Metodi di Quantificazione dell’Espressione Genica

Cosa significa “quantificare l’espressione genica?”

Alcune tecniche per quantificare l’espressione genica

Parte I: RT PCR qRT PCR (Real Time) Parte II: Northern Blot Western Blot

RT-­‐PCR  

mRNA  +  RTasi  +  oligo-­‐(dT)primer  

PCR  AAAAAAA-­‐3’  

3’   5  Primer  1  

mRNA  5’  

cDNA  

AAAAAAA-­‐3’  TTTTTTTT-­‐5’  

3’   TTTTTTTT-­‐5’  “first  -­‐strand”  cDNA  

3’   TTTTTTTT-­‐5’  5’  Primer  1  

5’  5’   Primer  2  

Rnasi  H   RT  

Doppo  la  PCR…  Corsa  ele.rofore0ca  

Si  prepara  un  gel  di  agarosio  ad  una  data  percentuale  (1-­‐2%)  con  0,4  µg/ml  EJdio  Bromuro    

Si  analizzano  i  risultaJ:  

+  Aux      -­‐  Aux    +  Aux      -­‐  Aux                                MK  

PIN2                                ACT  

10                10                  5                  10        Expr.  

10/5  =      2    10/10  =  1  

PCR  Semi-­‐quanJtaJva  

Una delle cause della inattendibilità della RT-PCR, a livello quantitativo è la difficolta di stimare esattamente l’intensità di segnale di prodotti di amplificazione che vanno a saturazione. Una semplice variante della PCR, nota come PCR semiquantitativa risolve in parte questo problema. Poiché è noto che i primi cicli di amplificazione seguono un andamento ragionevolmente esponenziale, nella PCR semiquantitativa si esegue una reazione di pochi cicli, e poi si risolvono i prodotti di amplificazione su gel di agarosio e di visualizzare il risultato mediante Southern blotting e ibridizzazione  con una sonda radioattiva.

La saturazione della reazione di PCR dipende , tra l’altro, dalla: •  Inattivazione della Taq polimerasi •  Deplezione dei NTP •  Deplezione dei primers •  Inibizione da parte del pirofosfato •  Auto-appaiamento di DNA amplificati  

PCR  compeJJva  

Anche se la PCR semi-quantitativa riesce a dare stime ragionevoli dei livelli di espressione relativi, recuperando, in parte il rapporto tra quantità di messagero e livello di amplificazione, i suoi risultati sono comunque molto approssimati e non può risalire in alcun modo alla concentrazione esatta dei trascritti.

La PCR competitiva affronta il problema in modo indiretto: non potendo conoscere la concentrazione esatta del trascritto in esame si preoccupa di compararlo con quella di un mRNA o di un DNA a concentrazione nota.

In questa tecnica vengono usati due DNA, amplificabili con una stessa coppia di primers, ma risultanti in amplificati di dimensioni diverse. Un DNA, il competitore, è di concentrazione nota. Vengono allestite una serie di reazioni parallele in cui il cDNA incognito viene mantenuto costante, mentre il competitore viene aliquotato in diluizioni seriali.

Diluizioni seriali di una quantità nota di competitore    

1  

Effettuare la PCR con la stessa coppia di primers 2  competitore (a)

primer 1 primer 2  

primer 1 primer 2

Analizzare su gel. La coppia con quantità di amplificati approssimativamente uguali indica che il cDNA target e il DNA competitore, in competizione per gli stessi primers, all’inizio dell’amplificazione erano presenti in quantità uguali. Poiché la concentrazione del DNA competitore è nota, si può risalire alla concentrazione del cDNA incognito

Quantità approssimativamente uguali  

1            2                  3                  4                5                  6                    6  

a  

b  

target (b)

3  

PCR  compeJJva  

Real time PCR  

La PCR in tempo reale è una implementazione della PCR che permette di avere informazioni quantitative più precise sulle concentrazioni relative di cDNA amplificati e dei loro mRNA corrispondenti. La quantificazione può essere assoluta o relativa. Nel caso della quantificazione assoluta si fa ricorso alla costruzione di una curva di calibrazione standard di RNA a concentrazione nota, da cui si può estrapolare la concentrazione ignota e quindi il numero di copie iniziali del nostro campione. La quantificazione relativa compara, con vari metodi, le concentrazioni relative di due campioni normalizzati ad un gene di riferimento.

L’accuratezza della qRT-PCR deriva dalla sua capacità di monitorare i prodotti di reazione in tempo reale, che gli permettere di ottenere informazioni sulla fase logaritmica della reazione di PCR Infatti, a differenza della PCR classica che ha bisogno di un post-trattamento, tipicamente un gel di agarosio con bromuro di etidio, per visualizzare i risultati dopo un certo numero di cicli alla fine della reazione, la PCR in tempo reale è in grado di identificare, al suo primo apparire, un prodotto di PCR, monitorando di continuo l’andamento della reazione, senza dover interrompere la reazione per poterla visualizzare su gel. La real time PCR risolve questo problema utilizzando precursori fluorescenti, come il bromuro di etidio o il SYBR Green, che vengono incorporati nel prodotto in formazione o che si intercalano nella doppia elica, man mano che si forma. In ogni caso sarà possibile monitorare in tempo reale la formazione del prodotto di amplificazione seguendone l’assorbimento con un sistema spettrofotometrico, in un sistema automatizzato che provvede anche alla routine della PCR. In questo modo la qRT-PCR riesce a misurare le curve di accumulo nella loro fase esponenziale

SCHEMA  DI  MACCHINA  A  PIASTRE  

SCHEMA  DI  MACCHINA  CON  ROTORE  

ESEMPIO  DI  INTERFACCIA  SOFTWARE  

Metodo  SyBr-­‐Green  

Metodo  Taq  Man  

Metodo  Molecular  Beacon  

Metodo  Scorpion  Probe  

0200000000400000000600000000800000000

1E+091,2E+091,4E+091,6E+09

0 5 10 15 20 25 30 35

AM

OU

NT

OF

DN

A

PCR CYCLE NUMBER

CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA0 11 22 43 84 165 326 647 1288 2569 512

10 1,02411 2,04812 4,09613 8,19214 16,38415 32,76816 65,53617 131,07218 262,14419 524,28820 1,048,57621 2,097,15222 4,194,30423 8,388,60824 16,777,21625 33,554,43226 67,108,86427 134,217,72828 268,435,45629 536,870,91230 1,073,741,82431 1,400,000,00032 1,500,000,00033 1,550,000,00034 1,580,000,000

110100100010000100000100000010000000100000000

1E+091E+10

-5 5 15 25 35

AM

OU

NT

OF

DN

A

PCR CYCLE NUMBER

La  qRT-­‐PCR  invece  di  misurare  l’accumulo  dei  prodo^  di  reazione  dopo  n  cicli,  misura  i  cicli  necessari  per  raggiungere  una  soglia  arbitraria  di  fluorescenza  de`a  Ct   (concentraJon   threshold).   Naturalmente   il   valore   di   Ct,   in   questo   caso   22,  dovrà  cadere  nella  regione  esponenziale  della  curva      

Ct  

Trasformando  il  grafico  in  scala  logaritmica,  appare  più  evidente  come  il  valore    di  Ct  va  a  cadere  nella  parte  esponenziale  della  curva  logaritmica,  assicurando  elevata  accuratezza  a  questo  Jpo  di  analisi        

Un’importante   proprietà   della   qRT-­‐PCR   è   che   i   valori   di   Ct   sono   inversamente  proporzionali   alla   concentrazioni   iniziali   dei   DNA   target,   come   si   può   verificare  facendo  diluizioni   seriali   di   un   campione   e   osservando   come,  man  mano   che   le  diluizioni  crescono,  ci  vogliono  più  cicli  per  raggiungere  la  soglia  di  concentrazione  (Ct)    

Passando  in  scala  logaritmica,  come  al  solito  è  più  evidente  la  correlazione  tra  i  Ct  e  le  diluizioni  (notare  che  a  Ct  più  eleva0  la  correlazione  è  perduta).      

series  of  10-­‐fold  diluJons    

Nf  =  Ni  (1+η)ct  

Nfa  =  Nia  (1+ηa)cta  

Nj  =  Nib  (1+ηb)ctb  

Nfa  =  Nj   Nia  (1+ηa)cta    =  Nib  (1+ηb)ctb    

Per  l'equazione  generale  della  PCR  avremo  alla  concentrazione  di  treshold  (Ct)      

Dove  Nf  è  il  numero  di  copie  finali,  Ni  il  numero  di  copie  iniziali,  η  l'efficenza  di  amplificazione          

Le  concentrazioni  di  a  e  b    al  punto  di  treshold    saranno:              

e  poichè,  per  definizione,     abbiamo:    

Nia  

Nib  =  

(1+ηb)ctb  

(1+ηa)cta  Log  Nia  –  Log  Nib  =  Log  (1+ηb)  ctb  -­‐  Log  (1+ηa)  cta  equivalente  a:  

Assumendo  ηa  =  ηb      ;      1+η  =  E          avremo:        

Log  Nia  –  Log  Nib  =  Log  (E)(ctb  –  cta)       ctb  –  cta  =  Δct    

Metodo  di  calcolo  della  real  0me  PCR:  dai  Ct  ai  ΔCt  e  alla  quan0ficazione    

Dobbiamo  però  considerare  l’espressione  del  gene  housekeeping  di  controllo  per  correggere    ct2-ct1 = 19.93-19.80 = 0.13 Il ΔΔct è quindi uguale a: ΔΔct = 2Δcttarget-Δctcontrollo = 211.60-0.13 = 211.47 = 2836 volte        

Un  esempio  pra0co  di  calcolo…  

Se  vogliamo  conoscere  per  esempio,    la  variazione  di  espressione  del  gene  interleuchina    β  in  seguito  a  un  certo  tra`amento,  ci  calcoliamo  la  Δct del campione in esame; ct2-ct1 = 29.63-18.03 = 11.60. Senza considerare l’efficienza di amplificazione il trattamento ha indotto il nostro gene: Δct = 2ct2-ct1 = 229.63-18.03 = 211.60 = 3104 volte            

Graficando    in    ordinata  i  Ct  e  in  ascissa  il  log  delle  concentrazioni,  tu^  i  punJ  cadono  lungo  una  re`a  con  un  alto  valore  di  correlazione.  E’  quindi  possibile  costruire  una  curva  di  taratura  da  cui  estrapolare  l'efficenza  di  amplificazione    

Calcolo  dell'efficienza    Finora   abbiamo   volutamente   trascurato   l'efficenza   di   amplificazione   (che   dipende  

principalmente   dai   primers   e,   in   misura   minore   da   parametri   sperimentali   che   possono  variare   da   reazione   a   reazione),   che   può   in   alcuni   casi   essere  molto  meno   efficiente   del  100%    A   causa   della   diversa   efficienza   di   amplificazione   non   è   di   solito   possibile   paragonare  campioni  amplificaJ  con  primers  diversi  con  il  metodo  del  ΔΔct  (a  meno  che  non  abbiano  la  stessa  efficenza)  

Calcolo  dell'efficienza    

Nf  =  Ni  (1+η)ct  

Log  Nf  =  Log  Ni    +  ct  Log  (1+η)      

ct  =  (1/Log  (1+η))  Log  Nf    -­‐  Log  Ni/Log  (1+η)        

ct  =    y    1/Log  (1+η)  =  m    Log  Nf    =  x  Log  Ni/Log  (1+η)  =  q    

η  =  [10(-­‐1/m)]  -­‐  1    

Per  l'equazione  generale  della  PCR  avremo  al  punto  Ct:  

Trasformando  in  Log:  

e  risolvendo  per  ct:  

o`eniamo  l'equazione  di  una  re`a    

dove:  

da  cui  possiamo  ricavare  η  come:        

Calcolo  dell'efficienza    Includendo  il  termine  di  efficienza  di  reazione  η,  al  punto  Ct  si  avrà:  

( )( ) ( )

( )⎥⎦⎤

⎢⎣

⎡

+−⋅⎥

⎦

⎤⎢⎣

⎡

+=

ηη 111

LogNLogNLog

Logct i

f( )ctif NN η+⋅= 1

( )fNLog

ct

( )( )η+

−=1LogNLogq i

( )⎥⎦⎤

⎢⎣

⎡

+=

η11

Logm

m q

qxmy +⋅=

110 /1 −= − mη

Un  ulJmo  problema  da  risolvere…  prodo^  non  specifici  

 Su   gel   di   agarosio   eravamo   in   grado   di  disJnguere,   in   base   al   peso  molecolare,   la  presenza  di  uno  o  più  prodo^  non  specifici  

La  macchina  di  Real  Time  misura  l’intensità  di  fluorescenza  riemessa  dal  pozze`o  senza  disJnguere  la  provenienza  del  segnale  

La  curva  di  dissociazione  risolve  il  problema  

Mk  Prodo`o  specifico  

Prodo^  non  specifici  

INVECE  

La  curva  di  dissociazione:  

Un  esempio  praJco…  

Gene  A  

Gene  B  

Contaminazione