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Metodologie di analisi di risorse geneticheper il loro utilizzo nel miglioramento
genetico
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PolimorfismoDifferenza genetica
relativamente comune inuna popolazione
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Nota:Una persona puo’ avere solo
1 o 2 alleli di unparticolare gene.
In una popolazione, cipossono essere molti allelidiversi di un particolare
gene
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Polimorfismi del DNAPolimorfismi del DNA
Polimorfismi del DNA = differenzenella sequenza di DNA
Per definizione, in una popolazione ilpolimorfismo è determinato dallapresenza di due o più alleli ad un locuscon frequenza>1%
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MARCATORI GENETICI
• MORFOLOGICI: descrittori morfo-bioagronomici
• BIOCHIMICI: isoenzimi, proteine di riserva
• MOLECOLARI: polimorfismi del DNA. Leclassi maggiormente usate per lo studio dellerisorse genetiche sono RAPD, SSR, AFLP
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CARATTERISTICHE FAVOREVOLI
• Non influenzati dall’ambiente
• Neutrali
• Stabili
• Numerosi
• Polimorfici (sequenze non codificanti)
• Campioni di qualsiasi tessuto
• Analisi indipendenti da sesso ed età
• Facili da monitorare
• Analisi automatizzabili
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AFLP MARKERS.
DNA extraction
DOUBLE
DIGESTION EcoRI e MseI
5’AATTCCAC TCGT 3’
3’GGTG AGCAT 5’
ADAPTORS adaptors (ds) EcoRI 3’ CATCTGACGCATGGTTAA 5’
LIGATION adaptors (ds) MseI 5’TACTCAGGACTCTA 3’
5’AATTCCACN NTCGTTA 3’
3’TTAAGGTGN NAGCAAT 5’
SELECTIVE primer EcoRI “+1” A
PREAMPLIFICATION primer MseI “+1” C
A 5’AATTCCACN NTCGTTA 3’ 3’TTAAGGTGN NAGCAAT 5’ C
5’AATTCCACA GTCGGTTA 3’
3’TTAAGGTGT CAGCAAT 5’
SELECTIVE primer EcoRI “+3” AAC
AMPLIFICATION primer MseI “+3” CAA
AAC
5’AATTCCACNNN NNNTCGGTTA 3’
3’TTAAGGTGNNN NNNAGCAAT 5’
AAC
5’AATTCCACAAC TTGTCGGTTA 3’
3’TTAAGGTGTTG AACAGCCAAT 5’
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PRINCIPALI APPLICAZIONI
Studi di Mappatura
Studi di diversità genetica
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Loma long
H1
Principali applicazioni : studi di diversità genetica
Scavina 6, due cloni provenienti dall’EcuadorNessuna differenza fenotipica
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Analisi microsatellite su Scavina 6
mTc15 mTc8 mTc2 mTc19
Referenceclones
Referenceclones
Referenceclones
Referenceclones
alcuni cloni sono differenti
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ANALISI DELLA VARIABILITA’GENETICA
Caratterizzazione di germoplasma
Stima delle relazioni filogenetiche
Fingerprinting varietale
Struttura genetica delle popolazioni
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Primer Marker
25 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 18 21
M 260 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
250 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
200 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0
190 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
150 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
N 200 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0
190 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
180 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
165 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
160 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
150 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
145 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
140 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0
125 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0
115 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0
Q 150 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0
125 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1
65 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0
CAMPIONI
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1 114 17L 1 9
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 18 21
0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0
0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0
0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0
0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0
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I. Calcolo delle similarità genetiche
II. Costruzione di una matrice di similarità
III. Rappresentazione grafica delle relazioni filogenetiche(costruzione di un dendrogramma)
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Coefficienti di SimilaritCoefficienti di Similaritàà Genetica Genetica
Spesso viene valutata la Dissimilarità (o Distanza) Genetica (GD).
GD = 1 indica completa diversità mentre GD = 0 indica completa identità
Indipendentemente dal tipo di coefficiente utilizzato, la Similarità Genetica(GS) rappresenta la quota di marcatori molecolari condivisi tra due individui
messi a confronto
GS = 1 indica completa identità tra i due individui confrontatiGS = 0 indica completa diversità
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Coefficienti di SimilaritCoefficienti di Similaritàà Genetica Genetica
Coefficiente di Nei e LiNLxy=2a / (a+b) + (a+c)
a = numero di bande condivise tra gli individui x ed y,
a+b = numero di bande presenti in x,
a+c = numero di bande presenti in y
Y + −
+ a b X − c
Coefficiente di Jaccard
Jxy=a/(a+b+c)
a = numero di bande condivise tra gli individui x ed y,b = numero di bande presenti in x ed assenti in y,c = numero di bande presenti in y ed assenti in x.
Y + −
+ a b X − c
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Coefficienti di SimilaritCoefficienti di Similaritàà Genetica Genetica
Coefficiente Simple Matching
SMxy=a+d / (a+d) + (b+c) a+ d= numero di siti condivisi, per presenza o per assenzadi bande tra gli individui x ed y,b + c = numero totale di differenze (polimorfismi) tra iprofili molecolari degli individui x ed y
Y + −
+ a b X − c d
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A B C D
Coefficienti di SimilaritCoefficienti di Similaritàà Genetica Genetica
Marcatori dominanti:
NLAB = 4/6 = 0.66
JAB = 2/4 = 0.50
SMAB = 5/7 = 0.71
NLBC = 0/5 = 0
JBC = 0/5 = 0
SMBC = 2/7 = 0. 285
NLxy=2a / (a+b) + (a+c)
Jxy=a/(a+b+c)
SMxy=a+d / (a+d) + (b+c)
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Coefficienti di SimilaritCoefficienti di Similaritàà Genetica Genetica
Marcatori co-dominanti:
NLAB = 2/4 = 0.5
JAB = 1/3 = 0.33
A B C D
SMAB = 4/6 = 0. 66
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Tali matrici sono necessarie per condurre le analisi di raggruppamentoattraverso la costruzione dei dendrogrammi
Coefficienti di SimilaritCoefficienti di Similaritàà Genetica Genetica
Matrici di similarità/dissimilarità
A B C D E F G A / 0,957 0,942 0,941 0,923 0,914 0,897 B 0,044 / 0,940 0,947 0,918 0,898 0,888 C 0,060 0,062 / 0,937 0,911 0,897 0,879 D 0,061 0,055 0,066 / 0,907 0,889 0,877 E 0,081 0,085 0,093 0,098 / 0,963 0,945 F 0,090 0,108 0,108 0,117 0,038 / 0,954 G 0,109 0,119 0,129 0,131 0,057 0,047 /
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Costruzione di un dendrogramma mediante l’utilizzo del metodoUPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)
Primo ciclo
Secondo ciclo
A B C D E B 0,8 C 0,6 0,6 D 0,4 0,4 0,4 E 0,4 0,4 0,4 0,6 F 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
A,B C D E C 0,6
D 0,4 0,4
E 0,4 0,4 0,6 F 0,2 0,2 0,2 0,2
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Costruzione di un dendrogramma mediante l’utilizzo del metodoUPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)
A,B C D,E C 0,6 D,E 0,4 0,4 F 0,2 0,2 0,2
AB,C D,E D,E 0,4
F 0,2 0,2
Terzo ciclo
Quarto ciclo
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Costruzione di un dendrogramma mediante l’utilizzo del metodoUPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)
ABC,DE F 0,2
Ultimo ciclo
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Esempio
A B C D E B 0,70 C 0,75 0,65 D 0,64 0,60 0,64 E 0,67 0,60 0,67 0,72
Punto debole del metodo UPGMA
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Studi di diversità genetica: elaborazione di dendrogrammi di distanzegenetiche intra ed interspecifiche
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Principali applicazioni: studi di mappatura genica
– Mappe fisiche: utili per la conoscenzadella sequenza nucleotidica del DNA
– Mappe Comparative: utili per lo studiodi regioni cromosomiche coinvolte nelcontrollo di geni di interesse agronomico;per lo studio di regioni regolatorie