méthodes d 'évaluation de l 'activité des antibiotiques in vitro
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M. ArchambaudLaboratoire Bactériologie-Hygiène
CHU Rangueil Toulouse
Méthodes d ’évaluation de l ’activité des antibiotiques in vitro
17 Mars-2009
"Toute substance chimique, élaborée par un microorganisme ou produit par synthèse, à coefficient chimothérapeutique élevé dont
l'activité se manifeste à très faible dose d'une manière spécifique, par l'inhibition de
certains processus vitaux, à l'égard des microorganismes."
Définition d'un antibiotique
Plus de 60 ans d’histoire 1897 : E. Duchesne « Concurrence vitale » Antagonisme entre
les moisissures et les microbes
1928 : Flemming découverte de la pénicilline G
1935 : découverte des sulfamides
1942 : utilisation de la pénicilline G en cliniqueaprès purification de la Pénicilline G par Florey et Chain
CMI : concentration minimale inhibitrice : plus petite concentration d’antibiotique qui inhibe toute culture visible d’une souche bactérienne après 18 heures de culture à 37°C. Cette valeur caractérise l’effet bactériostatique d’un antibiotique.
.CMB : plus petite concentration d’antibiotique ne laissant subsister 0,01% ou moins de survivants de l’inoculum initial après 18 heures de culture à 37°C. Cette valeur caractérise l’effet bactéricide d’un antibiotique
Méthodes d ’évaluation de l ’activité des antibiotiquesin vitro : CMI et CMB
CMI : détermination
CMI = 2 mg/l
Concentration d’antibiotiquesmg/l
Même inoculum bactérien10 6 bactéries/ml
Nombre de bactéries/ml
Temps en heures
témoin
2mg/l
4mg/l
8 mg/l
16 mg/l
32 mg/l
64 mg/l
bactériostase
bactéricidie
10 6 bact/mlInoculum initial
10 2 bact/ml< ou = 0,01% de survivants
CMI
CMB
Courbe de croissance en présence d’antibiotiques
Antibiotiques bactériostatiques - Antibiotiques bactéricidesSelon leur activité, les antibiotiques sont classés :
Antibiotiques bactériostatiquesCMB éloignée des CMI : CMB > 32 x CMI
les macrolides, tétracyclines, rifamycines, sulfamidesAntibiotiques bactéricides
CMB proches des CMI : CMB < 32 x CMIaminosides - β-lactamines - quinolones - glycopeptides
Tolérance :Certaines souches pourront être tolérantesvis à vis d'antibiotiques normalement bactéricides,si les CMB de ces antibiotiques s'éloignent des CMI
(>32 fois)
Antibiotique concentration ou temps dépendant
Antibiotiques concentration dépendantsl'activité bactéricide augmente avec la concentration d'antibiotique: et ont généralement une vitesse de bactéricidie rapide (les aminosides, les fluoroquinolones)L'obtention in vivo de concentration élevée semble déterminanteCette observation est à la base du mode d'administration proposé
dose journalière pour les ATB concentration dépendants
Antibiotiques temps dépendantsl'intensité de la bactéricidie est corrélée avec la duréependant laquelle la concentration dépasse la CMI :
ces antibiotiques sont les β-lactamines, les glycopeptides
Cette observation est à la base du mode d'administration proposédoses fractionnées, en continu pour les ATB temps dépendants
Mise en route d ’une antibiothérapieInfection documentée
Détermination du profil de sensibilité à différents antibiotiques de la ou des bactéries responsables de l ’infection
Antibiogramme
* détermine le profil de sensibilité d’une bactérie à un panel d’antibiotiques
* étudie ll’’activitactivitéé bactbactéériostatiqueriostatique des antibiotiques
* établit un lien avec les concentrations critiques qui déterminent les classes S, I, Rles classes S, I, R , prédictives du succès ou de l’échec thérapeutique.
Test prédictif et non descriptif : valeur relativeSon résultat est confronté aux résultats thérapeutiques
Antibiogramme : Test prédictif
Antibiogrammeen milieu solide par diffusion en milieu gélosé
Antibiotique : disque papier imprégné charge d’antibiotiqueformation d’un gradient de concentration autour du disque
Bactérie : inoculum bactérien calibré déposé à la surface d’une gélose (milieu standardisé Muller Hinton)
Incubation 37°C pendant 18 heures
Lecture : Images d’inhibition de la culture autour du disque
Antibiogramme par diffusion en milieu gélosé
CMI
Gradient de concentration
Diamètre d’inhibition
Lecture d ’un antibiogramme par diffusion en milieu géloséMesure du diamètre d ’inhibitionRelation entre diamètre et CMI :courbe de concordance établie sur un grand nombre de souches
2
1,75
1,50
1,25
1
0,75
0,5
0,20,01 0,02 0,04 0,1 0,2 0,4 1 2 4 8 16
Lecture d ’un antibiogramme par diffusion en milieu gélosé
Détermination des concentrations critiques (et les diamètres critiques) : qui découlent de données pharmacologiques (concentrations sériques obtenues avec des posologies habituelles) et définissent les classes S, I, R, raisonnablement prédictives du succès ou de l ’échec thérapeutique
Valeurs données par des groupes experts nationaux , européens
Pour être efficace la concentration sérique d’un antibiotique doit être supérieure à la CMI
Lecture interprétative de l’antibiogramme en milieu gélosé
1disque d’antibiotique, une bactérie, un diamètre d’inhibition = S, I, R
La lecture doit être interprétative :mécanisme de résistance faiblement exprimé
Basée sur la reconnaissance des phénotypes de résistance naturelle ou acquise :
- lecture comparative pour plusieurs antibiotiques de la même famille
- règles d ’interprétation CASFM- systèmes expert : lecture couplée à la lecture des
diamètres par caméra
Antibiogramme en milieu liquideAutomatisation possibleLecture informatisée
Mesure de l ’activité bactériostatique en milieu liquide, -2 concentrations correspondantes aux concentrations critiques -plusieurs concentrations Lecture automatique de la croissance bactérienneCouplée à une informatique pour déterminer les classes S, I, R
Systèmes experts pour la reconnaissance des mécanismes de résistance:
-intégration des règles d ’interprétation dans la base de données-intégration de zones de CMI pour chaque phénotype de résistance
connu
Antibiogramme : réponse au clinicien
Liste des antibiotiques : DCI et noms commerciauxRéponse interprétée en S, I ou RMéthodologieCMI si possibleCommentaires :
phénotypes de résistance aux antibiotiques (Posologie moyenneCoût du traitement par molécule)
Signalement d’une BMR (bactérie multirésistante)Signalement CLIN résistance inhabituelle
(décret 2001-671)
en milieu gélosé :-méthode de référence, différentes dilutions incorporées dans boîte de gélose, plusieurs souches-à l ’unité : E Test, de réalisation facile,
en milieu liquide : systèmes automatisés
Intérêts :repérer les sensibilités diminuées :
ex Pneumocoque et ββββ-lactaminesStaphylocoques et teicoplanine
adapter les posologiescomparaison CMI - dosage sériquesituations où les données pharmacologiques (volume de distribution) sont perturbées
Détermination des CMI
E Test
CMI
Elle se base sur :- le site infectieux et les principales espèces bactériennes pouvant êtreresponsables
- les antécédents infectieux du patient - l'écologie du service si le patient est hospitalisé- le spectre des antibiotiques ( AMM, Vidal)
* Espèces habituellement sensibles :* Espèces modérément sensibles :* Espèces résistantes
- mise à jour régulière du spectre : évolution de la résistance-Des règles de consensus sont établies pour certaines infections : * site SPILF
Mise en route d ’une antibiothérapieInfection non documentée - Antibiothérapie probabiliste
Site SPILF : Conférences de consensus téléchargeable
Déterminé sur un grand nombre de souches,Histogramme des valeurs de CMI, Détermination des CMI50 et CMI90,
CMI 50 : la plus petite concentration d'la plus petite concentration d'ATBATB permettant permettant d'inhiber la d'inhiber la croissance de 50% des souchescroissance de 50% des souches d'une espd'une espèèce bactce bactéérienneriennemarqueur de la marqueur de la sensibilitsensibilitéé naturellenaturelle d'une espd'une espèèce ce àà un ATBun ATB
CMI90 : La plus petite concentration d'La plus petite concentration d'ATBATB permettant permettant d'inhiber la d'inhiber la croissance de 90% des souchescroissance de 90% des souches d'une espd'une espèèce bactce bactéérienneriennemarqueur de la rmarqueur de la réésistance acquisesistance acquise àà un ATB par une espun ATB par une espèèce bactce bactéériennerienne
Spectre des antibiotiques
3 Classes : dans le Vidal pharmacodynamie* Espèces habituellement sensibles :plus de 90% des souches sont sensibles * Espèces modérément sensibles :plus de 90% des souches se situent dans la zone intermédiaire* Espèces résistantesau moins 50% des souches sont résistantes
* Espèces inconstamment sensibles : la fréquence de résistance s’échelonne entre 10 et 50% et est mentionnée dans le vidal
Spectre des antibiotiquesListing de bactéries /3 classes
Espèces modéremment sensibles
Espèces habituellement sensibles
Espèces résistantes
Appréciation de l ’activité bactéricide des antibiotiquesseuls ou associés
Techniques sont basées sur des dénombrements des bactériessur inoculum de départ et après mise en contact avec une solution d ’antibiotique
ou une association d ’antibiotiques
au bout de 18 heures, en temps fixeCMB
en cinétique, en temps variableCourbes de bactéricidie
pour les associations :Courbes de bactéricidie
Techniques réservées à des laboratoires de recherche
Appréciation de l ’activité bactéricide des antibiotiquesseuls ou associés
Etablir des courbes de bactéricidie
Dosage des antibiotiquesAdaptation des posologies
contrôle de la toxicité : aminosides, glycopeptidescontrôle de l ’efficacité en comparaison aux CMI
Prélèvement :sur tube secmoment du prélèvement
au pic : 15 minutes si voie IV1 heure si voie IM3 heures si per os
à la vallée
Prescription fréquente pour glycopeptides et aminosides