clnico ............................................................................. 8

2. Actividades profesionales realizadas .......................................................... 9

2.1. Elaboracin de medios de cultivo ....................................................... 9

2.2. Anlisis de aguas ............................................................................... 14

2.2.1. Filtracin de aguas por membrana ................................................. 14

2.2.2. Lecturas .......................................................................................... 18

2.2.3. Confirmaciones .............................................................................. 19

2.2.4. Investigacin de Legionella en aguas ............................................ 22

2.3. Anlisis de alimentos ........................................................................ 26

2.3.1. Microbiologa de alimentos ........................................................... 26

2.3.2. Lecturas .......................................................................................... 32

2.3.3. Confirmaciones .............................................................................. 33

2.3.4. Investigacin de Salmonella en alimentos ..................................... 35

2.3.5. Investigacin de Listeria monocytogenes en alimentos ................. 40

Bibliografa ......................................................................................................... 43


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1. Aspectos generales

Gmez-Beser es un laboratorio agoralimentario y de anlisis clnicos dotados de

la ms avanzada tecnologa para el anlisis de todo tipo de productos alimentarios

(materias primas, productos intermedios y productos terminados) y muestras clnicas.

Actualmente los Laboratorios cuentan con un equipo humano de profesionales

con diferente formacin pero complementaria, consiguiendo formar un equipo

multidisciplinar, capaz de dar respuesta a todas las demandas de todos los clientes.

Entre ellos se encuentran Bilogos, Tecnlogos de Alimentos, Farmacuticos,

Qumicos, Enlogos, tcnicos superiores en Medio Ambiente y Tcnicos superiores en

Anlisis Clnico.

Las muestras que se trabajan en el laboratorio y las tcnicas analticas que

emplean se centran en:

Anlisis microbiolgicos, fsico-qumicos y de aguas (alimentos)

Anlisis enolgicos

Anlisis de aguas y residuos

Anlisis clnicos

Anlisis de piscinas

Anlisis de tierras y residuos

Anlisis Legionella

Adems, consta de un equipo especializado que realizan consultora y asesora

tcnica tanto en productos como en procesos, para as dar una respuesta a los problemas

que la industria alimentaria encuentra en su produccin. Ofrecen:

Control de la Industria (Auditora e inspeccin)

Asesoramiento en Legislacin Tcnica alimentaria

Estudio de etiquetado de productos alimenticios

Diseo de fichas tcnicas de productos

Servicio de tramitacin ante la administracin

Estudios y Proyectos

Mejora de Rendimientos y Procesos

Implantacin de Sistemas de Calidad:

PGH (Planes Generales de Higiene)

APPCC (Anlisis de Peligros y Puntos de Control Crtico)

ISO 9000

ISO 2000

BRC


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Las instalaciones constan de varios laboratorios:

Laboratorio de Microbiologa

Laboratorio Fsico qumico

Laboratorio Enolgico

Laboratorio Clnico

1.1. Laboratorio de Microbiologa

En esta rea se realizan determinaciones microbiolgicas sobre materias primas,

productos intermedios y productos terminados. Las determinaciones que se realizan

abarcan todo el espectro de determinaciones microbiolgicas que legislativamente se

exige a los distintos sectores.

Este laboratorio realiza determinaciones microbiolgicas basadas en los mtodos

oficiales y/o mtodos recomendados por organismos internacionales.

La organizacin del laboratorio cuenta con una distribucin diferenciada en

zonas de preparacin y zonas limpias, sin cruces de lneas y con departamentos estancos

que aseguran, junto con los sistemas de calidad que se siguen, la calidad de los

resultados.

La profesionalidad y capacidad tcnica de los Laboratorios Gmez-Beser son

ratificadas por la Entidad Espaola Nacional de Acreditacin (ENAC), una prestigiosa

credencial que avala la calidad de los servicios.

Las determinaciones que se realizan son las siguientes:

Aguas

Recuento de aerobios a 37 C

Recuento de aerobios a 22 C

Recuento de Coliformes totales

Recuento de Coliformes fecales

Recuento de Clostridium perfringens

Recuento de Clostridium sulfito reductores

Recuento de E. Coli

Investigacin de E. Coli

Recuento de Estafilococos aureus

Investigacin de Estafilococos aureus

Recuento de Estreptococos fecales

Deteccin y recuento de Legionella pneumophila


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Recuento de Pseudomona aureginosa

Investigacin de Salmonella spp.

Recuento de nematodos/ huevos de nematodos

Alimentos

Recuento de Aerobios mesfilos

Recuento de Aerobios psicotrficos

Recuento de Clostridium sulfito reductores

Recuento de Clostridium perfringens

Recuento de Coliformes fecales

Recuento de Coliformes totales

Recuento de Enterobacterias

Recuento de E. Coli

Investigacin de E. Coli

Recuento de Estafilococos aureus

Investigacin de Estafilococos aureus

Recuento de Levaduras

Recuento de Mohos

Recuento de Mohos y Levaduras

Recuento de Listeria monocytogenes

Investigacin de Listeria monocytogenes

Recuento de Pseudomona aureginosa

Investigacin de Salmonella

Investigacin de Shigella

1.2. Laboratorio Fsico qumico

Este laboratorio est altamente especializado, y cuenta con un alto nmero de

determinaciones sobre productos alimenticios, entre las que se encuentran:

Composicin nutricional

Estudios de caducidad

Estudios de potabilidad del agua

Caracterizaciones fsicas

Composicin qumica

Estudio de vinos y vinagres

Caracterizacin de sales

Elaboracin fichas tcnicas de producto

Anlisis de aguas residuales

Caracterizaciones fsicas


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Entre los equipos disponibles encontramos:

- Cromatografa Inica

- Cromatografa de Gases

- Espectrofotometra de Absorcin Atmica

- Espectrofotometra molecular: Visible y UV

1.3. Laboratorio Enolgico

La empresa cuenta con un equipo de enlogos de reconocida experiencia en las

reas de anlisis enolgicos, seguimiento de vendimias, asesora enolgica, y anlisis

sensorial.

Las determinaciones que se realizan son las siguientes:

Vino y vinagre

Extracto seco

Cenizas

Masa volmica

Nitrgeno

Densidad

pH

Plomo

Protenas

Hierro

Cobre

Acidez total (actica)

Grado alcohlico

Anhdrido sulfuroso

Relacin extracto seco /

acidez total

Metanol

Bebidas alcohlicas

Acidez voltil

Acidez total

cido ascrbico

cido ctrico

Anhdrido sulfuroso

Arsnico

Azcares

Cadmio

Calcio

Cenizas

Cloruros

Densidad

Extracto seco

Grado alcohlico

Hierro

pH

Plomo

Sacarosa

Ferrocianuro

Cobre

Nitrgeno fcilmente

asimilable

cido mlico

IP

Abs. 280nm

BE

Tartrico

Lctico

Metanol

Succnico

Actico

1.4. Laboratorio Clnico

En los ltimos aos, los laboratorios han ido adaptndose a los avances

cientficos procurando incorporar la tecnologa de vanguardia y someterse a los

controles de calidad nacionales en internacionales, as como las BPL (Buenas Prcticas

de Laboratorio) en las instalaciones.

En esta estancia, se realizan anlisis de sangre y orina gracias al trabajo de ATS,

Tcnicos de Laboratorio y administrativos, que garantizan la calidad de los servicios

analticos.


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2. Actividades profesionales realizadas

2.1. Elaboracin de medios de cultivo

Un medio de cultivo es un material alimenticio que se usa en el laboratorio para

el desarrollo de los microorganismos. Una vez que ha sido preparado, un medio de

cultivo puede ser inoculado, es decir, se la aaden organismos, y a continuacin,

incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. El crecimiento de

los microorganismos es el cultivo.

Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento

necesarios, y deben estar exentos de cualquier microorganismo contaminante.

En la siguiente tabla, podemos observar los diferentes medios que se utilizan en

el laboratorio y sus caractersticas.

Medio de cultivo g/L Estado Utilidad pH

Rappaport 76 g/L Lquido Enriquecimiento

Salmonella/Shigella (S/S) 7.3-7.7

MKTTN 26.8 g/L Lquido* Eniquecimiento S/S 7.4-7.8

XLD

(xilosa, lisina y

desoxicolato)

56.68

g/L Slido Crecimiento S/S 7.2-7.6

S/S

(Salmonella/Shigella) 63.1 g/L Slido Crecimiento S/S 7.2-7.6

Caldo cerebro corazn 37 g/L Lquido

Confirmacin

Staphylococcus aureus

(S.A.)

7-7.4

Baird Parker (BP) 58 g/L Slido* Crecimiento S.A. 7-7.4

Verde Brillante 40 g/L Lquido Confirmacin de Coliformes

totales (CT) 7.2-7.6

VRB 38 g/L Slido Crecimiento CT 7.2-7.6

TSA

(Trypticase soja agar) 40 g/L Slido

Confirmacin CT y E. Coli

en aguas 7.1-7.5

Caldo Triptfano 16 g/L Lquido Confirmacin CT y E. Coli

en aguas 7-7.4

TTC

(Cloruro trifenil

tetrazolio)

56 g/L Slido Crecimiento CT y E. Coli en

aguas 7-7.4


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TBX

(Tryptone Bile Agar) 36.5 g/L Slido

Crecimiento Escherichia

Coli (E. Coli) 7-7.4

EMB

(Eosina azul metileno) 39.5 g/L Slido Confirmacin E. Coli 6.7-7.1

VRBG 39.5 g/L Slido Crecimiento de

Enterobacterias (EB) 7.2-7.6

Agar prpura 41.5 g/L Slido Confirmacin EB 6.8-7.2

Agua de peptona 20 g/L Lquido Crecimiento de bacterias 7-7.4

Agar nutritivo 28 g/L Slido Resiembra para aislamiento 7.2-7.6

YEAST 20g/L Slido Crecimiento de Aerobios

Mesfilos en aguas 6-6.4

PCA

(Plate count agar) 17.5 g/L Slido

Crecimiento de Aerobios

Mesfilos en alimentos 6.8-7.2

PCA + LD

(Leche descremada)

Relacin

1:1 Slido

Crecimiento de Aerobios

Mesfilos en lcteos 6.7-7

SB

(Slanetz y Bartley) 43.4 g/L Slido

Crecimiento Enterococos

intestinales para pozos 6.8-7.2

m-CP

(medio Clostridium

Perfringens)

35.5 g/L Slido* Crecimiento Clostridium

perfringens para pozos 7.2-7.8

DG18

(Dichloran Glicerol)

31.7 g/

820mL Slido*

Crecimiento de Mohos y

Levaduras 5.4-5.8

OGYEA

(Sabouraud

Oxitetraciclina)

37 g/L Slido Crecimiento de Mohos y

Levaduras 6.8-7.2

CET

(Agar Cetrimida) 45.3 g/L Slido*

Crecimiento Pseudomona

aeruginosa 7-7.4

KAA

(Kanamicina, esculina,

azida)

48 g/L Slido Crecimiento Estreptococos

fecales 6.8-7.2

SPS

(Sulfito Sulfadiazina

plimixina)

41.3 g/L Slido Crecimiento Clostridium

sulfito reductor 6.8-7.2

TSC

(Agar Triptosa-Sulfito-

Cicloserina)

45 g/L Slido Crecimiento Clostridium

sulfito reductor 6.8-7.2

BE

(Bilis Esculina) 64.5 g/L Slido

Confirmacin Enterococos

intestinales 6.8-7.2

(* Medios que tienen suplemento)


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El fundamento de la actividad es la preparacin de los medios de cultivo y

reactivos aspticos con las caractersticas fisicoqumicas adecuadas que permiten el

crecimiento de los microorganismos a investigar.

La realizacin de medios es similar para los distintos tipos, exceptuando

aquellos marcados con un asterisco, los cules precisan la adicin del suplemento

correspondiente, indicado por el fabricante, durante o tras su elaboracin.

Material:

- Probeta de 1 litro

- Matraces Erlenmeyer de 1 litro

- Bao mara

- Balanza analtica

- Agitador

- Algodn

- Imanes

- Botes de 200 y 500 mL

- Cinta testigo para autoclave

- Placas Petri estriles

desechables

- Reactivos para el medio de

cultivo

- Mecheros Bunsen

- Tubos estriles

- pHmetro

Equipo:

- Autoclave

Procedimiento:

1. En la probeta, medir 1 litro de agua destilada y aadirla al matraz.

Colocar en el bao mara para aumentar su temperatura. Esto facilitar tanto la

disolucin del medio, como el posterior estado de ebullicin con el que deben

concluir.

2. Pesar los reactivos necesarios para preparar 1 litro de medio (cantidad

indicada por el fabricante). Verter el contenido en el matraz con agua destilada,

colocado sobre un agitador con un imn en su interior con el fin de disolver y

homogeneizar el medio.

3. Tapar el matraz con algodn para evitar la evaporacin del agua. Una vez

homogeneizado, se coloca en un calefactor, donde estar en continua agitacin hasta

alcanzar el estado de ebullicin, que ser el estado donde daremos por acabada la

preparacin del medio.


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Para los medios sealados con un asterisco (*), una vez llegado al estado de

ebullicin, se le aade el suplemento adecuado:

- Para m-CP: suplemento especfico del medio.

- Para DG18: Glicerina.

- Para CET: Glicerina.

- Para BP: Yema de huevo con telurito.

- Para MKTTN: suplemento especfico del medio.

4. Tras retirar el Erlenmeyer del calefactor, se extrae el imn con ayuda de

otro imn y, antes de verter el medio en los botes donde se conservarn, se

introducen dos muestras del medio en dos tubos estriles, donde uno se utilizar para

medir el pH del medio, y el otro para, posteriormente, esterilizar e incubar en la

estufa, con el fin de comprobar que el medio est totalmente estril.

Verter en los botes; para medios slidos se emplearn botes de 200 ml, y para

medios lquidos botes de 500ml. Posteriormente, se pega un trozo de cinta de testigo

para autoclave, y se rotulan con la siguiente informacin:

- Nombre del medio, por ejemplo: BP.

- Lote: n de la semana del ao, y ao de la realizacin del medio. Por

ejemplo: L29/13.

- Fecha de caducidad: Siendo sta para los medios lquidos 3 meses desde

su elaboracin, y para los medios slidos 2 meses tras su preparacin.

Por ejemplo: 20/09/13

5. Preparados los tarros, se colocan en las canastas del autoclave para

esterilizarlos a 121C durante 20 minutos.

6. Una vez terminado el autoclave, se secan y se espera que se atemperen.

7. Para mantener las condiciones aspticas, se debe trabajar prximo a la

llama de un mechero Bunsen. Se vierte el medio en placas Petri estriles, siguiendo

la tcnica asptica, y se espera a que solidifiquen.

8. Una vez slidas, se etiquetan con el tipo de medio, lote y fecha de

caducidad, que en el caso de las placas, la duracin mxima es de un mes.

9. Guardar en la cmara frigorfica para su almacenamiento.


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Adems de los medios de cultivo que se realizan en el laboratorio, existen otros

especficos y reactivos que llegan directamente preparados, como son:

- Caldo One: para enriquecimiento de Listeria.

- Placas de Brillance: para el crecimiento de Listeria.

- Kit Microbat: para la confirmacin de Listeria.

- Placas de GVPC: para el crecimiento de Legionella.

- Placas de BCY y BCYE: para el protocolo de confirmacin de

Legionella.

- Placas de agar sangre de cordero: para el protocolo de confirmacin de

Legionella.

- Kit de confirmacin de Legionella.

- Plasma de conejo (Coagulasa test): polvo liofilizado con suero que se

reconstituye y se utiliza para la confirmacin de Staphylococcus aureus.

- Reactivo oxidasa.

- Enterotube: para la confirmacin de Salmonella.


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2.2. Anlisis de aguas

2.2.1. Filtracin de aguas por membrana

La tcnica de filtracin por membrana (MF) se basa en hacer pasar la muestra de

agua problema a travs de un filtro de membrana microporosa, en cuya superficie

quedan retenidos los microorganismos.

Para el anlisis de aguas de pozos, de piscinas y potabilidades, se utilizan filtros

que tienen un tamao de poro de 0.45 micras, ya que la mayora de microorganismos

tienen un tamao (dimetro) superior. Para el anlisis de aguas con posible Legionella y

aquellas con posible Clostridium perfringens en aguas de pozo, se usan filtros ms

pequeos, de 0.22 micras.

La normativa para abastecimiento y control de calidad de agua potable de

consumo pblico, establece como anlisis microbiolgicos a realizar, las

determinaciones de: coliformes totales, coliformes fecales, y Estreptococos fecales. El

nmero de determinaciones se establece segn el tipo de anlisis, ya sea mnimo o

completo.

Tambin se determinar Stapyilococcus aureus, Pseudomonas, Clostridium

perfringes y Enterococos intestinales.

Para cada una de estas determinaciones, se filtrarn 100 ml de agua. Para el

anlisis de aguas con posible Legionella, la filtracin ser de 1 litro de agua.

Material:

- Recipiente estril para toma de muestras con capacidad de 100 ml.

- Sistema de filtracin y fuente de vaco.

- Membranas de filtracin de 0.45 micras de dimetro de poro.

- Pinzas de acero con bordes biselados.

- Placas Petri.

- Mechero Bunsen.

- Placas con medios de cultivo necesario.


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Procedimiento:

Para realizar la filtracin de aguas por membrana utilizaremos un mechero

Bunsen para trabajar en condiciones estriles.

1. Limpiar con alcohol la superficie del portafiltros. Para ello, vertemos alcohol

en el portafiltros y flameamos con el mechero Bunsen.

2. Colocar un filtro de membrana sobre el soporte con la ayuda de unas pinzas

de acero previamente flameadas con alcohol.

3. Situar un recipiente estril sobre el soporte hasta que est fijo.

4. Verter 100 ml del agua problema en el recipiente, y aplicar el vaco hasta

que el lquido se haya filtrado.

5. Romper el vaco y extraer el recipiente. Con las pinzas flameadas el filtro del

soporte.

6. Se coloca el filtro dentro de una plaza Petri sobre el medio de cultivo

adecuado, con la cuadrcula hacia arriba, procurando que no se formen

burbujas entre la membrana y el medio de cultivo.

7. Las placas se incuban en posicin invertida en la estufa con la temperatura

adecuada.

Proceso de filtracin de aguas


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Anlisis completo de agua de piscinas

El anlisis completo de aguas de piscina abarca la determinacin de los

siguientes microorganismos:

Microorganismos a

analizar Medio de Crecimiento

Temperatura

de incubacin

Tiempo de

incubacin

Aerobios mesfilos a

37C

1 ml de agua en placa Petri

y se emplaca con YEAST 37C 48 horas

Coliformes totales Filtro en placa de VRB 30C 24 horas

Coliformes fecales Filtro en placa VRB 44.5C 24 horas

Staphylococcus aureus Filtro en placa de BP 37C 48 horas

Pseudomonas Filtro en placa de CET 37C 48 horas

Estreptococos fecales Filtro en placa de KAA 37C 48 horas

Anlisis mnimo de agua de piscinas

Para el anlisis mnimo de las aguas de piscina, se realizan las mismas

determinaciones exceptuando la de Estreptococo fecal.

Microorganismos a


Temperatura

de incubacin

Tiempo de

incubacin

Aerobios mesfilos a

37C



Coliformes totales Filtro en placa de VRB 30C 24 horas

Coliformes fecales Filtro en placa VRB 44.5C 24 horas

Staphylococcus aureus Filtro en placa de BP 37C 48 horas

Pseudomonas Filtro en placa de CET 37C 48 horas


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Anlisis de potabilidad en aguas de consumo humano

Para el anlisis de aguas de consumo humano, slo se estudian dos parmetros:

Microorganismos a


Temperatura

de incubacin

Tiempo de

incubacin

Coliformes totales y

Escherichia coli Filtro en placa TTC 37C 24 horas

Anlisis de aguas de pozo

Para el anlisis de aguas de pozo se realizan las siguientes determinaciones.

Microorganismos a


Temperatura

de incubacin

Tiempo de

incubacin

Aerobios mesfilos a

22C



Clostridium

perfringens

Filtro de 0.22 micras en

placa de m-CP

44.5C en

campana de

anaerobiosis

24 horas

Enterococos

intestinales Filtro en placa SB 37C 48 horas

Coliformes totales Filtro en placa de TTC 37C 24 horas


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2.2.2. Lecturas

Transcurrido el tiempo de incubacin a la temperatura indicada, se procede a las

lecturas.

Lecturas Colonias caractersticas

Aerobios mesfilos Todas aquellas que crezcan, excepto

aquellas que lo hagan en la superficie

Coliformes totales Colonias rosas, normalmente con forma de

elipse con precipitado alrededor

Coliformes fecales Colonias rosas/rojas con precipitado

alrededor

Staphylococcus aureus Colonias negras con halo blanco alrededor

Pseudomonas Colonias claras con reflejo verdoso,

fluorescentes bajo la aplicacin de luz UV

Estreptococos fecales Colonias negras y medio cambiado a color

negro

Clostridium sulfito reductor Colonias negras y produccin de gas

(medio roto y/o elevado)

Coliformes totales y E. coli

Colonias amarillas/naranjas siendo

apreciable su color por debajo de la

membrana

Clostridium perfringens Colonias normalmente de color amarillo

opaco o prpuras

Enterococos intestinales Colonias rojas, marrones o rosadas


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2.2.3. Confirmaciones

Si hay presencia de alguna colonia sospechosa en las lecturas realizadas, se

procede a las confirmaciones.

Confirmacin de Coliformes totales

Se siembra una colonia tpica en un tubo de verde brillante con campana de

Durham, y se incuba a 30C durante 24 horas. Si al cabo de ese tiempo aparece gas en la

campana y el lquido tiene un aspecto turbio, se concluye que la muestra es positiva en

Coliformes totales.

Confirmacin de Coliformes fecales

Se siembra una colonia tpica un tubo de verde brillante con campana de

Durham y se incuba a 44.5C durante 24 horas. Tambin se siembra una colonia tpica

en una placa de Agar Nutritivo (AN), y se incuba a 37C durante 24 horas. Al cabo de

ese tiempo si aparece gas y turbidez en el tubo de verde brillante, y negativo en el test

oxidasa de la placa AN, diremos que el resultado es positivo en Coliformes fecales.

Para realizar el test oxidasa, se toman colonias de la placa de agar nutritivo con

un asa de siembra, y se aaden a un papel de filtro. Posteriormente se le echa una gota

de oxidasa, si la colonia se tie de azul, se dice que es positivo en el test oxidasa, y

negativo en Coliformes fecales. En cambio, si no se produce cambio de color, sera

oxidasa negativo y habra que pasar las colonias a un tubo de verde brillante para

confirmar la presencia de Coliformes fecales.

Confirmacin de Staphyloccus aureus

Se siembra una colonia tpica (negra con halo) en un tubo estril con 3 ml de

Caldo Cerebro-Corazn y se incuba a 37C durante 24 horas. Transcurrido ese tiempo,

se echa en un tubo de hemlisis 0.1 ml del tubo anterior y se adicionan 0.3 ml de

Plasma de Conejo (Coagulasa test), y se incuba durante 24 horas a 37C. Se considera

resultado positivo en Staphylococcus aureus cuando se observa coagulacin en el tubo

de hemlisis.


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Confirmacin de Pseudomonas

Si al aplicar la luz UV en la placa se observan colonias claramente fluorescentes,

se dice que el resultado es positivo en Pseudomonas.

Confirmacin de Estreptococos fecales

Se siembra el filtro en una placa de KAA, y se incuba a 37C durante 24 horas.

Si el medio se tie de negro y aparecen colonias negras, el resultado ser positivo para

Estreptococos Fecales.

Confirmacin de Coliformes totales y Escherichia coli

Se siembra una colonia tpica (amarillas/naranjas que clarean tras la membrana)

en placa de TSA incubndola a 37C durante 24 horas.

Transcurrido este tiempo, se realiza el test oxidasa a la masa de crecimiento

presente en la placa TSA. Se cogen algunas colonias de la placa TSA con ayuda de un

asa de siembra estril, y se pasan a un papel de filtro. Se le aade una gota oxidasa y se

observa si se produce un cambio de color instantneo o no.

Si el resultado es oxidasa positivo (las colonias se tien de azul), se concluye

que es negativo para Coliformes totales y y E. coli, acabando aqu la confirmacin. En

cambio, si es negativo en el test oxidasa (no cambian de color) se procede a la siguiente

confirmacin. Para ello, se toman colonias de la placa TSA con el asa de siembra, y se

pasan a un tubo con 3 ml de Caldo triptfano, que se incuba a 44.5C durante 24 horas.

Pasadas las 24 horas de incubacin, se realiza la prueba del indol al tubo de

caldo triptfano aadiendo 0.2-0,3 ml de reactivo de Kovacs (un par de gotas con la

pipeta Pasteur). Si se forma un anillo amarillo, el resultado es negativo en E. coli; pero

si el anillo formado es de color rojo, se concluye que es positivo en E. coli.

Confirmacin de Clostridium Perfringens

Se exponen las colonias presentes a vapores de amonio dentro de la campana de

extraccin de gases. Si se aprecia que el color de las colonias pasa de prpura a azul, o

de amarillo a rojo, estaremos hablando de resultado positivo en Clostridium

Perfringens.


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Confirmacin de Enterococos intestinales

Se pasa el filtro de la placa SB a una placa de BE (Bilis Esculina), y se incuba a

37C durante 24 horas. Si aparecen colonias marrones/negras y el medio se tie a esta

tonalidad, se concluye que es positivo en Enterococos intestinales.

Los Aerobios mesfilos no precisan confirmacin.


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2.2.4. Investigacin de Legionella en aguas

Las bacterias del gnero Legionella estn muy extendidas en la naturaleza,

especialmente en los ambientes acuticos naturales. El problema radica en su facilidad

para colonizar los sistemas de agua caliente sanitaria, los sistemas de refrigeracin, los

humidificadores y otros sistemas de conduccin de aguas, a partir de los cuales es capaz

de infectar al hombre y ocasionarle trastornos respiratorios, bien por cuadros

Material:

- Recipiente estril para toma de muestras (250 ml)

- Sistemas de filtracin y fuente de vaco

- Membranas de filtracin de 0.22 micras de dimetro de poro

- Pinzas de acero con bordes biselados

- Mechero Bunsen

- Tubos estriles

- Pipetas automticas de 1 ml

- Pipetas manuales de 10 ml

- Agua esterilizada

- Agitador Vortex

- Placas de GVPC

- Asas de siembra estriles

Procedimiento:

Para realizar la filtracin de aguas por membrana utilizaremos un mechero

Bunsen para garantizar las condiciones estriles.

1. Limpiar con alcohol la superficie del portafiltros.

2. Colocar un filtro de membrana de 0.22 micras de dimetro de poro sobre el

soporte, con la ayuda de unas pinzas de acero previamente flameadas con

alcohol.

3. Situar un recipiente estril de 250 ml sobre el soporte hasta que est fijo.


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4. Verter la muestra de agua problema en el recipiente (250 ml), y aplicar vaco

hasta que el lquido se haya filtrado. Esa operacin se debe repetir 4 veces

hasta filtrar 1 litro del agua problema a travs del mismo filtro.

5. Una vez terminado el proceso de filtracin, se prepara un tubo estril con 10

ml de agua esterilizada usando una pipeta manual de 10 ml.

6. Romper el vaco y extraer el recipiente. Con las pinzas flameadas y con

ayuda de un asa estril, se enrolla el filtro y se introduce en el tubo de ensayo

con el agua estril. La membrana se debe limpiar filtrando leja (sin aadir

ningn filtro), con el fin de destruir el microorganismo sen el caso de que lo

hubiera, y evitar que contamine futuros filtros.

7. Agitar el tubo que contiene el filtro durante 2 minutos en el agitador Vrtex.

8. Sembrar 0.1 ml del tubo en una placa preparada de GVPC con una pipeta

automtica, y realizar una siembra masiva, ya que se trata de una

investigacin para ver presencia o ausencia.

9. La placa se incuba en posicin invertida en la estufa a 37C durante 10 das.

Existen otras tcnicas de investigacin como son las tcnicas de acidificacin y

trmica, pero no se emplean en el laboratorio Gmez-Beser.

Microorganismo a

investigar

Medio de

crecimiento

Temperatura de

incubacin

Tiempo de

incubacin

Legionella Siembra masiva en

placa de GVPC 37C 10 das


24

Lectura de Legionella

Las lecturas se realizan desde el tercer o cuarto da hasta el final de la

incubacin. Las colonias tpicas de Legionella son colonias blancas con un halo ms

claro alrededor.

En el caso de que las colonias sean sospechosas, se proceder a su confirmacin.

Confirmacin de Legionella

La placa de GVPC se divide en 3 cuadrantes, nombrndolas como A, B y C.

Se atemperar una placa de BCY (sin cistena) y otra de BCYE (con cistena), y

se dividirn tambin en 3 cuadrantes, nombrndolos de la misma manera.

Posteriormente, con ayuda de un asa estril, se toman varias colonias del

cuadrante A de la placa de GVPC y se siembran en el cuadrante A de la placa BCY. A

continuacin, se realiza lo mismo con la placa BCYE, y as con el resto de cuadrantes.

Una vez sembradas las placas, se introducen en la estufa de 37 C durante 4 das.

Transcurrido ese tiempo, debe observarse que en la placa BCYE ha habido

crecimiento, y en la de BCY hay ausencia de ste. Si es as, es posible que sea

Legionella y se procedera a la siguiente confirmacin.

Si no se ha producido crecimiento en ninguna placa, o lo ha habido en todas, se

descarta la posibilidad.

En el caso de sospecha de Legionella, se efecta la confirmacin con un kit

comercial de confirmacin de Legionella, que se basa en la aglutinacin del ltex.

El Kit de confirmacin est compuesto por:

- DR801: Reactivo para la prueba de Legionella pneumophila, serogrupo 1.

- DR802: Reactivos para la prueba de Legionella pneumophila, serogrupos

2-14.

- DR803: Reactivos para la prueba de especies de Legionella.

- DR804: Suspensin de control positivo.

- DR805: Suspensin de control negativo.

- DR806: Suspensin de Ltex, similar al antgeno de Legionella.

- Suspensin Tampn (diluyente) y Tarjetas de Reaccin o de

Aglutinacin.


25

Procedimiento:

1. En una tarjeta de aglutinacin, se vierte una gota de suspensin tampn y

una gota de Legionella ltex en cada uno de los crculos numerados de la

tarjeta.

2. Posteriormente, en el crculo nmero 1 se aadir una gota de control

positivo, y en el crculo 2, una gota de control negativo. Si se observa que en

el crculo nmero 1 se produce un precipitado, ausente en el crculo 2, se

interpreta que es Legionella positivo.

3. A continuacin, se coge una colonia de la placa BCYE con ayuda de un asa

estril, y se mezcla con los reactivos vertidos anteriormente en los crculos 3,

4, 5 y 6.

4. Se tomarn como Legionella positivo aquellos crculos que, tras mezclarlos

con la colonia a investigar, aparece aglutinacin.


26

2.3. Anlisis de alimentos

2.3.1. Microbiologa de alimentos

La microbiologa en alimentos es una actividad con la que se pretende averiguar

si el alimento est contaminado.

Material:

- Mechero Bunsen

- Agua de peptona

- Probeta de 100 ml

- Bolsas estriles Stomacher

- Balanza analtica

- Hojas de bistur

- Depresores estriles

- Pipeta automtica de 1 ml

- Pipeta manual de 10 ml

- Asas estriles

- Tubos de ensayo estriles

- Placas preparadas de Baird

Parker y DG18

Equipos:

- Campana de flujo laminar

- Homogeneizador Stomacher

Procedimiento:

1. Por legislacin, las muestras se deben preparar con 25 g de muestra y 225 ml

de agua de peptona, de manera que la proporcin sea de 1:10. En el

laboratorio, para mantener la proporcin 1:10, se toman 5 gramos del

alimento a analizar, y se le aaden 45 ml de agua de peptona. Antes de

comenzar la homogeneizacin de alimentos, se debe crear un ambiente

estril encendiendo un mechero Bunsen. Posteriormente, se coloca la bolsa

de Stomacher sobre la balanza, dejando la apertura hacia arriba y se fija

mediante un adhesivo. En ese momento, la balanza debe ser tarada.


27

2. Con ayuda de un depresor estril y una hoja de bistur si fuera necesario, se

toman 5 g de muestra y se vierten en la bolsa de Stomacher. A continuacin,

se aaden 45 ml de agua de peptona con ayuda de una probeta esterilizada.

3. Seguidamente, se mezcla el agua de peptona con el alimento y se introduce

durante varios segundos en el homogeneizador Stomacher. ste es un

sistema de palas con movimientos peristlticos que homogeniza la muestra.

4. Una vez homogeneizado, se saca la bolsa y se prepara para realizar la

microbiologa.

La microbiologa de alimentos se realiza en la campana extractora, con la

luz y el flujo laminar encendidos, con el fin de crear un ambiente estril para

la siembra.

5. Se llenan tubos estriles con 9 ml de agua de peptona para realizar las

posteriores diluciones. Se precisarn tantos tubos como diluciones haya que

efectuar.

Las determinaciones y diluciones que hay que realizar varan segn el grupo de

alimentos al que pertenece la muestra.

Grupos Determinaciones Diluciones

A (alimentos fros) AM, CT, EC, SA, SAL, LIST 10-3

B (alimentos calientes) AM, CT, EC, SA, SAL, LIST 10-2

Dulce EC, SA, S/S, CSR, MyL, LIST -

Pan, harina y picos AM, EC, S/S, MyL 10-4

Pescado crudo AM, EB, S/S, LIST 10-4

Pescado cocido AM, EB, SA, S/S, LIST 10-3

Seco-salado AM, EB, S/S, LIST -

Molusco bivalvo CF, EC, SAL -

Conserva AM, CSR, CP -

Fruta / Verdura EC, SAL, LIST -


28

Productos aperitivos EB, SA, EF, SAL -

Preparados crnicos EC, SAL, LIST 10-4

Carne cruda EC, S/S, LIST 10-4

Huevos AM, EB, SA, SAL 10-4

Helados AM, EB, SA, SAL, LIST -

Especias EC, CSR, SAL, LIST -

AM = Aerobios mesfilos S/S = Salmonella/Shigella

CT = Coliformes totales SAL = Salmonella

EC = Escherichia coli LIST = Listeria

SA= Staphylococcus aureus CSR = Clostridium sulfito reductor

CP = Clostridium perfringens MyL = Mohos y levaduras

El nmero del exponente en las determinaciones indica en nmero de

diluciones que se deben realizar.

Las diluciones necesarias se calculan a partir del nmero de microorganismos

que suele tener cada alimento. Se realizan diluciones para facilitar el recuento

posterior; de esta forma, multiplicando por el nmero de dilucin en el que se

realiza la lectura de microorganismos en placa, se calcula el nmero total de

bacterias que tiene la muestra de alimento.

6. Las disoluciones se realizan de la siguiente forma:

- Para la dilucin de 10-1, se toma 1 ml directamente del contenido de la

bolsa Stomacher (dilucin -1) y se vierte en una placa Petri estril.

- Para la dilucin de 10-2, se vierte 1 ml del contenido en la bolsa

Stomacher a un tubo con 9 ml de agua de peptona (dilucin -2), se agita

en el agitador Vrtex, y se pipetea 1 ml de este tubo a una placa Petri

estril.

- Para la dilucin de 10-3, se coge 1 ml del tubo anterior (disolucin 10-2) y

se aade a otro tubo con 9 ml de agua de peptona (dilucin -3), se agita

en el Vrtex, y se vierte 1 ml de este tubo a una placa Petri estril.


29

- Para la dilucin de 10-4, se toma 1 ml del tubo anterior (disolucin 10-3) y

se aade a otro tubo con 9 ml de agua de peptona (dilucin -4), se agita

en el agitador Vrtex, y se vierte 1 ml de este tubo a una placa de Petri

estril.

- Para la determinacin de Staphylococcus aureus (SA), se toma 0.1 ml de

la dilucin 10-1

(directamente de la bolsa Stomacher), y se aaden a una

placa de Baird Parker ya preparada. Se realiza siembra masiva con ayuda

de un asa estril. Normalmente, la placa de BP se divide en 2 mitades

para sembrar 2 alimentos distintos.

- Para la determinacin de Clostridium sulfito reductor, se toma 1 ml de la

dilucin de la bolsa Stomacher y se vierte a un tubo estril.

Posteriormente, se aaden 9 ml de medio de cultivo SPS, y una capa de

parafina para proporcionarle condiciones de semi-anaerobiosis.

- Para la determinacin de mohos y levaduras se emplearn diferentes

medios de cultivo, en funcin de la actividad de agua del alimento. Para

aquellos con una aw menor a 0.6, se toma 1 ml de dilucin directamente

de la bolsa Stomacher y se aade a una placa de Petri estril, y

posteriormente se le aadir el medio necesario. Para los alimentos con

una aw entre 0.6 -0.95, se toma 0.1 ml de la dilucin de la bolsa, y se

hace siembra masiva en una placa ya preparada de DG18, con ayuda de

un asa estril.

- Para la determinacin de Estreptococos fecales (EF), se siembra 1 ml de

la dilucin de la bolsa Stomacher en placas ya preparadas de KAA. Con

ayuda de un asa estril, se realiza siembra masiva.

- La determinacin de Salmonella se realiza tras haber incubado la bolsa

de Stomacher a 37C durante 24 horas. El proceso de investigacin de

Salmonella se explicar detalladamente ms adelante.


30

- La determinacin de Listeria se realiza tras haber incubado la bolsa

Stomacher a 30C durante 24 horas. Este procedimiento se explicar

posteriormente.

7. Una vez preparadas las placas con las diluciones necesarias, se le

adiciona a las placas los medios de cultivo correspondientes, que deben ser

previamente derretidos. Para el vertido de los medios de cultivo en las

placas, se debe continuar trabajando en condiciones estriles, ya sea en la

campana de extraccin, o prximo a la llama de un mechero Bunsen.

Previamente, los medios de cultivo se introducen en el bao mara para que

se derritan. Es importante esperar a que stos se atemperen antes de verterlos

en las placas. Ya que si estn demasiado calientes, pueden ocasionar la

destruccin de los posibles microorganismos que estamos investigando.

Una vez atemperados los medios, se aaden a las placas correspondientes. Se

vierte el medio de forma que cubra la base de las placas Petri. Se agita de

forma circular, hacia un lado y hacia el otro, para homogeneizar la muestra

con el medio.

Las Enterobacterias y los Coliformes totales necesitan dos capas del medio

correspondiente, la cual se aadir tras haberse secado la primera capa. Esta

segunda capa se vierte para crear un ambiente de anaerobiosis.

8. Una vez que el medio est solidificado en las placas, stas se llevan a

incubar en la estufa adecuada en posicin invertida (con la tapa hacia abajo),

excepto las placas de mohos y levaduras, que se introducen con la tapa hacia

arriba, dentro de una bolsa de plstico.


31

Microorganismos a


Temperatura

de incubacin

Tiempo de

incubacin

Aerobios mesfilos PCA 30C 72 horas

Coliformes totales VRB (doble capa) 30C 24 horas

Coliformes fecales VRB (doble capa) 44.5C 24 horas

Enterobacterias VRBG (doble capa) 37C 24 horas

Escherichia coli TBX 44.5 C 24 horas

Clostridium sulfito

reductor SPS 37C 24 horas

Staphylococcus aureus BP 37C 48 horas

Estreptococos fecales KAA 37C 48 horas

Mohos y levaduras

OGYE cuando aw < 0.6 20C 5 das

DG18 cuando aw = 0.6

0.95 20C 10 das

DRBC cuando aw 20C 5 das


32

2.3.2. Lecturas

Transcurrido el tiempo de incubacin a la temperatura indicada, se procede a las

lecturas de placas.

Lecturas Colonias caractersticas

Aerobios mesfilos Todas aquellas que crezcan, excepto

aquellas que lo hagan en la superficie

Coliformes totales Colonias rosas, normalmente con forma de

elipse con precipitado alrededor

Coliformes fecales Colonias rosas/rojas con precipitado

alrededor

Enterobacterias Colonias rosa fucsia/violeta con

precipitado alrededor

Escherichia coli Colonias verdes

Clostridium sulfito reductor Colonias negras y produccin de gas

(medio roto y/o elevado)

Staphylococcus aureus Colonias negras con halo blanco alrededor

Estreptococos fecales Colonias negras y medio cambiado a color

negro

Mohos y levaduras Colonias negruzcas, verdosas o blancas

con o sin vellosidades

Salmonella/Shigella

Placa XLD: colonias negras, rosas o

amarillas, con o sin halo

Placa S/S: colonias incoloras,

transparentes o negras, con o sin halo

Listeria Monocytogenes Colonias verdes con un halo blanco


33

2.3.3. Confirmaciones

Si existe presencia de alguna colonia sospechosa en las lecturas realizadas se

procede a las confirmaciones.

Confirmacin de Coliformes totales


Durham, y se incuba a 30C durante 24 horas. Si al cabo de ese tiempo aparece gas en la

campana y el lquido tiene un aspecto turbio se dice que es positivo en Coliformes

totales.

Confirmacin de Coliformes fecales


Durham y se incuba a 44.5C durante 24 horas. Por otra parte, se siembra una colonia

tpica en una placa de Agar Nutritivo (AN), y se incuba a 37C durante 24 horas. Si

transcurrido este tiempo aparece gas y turbidez en el tubo de verde brillante, y es

oxidasa negativo en la placa de AN, se concluye que es positivo en Coliformes fecales.

Confirmacin de Enterobacterias

Se pasa una colonia tpica (rosa fucsia/violeta con precipitado alrededor) a una

placa de Agar Nutritivo (AN) y se realiza siembra masiva. Esta placa se incuba a 37C

durante 24 horas.

Pasado este tiempo, se realiza la prueba de la oxidasa al crecimiento presente en

la placa de AN. Si la prueba oxidasa da negativo (no vira a color azul), se pasa a una

placa de Agar Prpura (AP), realizando siembra masiva con ayuda de un asa de siembra

estril, y se incuba a 37C durante 24 horas.

Se concluye el resultado positivo a la presencia de Enterobacterias en el

alimento si, transcurrido el tiempo de incubacin, el medio de la placa de AP vira a

amarillo.


34

Confirmacin de Escherichia coli

Se siembra una colonia tpica en una placa de EMB y se incuba a 30C durante

24 horas. Si pasado este tiempo se produce crecimiento de colonias color tornasol,

podemos decir que el resultado es positivo para la presencia de E. coli en el alimento.

Confirm acin de Staphylococcus aureus

Se siembra una colonia tpica en 3 ml de Caldo Cerebro-Corazn, y se incuba a

37C durante 24 horas. Tras la incubacin, se aade en un tubo de hemlisis 0.1 ml del

tubo anterior y 0.3 ml de Plasma de Conejo (Coagulasa test), y se incuba en la estufa de

37C durante 24 horas.

Se considerar resultado positivo en Staphylococcus aureus si se produce

coagulacin en el tubo de hemlisis tras la incubacin.

Confirmacin de Estreptococos fecales

Se siembra una colonia tpica en una placa de KAA, y se incuba a 37C durante

24 horas. Si el medio se tie de negro y aparecen colonias negras, el resultado ser

positivo para Estreptococos fecales.

Los Aerobios mesfilos, Clostridium sulfito reductor, y los mohos y levaduras

no requieren confirmacin.


35

2.3.4. Investigacin de Salmonella en alimentos

Para el estudio de Salmonella en alimentos, si incuba la bolsa Stomacher con 5

gramos de alimento y 45 ml de agua de peptona, a 37C durante 24 horas.

Transcurrido este tiempo, se preparan 2 tubos estriles, uno con el medio

MKTTN, y otro con el medio Rappaport. En un tubo, se vierten 5 ml de MKTTN con

ayuda de una pipeta manual estril, y se le aade 1 ml de muestra de la bolsa

Stomacher. En el otro tubo, se agregan 5 ml del medio Rappaport y se le aade 0.1 ml

de muestra con ayuda de una pipeta automtica. Ambos tubos se incubarn a 37C y

41.5C, respectivamente, durante 24 horas.

Transcurrido este tiempo, se realiza la siembra en placas con el medio S/S y

XLD. Dividimos ambas placas en 2 mitades, y sembramos con ayuda de un asa

impregnada del contenido del tubo de MKTTN en una de las mitades de cada placa. Se

debe repetir el mismo procedimiento con el tubo de Rappaport en la otra mitad de cada

placa. Estas placas se incubarn a 37C durante 24 horas.

Para facilitar la posterior lectura de las placas, se deben rotular indicando el tubo

proveniente de la siembra en cada una de las mitades.

Si transcurrido el tiempo de incubacin se observan colonias tpicas, se procede

a su confirmacin.

Confirmacin de Salmonella / Shigella

Si se observa crecimiento de colonias tpicas tanto en la placa de XLD como en

la de S/S, se efectuar su confirmacin.

En primer lugar, se toma una colonia tpica de cada placa con ayuda de un asa de

siembra estril, y se realiza siembra masiva en placas de Agar Nutritivo (AN). Se

utilizar una placa de AN para la siembra de una colonia tpica de la placa S/S, y otra

placa de AN para la siembra de una colonia tpica de la de XLD. Ambas placas se

incuban a 37C durante 24 horas.

Pasadas las 24 horas de incubacin, se realiza la prueba de la oxidasa al

crecimiento presente en ambas placas de AN. Si el resultado es negativo para la oxidasa

(no cambian a color azul), se procede a la siguiente confirmacin, empleando un test

comercial denominado Enterotube para cada placa.


36

Enterotube test

El test Enterotube consiste en un tubo de plstico con distintos compartimientos,

formado por 12 medios de cultivo diferentes, que permiten la determinacin de 15

reacciones bioqumicas.

Est concebido para la inoculacin simultnea

de los 12 medios con una sola colonia, utilizando la

aguja de inoculacin dispuesta en el centro.

La combinacin de reacciones resultante,

junto con la gua de interpretacin (libro de cdigos),

permite la identificacin de Enterobacterias con

importancia clnica.

Las reacciones qumicas que tienen lugar en este test son las siguientes:

Prueba Reaccin Negativo Positivo

Glucosa Fermentacin de glucosa De rojo a naranja De amarillo a dorado

Gas Produccin de gas en la

fermentacin de la glucosa

Sin desprendimiento

de cera

Con desprendimiento

de cera

Lisina Descarboxilacin de la

lisina Amarillo Morado

Ornitina Descarboxilacin de la

ornitina Amarillo Morado

H2S Produccin de H2S De beige a mbar

claro Negro

Indol Produccin de indol Incoloro Rosa o rojo

Adonitol Fermentacin de adonitol De rojo a naranja De amarillo a dorado

Lactosa Fermentacin de lactosa De rojo a naranja De amarillo a dorado

Arabinosa Fermentacin de arabinosa De rojo a naranja De amarillo a dorado

Sorbitol Fermentacin de sorbitol De rojo a naranja De amarillo a dorado

VP (Voges-

Proskauer) Produccin de acetona

De incoloro a mbar

claro Rojo

Dulcitol Fermentacin de dulcitol Verde De amarillo a dorado

PA Desaminacin de

fenilalanina

Cualquier tono de

verde

De negro a gris

oscuro

Urea Hidrlisis de la urea De incoloro a mbar

claro De rosa claro a rosa

Citrato Utilizacin del citrato Verde Azul


37

Procedimiento:

1. En primer lugar, se arrastran colonias de la placa de AN con la punta de la

aguja de inoculacin dispuesta en el centro del Enterotube.

2. Una vez arrastradas las colonias, llevamos la aguja de inoculacin hacia atrs

y hacia adelante para que pase por todos los medios, inoculando as las

colonias en cada uno de los compartimentos.

3. Posteriormente, colocamos la aguja de manera que permanezca en contacto

con todos los medios.

4. En el extremo derecho de la aguja encontraremos una marca por la que

debemos romperla, de manera que no sobresalga por ningn extremo del

Enterotube.

5. A continuacin, nos aseguramos de que la aguja atraviese todos los

compartimentos, y colocamos las capuchas a cada extremo.

6. Colocamos el Enterotube en una gradilla en posicin vertical, de modo que

el compartimento de la glucosa quede hacia arriba, e incubamos a 37C

durante 24 horas.


38

7. Transcurrido el tiempo de incubacin, se procede a la interpretacin y

registro de los resultados con ayuda de la gua comercial, con excepcin de

indol y Voges-Proskauer.

La lectura de las dems pruebas debe efectuarse antes de realizar las pruebas

de indol y Voges-Proskauer, puesto que los reactivos aadidos en estas

pruebas pueden alterar las dems reacciones del Enterotube.

8. Para realizar la prueba de indol, se coloca el Enterotube en posicin

horizontal y se aaden unas gotas de reactivo Kovacs a travs de la pelcula

plstica del compartimiento de H2S/indol con una aguja o jeringa, o

haciendo un orificio mediante calor en la pelcula plstica con ayuda de una

aguja de inoculacin caliente o pipeta desechable y vertiendo el reactivo en

el compartimiento.

Se debe permitir que el reactivo entre en contacto con la superficie del medio

o la superficie interna de la pelcula de plstico para poder observar si se

produce o no la reaccin. Una prueba positiva se indica por la aparicin de

color rojo en el reactivo aadido sobre la superficie del medio o la pelcula

de plstico a los 10 segundos aproximadamente.

Por otra parte, para la prueba de Voges-Proskauer, se inyectan los reactivos

VP al compartimento indicado, y se observa si se produce la reaccin tras 20

minutos de la adicin.


39

9. Por ltimo, se interpretan los resultados marcando con un crculo las

puntuaciones de las reacciones que han sido positivas, se suman estas

puntaciones, y se busca el cdigo obtenido en la gua de interpretacin para

verificar de que Enterobacteria se trata.

Por lo general, no suele tratarse de Salmonella, por lo que se concluye la

confirmacin como negativo en la presencia de Salmonella/Shigella.


40

2.3.5. Investigacin de Listeria monocytogenes en alimentos

La Listeria monocytogenes es un microorganismo telrico, muy extendido en el

medio ambiente.

El procedimiento de investigacin de Listeria se realiza en aquellos alimentos

propensos a su presencia. Estos alimentos pertenecen a los siguientes grupos:

- A (alimentos en crudo)

- B (alimentos tratados

con calor)

- Pescados crudos

- Pescados cocidos

- Pescados seco-salado

- Frutas y verduras

- Carnes

- Helados

- Especias

Actualmente, tambin se incluye la investigacin de Listeria en todos los

productos donde se estudie la caducidad. Para estos productos, se debe comprobar

previamente si cumplen las condiciones adecuadas para la proliferacin de Listeria,

como son:

- Alimentos con un pH menor o igual a 4.4, y actividad de agua menor o

igual a 9.2.

- Alimentos con un pH menor o igual a 5.0, y actividad de agua menor o

igual a 9.4.

Por lo general, este microorganismo no suele encontrarse en los alimentos. Por

ello, en el laboratorio Gmez-Beser, slo se investiga en aquellos ms propensos a su

presencia; como son: las carnes y pescados crudos, preparados crnicos, pescados seco-

salados, pescados marinados, y productos en los que se estudia la caducidad.

Procedimiento:

Para el estudio de Listeria en alimentos se realiza una dilucin 1:10, tomando 5

gramos de alimento y 45 ml de Caldo One.

Al igual que anteriormente, se debe crear un ambiente estril encendiendo un

mechero Bunsen. Se coloca la bolsa de Stomacher sobre la balanza, con la apertura

hacia arriba y fijada mediante un adhesivo. Taramos la balanza, y aadimos 5 gramos

del alimento a investigar con ayuda de un depresor estril y una hoja de bistur, si fuera

necesario.

A continuacin, se aaden 45 ml de Caldo One y se homogeniza introduciendo

la bolsa en el Stomacher durante varios segundos.


41

Tras la homogeneizacin, cerramos la bolsa con un clip y la introducimos en la

estufa de 30C durante 24 horas.

Transcurrido el tiempo de incubacin, tomamos 0.1 ml de la disolucin de la

bolsa, y sembramos en una placa de medio Brillance. Se realiza la siembra de forma

masiva con ayuda de un asa estril, e introducimos la placa en la estufa de 37C durante

24 horas.

Si pasadas las 24 horas se observa crecimiento de colonias sospechosas (verdes

con un halo blanco), se procede a su confirmacin.

Confirmacin de Listeria

En primer lugar, se realizan 3 pruebas de forma directa: Oxidasa (-), Catalasa

(+), y prueba de ltex aglutinacin (-).

- Test oxidasa: Sobre un papel de filtro se colocan varias colonias

sospechosas de Listeria monocytogenes, y vertimos unas gotas de

reactivo oxidasa. Tras unos segundos, determinaremos que la prueba es

positiva si las colonias se tien de azul, o negativa si no hay cambio de

color.

- Prueba de la catalasa: Sobre una placa vaca se vierten varias gotas de

agua oxigenada con ayuda de una pipeta Pasteur. Se mezclan varias

colonias con el agua oxigenada empleando un asa de siembra, y se

observa si se produce reaccin o no. La prueba ser positiva si, al

mezclar las colonias, se produce la formacin de burbujas.

- Prueba de ltex aglutinacin: Se vierten varias gotas de una disolucin

de KOH al 30% sobre una placa vaca, con ayuda de una pipeta Pasteur.

Se toman varias colonias con un asa de siembra estril, y se mezclan con

el KOH. La prueba ser positiva si al mezclarlas se produce aglutinacin,

es decir, presenta un aspecto viscoso.

Si los resultados de las pruebas coinciden con

el protocolo de confirmacin; Oxidasa (-), Catalasa

(+), y test de ltex aglutinacin (-); se procede a la

confirmacin con el kit de Microbact, un

procedimiento de confirmacin de Listeria basado en

la colorimetra.


42

Kit Microbact

1. Con un asa estril, se toma la mayor cantidad posible de colonias

sospechosas, y se introducen en un bote que contiene una solucin que

provoca la estabilidad y la proliferacin de la bacteria. Se homogeniza

durante unos segundos con el agitador Vrtex.

2. Una vez homogeneizado, con ayuda de una pipeta automtica, se inoculan

0.1 ml en casa pocillo del Microbact. Adems, en el ltimo pocillo se aade

0.1 ml de hemolisina.

3. Incubamos el Microbact a 37C en posicin horizontal. La lectura puede

realizarse transcurridas entre 4-24 horas de incubacin.

4. Terminado el tiempo de incubacin, se observa un cambio de color debido al

contacto de la bacteria con los reactivos de cada pocillo. El kit Microbact

incorpora una plantilla en la que se explican los posibles cambios de color y

su significado (positivo o negativo).

5. Comprobamos los resultados obtenidos con los de la plantilla y anotamos las

reacciones positivas y negativas. Cada prueba tiene un nmero asociado,

dando como resultado final un cdigo que deberemos introducir en el

programa informtico de Microbact. Este cdigo nos muestra el tipo de

Listeria presente en el alimento analizado.

6. La nica especie con importancia en la investigacin de Listeria es la

Listeria monocytogenes.


43

Bibliografa

Programas Normalizados de Trabajo de Gmez-Beser

Colaboracin de Elena Berejano Paraj

http://www.laboratoriosgomezbeser.com/

http://www.aesan.msc.es/AESAN/web/cadena_alimentaria/detalle/criterios_micr

obiologicos.shtml
http://www.laboratoriosgomezbeser.com/http://www.aesan.msc.es/AESAN/web/cadena_alimentaria/detalle/criterios_microbiologicos.shtmlhttp://www.aesan.msc.es/AESAN/web/cadena_alimentaria/detalle/criterios_microbiologicos.shtml

memoria prácticas

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