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Métodos de gerar animais transgênicos e controle da

expressão gênica

Prof. Dr. Vinicius Campos Disciplina de Transgênese Animal

Graduação em Biotecnologia - UFPel

1. Histórico e contextualização

2. Métodos de gerar animais transgênicos

3. Métodos de controle da expressão de um transgene

Abordagens da aula...

• 1980 – Primeiro animal transgênico – camundongo – Gordon et al. via microinjeção de DNA

• 1982 – Camundongo gigante (GH) – Palmiter et al.

• 1985 – Coelhos, suínos e ovelhas transgênicas

• 1989 – Transferência gênica mediada por espermatozóides (SMGT)

• 1992 – Knockout por recombinação homóloga – Oliver Smithies

• 1997 – Transgênese via Transferência nuclear de células somáticas (SCNT)

• 2003 – Knockdown em animais transgênicos

Histórico e contextualização

Histórico

Palmiter & Brinster , 1982

• Camundongo Gigante

• Inserção do gene do GH sob controle

do promotor da metalotioneína

• Gerados Via Microinjeção

Macacos GFP positivos

Camundongos GFP

Atualmente os animais transgênicos

são uma das ferramentas mais

importantes da moderna biotecnologia

animal

Aplicações dos Animais Transgênicos

I – Estudo da função dos genes - knockout

II - Melhoramento Animal

III – Produção de proteínas recombinantes

Geração os animais e controle do transgene

Cada aplicação dos animais transgênicos

Precisa de um método específico de geração e controle da expressão do

transgene

Quais técnicas são usadas para gerar os animais transgênicos?

Métodos de Geração dos Animais Transgênicos

Tran

sfer

ênci

a G

ênic

a Embriões

Gametas

Células

Construção do DNA exógeno (transgene)

1ª ETAPA 2ª ETAPA

Tran

sfer

ênci

a G

ênic

a

Embriões

Gametas

Células

Microinjeção de DNA

Infeção com retrovírus

ou Lentivírus

SMGT

TMGT

OMGT

Local da Transferência Gênica

Técnicas Usadas

Células Germinativas

Células-Tronco

Embrionárias (ES)

SCNT

Transferência Gênica em Embriões

Microinjeção Pronuclear

Microinjeção Citoplasmática

Infecção com Retrovírus ou

Lentivírus (Espaço perivitelínico)

• Primeiro método para gerar animais transgênicos

• Método mais utilizado na geração de animais transgênicos

• Taxas de eficiência de 1-5% em camundongos

• Pouco eficiente em animais domésticos (bovinos, suínos, ovinos e caprinos)

• Necessidade de equipamentos sofisticados como o micromanipulador - mão de obra treinada

• Não execução de recombinação homóloga

• Injeção de DNA ultrapuro – até 1000 cópias

Embriões - Microinjeção pronuclear

Etapas da microinjeção pronuclear

Embriões - Microinjeção pronuclear em Bovinos

Centrifugação dos grânulos de lipídeos

permite a visualização dos

pronúcleos

• Utilizada em animais onde os pronúcleos NÃO são visíveis – peixes

• Método mais utilizada na geração de peixes transgênicos

• Taxas de eficiência de até 20% em zebrafish

• Não permite recombinação homóloga

• Necessidade de altas concentrações de DNA exógeno – 20 milhões de cópias - o que induz alta toxicidade aos embriões

• Alta porcentagem de mosaicos

Embriões - Microinjeção citoplasmática


Zigoto

DNA

exógeno

Placa com

agarose Zigotos

Microinjeção

citoplasmátia de

DNA exógeno


Zigotos de

zebrafish

Microinjeção

citoplasmática


Embriões – Infecção Viral

• Vetores retrovirais ou lentivirais (vírus de RNA)

• Manipulados geneticamente para conter o gene de interesse – processo lento e trabalhoso

• Principal técnica de geração de aves transgênicas – mas também é usada em mamíferos

• DNA viral leva ao silenciamento do transgene durante as gerações

• Há uma preocupação com a possível ativação do vírus durante a vida do animal – mesmo que os genes antigênicos tenham sido desativados

• Baixas taxas de integração

Embriões Infecção Viral

Em aves

Injeção na blastoderme

50-60.000 células


Em aves


Zigoto

Lentivírus

Injeção no

espaço

perivitelínico

Em mamíferos

Infectam células

quiescentes


Zigoto Incubação com

Lentivírus

Tratamento com

pronase para

tornar a zona

pelúcia

permeável

Em mamíferos

Tran

sfer

ênci

a G

ênic

a

Embriões

Gametas

Células



ou Lentivírus

SMGT

TMGT

OMGT


Técnicas Usadas


Células-Tronco

Embrionárias (ES)

SCNT

Transferência gênica para os gametas

• Transferência gênica mediada por espermatozóides (SMGT)

• Transferência gênica mediada por testículos (TMGT)

• Transferência gênica mediada por oócitos (OMGT)

Transferência gênica para os gametas

• Técnicas relativamente simples em relação aos outros métodos de geração de animais transgênicos

• Técnicas de geração em massa – em um procedimento podem ser gerados vários animais transgênicos

• O método mais simples para a geração de animais

transgênicos e pode ser aplicado a qualquer espécie

que use o espermatozóide para reprodução

• Não necessita equipamentos sofisticados

• Baixa repetibilidade

• Baixas taxas de integração no genoma hospedeiro –

muitos mosaicos

• Baixa incorporação de DNA pelo espermatozóide

Transferência gênica mediada por espermatozóides (SMGT)

Sperm-mediated

gene transfer (SMGT)


Sêmen + DNA exógeno

Como incrementar a transfecção de DNA?

Métodos de Transfecção de DNA

Eletroporação

Lipofecção

Incubação

Baixa eficiência para espermatozóides

Métodos de Transfecção de DNA

O DNA exógeno está exposto a DNase

Meio extracelular

Meio intracelular

DNase no plasma seminal

DNase no citoplasma

• Remoção do plasma seminal • Eletroporação • Desidratação e reidratação • Lipofecção, DMSO • Linker-Based SMGT – Anticorpos carreadore de DNA • REMI-SMGT • Lentivirus • Aumento da permeabilidade da membrana • ICSI-SMGT • NanoSMGT


Técnicas para aumentar a transfecção de DNA para espermatozoides

• Na inseminação artificial ou na FIV nem sempre o espermatozoide transfectado irá fecundar um oócito

• Na ICSI é possível escolher apenas os espermatozóides transfectados e injetá-los no oócito

• Altas taxas de transgênese

• Muito utilizada em bovinos

• Porém reduz a simplicidade da SMGT

ICSI-SMGT

ICSI-SMGT

Injeção apenas do espermatozoide transfectado

• Utilização de nanoestruturas na transfecção de DNA para os espermatozóides

• Nanotubos, nanopolímeros, nanopartículas

• Permite uma maior taxa de transfecção

• Proteção contra DNases no plasma seminal

NanoSMGT

NanoSMGT Quantificação da internalização do DNA exógeno (qPCR)

Campos et al. (2011)

• Dependendo da aplicação do animal transgênico – macho ou fêmea

• Sêmen sexado em bovinos

• Comercialmente disponível

• Custos acessíveis

Sêmen Sexado - SMGT

USO DE SÊMEN SEXADO NA SMGT PARA PRODUZIR BOVINOS TRANSGÊNICOS COM SEXO

PREDEFINIDO

• Transfecção de espermatozóides com mais de um gene ao mesmo tempo

• Possibilidade de gerar animais multi-transgênicos

Multi-SMGT

• É uma variante da SMGT

• É a SMGT in vivo

• Injeção de DNA direta nos testículos

• Captura do DNA exógeno pelas espermatogônias

• Geração de espermatozoides ¨transgênicos¨

• Aplicado principalmente em camundongos e aves

• Compartilha das mesmas limitações da SMGT

• Entretanto, a integração de DNA é maior que na SMGT – incorporação do DNA pelas espermatogônias

Transferência gênica mediada por testículos (TMGT)

Transferência gênica mediada por testículos (TMGT)

INCORPORAÇÃO DO

DNA EXÓGENO

Transferência gênica mediada por oócitos (OMGT)

• Método pouco utilizado • Injeção de DNA direta nos ovários • Poucos estudos • Captura do DNA pelas oogônias

Tran

sfer

ênci

a G

ênic

a

Embriões

Gametas

Células



ou Lentivírus

SMGT

TMGT

OMGT


Técnicas Usadas


Células-Tronco

Embrionárias (ES)

SCNT

Embora a transferência gênica para células envolva em algum momento a manipulação de gametas ou embriões, a transferência gênica é

feita através da transfecção de DNA para células cultivadas

Transferência Gênica para Células

Células transfectadas com

vetor pEGFP

• Tranferência gênica para células germinativas

– Spermatogônias

– Células Primordiais germinativas

• Tranferência gênica para células tronco-embrionárias

• Tranferência gênica para células somáticas

– Transferência nuclear de células somáticas (SCNT)


• São os métodos mais avançados para a geração de animais transgênicos

• Transferência-gênica em células permite a recombinação homóloga

• Transgênese condicional – Sistema CreLoxP

• Permite a integração sítio-dirigida ou gene targeting


Transferência gênica para espermatogônias

Transplante de células germinativas primordiais (PGCs)

Transferência gênica para células-tronco embrionárias (ES)

• Permite a recombinação homóloga

• Transgênese condicional via sistema CreLoxP

• Knockout condicional

• Knockin condicional

• Baixas taxas de mosaicismo após a F1

• Apenas em camundongos há o cultivo de ES

Transferência gênica para

células-tronco embrionárias (ES)

Transgênese condicional - CreLoxP

Transferência nuclear de células somáticas (SCNT)

Métodos de Geração dos Animais Transgênicos

Tran

sfer

ênci

a G

ênic

a Embriões

Gametas

Células

Construção do DNA exógeno (transgene)

1ª ETAPA 2ª ETAPA

Na construção do transgene definimos como controlar a sua

expressão

• O controle da expressão do transgene se dá através de duas situações:

1. Pela forma como o transgene foi construído, como foi projetado para ser expresso

2. Pelo local de integração no genoma hospedeiro

Métodos de controle da expressão gênica em animais transgênicos

Construção do Vetor

Local de integração

Definem como o

transgene será expresso

Métodos de controle da expressão gênica em animais transgênicos

Construção do vetor (cassete gênico)

• Regras gerais na construção de vetores para a produção de animais transgênicos

– Evitar fragmentos com ilhas CpG

– Usar DNA genômico com introns ao invés de cDNA

– Usar promotores grandes com enhancers

– Evitar usar DNA bacteriano ou viral

– Remover genes de resistência à antibióticos antes da transferência gênica

–

Construção do vetor (cassete gênico)

• Promotor

– Enhancers

• Região transcrita

– Íntrons

– 3’ UTR

– 5’ UTR

– Região codificadora (CDS)

– Região Terminadora

– Construções bicistrônicas

• Regiões Flanqueadoras

– Insulators

– Sítios para integração sitio-dirigida

Componentes de um vetor para gerar animais transgênicos

• É a principal região regulatória da construção

• É o principal responsável pelo direcionamento da expressão para algum órgão ou tecido

• Pode ser tecido-específico ou constitutivo

• Deve conter enhancers para aumentar a intensidade da expressão

• Evitar regiões com ilhas de CpG

• É indispensável para qualquer construção de vetores para geração de animais transgênicos

Promotor

• Ex. Citomegalovírus (CMV)

• Ex. Beta-actina

• Ex. Metalotioneína

• Ex. EF1α

Promotores constitutivos

Induzem a expressão do transgene em todas as células do animal transgênico


Promotor CMV Vetor comercial

pEGFP-N1


Camundongos Transgênicos expressando o

gene EGFP sob controle do promotor CMV

Aumento da taxa de mosaicismo

• Ex. Beta-lactoglobulina – glândula mamária

• Ex. Ovalbumina – oviduto de aves

• Ex. Uromodulin - rins

Promotores tecido-específicos

Direcionam a expressão do transgene em todas as células do animal

transgênico

Todos precisam de fatore de transcrição específicos sintetizados apenas nos tipos

celulares específicos

• Introns – Presentes na maioria dos genes eucarióticos

– 50-250 pb

– A ausência de introns reduz a expressão gênica

– Utilizar pelo menos um intron no flanco 5’ da região codificadora

– Pode conter sítios para fatores de transcrição

– Facilitam o transporte do RNA mensageiro para o citoplasma

– Indispensável

Região transcrita

• 5’ UTR – Deve conter o mínimo de sequencias GC

– Codon de iniciação AUG deve ser precedido de uma sequencia de Kozak – ACC

• 3’ UTR – Sítio de poliadenilação poly(A)

– Sítios-alvo para microRNAs devem ser removidos

– Regiões ricas em CU aumentam a estabilidade do RNA mensageiro

Região transcrita

• Região codificadora – Contém a mensagem genética

– Otimização de códons preferenciais

– www.kazusa.or.jp/codon

– Utilização de genes sintéticos

– Evitar ilhas de CpG

Região transcrita

http://www.kazusa.or.jp/codon

• Isoladores ou Insulators – Usadas nos dois flancos do transgene para sobrepor o

efeito da posição de integração no genoma

– Insulator do gene da beta-globina (5’HS4)

– 300 pb

– Impede que sequencias vizinhas intefiram na expressão do transgene

– “Sequencia abridora de cromatina”

– Mantém a cromatina aberta permitindo a transcrição

– Aumenta a especificade da transcrição

Regiões Flanqueadoras


Construção contendo o insulator HS4 do gene da beta globina


Vídeo 1 – Sem insulator

Vídeo 2 – Com insulator

• Motivos para integração sítio-específica – Sítios para reconhecimento de transposases

– Sítios para meganucleases

– Sítios LoxP para reconhecimento por Cre recombinase


• OVA/EPO vector – Promotor da ovalbumina com enhancers

– cDNA da EPO humana com códons otimizados para aves

– Paente depositada INPI - Campos et al., 2012 -

– “Sequencia de DNA recombinante para produção de eritropoetina recombinante em galinhas transgênicas”

Exemplo de um cassete gênico

5’ 3’

Promotor OVA 2784 pb

Kozak EPO CDS SV40 Poly (A)

BamHI XhoI

• Promotores induzíveis por poluente ambientais – Promotor da com motivos responsívos à

poluentes

Vetores para controle da expressão do transgene por indutores externos

Elemento Responsivo Motivo de DNA no promotor

EPRE – metais pesados GGTGACAAAGC

ERE - estrógenos TAATGGTGACAAAGCAACTT

AHRE – hidrocarbonetos TGCTGACTCAGCA

• Knockout – bloqueio da expressão – Vetores para recombinação homóloga

– CreLoxP

• Knockdown – diminuição da expressão – Vetores para RNAi

– Vetores para microRNAs

Vetores para inibição da expressão de um gene endógeno

Knockout por recombinação Homóloga (HR)

• Proteínas transdominantes negativas – Vetores para superexpressar uma proteína

semelhante porém inativa

– Irá competir com a proteína nativa, porém terá vantagem

– Maior concentração que a proteína nativa

Vetores para inibição da expressão de um gene endógeno

• Tão responsável quanto o vetor no controle da expressão do transgene

• Se o vetor for integrado num sítio de heterocromativa ficará silenciado

• Se o vetor se inserir no meio de um gene ativo causará mutagênese insercional

Controle do local de integração no genoma hospedeiro

• Integração passiva

– Microinjeção

– SMGT

– ICSI-SMGT

• Integração ativa ou sítio dirigida ou gene targeting

– ES

– SCNT

– PGCs


• Integração passiva

– Sem controle do local de integração

– Concatâmeros – múltiplas cópias

– Pode ocorrer silenciamento

• Integração ativa ou sítio dirigida ou gene targeting

– Controle preciso do local de integração através de enzimas

– Única cópia

– Rara ocorrência do silenciamento


• Zinc Finger Nucleases

• Meganucleases

– I-SceI

• Transposons

– Tol2

– SleepBeauty

– piggyBac

Integração ativa ou sítio-dirigida ou gene targeting

Transposons e meganucleases

Sítio para o transposon Tol2 Sítio para a meganuclease I-Sce I

Referências

Prof. Dr. Vinicius Farias Campos Graduação em Biotecnologia [email protected]

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