Méthodes d’études de la dynamique dans la cellule par photo‐conversion ou FRAP : 

avantages et limites

Xavier BaudinSophie Abélanet

MiFoBio 2016Atelier « maitrise » 

Contexte biologique du TP : β‐caténineΒ‐Caténine (90KDa autour 130 avec la GFP) :

• régulation et coordination des adhésions cellules à cellules via complexe avec E‐Cadhérine localisé à la membrane plasmique. Régulation interaction des moléculesde jonctions avec l’actine du cytosquelette.

• Composant essentiel dans la cascade de signalisation Wnt = Activation des gènesde transcription responsable de la prolifération et différentiation cellulaire

Membrane plasmique

Cytoplasme

Noyau

β‐Caténine

β‐Caténine

β‐Caténine

E‐Cadhérine

α‐Caténine

Filaments Actine

BCL9

TCF1Wnt gènes cibles

AdhésionCellules à Cellules

Jonctions Cytosquelette

Dégradation

Prolifération et différenciation 

cellulaire

β‐caténine : Etude dynamique/synthèse/dégradation

Objectif : visualisation dynamique

Choix de l’approche

Photo‐conversion

• Etude dynamique de suivi de Fluorescence sur des zones locales (mesure des tOUT)

• Etude dégradation sur cellule entièrement photoconvertie

• Etude relocalisation en présence de drogues avec conversion sur zone locale

FRAP

• Etude dynamique de suivi de recouvrement Fluorescence sur des zones locales (mesure des tIN)

• Etude de synthèse protéique

compare les effets de mutations et de drogues

Utilisation de protéines fluorescentes classiques

• FRAP (Fluorescence recovery After Photobleaching)Mesure du recouvrement de fluorescence dans la zone d’intérêtConfocal à balayage ‐ Plein Champ ou spinning disk avec module FRAP

Méthodes d’études dynamiques dans la cellule

http://zeiss‐cam

pus.magne

t.fsu.edu

/

0102030405060708090100

0 2 4 6 8 10

Intensité

 relative de

 fluo

rescen

ce 

(en %)

Temps (minutes)

• Choisir le système d’acquisition, choisir et régler l’objectif (bague correctrice)

• Choisir la taille du champ à observer, la taille du pinhole

• Privilégier le S/B et la fréquence d’acquisition

• Choisir la forme et taille de la ROI de photoblanchiment

• La durée de photoblanchiment doit être la plus courte possible car les molécules diffusent aussi pendant

• Eviter le photoblanchiment pendant le reste de l’acquisition (utilisation du binning)

• La fréquence d’acquisition des images doit être plus haute que la vitesse de diffusion (pour acquérir un nombre suffisant de point de temps pendant la première partie du recouvrement)

• Temps acquisition suffisamment long (idéalement un plateau) 

FRAP : β‐caténine‐GFP  acquisition

• Correction des mouvements lors de l’acquisition

• Problème lors des déformations de l’échantillon

• Soustraction du Background

• Correction du facteur de bleaching sur une cellule témoin, sur la cellule entière, sur la ROI de bleachavant bleach ou au plateau

• Normalisation des données

FRAP : β‐caténine‐GFP  traitement

Background (B)

FRAP (F)

REF (R)

Ri (Ft‐F0)   Rt (Fi‐F0)

x x  100

Ri (Ft‐F0)   Rt (Fplateau‐F0)

x x  100

normaliser pour la fraction mobile

normaliser pour les autres paramètres cinétiques

(Ƭ½, faire du fit)

FRAP : β‐caténine‐GFP  Analyse

Background (B)

FRAP (F)

REF (R)

Modèle de FIT : méthode Ellenberg(Ellenberg J., Siggia E.D., Moreira J.E., Smith C.L., Presley J.F., Worman H.J., Lippincott‐Schwartz J. (1997) J. Cell Biol.

1 4

/

ω = Rayon du bleach (en pixel ou µm)Dt = Coefficient de diffusion

ω = 3,7µmDt = 0,18µm²/min

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

1 3 5 7 9

Intensité

 relative de

 fluo

rescen

ce (e

n %)

Temps (minutes)

Utilisation de protéines fluorescentes photo‐transformables

• Photo‐ActivablePassage d’un état noir à un état fluorescent de manière irréversibleConfocal à balayage ‐ Plein Champ ou spinning disk avec module FRAP ‐ Biphoton

• Photo‐réversiblePassage d’un état noir à un état fluorescent de manière réversibleConfocal à balayage ‐ Plein Champ ou spinning disk avec module FRAP ‐ Biphoton

• Photo‐convertiblePassage d’un état fluorescent à un état fluorescent d’une autre couleur de manièreirréversible. Confocal à balayage ‐ Plein Champ ou spinning disk avec module FRAP ‐ Biphoton

Méthodes d’études de la dynamique dans la cellule

Protéines Fluorescentes photo‐transformables : Panel large de choix

Protein Photoconversion Activating Light Oligomeric StateQuantic Efficiency

Extinction Coefficient

PA‐GFP None to Green UV or Violet Monomer 0,79 17400

(PS‐)Dronpa None to Green UV or Violet Monomer 0,85 95 000

PS‐CFP2 Cyan to Green UV or Violet Monomer 0,23 47 000

PA‐mCherry1 None to Red UV or Violet Monomer 0,46 18 000

Kaede Green to Red UV or Violet Tetramer 0,88 / 0,33 98800 / 60400

mKikGR Green to Red UV or Violet Monomer 0,69 / 0,63 49000 / 28000

EosFP Green to Red UV or Violet Tetramer 0,62 37 000

mEos2 Green to Red UV or Violet Monomer 0,43 / 0,35 78000 / 39000

mEos3.2 Green to Red UV or Violet Monomer 0,84 / 0,66 56000 / 46000

Dendra2 Green to RedUV or Violet or 

BlueMonomer 0,5 / 0,55 45000 / 35000

mClavGR2 Green to Red UV or Violet Monomer 0,77 / 0,54 19000 / 32000

mMaple Green to Red UV or Violet Monomer 0,74 / 0,56 15000 / 30000

PA : photo‐activablePS : photo‐switchable =  réversibleles autres : photo‐conversion = irréversible

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/applications/opticalhighlighters.html

• Protéines Photo‐Convertibles (ex: Eos and Kaede) :

Clivage du chromophore induit par de la lumière violette

Passage entre 2 états fluorescents avec 2 couleurs d’émissions distinctes

Before Photoconversion

Photoconverted

Méthodes d’études dynamiques dans la cellule

Utilisation de protéines fluorescentes photo‐transformables

http://zeiss‐campus.magnet.fsu.edu/

Photoconversion : β‐caténine‐mMaple

β‐caténine mEos2 ou β‐caténine Dendra2 

β‐caténine mMaple

Expressions non stables

A. McEvoy PLosOne 2012

dt5min

• Photoconvertible du  vert  au rouge (irréversiblement) avec un haut contraste, par activation avec un faisceau lumineux de lumière UV ou bleue

• Protéine fluorescente, photoactivable (légèrement en GFP, ce qui rend les calculs de TIN non possible avec cette lignée)

• La forme photoconvertie (rouge) est hautement stable

• Protéine fluorescente monomérique, donc particulièrement adaptée pour les fusions

• Ces propriétés en font un outil précieux‐ pour faire un suivi de cellules, d’organelles ou de protéines‐ pour des études de dynamiques de protéines ou de structures intracellulaires.

Caractéristiques de mMaple : bilan

• Choisir le système d’acquisition, choisir et régler l’objectif (bague correctrice)

• Choisir la taille du champ à observer, la taille du pinhole

• Privilégier le S/B et la fréquence d’acquisition

• Choisir la forme et taille de la ROI de photoblanchiment

• La durée de photoactivation doit être la plus courte possible car les molécules diffusent aussi pendant

• Eviter le photoblanchiment pendant le reste de l’acquisition (utilisation du binning)

• La fréquence d’acquisition des images doit être plus haute que la vitesse de diffusion (pour acquérir un nombre suffisant de point de temps pendant la première partie du recouvrement)

• Temps acquisition suffisamment long (idéalement un plateau) 

Photoconversion : β‐caténine‐mMaple

Photoconversion : β‐caténine‐mMaple AnalyseAnalyse: Suivi du recouvrement de fluorescence en vert

(Image J ‐ Image ‐ stack ‐ plot Z axis profile sur la ROI)

Normalisation des résultats : 

Ref (R)

Photoconversion (P)

Bruit (B)‐20

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20

Intensité

 relative de

 fluo

rescen

ce (e

n %)

Temps (minutes)

Vert

Rouge

• Suivi de protéineTaux de mouvement et directionCoefficient de diffusionFraction mobile

Temps de résidence dans un compartimentTaux d’échange entre compartimentTaux de synthèse et dégradation

• Suivi d’organelleTaux de mouvement et directionFusion fission

• Suivi de cellulesTaux de mouvement et directionLocalisation de celluleTaux de division cellulaire

Autre application de la photoconvertion