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Métodos de Detecção de Mutações dos genes
B-RAF e C-KIT em Melanomas
Dra Isabela Werneck da Cunha, MD phD Divisão de Patologia Molecular
Departamento de Anatomia Patológica [email protected]
DNA
RNA
Proteínas
Funções celulares
Detecção das mutações • Detecção de proteínas alteradas, supressas ou super-
expressas – Imunoistoquímica
• Aumento ou diminuição do mRNA – RT-PCR
• Análise do DNA
– PCR – Real time PCR – Sequenciamentos – Hibridização in situ (se alterações no numero de cópias ou translocações
de genes inteiros)
O DNA – principais características
• Dupla-Fita
• Anti-Paralelas
• Complementares A T
C G
Códon Códon Códon Códon Códon
aminoácidos
4 nucleotídeos= 64 combinações diferentes de 3 em 3 (Temos 20 aminoácidos) Redundância: Vários códons codificam o mesmo aminoácido
• Mutações em Melanoma
– BRAF – NRAS – KIT
• Vias similares • Mutualmente
exclusivas • Diferentes tipos de
Melanoma
Lazar AJ & Murphy GF, Robbins and Cotran´s Pathologic Basis of Disease
Melanoma
•Diferentes vias moleculares
•Diferentes tratamentos
Subtipos de Melanoma
Mike Davies, MDACC CSD, Chronic sun-damaged
– GENE BRAF
– Gene da família das Kinases da via MAP kinase/ERKs
– Participa dos processos de divisão celular e diferenciação.
– A mutação leve a produção de uma proteína com atividade 10x maior que a selvagem, favorecendo proliferação celular, invasão, angiogênese e metástase.
Mutação do BRAF vista em 66% dos melanomas (Davies et al.2002)
– 97% das mutações envolvem o codon 600 (GTG>GAG)
(Valina>Ac.Glutâmico) (V600E)
– Associação com resposta (78%) a tratamento de melanoma
metastático com inibidores de BRAF (vemurafenib) (Eggermount et al 2011).
(JaKob J et al, Cancer 2012)
GENE BRAF
Targeted therapy for metastatic melanoma
Garnett MJ et al. Cancer Cell 2004;6:313–319; Wan PT et al. Cell 2004;116:855–887.
Zelboraf mode of action BRAF V600E
MEK
ERK
Arrested cell proliferation and survival
x Zelboraf
RAS-GTP
Growth factors
MAPK, Mitogen-activated protein kinase
BRAF
Normal cell proliferation and survival
MEK P
ERK P
Oncogenic BRAF signaling
BRAF V600E
Excessive cell proliferation and survival
MEK
ERK
P
P
– Gene da família das Proteínas Tirosino-Kinases
– Participa dos processos de divisão celular e diferenciação.
– A mutação leve a produção de uma proteína constantemente ativa,
favorecendo proliferação celular, invasão, angiogênese e metástase.
–
Cytogenetic Location: 4q11-q12 Molecular Location on chromosome 4: base pairs 55,524,094 to 55,606,880
GENE KIT
GENE KIT
GENE KIT
•Seleção dos casos •Extração do DNA •PCR de amplificação dos genes envolvidos •Real Time, sequenciamento, pirosequenciamento, análise de fragmentos, next sequencing generation, etc.....
•Análise dos dados
Pesquisa de Mutações
Mistura de células tumorais e estromais: Necessidade de microdissecção.
Heterogeneidade intratumoral. DNA mutado misturado com DNA selvagem: Desafio para detectar baixas taxas de mutação.
Fixação tecidual pode levar a dano do DNA. Tecido necrótico pode não ter DNA amplificado.
Tipo de fixação e outras impurezas como melanina podem interferir na amplificação do DNA
% tumoral % cópias mutantes
% DNA amplificado
Tipo de fixação
A grande maioria dos melanomas para testes moleculares estão emblocados em parafina
Adaptado
• PARA 1 litro • 100 ML DE FORMALDEIDO A 37% • 4,0 gramas de Fosfato de Sódio Monobásico NA H2 P04
H20 • 12,26 gramas de Fosfato de Sódio Bibasico Na2H PO4.7 H20 • 900 ml de Água destilada
• Acertar o PH = 7.2 a 7.4 com Hidróxido de Sódio NaOH=5 normal
Fixação do Material (formol tamponado a 10%)
FORMOL TAMPONADO A 10%
Formol tamponado 10%
Confirmação Diagnóstica (checagem do material enviado)
Seleção da amostra
• Microdissecção a laser
• Microdissecção manual /scrape
Tumor content study Correct detection of V600E mutations in specimens with at least
15% tumor content and/or mutation level >5%
Specimen Tumor content* % mutation Test result 1 5%/5% 3% Mutation not detected 4 10%/10% 4% Mutation not detected 5 10%/10% 14% Mutation not detected 8 15%/15% 3% Mutation detected 12 20%/20% 28% Mutation detected 14 20%/20% 2% Mutation detected 17 30%/25% 20% Mutation detected 22 35%/35% 7% Mutation detected
26 40%/35% 7% Mutation detected
31 40%/45% 36% Mutation detected
cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test. CE-IVD Package Insert. Roche Molecular Systems, Inc., USA. 2011.
*Tumor content for first and last of 12 adjacent 5µm sections from each specimen
Impacto da quantidade relativa de estroma na sensibilidade de detecção de mutação do gene
KRAS (Macedo MP 2012)
• Lâminas histológicas submetidos a análise de imagens para estimar a proporção de tumor em relação ao estroma
48% de células neoplásicas
Impacto da quantidade relativa de estroma na sensibilidade de detecção de mutação do gene KRAS
Extração do DNA
Inúmeros métodos Inúmeros kits
• Espectofotômetro • Mede quantidade e
qualidade do DNA obtido • Usar o DNA para realizar a
PCR.
PCR
• Polymerase Chain Reaction (reação em cadeia da polimerase)
• Amplificação do DNA (criação de múltiplas cópias)
• Consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA.
• Pode ser usada para amplificar todo o gene ou somente parte de um gene
595 596 597 598 599 600 601 602 603 ........
Área de interesse
DNA
PCR
Codon 600
Sequenciamento Gênico
• Determinar a ordem das bases nitrogenadas A G C T da molécula de DNA
• Métodos: • Sanger – conceito de sequenciamento por ``Chain termination´´
• Pirosequenciamento: sequenciamento por síntese • Next sequencing generation • Análise de fragmentos, etc • RT-PCR
Um Pouco de História.....
"for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids“
Nobel Prize in Chemistry - 1980
Frederick Sanger 1918-
Walter Gilbert 1932-
c.1780 G>A, pD594N
Pirossequenciamento
PPi ATP
Emissão de luz
Tempo
•Se baseia no conceito de liberação de pirofosfato após incorporação de cada nucleotídeo- conceito do sequenciamento por síntese •Mais sensível que Sanger •Quantitativo
cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test. CE-IVD Package Insert. Roche Molecular Systems, Inc., USA. 2011.
cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test Based on TaqMan® PCR
Probe and primer binding Polymerization Fluorescence TaqMan® probe
Fluorophore
Quencher Amplifica
tion Cleavage products
Forward PCR primer
Competitive landscape cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test – comparison to
other methods
Feature cobas® BRAF test1
therascreen BRAF RGQ2 kit
Direct sequencing
Next generation sequencing PCR-based LDT
% tumor required
≥50% Undefined Undefined Undefined Undefined
DNA input required
125 ng/25 μl requires PCR titration Undefined Undefined Undefined
Sensitivity ≤5% FFPET 1–5% in cell line ~20% ~1%–5% Undefined
Storage conditions
2 to 8°C -18°C to -25°C Variable Variable Variable
Control/result interpretation
Automated Manual Manual Manual Manual
Workflow <8 hours ~16 hours ~3 days ~5 days ~16 hours
IVD platform CE-IVD, FDA approved RUO RUO RUO RUO
1cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test. CE-IVD Package Insert. Roche Molecular Systems, Inc., USA. 2011; 2therascreen BRAF RGQ PCR Kit CE-IVD Handbook, Qiagen Manchester Ltd, UK, 2011.
LDT=Laboratory-developed test
• Imuno-histoquímica – VE1 – Anticorpo monoclonal anti-BRAF
V600E • Representa a sequência de aa da
mutação V600E • aa 596-606: GLATEKSRWSG
– Negativo em: • Gene tipo-selvagem • Outras mutações do BRAF
Assessment of BRAF V600E mutation status by immunohistochemistry with a mutation-specific
monoclonal antibody
David Capper • Matthias Preusser • Antje Habel • Felix Sahm • Ulrike Ackermann • Genevieve Schindler • Stefan Pusch • Gunhild
Mechtersheimer • Hanswalter Zentgraf • Andreas von Deimling
Acta Neuropathology (2011) 122:11–19
Immunohistochemical testing of BRAF V600E status in 1,120 tumor tissue samples of patients with brain metastases David Capper • Anna Sophie Berghoff • Manuel Magerle • Aysegu¨ l Ilhan • Adelheid Wo¨hrer • Monika Hackl • Josef Pichler • Stefan Pusch • Jochen Meyer • Antje Habel • Peter Petzelbauer • Peter Birner • Andreas von Deimling • Matthias Preusser Acta Neuropathology (2012) 123: 223 – 233
Em resumo
• Condições pré analíticas – Tamanho/Tipo da amostra – DNA degradado (descalcificação) – Fixação inadequada
• Métodos (sensibilidade X especificidade)
Taxa de resultados inconclusivos: 2 a 3 % (dados americanos)