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Método de análisis de las micotoxinas y aseguramiento de la
calidad analítica
Rodolfo Rivers., BQ. MSc.Consultor de Inocuidad y Calidad de los Alimentos
FAO/RLC
Micotoxinas
• Substancias producidas por algunos hongos, que puedencontaminar granos básicos y alimentos procesados y almacenados. Son substancias generadas por hongos microscópicos en productosalimenticios que al ser ingeridas son capaces de producirreacciones tóxicas, inducir cancer hepático, causar mutaciones y muerte en animales superiores y representan un riesgo potencialpara la salud humana
Método de Análisis para micotoxinas (Codex)
• El Codex Alimentarius recomienda aplicar un enfoque basado en criterios de desempeño al que deberáajustarse el método de análisis utilizado
• Se incorporan novedades metodológicas sin tener que volver a examinar o modificar el método especificado
• Los criterios de desempeño establecidos para los diferentes métodos deberían incluir todos los parámetros que aplican los laboratorios
• Los laboratorios tiene libertad de utilizar el método de análisis más adecuado para sus instalaciones.
Selección del método• Seleccionar, la literatura, el informe del laboratorio
interno, los métodos estándar, etc.
• Límite de detección debe ser apropiado para las micotoxinas y la matriz
• Deben ser confiables y repetibles
• Lo ideal sería dar las recuperaciones de 70-120% *
• Debe ser actual
• Deben adecuarse a las instalaciones de laboratorio
* deben cumplir con los criterios de la CE 98/53
Equipos• Procesadora de alimentos• Licuadora.• Baño Maria.• Bomba de aire con adaptador para jeringa de 10 ml• Balanza electrónica• Agitador de tubos Vórtex• Dispensador de 0-50 ml• Cromatógrafo Liquido de alta presión, con detector de
fluorescencia.• Probetas de 50 ml• Embudos de 5 cm. de diámetro• Tubos eppendorf de 2 ml.• Papel filtro Whatman N°1• Filtro de fibra de vidrio• Micropipetas de 10-100 µl y de 100 a 1000 µl• Columnas de inmunoafinidad
Reactivos
• Hexano HPLC
• Benceno HPLC
• Metanol HPLC
• Cloruro de sodio p.a.
• Acido Trifluoracetico (TFA)
• Acetonitrilo HPLC
• Nitrógeno gaseoso
Pasos a seguir
1. Preparación de Reactivos
2. Procedimiento
– Preparación de la muestra
3. Preparación de estándares, curva de calibración y fortificación
4. Detección instrumental
5. Expresión de resultados
Preparation of standards
• Stocks• (1000 µg/ml = 1mg/ml)
• Intermediate• (10 µg/ml)
• Working solutions• (1, 0.1µg/ml or lower)
DetecciónHPLC-FLU.
Preparación para la determinación finalEvaporacion de Solvente
Adición de Solvente
Con volumen definido
Clean-upRemover interferentes de la matriz
Filtración
Extracción10 - 200 g sample
Mezcla y homogenización
Muestra
Expresión de resultados
• Se construye una curva de calibración para cada estándar de aflatoxina B1, B2, G1 y G2 obteniéndose una ecuación lineal en la cual se interpolan las áreas obtenidas para las muestras, dando como resultado una concentración de aflatoxina de B1, B2, G1 y G2 en la muestra.
• Los resultados se expresan en ng/ml (ppb) de aflatoxina B1, B2, G1 y G2. Una muestra se considerará positiva si la cantidad de aflatoxinas totales analizadas superan los 4 ppb y se informará al cliente su resultado
AflatoxinasB1, B2, G1, G2
AflatoxinasM1
Método Validado
Método Validado
TejidoAnimal
(Hígado)
Leche
Aflatoxin B1Aflatoxin M1
Resultados de métodos analíticos
• Basados en principios de aseguramiento de la calidad
• Validados
• Acreditación según norma ISO 17025
– Son internacionalmente reconocidos
– Considerados de referencia para la
evaluación de conformidad de los productos
de intercambio en el comercio internacional
Objetivos de un Sistema de Calidad
• Prevención: Evitar que se propaguen errores e
ineficiencias
• Detección: Identificar los elementos causantes
de los errores
• Corrección y mejora: Eliminar las causas de
los errores y mejorar los procesos
• Demostrar: Evidenciar objetivamente que se ha
cumplido con los requistos.
Validación de métodos
• Calibración con patrones o materiales de referencia
• Comparación con resultados obtenidos con otros métodos
• Comparación interlaboratorios
• Evaluación de factores que influyen en el resultado
• Identificación de los factores y estimación de la incertidumbre
• Selectividad, repetibilidad, reproducibilidad, robustez, sensibilidad, limite de detección y de cuantificación.
Aseguramiento de la calidad de los ensayos
• Procedimientos de Control de calidad
• Uso regular de MR certificados
• Realizar cartas control
• Participación en interlaboratorios
• Repetición de ensayos con el mismo método o
métodos diferentes
• Repetición del ensayo en la muestra
Norma ISO 17025
• Se aplica a todo los laboratorios independientemente de:
– La cantidad de personal
– La extensión del alcance de los ensayos
• Establece requisitos de:
– Gestión
– Técnicos
ISO 17025
• La incertidumbre debe reportarse con un resultado....
• A petición del cliente (necesidad de estar preparados en un caso se pregunta).
• Si la incertidumbre afecta a la interpretación de los resultados.
• Si la incertidumbre afecta a la validez de un resultado
• La Norma dice:
– ¿Qué hay que hacer? (Requisito)
• El laboratorio dice el
– ¿Cómo? (Como se implementa el
requisito)
Acreditación - Certificación
Certificación
Acreditación
Norma ISO 9001:2000Asegura que el sistema de calidad
Este conforme a la normaConcordancia con la norma ISO 9000
Norma ISO 17025Determina la competencia técnica del
Personal, la validez técnica de lasOperaciones
Tiene que demostrar competencia
Validación
Confirmación, mediante el aporte de pruebas objetivas, de que se han cumplido los requisitos para el uso pretendido o una aplicación especifica
Componentes de una validación
• Prueba de la especificidad– perfectamente selectivo para la micotoxina de interés
• Sensibilidad – LOD, LDC
• Exactitud y precisión– de repetibilidad (dentro de un plazo, por ejemplo, de réplicas)– reproducibilidad
• Robustez– llevada a cabo día a día– llevada a cabo entre los laboratorios
Reproducibilidad
• Grado de concordancia entre los resultados de sucesivas mediciones del mismo mesurando realizadas en diferentes condiciones de medición
• El ensayo se realiza sobre el mismo material de ensayo en diferentes condiciones
Repetibilidad
• Grado de concordancia entre los resultados de sucesivas mediciones del mismo mesurando realizadas en las mismas condiciones de medición
• Las mismas condiciones significa resultados obtenidos:– Con el mismo método de ensayo
– Sobre el mismo material de ensayo
– Bajo las mismas condiciones
(mismo operador, mismo equipo, mismo laboratorio y un corto intervalo de tiempo)
Ensayo de Aptitud Interlaboratorio“Proficiency testing”
• Los programas de ensayo de aptitud
organizados externamente por un proveedor de
ensayos interlaboratorio constituyen un medio
independiente por el cual un laboratorio se
puede evaluar objetivamente y demostrar la
veracidad y precisión de los resultados
obtenidos por sus métodos analíticos
Sensibilidad y Rango
• Validación de un rango de concentración que puedan emplearse para el método deLOD - límite de detección (menor);
• sistema y de las muestrasLDC - límite de cuantificación (inferior); 3.3xLOD
0
3
10
blanco
LOD
LOQ
región de alta incertidumbre
Región de cuantificaciónmenos cierto
Región de deteccióncertera
Región de alta seguridadpara la detección y cuantificación
Relación: Concentración, LOD, LOQ
Porque se estima la medición de incertidumbre
• Exige la acreditación (por ejemplo, ISO 17025).
Los clientes y la legislación exige que los laboratorios están acreditados
Para saber si un resultado es la concentración de micotoxinas es muy probable que sea por encima o por debajo de un límite.
Para saber si los resultados de medición de acuerdo con los demás
Robustez
A.- Cambios menores
• Se utiliza la introducción deliberada de variaciones menores razonables y la observación de sus consecuencias.– Operador– Procedencia y edad de los reactivos– Disolventes– Patrones– Extractos de la muestra– Temperatura– pH
Reporte de medición de incertidumbre
• Resultado ± Incertidumbre
• Ej.: “6.5 ± 2.6 µg/kg”
• “8.9 ± 3.2 µg/kg.La mejor estimación de la concentración de ocratoxina A es de 8,9 µg / kg. Sin embargo, la incertidumbre expandida asociada con el resultado abarca el límite legislativo de 10 µg / kg. "
B.- Cambios mayores o importantes
– Diferentes especies
– Diferentes matrices o condiciones de
muestreo
Estabilidad
• parámetro de funcionamiento independiente del
modelo de validación empleado
• Estabilidad del analito en la solución
– Resto del analito (%) = Ci x 100/ Cfresco
• Estabilidad del analito (o los analitos) en la
matriz
– Utilice muestras reales siempre que sea posible. Cuando no disponga de ellas, utilice una matriz enriquecida con el analito.
Exactitud y precisión
• repetibilidad en un rango relevante de concentraciones
• repetibilidad para la recuperación de muestras enriquecidas
• eficacia de la extracción
• repetibilidad para una muestra dada (porejemplo, CV <20%)
Recuperación
• Por pics de micotoxinas en un “blanco” de matriz similar a la estudiada
• Nivel de adición debe ser relevante para las muestras, el límite normativo, y la LDC (por ejemplo, LDC a 100xLOQ
• "El blanco" idealmente debe estar libre de micotoxinas
• La recuperación debe ser de 70-120%
Eficacia de la extracción
• Experimentos de recuperación no demuestran la
eficacia de la extracción para las micotoxinas
producidas naturalmente en una muestra
• A menos que un método estándar se utilize
debe haber una cierta garantía de recuperación
completa
– comparar los resultados con los que utilizan un método estándar
– utilizar una muestra certificada para las pruebas de validación
Web de interés
• http://www.aoac.org
- methods, collaborative studies
• http://www.sigma-aldrich.com
- standards, safety data, certificates of analysis
• http://www.chm.bris.ac.uk/safety
links to safety sites
• Europa Food Safetyhttp://europa.eu.int/pol/food/index_en.htm
• Links to Rapid Alert Systemhttp://europa.eu.int/pol/food/food/rapidalert/index_en.htm
• http://www.iupac.org/
- symposia, links to mycotoxin sites
• http://www.mrc.ac.za/promec/
- standards for sale
• http://ptg.csl.gov.uk
- FAPAS proficiency testing scheme, contaminated test materials
• European Mycotoxin Awareness Network (EMAN) www.mycotoxins.org
Mycotoxicology Newsletterwww.mycotoxicology.org