metabolic engineering of escherichia coli for enhanced production of succinic acid, based on genome...

Metabolic Engineering of Escherichia coli for Enhanced Production of Succinic Acid, Based on Genome Camparison and In Silico Gene Knockout Simulation

Nadja Kleisch 21.01.2015

S. J. Lee, D.Y. Lee, T. Y. Kim, B. H. Kim, J. Lee, and S. Y. LeeApplied and Environmental Mikrobiology, 2005, 7880-7887

Inhalt Einleitung

Succinylsäure Relevanz Produktion in E. coli Neuer Ansatzpunkt

Ergebnisse Vergleich der metabolischen Stoffwechselwege In silico Vorhersage Zusätzliche Optimierungen Pyruvat

Zusammenfassung

1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 2

Einleitung


Succinylsäure

• Bernsteinsäure • farblose, kristalline, aliphatische Dicarbonsäure[2]

• eins der Fermentationsprodukte im anaeroben Metabolismus

• ebenso ein Zwischenprodukt im Citratzyklus

• Herstellung sowohl technisch als auch biotechnologisch


Abb.1.: Strukturformel von Bernsteinsäure[1]

Gewinnung der Succinylsäure

technisch:• katalytische Hydrierung von Maleinsäure, Maleinsäurehydrids

oder Fumarsäure[4]

• Katalysatoren z.B. Ni, Cu oder NiO

biotechnologisch:• durch Fermentation, aus Kohlenhydraten C6 Zuckern[5]

• effiziente Bernsteinsäureproduzenten sind u.a.:• das obligate anaerobe Anaerobiospirillum succinciproducens • Mitglieder der Familie Pasteurellaceae:

• Basfia succinciproducens [7]

• Actinobacillus succinogenes[6]

• Mannheimia succinciproducens [8]


Abb.2.: technische Produktion von Bernsteinsäure[1]

aus Maleinsäure

Relevanz


Abb.3.: Bernsteinsäure-produkte [13] modifiziert

E363

Marktpotenzial von hunderttausend Tonnen prognostiziertBernsteinsäureproduktion als Forschungsschwerpunkt

• zwei Ansätze:

1. Optimierung natürlicher Bernsteinsäureproduzenten wie Mannheimia succinciproducens

2. Einsatz von gut erforschten, leicht kultivierbaren Stämmen wie E. coli


Relevanz

• ist grundsätzlich während der anaeroben Fermentation in der Lage Bernsteinsäure zu produzieren

Metabolic Engineering

Optimierungsversuche:

• Mutante NZN111, enthält Doppelmutation ldhA und pfl zur Reduktion von Nebenprodukten[10]

• geringeres Wachstum, verhindert lediglich Milchsäureproduktion

• Steigerung der Ausbeute durch:

• Vermehrung der CO2- fixierenden anaplerotischen Stoffwechselwege

• Amplifikation von PEP-Carboxykinase aus Actinobacillus succinogenes in einem PEP-Carboxylase negativem E. coli-Stamm [11]

trotz dieser Optimierungen kein Hochleistungsstamm


Produktion in E. coli:

Abb.4.: Metabolische Stoffwechselwege von E. coli [8]

Neuer Ansatzpunkt durch:

• Veröffentlichung des vollständig sequenzierten Genoms von M. succiniproducens MBEL55E

• gram negatives, capnophiles Bakterium• Hochleistungsstamm

daraus ergibt sich die Möglichkeit, metabolischen Flüsse von M. succiniproducens MBEL55E in E. coli nachzuahmen

logik- und wissensbasierte Herangehensweise zur Stammoptimierung



Ergebnisse

• Ziel relevante Stoffwechselwege zu identifizieren und nachzuahmen

• komparative Analyse der zentralen Stoffwechselwege in Bezug auf die Bernsteinsäureproduktion von E. coli und M. succiniciproducens

Grundlage:• in E. coli führen diverse metabolische Flüsse von dem Produkt weg• Genom von E. coli ca. 2 mal größer

Umsetzung:

Vergleich bezieht nur metabolische Stoffwechselwege mit ein, die in E. coli gefunden wurden, aber nicht in M. succiniciproducens


Vergleich der metabolischen Stoffwechselwege


Zielgene für knockout (rot) weitere Unterschiede (gelb)

Succinat Dehydrogenase (sdhABCD) Malat Dehydrogenase (sfcA)

Malat Dehydrogenase (mqo) Fumarat Hydratase (fumAB)

Phosphattransferase System (ptsG) Pyruvat Oxidase (poxB)

Glyoxylate shunt (aceBA) Acetyl CoA Synthase (acs)

Pyruvatkinase F (pykF)

Abb.5.: Vergleich der zentralen Stoffwechselwege in Bezug auf die Bernsteinsäureproduktion von E. coli und M. succiniproducens [8]

# E. coli Stamm Mutationen

0 W3110 /

1 W3110G ptsG

2 W3110GF ptsG und pykF

3 W3110GFO ptsG, pykF und mqo

4 W3110GFH ptsG, pykF und sdhA

5 W3110GFHO ptsG, pykF, mqo und sdhA

6 W3110GFHOE ptsG, pykF, mqo, sdhA und aceBA


Metabolic Engineering

W3110 W3110G W3110GF W3110GFO W3110GFH W3110GFHO W3110GFHOE0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

0.016

0.018

0.02

E. coli Stämme

Ber

nst

ein

säu

re-A

nte

il*

• durch folgende knockout-Versuche

*Bernsteinsäure-Anteil = Bernsteinsäure/(Bernsteinsäure + Nebenprodukte )

keine Steigerung der Bernsteinsäureproduktion!

Grund:• nicht alle möglichen kombinatorischen Möglichkeiten sind

bestimmt und getestet worden

nicht durchführbar

daher:• in silico knockout Experimente


• „genome-scale E. coli Model“ von Reed et al.[12]

• ausgeschaltete Gene wurden gleich Null gesetzt• Pyruvatkinase A und F können im Programm nicht auseinandergehalten werden

Inaktivierung beider Gene

Vorhersagen:

• knockout von ptsG und pykFA führt zur 100fachen Steigerung

• zusätzliche Erhöhung durch Inaktivierung von pfl Gen möglich

• sdhA, mqo und aceBA haben keine Auswirkung auf die Produktion


In silico Vorhersage

• Inaktivierung von ptsG und pykFA in E. coli

Ergebnis:

• nach 24 h anaeroben Wachstum 3,4fache Steigerung der Bernsteinsäureproduktion

• Nebenprodukte konnten reduziert werden

aber:• entspricht nicht der

vorhergesagten Menge• trotz Steigerung ist Ausbeute

im Vergleich zu etabliertenProduktionsstämmen gering


Validierung

8,29 9,23


W3110 W3110GFA 24 h W3110GFA 80 h0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

E. coli Stamm

Ber

nst

ein

säu

re-A

nte

il*

Inaktivierung von pfl und ldhA• bereits von Bunch et al. durchgeführt[10]


Zusätzliche Optimierungen

W3110 W3110GFA 80 h W3110GFAP W3110GFAPL0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

E. coli Stamm

Ber

nst

ein

säu

re-A

nte

ilW3110GFAP (knockout pfl):

• Reduktion der Essigsäurebildung • keine Formiatbildung • 2facher Anstieg von Milchsäurebildung12,6fache Steigerung der Bernsteinsäure

W3110GFAPL (knockout ldhA):

• schlechtes Wachstum unter anaeroben Bedingungen

• Ausbeute nicht so hoch wie bei W3110GFAP

9,23 11,5312,6


• den größten Einfluss auf die

Bernsteinsäureproduktion haben die pyruvatformenden Enzyme (rot)

• aber auch die pyruvatverbrauchenden Enzyme (gelb) spielen eine Rolle

steht kein Pyruvat zur Verfügung wird der metabolische Fluss in Richtung Bernsteinsäure gelenkt

Verifizierung:• Kultivierung der Mutante W3110GFA unter Zugabe von Pyruvat

Gemischtsäuregärung ähnlich wie im Wildtyp


Pyruvat

Abb.6.: metabolische Stoffwechselwege von E. coli [8]


Zusammenfassung


• Stammoptimierung mittels komparative Analyse ist nur schwer möglich

lieferte lediglich Anhaltspunkte

• in silico Vorhersangen für Gen knockouts, erwiesen sich als gute

Methode um Ziele für die Inaktivierung zu identifizieren• trotz bestmöglicher Computersimulation können die Auswirkungen von

Geninaktivierungen in vitro nicht exakt vorhergesagt werden

• mithilfe von zusätzlichen Optimierungen konnte eine finale Steigerung um das 12,6fache erreicht werden

• aber im Vergleich zu etablierten Produktionsstämmen immer noch gering

• Pyruvat spielt in der Bernsteinsäureproduktion eine essentielle Rolle

Eine logik- und wissensbasierte Herangehensweise zur Stammoptimierung stellt eine interessante Alternative zur

Zufallsmutagenese dar.

221. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015

Literatur und Quellen

[1] http://de.wikipedia.org/wiki/Bernsteins%C3%A4ure (zuletzt überprüft am 15.01.14)

[2] http://www.carlroth.de/jsp/de-de/sdpdf/3195.PDF (zuletzt überprüft am 15.01.14)

[3] http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?rn00020+R02164 (zuletzt überprüft am 15.01.14)

[4] A. Cukolovic, C. V. Stevens: ”Feasibility of production methods for succinic acid: a marriage of renewable resources and chemical technology”, Biofuels, Bioproducts and Biorefining 2 (6), 2008; S. 505-529;

[5] H. Song S.Y. Lee: „Production of succinic acid by bacterial fermentation “, Enzyme and Microbial Technology Volume 39, (3), 2006, 352–361

[6] P.C. Lee, W.G. Lee, S. Y. Lee* and H.N. Chang: „Succinic acid production with reduced by-product formation in the fermentation of Anaerobiospirillum succiniciproducens using glycerol as a carbon source“ , Biotechnology and Bioengineering, 2001, Volume 72, (1), 41–48

[7] P. Kuhnert, E. Scholten, S. Haefner, D. Mayor, J. Frey: “Basfia succiniciproducens gen. nov., sp. nov., a new member of the family Pasteurellaceae isolated from bovine rumen“, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2009

[8] S. J. Lee, D.Y. Lee, T. Y. Kim, B. H. Kim, J. Lee, and S. Y. Lee: „Metabolic Engineering of Escherichia coli for Enhanced Production of Succinic Acid, Based on Genome Camparison and In Silico Gene Knockout Simulation“, Applied and Environmental Mikrobiology, 2005, 7880-7887

[9] J. G. Zeikus, M. K. Jain, P. Elankovan: “Biotechnology of succinic acid production and markets for derived industrial products”. Applied Microbiology and Biotechnology, 1999, Volume 51 (5), 545-552

[10] P. K. Bunch, F. Mat-Jan, N. Lee, and D. P. Clark.: “The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli“, Microbiology, 1997, 43, 187–195

[11] Y. P. Chao and J. C. Liao: ”Alteration of growth yield by overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase in Escherichia coli“, Appl. Environ. Microbiol., 1993. 59:4261–4265

[12] J. L Reed, T. D. Vo, C. H. Schilling and B. O. Palsson: “An expanded genome-scale model of Escherichia coli K-12 (iJR904 GSM/GPR)“, Genome Biol. 2003, 4, R54

[13] R Stellmacher, J. Hangebrauk, G. v. Abendroth, E. Scholten und C. Wittmann:»Fermentative Herstellung von Bernsteinsäure mit Basfia succiniciproducens DD1 in Serumflaschen“. Chemie Ingenieur Technik, 2010

231. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015

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