Metoda Kjeldahl

Azotit është një nga pesë elemente kryesore gjenden në materiale organike të tilla si proteinat. Ky fakt është pranuar nga një kimist danez, Johan Kjeldahl, i cili ka përdorur atë si një metodë e përcaktimit të shumës së proteinave në mostrat e marra nga një shumëllojshmëri e gjerë e organizmave. Në 1883 Kjeldahl i paraqiti ShoqërisëKimike daneze një metodë (rishikuar më shumë që në ditën e tij) për përcaktimin e sasisë së azotit në përzierjen e substancave që përmbajnë kripëra të amonit, nitrateve,ose komponimet organike të azotit.

Bazë e kesaj procedure  është oksidimi i kompleksit organic duke përdorur acid sulfurik tëfortë. Karboni qe ndodhet ne materialet organike oksidohet  dhe kalon ne dioksid karboni ndersa hidrogjeni konvertohet në ujë.

Azoti, i gjetur nga grupet aminike ne zinxhiret peptidik konvertohet ne jone amoni, tretesira ne solucionin oxidues nuk mund te konvertohet ne amonjakt te gazt.

Metoda kjeldahl per analizen e azotit eshte standarte ne te gjithe boten per llogaritjen e permbajtjes se proteinave ne nje shumllojshmeri varjetetesh te materialeve duke filluar nga ushqimet e njerzve dhe te kafshve, plehrave etj.

Tri hapat e procedures

Metoda e Kjeldahl përbëhet nga tre hapa, të cilat duhet të kryhen me kujdes në rend:

1. mostra eshte tretur me pare ne ac sulfurik te perqendruar ne prani te nje katalizatori, i cili ndihmon ne konvertimin e azotit aminik ne jone amon

2. jonet amonium konvertohen pastaj ne gaz amonjakal, uke u nxehur dhe distiluar. gazi amonjakal eshte drejtuar ne nje leng ku tretet perseri dhe kthehet ne jone amoni per te dyten here.

3. ne fund shumen e amonjakun qe e kemi te akumuluar e percaktojme me nje metode standarte me titrim, dhe bejme llogaritjet per te.

Hapi i parë: Tretja e mostrës

Ky eshte hapi qe kerkon me shume koh ne analiza. Qellimi i ketij hapi eshte qe te prishen lidhjet qe mbajne polipeptidet te bashkuara, dhe kalimin e tyren ne kimikate te thjeshta si ne uje, dioxid karboni dhe natyrisht ne amonjak.

Reaksionet e tilla mund te jene te nxitura nga prezenca e katalizatorve dhe nga substancat neutrale, te tilla si (K2SO4), i cili ngre piken e vlimit te acidit te tretur dhe temperaturen e reaksionit.

Katalizatorët janë përdorur edhe për të ndihmuar në procesin e tretjes, shumë pretj tyre janë provuar duke përfshirë selenium, merkuri, bakri, ose jonet e merkurit ose bakri.

Tretja harriet nga:

1. Peshon nga rreth 1 gm e mostrës që përmbajnë proteina, duke bërë një shënim të peshës, dhe vendosim e mostrës në një balonë tretje, së bashku me 12-15 ml të acidit sulfuric te perqendruar(H2SO4).

2. Shtojme shtatë gram sulfat kaliumi dhe njëkatalizator, zakonisht bakrit.

3. Duke e çuar tubin drejt tretesires ku kryhet nje perzierje ne temp (rreth 370oC për 400oC) .

4. Ngrohim  përzierjen në tubin ( termus ) derisa mund të shihet tymi i bardhë , dhe pastaj vazhdojme ngrohjen për rreth 60-90 minuta.

5. Ftohim tubin , dhe me kujdes  shtojme  250 ml uje.

Hapi I dyte: Distilimi

Qëllimi i hapin e ardhshëm, distilim, është për të ndarë amoniakun(azotin) nga përzierja e tretur. Kjo është bërë duke:

1. rritjen e pH ne përzierje duke përdorur hidroksid natriumi (45% NaOH solucion). Kjo ka efekt të ktheje jonet e  amonit (NH4 +)  (të cilat janë shpërndarë në të lëngët) ne amoniakut (NH3), i cili është një gaz.

2. ndarjen e azotit larg nga perzierja e tretesires me ane te distilimit te amonjakut (konvertimitn e tij ne nje gaz volatil, duke rritur temperaturen e pikes se vlimit) dhe pastaj kalimin e ketyre gazrave ne nje solucion te vecant me 15 ml HCl (acid klorhidrik) dhe 70 ml uje.

3. heqeja e pjeses se kemishesh nxehese dhe shpelarja e kondesatorit me uje ne menyre qe te sigurohet se i gjith amonjaku te jete tretur.

Stadi i trete

Kur amonjaku tretet ne acid, ai neutralizohet nga dica molekula HCl te cilat gjenden atje. Ai acid qe ka ngelur mund te "titrohet me pas", qe eshte nje titrim standart, duke njohur soluconin e bazes (zakonisht NaOH). Ne kete menyre sasia e amonjakut e distiluar nga kjo tretesire solucioni mund te llogaritet (kalkulohet), dhe keshtu llogaritet dhe sasia e azotit ne proteine.

Sasi e acidit, dhe qe ketej amoniaku janë të përcaktuara nga:

1. duke shtuar nje indikator teregues ne acid/ ne solucionin e amonjakut. Kjo ngjyre duhet te kthehet ne nje ngjyre te ndezur te forte, duke treguar se një sasi të konsiderueshme e acidit eshte ende e pranishme.

2. hedhim nje solucion standart te NaOH (hidroksid natriumi) me byret derisa solucioni acid te marri ngjyre.

3. duke vezhguar per castin kur shfaqet ngjyra portokalli, ky cast tregon arritjen e "pikes se fundit" dhe tregon se gjith acidi eshte neutralizuar nga baza.

4. shendojme volumin e bazes qe harxhojme per te harritur piken e fundit te pikes se neutralizimit.

5. kryerjen e kalkulimeve per te gjetur sasine e amonjakut, dhe keshtu te azotit, qe e ka prejardhjen nga mostra orgjinale.

KALKULIMET (PERLLOGARITJET)

Nje mol amonjak qe e ka prejardhjen nga perzerja (nga proteina orgjinale) do te neutralizoje pikerisht nje mol acid ne balone.

Kalkulimi i pare, eshte per te gjetur numurin e moleve amonjak qe jane prodhuar dhe mbajtur ne balone.

Kjo kryhet keshtu :

llogarisim fillimisht numurin e moleve te acidin ne balone neutrazlizuese (para se amonjaku te jete

neutralizuar) duke shumezuar molaritetin e solucionit acid me volumin e solucionit neutralizues.

Molet acid = molariteti I acidit x volimi I perdorur per titrim(molesA = M x V)

llogaritim numurin e moleve te bazes (NaOH) qe jane shtuar me buret per neutralizimin e acidit te mbetur (NaOH NUK neutralizon amonjakun)

molet e bazes = molariteti I bazes x volume I shtuar nga byreta(molesB = M x V)

zbresim "molet e bazes" nga "molet acid" qe jane prezente qe nga fillim, per te marre : numurin e moleve te amonjakut qe vijne nga proteinat. numuri i moleve te amonjakut eshte i njejte me numurin e moleve te azotit per te llogaritur numurin ne gram te azotit ne mostren orgjinale te proteines,

shumezojme "molet e azotit" me masen atomike te azotit (masa e atomit te azotit)

azoti (gr) = molet azot x mas atomike

(gN = molesN x 14.0067)

Sasia e proteinave te paperpunuara gjendet duke shumezuar perqindejn e azotit me nje koeficent qe zakonisht esthe 6.25

CP = %N x 6.25

Perqindja e azotit gjendet :

Përqindja e azotit gjetur në mostrën origjinale  mund të llogaritet nga:

% azot =(gr azotit / mostër gr) x 100% N =(gN / gS) x 100