BIOQUMICA HUMANA

2010

MTODOS DE DETERMINACIN DE PROTENAS TOTALES

PROTENAS PLASMTICAS

PROTEINOGRAMA

ELECTROFORESIS

WESTERN BLOT

MTODOS DE DETERMINACIN DE PROTENAS TOTALES Los mtodos para medir la concentracin de protenas totales (PT) pueden clasificarse en: 1. Fsicos:

absorbancia del enlace peptdico a 190 nm: se basa en la propiedad que tiene el enlace peptdico de absorber a esa longitud de onda.

absorbancia de los aminocidos aromticos a 280 nm: su principal limitacin es que no todas las protenas tienen la misma proporcin de estos aminocidos, lo que le resta exactitud.

refractometra: mtodo de eleccin, pero hoy en da en la prctica clnica se est dejando de usar.

2. Qumicos: reaccin de Kjeldahl: considerado histricamente como el mtodo referencia. mtodo de Lowry: se basa en la reduccin del reactivo de Folin-Ciocalteau

provocada por el complejo unin peptdico-Cu2+ en medio alcalino con la participacin de restos fenlicos (tirosilos).

reaccin de Biuret: se fundamenta en la formacin de un complejo, en medio alcalino, entre el Cu2+ y los enlaces peptdicos (absorcin a 540 nm). En la prctica clnica, es una de las metodologas ms usada para el dosaje de PT.

mtodos turbidimtricos (precipitacin con cido tricloroactico-TCA o sulfosaliclico)

mtodo de Bradford En el Trabajo Prctico se determinar la concentracin de protenas por el Mtodo de Bradford. Fundamento: es una tcnica sensible que consiste en la medicin de la extincin provocada por el cambio en el espectro visible de un colorante (Coomasie Blue G-250) cuando ste se une a las protenas (absorbiendo as a 595 nm). Esta unin se realiza a travs de grupos ionizados y se comprueba proporcionalidad con la concentracin de protenas contenidas en la muestra. La determinacin del contenido proteico de una muestra requiere la comparacin del valor de absorbancia de la muestra con los obtenidos a partir de cantidades conocidas de protenas, con los que se construye una curva de calibracin: a mayor cantidad de protenas, mayor color desarrollado y por lo tanto, mayor absorbancia. Recordar que esta proporcionalidad es slo lineal hasta un cierto lmite de concentracin. Para construir la curva de calibracin se requiere contar con un solucin testigo de protena de concentracin conocida (generalmente se utiliza albmina srica bovina o inmunoglobulina G). Se preparan por lo menos 4 tubos testigos con distintas cantidades de protenas (T1, T2, T3 y T4) y otro tubo denominado blanco (en el cual el volumen de la solucin de protenas se reemplaza por agua). En forma simultnea, se procesan las muestras incgnitas. Luego se agrega la misma cantidad del reactivo de Bradford a cada tubo (dado que en definitiva se compara el color desarrollado evidenciado por la absorbancia de la solucin en cada tubo, sus volmenes finales deben ser iguales).

Protocolo ejemplo de determinacin de protenas por el mtodo de Bradford: Una vez preparados los tubos, se lee la absorbancia de cada uno de ellos a la

longitud de onda de 595 nm. La absorbancia obtenida en el tubo blanco debe ser restada a cada uno de los tubos restantes. Una opcin es calibrar el equipo con el tubo blanco: esto consiste en asignar a la absorbancia del blanco, una lectura igual a cero. De esta manera, automticamente esta lectura es restada por el fotocolormetro a todas las muestras posteriormente ledas en el equipo. Los resultados obtenidos se vuelcan en una tabla como la que sigue.

Con las absorbancias de los tubos testigos obtenidas en el fotocolormetro, se construye el grfico de Absorbancia a 595 nm en funcin de la cantidad de protena (mg). En el ejemplo, los tubos conteniendo testigos 4 y 5 muestran una desviacin de la zona lineal de cumplimiento de la Ley de Lambert- Beer, motivo por el cual no se consideran al trazar la recta promedio.

Para determinar la concentracin de protenas en la muestra (X), se interpolan en

la curva de calibracin las absorbancia/s correspondientes a el/los tubo/s que contenan la muestra. As, sabiendo la cantidad de protena (X) contenida en el volumen de muestra utilizado en la medicin, puede calcularse la concentracin proteica.

PROTENAS PLASMTICAS Como se mencion previamente, el plasma sanguneo es una solucin muy

compleja que contienen un gran nmero de protenas. Las protenas se encuentran en el plasma humano en una concentracin media de 7.2 g/100 ml y representa la mayor parte de los slidos del mismo. Entre las funciones principales que cumplen las protenas plasmticas se encuentran el mantenimiento de la volemia, actuando como factor regulador del intercambio de lquido entre la sangre circulante y el espacio intersticial. La albmina es responsable de ms del 70% de la presin onctica del plasma. Otra de las funciones importantes se relaciona con su capacidad de amortiguar el pH, ya que las protenas del plasma ejercen accin buffer debido a los restos histidina, que pueden ceder o aceptar protones, regulando el pH normal sanguneo. Entre otras funciones de

importancia se encuentran el transporte de sustancias endgenas como hormonas, cidos grasos, iones, etc.; transporte de sustancias exgenas como antibiticos y drogas; participacin en eventos de coagulacin, fibrinolisis y de inmunidad donde se incluyen inmunoglobulinas y el sistema del complemento.

La tcnica ms comn para separacin de protenas del suero es la electroforesis (conocida como proteinograma electrofortico). Este mtodo est basado en el principio de que cuando una corriente es aplicada a un medio que contenga partculas cargadas, aquellas partculas con una carga negativa migrarn hacia el electrodo positivo y aquellas partculas con una carga positiva migrarn hacia el electrodo negativo. La matriz del soporte es el medio a travs del cual las protenas migran durante el proceso electrofortico. Los medios de soporte pueden ser de varios tipos. Los medios utilizados pueden separar protenas en base a la carga molecular solamente, o en base tanto a la carga molecular como al tamao. En el caso del proteinograma electrofortico, las protenas migran en funcin de la carga, independientemente de su tamao. Para ello, el soporte comnmente usado puede ser agarosa o acetato de celulosa. Las protenas pueden tener una carga positiva o negativa, o no estar cargadas, dependiendo del pH del buffer de corrida, que generalmente es 8,6. A este pH, la mayora de las protenas del plasma adquieren una carga negativa. Una vez separadas, las bandas de protenas individuales son visualizadas por el uso de un colorante que tie las diferentes protenas. Los colorantes usados incluyen: negro de amida, Ponceau S, y azul brillante de Coomassie. Los colorantes tienen diferentes afinidades para las diversas protenas y se comportan en forma diferente con respecto al medio de soporte que ha sido usado para la separacin de protenas. Utilizando la tcnica de separacin de protenas por electroforesis con acetato de celulosa como soporte, se pueden separar protenas sricas en 6 bandas principales: prealbmina y albmina (por ser la molcula ms pequea y tener el mayor nmero de grupos cargados negativamente migra con mayor rapidez) seguida por las globulinas (1, (2, ( y (, en ese orden. A su vez, si el soporte utilizado es agarosa, se puede separar ( en (1 y (2.

Dado que es una tcnica semicuantitativa, suele realizarse una densitometra para estimar la cantidad de protena contenida en cada banda.

Bandas principales del proteinograma:

1. Pre-albmina: valor normal: 0,3 g/100 ml, incluye a la transtiretrina. la visualizacin depende de que todas las condiciones tcnicas sean las ptimas. su disminucin es un marcador sensible del estado nutricional o reaccin

inflamatoria. la presencia de esta banda no se informa.

2. Albmina: valor normal: 3,5-5,0 g/100 ml. es la protena ms pequea y con mayor nmero de grupos cargados

negativamente; esta caracterstica le permite migrar con mayor rapidez. constituye una banda homognea, puesto que se trata de una nica protena, acta

como trasportador activo de diferentes compuestos tales como cidos grasos, pigmentos biliares, hormonas esteroides, frmacos y otros.

es un reactante de fase aguda negativo, por lo que en estados infecciosos agudos est disminuida.

estados asociados con hipoalbuminemia: estados de malnutricin o malabsorcin, enfermedad heptica severa (por fallas en su sntesis) o aumento de su catabolismo, no se conoce un estado patolgico con hiperalbuminemia.

3. 1-globulina: valor normal: 0,1-0,3 g/100 ml. banda formada principalmente por: 1-antitripsina (mayoritaria), glucoprotena

cida 1 u orososeromucoide, transcortina y globulina fijadora de tirosina. un aumento o disminucin de esta banda se debe a un aumento o disminucin de

1-antitripsina (predomina en la fraccin 1) - 1-antitripsina:

cumple con el 90% de la accin antiprotesica del organismo; es el inhibidor biolgico de las enzimas proteolticas de los lisosomas). Es un reactante de fase aguda positivo.

-aumento de 1-antitripsina: estrs, reactante de fase aguda, tumores; disminucin de 1-antitripsina: estados de malnutricin/malabsorcin, enfermedad

heptica severa, o aumento de su catabolismo (procesos relacionados con la disminucin de cualquier protena).

- glucoprotena cida 1: inhibe o inactiva a la progesterona, es un reactante de fase aguda positivo. - transcortina: transporta 2/3 del cortisol y otros corticoides. El cortisol circulante se une tambin (minoritariamente) a la albmina. La transcortina se sintetiza en el hgado. - protena fijadora de tiroxina: une T3 (triyodotironina) y T4 (tiroxina). Las hormonas tiroideas circulantes se unen tambin a la prealbmina.

tanto la transcortina como la protena fijadora de tirosina aumentan en el embarazo y tras la administracin de estrgenos.

4. 2-globulina: es una fraccin heterognea, valor normal: 0,5-0,75 g/100 ml. est integrada por: haptoglobina, 2-macroglobulina y ceruloplasmina.

- haptoglobina: su funcin es captar hemoglobina (Hb): La formacin del complejo Hb-haptoglobina

impide que la pequea cantidad de Hb liberada por hemlisis normal intravascular sea excretada por orina, evitando as el efecto txico de la Hb libre y la prdida de Fe.

es un reactante de fase aguda positivo, (aumenta en estados infecciosos agudos).

su disminucin se asocia a cualquier estado patolgico que curse con hemlisis intravascular debido a un aumento de su consumo (anemia hemoltica, etc).

- 2-macroglobulina: est aumentada fisiolgicamente en el embarazo y en nios (dada su funcin

relacionada con el desarrollo). - ceruloplasmina:

participa en el metabolismo del hierro y el Cu++, ya que una molcula puede fijar hasta 8 tomos de Cu++, es un reactante de fase aguda positivo, y aumenta en tumores y leucemias.

la deficiencia congnita de ceruloplasmina desarrolla la enfermedad de Wilson. 5. -globulinas:

valor normal: 0,6-1,1 g/100 ml 1-globulina: incluye a la transferrina y la hemopexina. 2-globulina: incluye a C3

- transferrina: es una protena que fija Fe (cada molcula puede fijar 2 Fe). es un reactante de fase aguda negativo, pero adems siempre que disminuya la

albmina, disminuye 1 (excepto en el embarazo) por disminucin de la transferrina.

en procesos con dficit de Fe (por estimulacin de la sntesis de su protena transportadora) aumenta sus niveles, al igual que en el embarazo;

- Hemopexina: fija y transporta al grupo hemo liberado de la Hb en la hemlisis, cuando est

saturada su capacidad de captacin por la haptoglobina. - C3:

participa del sistema del complemento. un reactante de fase aguda positivo y disminuye (adems de las situaciones

generales) y en enfermedades autoinmunes (LES, AR). 6. -globulinas:

es una zona heterognea si la muestra es plasma, aparece en esta regin (post-2 o g-rpida) una banda

homognea que corresponde al fibringeno (0,3 g/100 ml), esto constituye una interferencia y debe pedirse nueva muestra (suero);

est constituido mayoritariamente por inmunoglobulinas (sin embargo es importante recordar en la bsqueda de algn componente monoclonal que stas protenas pueden migrar desde 2 hasta el punto de siembra), incluye:

- IgG: monmero de 160 kDa, se reconocen 4 subclases, es la mayoritaria, puede atravesar la placenta y es la principal inmunoglobulina en la respuesta inmune secundaria; - IgA: se puede encontrar como monmero, dmero o trmero, media la inmunidad de mucosas; - IgM: es una inmunoglobulina pentamrica, asimtrica, de PM hasta 1000 kDa, no atraviesa la placenta y es la inmunoglobulina que media la respuesta inmune primaria; - IgD: es una inmunoglobulina de superficie, neutralizante, con PM de 200 kDa; - IgE: tiene un PM promedio de 200 kDa, est asociada a estados de alergia.

Algunas patologas que producen alteraciones en el proteinograma electrofortico -CIRROSIS HEPTICA: Es una enfermedad crnica caracterizada por fibrosis y la formacin de ndulos que distorsionan la arquitectura del hgado, con la consiguiente alteracin de su funcin. Se observa una elevacin heterognea de la banda de las -globulinas y una fusin o puente -. Las fracciones de albmina y -globulinas estn disminuidas.

-INFECCIN AGUDA: Esta disproteinemia consiste en un aumento de la fraccin 2 (mucoprotenas). El fibringeno tambin est aumentado, siendo sta la causa de la eritrosedimentacin elevada. -MIELOMA MLTIPLE: Es un tumor maligno de las clulas plasmticas en el que ocurre una produccin excesiva de clases especficas de inmunoglobulinas. El proteinograma se caracteriza por una elevacin estrecha y homognea de la fraccin de las -globulinas. En algunos mielomas aparecen en la circulacin cadenas cortas o fragmentos de cadenas largas de inmunoglobulinas anmalas que filtran por el rin con facilidad debido a su bajo peso molecular, constituyendo en orina la llamada protena de Bence-Jones. -INFECCIN CRNICA: Se observa un aumento de la fraccin de las -globulinas de tipo heterogneo. En este cuadro se encuentran elevadas todas las inmunoglobulinas del suero. -SINDROME NEFRTICO: Es una enfermedad renal caracterizada por albuminuria, edemas, hipoalbuminemia e hiperlipemia. En este caso es caracterstico un incremento de las 2-globulinas y un marcado descenso de la albmina. Se observa igualmente un descenso marcado de las -globulinas.

ELECTROFORESIS

Introduccin y tcnica bsica Las protenas suelen tener carga neta; por lo tanto, si se aplica un campo elctrico

a una solucin que contenga una mezcla de protenas, stas migrarn a una velocidad que depender de su carga neta, forma y peso molecular. Esta tcnica es conocida como electroforesis. Las separaciones electroforticas se realizan casi siempre en soportes slidos, generalmente para separar una mezcla de protenas, el soporte de eleccin son los geles de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida son qumicamente inertes y se preparan fcilmente por polimerizacin de monmeros de acrilamida. El polmero forma una red porosa que acta como un tamiz que potencia la separacin de las molculas. La electroforesis de protenas en geles con una matriz de poliacrilamida, comnmente denominada electroforesis en poliacrilamida (PAGE, 'polyacrilamide gel electrophoresis') es sin duda alguna, una de las tcnicas ms ampliamente usada para caracterizar mezclas complejas de protenas. La electroforesis en poliacrilamida es un mtodo conveniente, rpido y econmico pues se requieren slo cantidades del orden de microgramos de protena. En funcin del estado de las protenas (nativo o desnaturalizado) a lo largo del proceso electrofortico, stas se clasifican en electroforesis nativas o desnaturalizantes.

una electroforesis desnaturalizante, la electroforesis que se realiza en forma ms frecuente, es la que somete a las protenas a migracin asegurando la completa desnaturalizacin (prdida de la estructura tridimensional). En esta situacin, la migracin es proporcional a la carga y al tamao de la molcula pero no a su forma. El agente desnaturalizante ms empleado es el sodiododecilsulfato o SDS, un detergente.

una electroforesis nativa es aquella en la que se somete a las protenas a migracin sin desnaturalizacin. En esta situacin, las protenas migran en funcin de su carga, de su tamao y de su forma.

Algunas caractersticas destacables de la electroforesis en geles de poliacrilamida son: Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizacin de la acrilamida por

accin de un agente entrecruzador ('cross-linking'), la bisacrilamida. Las proporciones relativas de poliacrilamida y bis-acrilamida determinan la

porosidad del gel El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina el rango de separacin del

gel. Habitualmente los geles se denominan en funcin del porcentaje de acrilamida/bisacrilamida que contienen. As, la mayora de las protenas se separan bien en el rango de 5 a 10%. Un porcentaje menor (mayor tamao de poro) es mejor para separar protenas de gran tamao.

SDS-PAGE SDS-PAGE es la electroforesis de protenas ms ampliamente usada. Su nombre

indica que la electroforesis en geles de poliacrilamida se realiza en presencia de SDS ('SDS-polyacrilamide gel electrophoresis').. La mezcla de protenas se disuelve primero en un medio con dodecilsulfato de sodio (SDS), un detergente inico que se una a las protenas y es capaz de romper todas las interacciones no covalentes de las protenas y en un agente reductor de puentes disulfuro como pueden ser el ditiotreitol (DTT) o el -mercaptoetanol. De esta manera, las protenas se desnaturalizan y son separadas en sus polipptidos constitutivos (en caso de tener estructura cuaternaria) El SDS es un detergente desnaturalizante que se une a las cadenas polipeptdicas desnaturalizadas con una relacin constante de SDS por g de protena, unindose

aproximadamente una molcula de SDS por cada dos aminocidos de la cadena. Esta unin masiva de molculas de SDS bloquea la carga propia de la protena y le confiere al complejo una carga neta negativa proporcional a su masa, haciendo que todas las protenas complejadas con SDS migren hacia el nodo.

En estas condiciones todas las molculas tienen la misma forma, en tanto que su carga es proporcional a su tamao.Por lo tanto, la separacin de las protenas en un campo elctrico ya no ser dependiente de estos dos factores. Sin embargo, al estar migrando dentro de una red porosa, las protenas de menor peso molecular se desplazaran ms fcil y rpido, en tanto que las de mayor peso molecular quedarn ms retrasadas. En consecuencia la separacin de los complejos SDS-protena es proporcional slo al tamao de la protena.

Las protenas mayoritarias (en el orden de los g) se detectan tiendo el gel con un colorante, como el azul de Coomasie, mientras que las protenas minoritarias se visualizan tindolas con sales de plata (en el orden de los ng). Se puede entonces determinar el peso molecular aparente de cualquier protena por comparacin con un patrn de protenas de pesos moleculares conocidos. Las movilidades de las protenas en los geles de SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo de su peso molecular. Esta tcnica permite estimar el peso molecular (PM) de una protena, comparando su movilidad electrofortica con la de protenas de PM conocido. Estas determinaciones poseen un margen de error de ~10%. La determinacin del PM de protenas mediante la separacin en geles de poliacrilamida con SDS es vlida cuando se analizan cadenas proteicas individuales (subunidades), en donde se han reducido todos los enlaces disulfuro y por ende, se ha distendido toda la cadena proteica para su interaccin con el SDS. La movilidad electrofortica relativa (Rf) es inversamente proporcional al logaritmo del PM. Trazando un grfico con estndares de PM conocido, se obtiene una lnea de referencia en la cual se puede interpolar muestras de PM desconocido. El Rf se calcula dividiendo la distancia (mm) recorrida por la banda en cuestin, entre la distancia recorrida por el colorante azul de bromofenol (frente de corrida) o el largo del gel.

WESTERN BLOT Mtodos de transferencia a filtros Introduccin

La transferencia de protenas o 'blotting' supone la inmovilizacin de las protenas sobre membranas sintticas, seguido de la deteccin, empleando sistemas especialmente diseados para la tincin de 'blots'. El mtodo ms potente es el denominado 'Western blot' en el que las protenas son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y posteriormente se transfieren a una membrana mediante la aplicacin de un campo elctrico perpendicular al gel. El procedimiento es anlogo al desarrollado por el Prof. E. Southern para la separacin de fragmentos de ADN ('Southern blotting') y por ello se le denomin 'Western'. Trabajar con las protenas fijadas sobre una membrana tiene diversas ventajas:

1) Son ms rpidas de teir y desteir; 2) se detectan cantidades menores de protenas, pues se concentran en la superficie

y no se diluyen en todo el espesor del gel; 3) las membranas son mucho ms fciles de manipular que el propio gel. 4) Los anticuerpos utilizados tienen mejor acceso a las protenas.

El procedimiento de 'blotting' consta de 5 etapas: 1- Inmovilizacin de protenas sobre la membrana, generalmente mediante electrotransferencia. En este mtodo, las protenas son transferidas electroforticamente desde el gel a la membrana. Se construye lo que se conoce como sndwich, donde se apilan sucesivamente una esponja plana, papel absorbente, el gel, la membrana sinttica, ms papel y finalmente otra esponja plana. Todo este conjunto debe estar embebido en una solucin buffer de transferencia (para obtener una solucin de continuidad que permita la conduccin de la corriente elctrica), se introduce en un tanque con la misma solucin buffer (de transferencia) y dos electrodos planos. Se dispone de forma tal que el gel quede hacia el nodo (-) y la membrana hacia el ctodo (+). Se aplica una diferencia de potencial y debido a que la carga neta de las protenas en el caso de los geles de SDS-PAGE es negativa, stas migrarn desde el gel hacia la membrana donde quedarn retenidas.

Una vez realizada la transferencia, la membrana se puede analizar inmediatamente o bien conservarla en fro (2 a 8C) durante meses. Es importante incorporar en el gel a transferir un control de la transferencia que habitualmente es el propio carril donde se han cargado los marcadores de peso molecular, que al transferirlos se tien sobre el filtro para ver si la transferencia ha sido correcta. Habitualmente se emplean tcnicas de tincin de protenas sobre el filtro, como control de la transferencia. Existen diferentes mtodos para teir todas las protenas presentes en el filtro, pero la tincin de eleccin ms frecuente es con el colorante Rojo Ponceau. ste se une rpida y reversiblemente a las protenas, por los tanto no es permanente. Por lo tanto, puede eliminarse para continuar con la tcnica de Western blot.

2- Saturacin de todos los lugares de unin de protenas de la membrana no ocupados para evitar la unin no especfica de anticuerpos.

Una etapa comn a todos los procedimientos de inmunodeteccin es lo que comnmente se denomina 'bloqueo de la membrana', para prevenir la unin no especfica a la membrana del sistema de deteccin, con el riesgo asociado de tener un elevado 'background' o falsos positivos. Se han descrito numerosas soluciones bloqueantes, y todas ellas son efectivas. Las dos soluciones de bloqueo que son compatibles con casi cualquier sistema de deteccin, son las soluciones de leche desnatada y las soluciones de albmina srica bovina (BSA). La membrana se incuba durante un determinado tiempo en esta solucin y se contina con el protocolo de deteccin. 3- Incubacin del 'blot' con anticuerpos primarios contra la/s protena/s de inters. El tipo de anticuerpos empleado en la deteccin de las protenas transferidas a filtro no es determinante. Existen tanto anticuerpos policlonales como monoclonales con alta especificidad y sensibilidad. Sin embargo, los monoclonales se pueden obtener en mayor cantidad y mantienen siempre sus propiedades de reconocimiento independientemente del lote, pero son mucho ms costosos. Se prepara una dilucin del anticuerpo primario en una solucin que posee la misma composicin que la solucin de bloqueo. Se incuba la membrana durante un perodo determinado (las condiciones pueden ser variables y deben ajustarse segn la protena en estudio, se pueden modificar la temperatura de incubacin, la dilucin de la solucin del anticuerpo, tambin se puede realizar con o sin agitacin). 4- Incubacin del 'blot' con anticuerpos secundarios, o reactivos que actan de ligando para el anticuerpo primario unido a enzimas u otros marcadores. Como anticuerpos secundarios se suelen emplear anticuerpos que reconocen a las inmunoglobulinas (o sea, el anticuerpo primario). Estos anticuerpos tienen unidos en forma covalente una enzima o un tomo radioactivo, que ser utilizado para evidenciar la presencia de la protena a identificar. Nuevamente se prepara una dilucin del anticuerpo secundario en la solucin de bloqueo

y se incuba la membrana por un determinado tiempo. Observacin: luego de la incubacin con el anticuerpo primario y con el anticuerpo secundario se debe someter a la membrana a exhaustivos lavados para eliminar el excedente que no se uni a la misma. 5-Sistema de revelado de las bandas de protenas marcadas con el complejo de anticuerpos. Existen dos grandes grupos de marcadores o sistemas de revelado empleados en 'Western blotting'

1. enzimas que estn unidas covalentemente al anticuerpo secundario. Las mismas catalizan una reaccin en la que se forma un precipitado coloreado, o en la que se emite luz. La peroxidasa de rbano (HRP) y la fosfatasa alcalina, se emplean con gran frecuencia. Se dispone de sustratos, para ambas enzimas que forman precipitados coloreados sobre la membrana as como de sustratos quimioluminiscentes (emiten luz) que permiten obtener una banda en una placa radiogrfica (ver ambos esquemas).

2. radioqumicos, que emiten radiaciones ionizantes. El revelado se realiza mediante exposicin de la membrana ante una pelcula radiogrfica.