metodos de identificacion
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MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN
CLAUDIA CONSTANZA PEREZ RUBIANO
1. METODOS DIRECTOS
Económico
Se visualizan
RECUENTO EN PLACA
RECUENTO EN CAMARA
Recuento de levaduras
No diferencia células
viables de no viables
Coloración supravital
Azul de metileno
Cerveza, licor y jugos
Recuento de hifas de
hongos
Determina calidad de
materias primas
Industria de salsa de
tomate y jugos
Se diluye a 8 grados
Brix.
PETROFF HAUSER HOWARD
HEMOCITÓMETRO O CÁMARA CUENTA
GLÓBULOS
Este sistema tiene 2 áreas de conteo separadas, cada una debe contener de 0.1 mm3 de muestra cuando se cubre con un cubre objetos especial.
Áreas de conteo
Bar
Bar
CUBRE OBJETOS ESPECIAL
Un cubreobjetos
especial, grueso se
monta sobre dos barras
de cristal y esto forma
las dos cámaras.
CUADRÍCULAS DE CONTEO
Líneas finas en el piso de
la cámara ayudan con el
conteo celular.
El # células por ml =
Promedio del # de
células de los cuadros de
las esquinas x 104.
LA TRANSFERENCIA DE LA SUSPENSIÓN
CELULAR SE HACE POR CAPILARIDAD
Llene la cámara con la suspensión celular utilizando una pipeta con punta fina aplicándola sobre el área escavada de la cámara
Deje la suspensión entrar por capilaridad
No ejercer presión durante el llenado con presión
CÁMARA CUENTA HONGOS DE HOWARD
Fue diseñada especialmente para contar hongos y levaduras en un volumen dado de alimento.
La estructura es similar a la del hemocitómetro pero no tiene cuadrícula en el piso de la cámara.
Un disco ocular de Howard en el ocular del microscopio se usa para facilitar el conteo.
HOWARD
RECUENTO EN PLACA
RECUENTO EN
PROFUNDIDAD
RECUENTO EN
SUPERFICIE
RECUENTO EN
SANDWICH
Menor
contaminación
Mayor posibilidad
de contaminación
Menor
contaminación
Medios transparentes Medios opacos Medios opacos
Detecta menor de 10
UFC/ml
Detecta a partir de
de 100 UFC/ml
Detecta menor de 10
UFC/ml
Bacterias mesófilas Adición de yema de
huevo. Bacterias
Psicrótrofas
Bacterias lipolíticas-
agar tributirina
Reveladores:
cloruro férrico,
sulfato ferroso
FILTRACION POR MEMBRANA
Muestra líquida no
viscosa, licores, jugos
agua
Alta sensibilidad
Muy costoso
Bomba de vacio
Filtros de
nitrocelulosa (o.45,
0.22um)
Filtra mínimo 100 ml
y maximo 300 ml
Mesófilos, coliformes,
Pseudomonas, E. coli
Mesófilos aerobios
Recuento rápido de
coliformes en
productos lácteos
Recuento de
Staphylococcus
aureus
Enterobacterias
Mohos y levaduras
E. coli
PETRIFILM
Se toma la muestra y
colorante de
fluorescencia (naranja
de acridina) que tiñe
microorganismos
viables y se visualiza
en microscopio
Visualiza poblaciones
EPIFLUORESCENCIA SIMPLATE
Recuento Total de
Bacterias, Recuento
de Coliformes Totales
y E.coli, Recuento de
mohos y levaduras y
Recuento de
Campylobacter.
SIMPLATE
2. METODOS INDIRECTOS
Se observan cambios en el medio, turbidez, gas,
cambio de color, etc. No se ve cantidad de
microorganismos.
Identificar características metabólicas en el
medio de cultivo.
Basado en la reducción de
colorante
Azul de metileno
El tiempo transcurrido
para que tenga lugar la
reducción del colorante es
inversamente
proporcional al número de
microorganismos
En industria láctea como
indicador de leche cruda
TIEMPO CALIDAD
<30 min Mala calidad
30-1 hora Regular
calidad
1-4 hora Buena calidad
>4 Excelente
calidad
PRUEBA DE TRAM
(prueba de tiempo de
reducción de azul de
metileno
10 ml de leche y 1 ml de
azul- 35-37 C(bano maria)
Mide características de
microorganismo sobre
el medio
Técnica estadística que
se distribuye bajo la
curva de Poisson
Mas sensible que el
recuento en placa.
Coliformes: Caldo
brilla. Fermentan
lactosa
S. aureus: Giolliti
cantoni (reducción de
telurito a teluro
metálico
Clostridium: Medio
caldo carne cocido,
proteólisis y
producción de H2S por
aminoácidos
azufrados
TECNICA DEL NMP Usos
Mini bioquímicas
Grupo concreto de
microorganismos
Códigos diagnósticos
Huella dactilar
metabólica
Bases de datos
Si cambia el color es
porque degrada
azúcar y cambia pH
rojo- amarillo
MINIKITS
METODOS QUIMICOS
Todas las células
vivas tienen ATP
Mediante la enzima
Luciferin luciferasa se
cuantifica el ATP
Luminómetro (unidad
relativa de luz)
Hisopo recoge
muestra-este se
introduce en líquido
con la enzima.
Mucha luz-muchos
microorganismos.
Cuantifica cualquier
ATP ya sea de
microorganismos o de
otras fuentes.
Se utilizan protocolos
para purificar ATP de
microorganismos.
Problema de
cuantificación: no
discrimina
Gen lux (Salmonella)
1. Bioluminiscencia
Reacción química que
permite evaluar el
crecimiento de
bacterias.
Para identificar
organismos patógenos:
coliformes, E. coli,
Salmonella, S. aureus.
Colillert
LMX
Rambach
Petrifilm
2. Métodos fluorógenos y cromógenos
En las últimas décadas la detección y
cuantificación directa (sin aislamiento) de
organismos coliformes y E. coli utilizando medios
de cultivo que contienen sustratos definidos ha
sido amplia y rápidamente aceptada. Estos
sustratos son utilizados por enzimas específicas
del grupo de bacterias coliformes y E. coli. El
método se basa en el principio de unir estos
compuestos a algún sustrato que se libere al
medio al ocurrir la reacción, produciendo un
cambio de color perceptible o el desarrollo de
fluorescencia. Por esta razón se conocen como
compuestos cromogénicos y fluorógenicos.
TIPOS DE SUSTRATO
Lámpara UV
Fluorescencia difusa
Uso en medio de
cultivo líquido o sólido
Autofuorescencia
Pseudomonas
No
Color limitado a la
colonia
Usos en medio líquido
o sólido
Interferencia de color
SUSTRATO
FLUOROGENO
SUSTRATO
CROMÓGENO
Colilert (sustrato
definido).
4 –metil -umberiferil -
D- glucuronido.
Gucoronidasa –MUG:
reactivo químico
produce fluorescencia
o-nitrophenyl-β-D-
galactopyranosido –
ONPG:β-galactosidasa:
cromógeno. Produce
cambio en coliformes.
Utilizan la ß-galactosidasa para metabolizar el
nutriente indicador ONPG cambiando de incoloro
a amarillo.
E. coli utiliza la ß-glucuronidasa para
metabolizar el MUG y crear fluorescencia.
Como la mayoría de los microorganismos no
coliformes no poseen estas enzimas ,no pueden
proliferar ni interferir. Los pocos gérmenes no
coliformes que poseen estas enzimas son
suprimidos selectivamente por la matriz
específicamente formulada de Colilert. Este
enfoque reduce al mínimo los falsos positivos y
negativos.
P/A
X –gal: Para indicar si la bacteria expresa la β-
galactosidasa -coliformes produciendo coloración
azul.
MUG (fluorógeno) reacciona con glucoronidasa
(enzima de E.coli y produce fluorescencia).
Triptofanasa- triptófano: Si hay producción de
indol de E.coli.
LMX
β - Galactosidasa
Salmonella reacciona
con el cromógeno
Coliformes crecen
porque hay otras
fuentes de carbono.
El sustrato
propilenglicol solo
Salmonella lo puede
degradar, cambia el
pH
RAMBACH (cromógeno)
METODOS FISICOS
Cambios eléctricos que produce un
microorganismo cuando está en un medio de
cultivo. La corriente es más difícil de pasar
cuando hay muchos microorganismos.
Coliformes fecales, enterobacterias, enterococos.
Emplean un medio de cultivo estable.
No debe cambiar el pH.
Impedancia cambia a 106
Impedancia
PRUEBAS BIOLOGICAS
Se utilizan para determinar la presencia de
toxinas y/o su virulencia (microorganismos).
Incluyen el uso de animales: curíes, conejos,
ratones.
Estudios epidemiológicos
Limulus polyphemus
Amebocitos
Adición de Ca
Endotoxinas
Los lipopolisacaridos
resultan de la lisis de
la pared (encefaleas,
mialgias, escalofrios)
Lisado
amebocitos+proenzima
+ muestra→ hidrólisis
P- nitroalinina
(espectofotómetro)
PRUEBA DE LAL (lisado
de amebocitos de
Limulus). LAL CROMOGENO
Identifica E. coli y
Shigella
Capacidad invasora de
células epiteliales del
intestino delgado →
toxinas
enteroinvasivas.
Penetra células
epiteliales (cobayos)
Evaluar si E. coli y
Shigella producen
enterotoxinas → 106
microorganismos →
en ojos → si se
produce la toxina
entra en la queratina
de los ojos (capa
blanca)
PRUEBA DE SERENY
Para observar si se
están produciendo
toxinas
(enterotoxinas) de E.
coli.
Saca ileón.
10 cm de longitud
(morcillitas). Cerrar,
sacrificar.
Observar intestino
delgado, cuando E. coli
produce la toxina
distensiona los fluidos,
aumentando el tamaño
de la morcilla.(diarrea).
Cultivo en solución
salina 18-24 horas
Medir el volumen antes
y después.
ASA LIGADA DE
CONEJO
Determinar toxinas de E. coli
Separar ratón de su madre
Administrar oralmente 0.05m/l
25C durante 2 h. Tiempo estable.
Sacrificar
Coeficiente peso intestino-peso corporal
RATON LACTANTE
PRUEBAS INMUNOLOGICAS
Identificar patógenos (Salmonella, Listeria, E.
coli)
Toxinas microbianas
-Aglutinación
-Inmunoensayo
-ELISA
Microorganismo
aislado
Soporte de esferas de
látex cubiertas con Ac
para toxina que se
quiere determinar
Enfrentar con la
muestra, para probar
si tienen Ag
específicos
Coagulación prueba
(+) presencia de la
toxina
S. aureus, E. coli, B.
cereus, C. perfingens
AGLUTINACION
Inmunoenzimática
Detecta toxinas de
hongos, S. aureus,
Clostridium.
Efecto de luz o cambio
de color
(colorimétrico).
Adicionar enzima.
Indirecta Ag- Ac
Muestra de sangre
centrifugada (suero)
Encontrar anticuerpos
específicos
Adicionar tecnecio o
yodo (sustancias
radioactivas) unidas a
una sustancia
especifica los Ag
ELISA RADIOINMUNOENSAYO
Se produce radioactividad y se observa por equipo
especial
Para toxinas de hongos y S. aureus
1-10ng/g
TÉCNICAS MOLECULARES
48 horas desde el
procesamiento
Sensibilidad
Permite identificar
microorganismos
incluso no cultivables
como virus no
encontrados
Personal capacitado,
inversión en equipos.
Reconoce contactos,
pero no viabilidad
(vivo o muerto el
microorganismo).
RFLP
PCR
PCR en tiempo real
Sondas de hibridación
VENTAJAS DESVENTAJAS
Amplifica fragmentos
específicos de RNA o
DNA
Se utiliza
transcriptasa reversa
para que el RNA se
convierta en DNA
Alta sensibilidad y
especificidad
Corto tiempo
Muestra: tratamiento
previo para extraer el
DNA
Tac polimerasa y
resistente a los 95°C
En 1977 se uso
polimerasa termolábil
de E. coli y se rompía
por la alta
temperatura
PCR
Hibridación (92°C).
Separa hebras de DNA
15-20 sg
Anillaje: pegarse los
primers que se pegan al
DNA si son
complementarios, estos
anillajes se dan a 55 o
65°C. 20 sg
Astringencia: entre más
alta la temperatura mas
específica es la técnica
Elongación: se coge el
DNA con el primer
complementario (ciclo
duplicando una hebra,
entre más ciclos más
DNA) 20 sg
Los primers hacen
específica a la técnica de
PCR porque el
experimentador
Decide que primers
coloca secuencias de 20 a
40 pb. Se mandan
fabricar y se debe tener
la secuencia de lo que se
quiere amplificar
Etapas PCR
Con electroforesis
Deben llevar un
patrón de peso
molecular
Bromuro de etidio es
el colorante que
permite ver el DNA,
este se intercala en el
DNA y permite que
fluoresca.
Se hace un corrido
(2h) en agarosa que es
el soporte.
Como visualizar la PCR
Usa sondas con
fluorometria
No necesita
electroforesis porque
tiene combinados en
los primers sondas
fluorógenas y emite
luz roja
Tiene un control + y_
Para E. coli
enterohemorrágica y
Salmonella y L.
monocytogenes
Lo que da por el suelo
de la grafica es _ y por
encima que es +.
PCR en tiempo real
Se encuentra fuera del
mercado
Campylobacter yeyuni,
S. aureus.
SONDAS DE
HIBRIDACIÓN