metodos de estudio y control de los microorg
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MÉTODOS DE ESTUDIO Y CONTROL
DE LOS
MICROORGANISMOS
MÉTODOS DE ESTUDIO Y CONTROL
DE LOS
MICROORGANISMOS
Dra. M. E. Arias FernándezDpto. Microbiología y Parasitología
E-mail: [email protected]
• Métodos de observación de los microorganismos� El microscopio. Tipos de microscopios. Preparación y examen
de muestras. Tipos de tinciones.
• Métodos de aislamiento de los microorganismos
• Crecimiento de los microorganismos:� Nutrición microbiana: requerimientos nutritivos� Cultivo de los microorganismos: medios de cultivo� Crecimiento microbiano: curva de crecimiento� Determinación del crecimiento.� Influencia de los factores ambientales sobre el crecimiento� Microorganismos extremófilos
• Control de poblaciones microbianas:� Métodos físicos: Esterilización y otros métodos� Métodos químicos: desinfectantes, antisépticos y
esterilizantes� Agentes antimicrobianos: antibióticos y quimioterapéuticos de
síntesis
PROGRAMAPROGRAMA
MÉTODOS DE OBSERVACIÓN DE LOS
MICROORGANISMOS
MÉTODOS DE OBSERVACIÓN DE LOS
MICROORGANISMOS
MICROORGANISMOSMICROORGANISMOS
PROTOZOOS
ALGAS
HONGOS VIRUS
BACTERIAS
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
MICROSCOPIO ÓPTICO
RANGO DE TAMAÑO DE LOS MICROORGANISMOS
VIRUS BACTERIAS
SUBVIRICAS
EUCARIOTAS
1 nm 10 102 103 104 105 106
1 µm 1 mm
TIPOS DE MICROSCOPIOSTIPOS DE MICROSCOPIOS
• Microscopio óptico:� Microscopio de campo claro� Microscopio de campo oscuro� Microscopio de contraste de fases� Microscopio de fluorescencia� Microscopio de láser confocal
• Microscopio electrónico:� De barrido� De transmisión
• Microscopio de fuerza atómica (AFM)
EL MICROSCOPIO ÓPTICOEL MICROSCOPIO ÓPTICO
CAMPO OSCURO CONTRASTE DE FASES
CAMPO CLARO FLUORESCENCIA CONFOCAL
EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICOEL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO (SEM)
Haz de electrones que atraviesa cortes ultrafinos de una muestra
Haz de electrones que “barre” la superficie de un objeto sólido
Resolución: < 7nm
Resolución: 5 Å
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN (TEM)
Microscopio de efecto túnelMicroscopio de fuerza atómica
Manipulandoátomos...
Obtiene imágenes con resolución de menos de 1 nm
Observación de una espora de Aspergillus oryzae atrapada en un poro con microscopio de fuerza atómica
TIPOS DE TINCIONESTIPOS DE TINCIONES
TINCIÓN SIMPLETINCIÓN SIMPLE
TINCIÓN DIFERENCIALTINCIÓN DIFERENCIALTINCIÓN DE GRAM TINCIÓN DE Ziehl-Neelsen
TINCIONES ESPECÍFICASTINCIONES ESPECÍFICAS
TINCIÓN DE CÁPSULA TINCIÓN DE FLAGELOS TINCIÓN DE ESPORAS
MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE
LOS MICROORGANISMOS
MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE
LOS MICROORGANISMOS
MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROSMÉTODOS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS
• Siembra por estría en placa Petri• Vertido en placa• Extensión en placa:
- Diluciones seriadas- Asa de Digralsky
SIEMBRA POR ESTRÍA EN PLACA DE PETRI
MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROSMÉTODOS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS
DILUCIONES SERIADAS
Extensión en placa Vertido en placa
MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROSMÉTODOS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS
MEDIOS DE CULTIVOMEDIOS DE CULTIVO
� Medios definidos
� Medios complejos
� Medios selectivos
� Medios diferenciales
� Medios selectivos y diferenciales
� Medios de enriquecimiento
COMPOSICIÓN DE UN MEDIO DEFINIDO Y UN MEDIO COMPLEJO
• Medio definido
� Glucosa…………. 10 g� (NH4)2SO4…………. 2 g� CaCl2 ……….......0,01 g� FeSO4.7H2O…..0,005 g� MgSO4.7H2O…..0,02 g� Agua destilada…… 1 L� Agar……………… 15 g
• Medio complejo: caldo nutritivo
�Peptona…………… 5 g
�Extracto de carne.. 3 g
�NaCl…………………8 g
�Agua destilada…….1 L
MEDIOS DE CULTIVOMEDIOS DE CULTIVO
MEDIOS DE CULTIVOMEDIOS DE CULTIVO
Medios selectivos y diferenciales
Medios de enriquecimiento
Agar Entéricode Hektoen
Agar Baird-Parker
Agar Levine(EMB) Agar Wilson-Blair
Caldo Giolitti-CantoniCaldo Müller-Kauffmann
(Enterobacterias patógenas) (Estafilococos) (Coliformes) (Salmonella)
(Estafilococos)(Salmonella)
CRECIMIENTO Y CONTROL DE
LOS MICROORGANISMOS
CRECIMIENTO Y CONTROL DE
LOS MICROORGANISMOS
NUTRICIÓN MICROBIANA: REQUERIMIENTOS NUTRITIVOSNUTRICIÓN MICROBIANA: REQUERIMIENTOS NUTRITIVOS�Fuente de carbono:
- CO2: Autótrofos
- Compuestos orgánicos: heterótrofos
�Fuente de energía: generación de ATP y poder reductor
- Luz: fototrofos
- Compuestos químicos: quimiotrofos
- compuestos orgánicos: quimioorganotrofos
- compuestos inorgánicos: quimiolitotrofos
�Tipos nutricionales de los microorganismos:
� Fotoautótrofos
� Fotoheterótrofos
� Quimiolitotrofos autótrofos
� Quimiolitotrofos heterótrofos: mixotrofos
� Quimioorganotrofos heterótrofos (quimioheterótrofos)
CADENA METABÓLICA: ETAPASCADENA METABÓLICA: ETAPAS
1- ENTRADA DE NUTRIENTES
CADENA METABÓLICA: ETAPASCADENA METABÓLICA: ETAPAS
2- REACCIONES CATABÓLICAS
CADENA METABÓLICA: ETAPASCADENA METABÓLICA: ETAPAS
3- BIOSÍNTESIS
CADENA METABÓLICA: ETAPASCADENA METABÓLICA: ETAPAS
4- POLIMERIZACIÓN
CADENA METABÓLICA: ETAPASCADENA METABÓLICA: ETAPAS
5- ENSAMBLAJE
FUENTE DE NITRÓGENO
� Inorgánica:
- NH4+
- NO3-
- N2
� Compuestos orgánicos nitrogenados:- aminoácidos- bases nitrogenadas, etc.
(Bacillus, Pseudomonas)
(Nitrosomonas, Nitrobacter)
(Azotobacter, Cianobacterias)
(Clostridium, fototrofas rojas y verdes)
OTROS REQUERIMIENTOS NUTRICIONALESOTROS REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES
� Fósforo: Fosfato
� Azufre:
- SO4 2-
- SH2
- Compuestos
orgánicos azufrados
� K, Mg, Na, Ca, Fe, etc.
� Micronutrientes: Cr, Co, Cu, Mn, Mo, etc.
� Factores de crecimiento: vitaminas, aminoácidos, purinas, pirimidinas, etc.
(Thiobacillus, Beggiatoa,Foto-trofos erobios)
(B. Fototróficasrojas y verdes)
(Desulfovibrio, Desulfobacter)
(Desulfuromonas,
Archaea term.)
CRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONESCRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONES
• División celular en procariotas
Fisión binaria
El tiempo para completar el ciclo depende de factores
nutricionales y genéticos
1. Contraste de fases
2. Tinción de nucleoide
3. Tinción del anillo FtsZ
4. Tinción de nucleoide y anillo
1
2
3
4
CRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONESCRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONES
• Crecimiento de poblaciones- Velocidad de crecimiento
- Tiempo de generación
- Expresión del crecimiento
Datos de una población que se
duplica cada 30 minutos
Crecimiento exponencial de un cultivo bacteriano que se inicia con una sola célula y que tiene un tiempo de generación de 30 min:
Datos representados
en distintas escalas
CRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONESCRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONES
• Curva de crecimiento: sus fases
DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTODETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO
RECUENTO DIRECTO AL MICROSCOPIO
TURBIDIMETRÍA
RECUENTO DE VIABLESDETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTODETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO
EFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTOEFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO
• Temperatura
Desnaturalización de Proteínas;
Colapso de la membrana; citoplasmática; lisis térmica
Gelificación de membrana; proceso de transporte demasiado lento para soportar el crecimiento
Tasa d
e C
recim
iento
Reacciones enzimáticas a la máxima velocidad posible
Reacciones enzimáticas incrementando sus velocidades de reacción
Temperatura mínima y óptima
EFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTOEFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO
• TemperaturaTipos de microorganismos según su temperatura óptima
Mesófilos
Termófilos
Psicrófilos
Hipertermófilos Hipertermófilos
EFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTOEFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO
Salinidad
�Halófilo: discretos (1-6 %) y moderados (6-15 %) de NaCl
� Halotolerante: crecen en amplio rango de actividad de agua
�Halófilos extremos: 17-36 % NaCl
Aer
ob
ios
An
aero
bio
s
Fac
ult
ativ
os
Mic
roae
rófi
los
An
aero
bio
s ae
roto
lera
nte
sTipos de microorganismos en relación
con el oxígeno
Medio con tioglicolato y
resazurina
Medio con tioglicolatoy resazurina
CULTIVO DE ANAEROBIOS
Catalizador (Pd)
H2
2H2+O2 2H2O
Radicales tóxicos del oxígeno
Enzimas que destruyen radicales tóxicos del O2
Pyrococcus furiosus
MÉTODOS DE CONTROL MICROBIANO: TERMINOLOGÍAMÉTODOS DE CONTROL MICROBIANO: TERMINOLOGÍA
� Esterilización: destrucción total de formas vivas/material inerte
� Desinfección: destrucción/inhibición de agentes infecciosos en estado vegetativo en material inerte desinfectantes
� Antisepsia: destrucción/inhibición de agentes infecciosos en estado vegetativo en la superficie de tejidos vivos antisépticos
� Saneamiento: reducción población microbiana en material inerte o tejidos vivos hasta niveles seguros limpieza mecánica/productos
� Quimioterapia: control crecimiento microbiano dentro de un hospedador agentes quimioterapéuticos antimicrobianos
CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
• Métodos físicos: esterilización por calor
� Calor seco
� Horno Pasteur (170°C/ 1-2h)
� Flameado (incineración)
CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
� Vapor de agua a presión: el autoclave (121°C/ 20min)
� Hervido (100°C)
� Calor húmedo
� Tindalización (100°C)
� Esterilización a temperatura ultraelevada (UHT)
• Métodos físicos: esterilización por calor
� Pasteurización: Reducción de
población microbiana y alargamiento vida útil
HTST: 71-72°Cdurante 15 seg.
CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
Métodos físicos: esterilización por filtración
� Filtración de soluciones termosensibles
� Filtración del aire:� Algodones en los tubos de vidrio, mascarillas� Filtro de alta eficacia de retención de partículas (HEPA)
� Cabinas de seguridad biológica de flujo laminar� Habitaciones especiales de hospitales (inmunosuprimidos)
CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
Métodos físicos: esterilización por radiación
� Depende de la energía (λ), intensidad y duración
� Radiaciones utilizadas: � IONIZANTES (λ < 200nm)
� Rayos γ (60Co y 137Cs)� Rayos de electrones� Rayos X
� NO IONIZANTES (λ > 200nm)� Luz UV (λ = 260nm)� Microondas
Suministros quirúrgicos, medicamentos, materiales de
laboratorio, industria alimentos, productos cárnicos
Desinfección de superficies, aire, etc.
CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
� Control por bajas temperaturas� Congelación� Refrigeración (0-5°C)
Métodos físicos: otros métodos
� Desecación� Evaporación (Industria alimentaria)
� Liofilización (conservar cultivos, hemoderivados, etc)
� Soluciones hipertónicas (salazón, miel, mermeladas, etc)
CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
• Métodos químicosPropiedades de los agentes químicos:
1. Inocuo para las personas y no corrosivo para materiales2. Amplio espectro3. Eficaz a diluciones altas y en presencia de materia orgánica4. Soluble en agua5. Estable, inodoro y económico
Tipos de agentes químicos:
� Antisépticos� Desinfectantes� Esterilizantes
CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
• Métodos químicosPrincipales grupos de antisépticos:
AGENTE APLICACIÓN
� Alcohol (60-85% etanol) Piel
� Fenoles (hexaclorofeno, triclosan, clorhexidina)
Jabones, lociones, cosméticosy desodorantes
� Detergentes catiónicos(cloruro de benzalconio)
Jabones y lociones
� Peróxido de hidrógeno al 3% Piel
� Compuestos de yodo (Betadine) Piel
� Nitrato de Plata Ojos neonatos
CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
• Métodos químicosPrincipales grupos de desinfectantes y esterilizantes
AGENTE APLICACIÓN
� Alcohol (60-85% etanol) Instrumental médico
� Detergentes catiónicos(amonio cuaternario)
� Formaldehído (3-8%) Superficies
� Compuestos Clorados
� Sulfato de cobre Algicida
Instrumental médico, alimentos yequipos de industria lácteas
Suministro de agua
Industria alimentaria (equipos)
� Gas Cloro
� Óxido de etileno (gas) Esterilizante de material termosensible
CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
• Métodos químicosAgentes antimicrobianos: antibióticos y quimioterapéuticos
de síntesis
Alexander Fleming
Howard Florey y Ernst Chain
Antibiogramas
Penicilinas
Sulfanilamida
Gerhardt Domagk
Bactericida
Bacteriolítico
Bacteriostático
Tipos de agentes antimicrobianos
CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANOCONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
Antibióticos: microorganismos productores
� Bacterias� Actinomicetos (4600)� Bacillus (950)
� Hongos (1600)
� Plantas
� Animales5-
Metoxihidrocarpaina
PROBLEMAS ACTUALES EN TERAPIA
�Aumento de resistencias:
� Abuso y mal uso de los antibióticos
� Enfermedades crónicas
�Soluciones:
� Uso restringido de los antibióticos
� Búsqueda de nuevos antimicrobianos
� Mejora de los ya existentes