metodos moleculares - canacintra congreso industria … · advierte la fda sobre queso contaminado...
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¿Por qué analizar?
• Garantizar la seguridad humana (animal)
• Cumplimiento a regulaciones, reglñamentos y/o leyes
• Protección de la marca
•Requerimientos de clientes (cadenas comerciales, consumidores)
•Control de Calidad (ambientes y procesos)
Agencias Regulatorias
Food Industry
Consuidores
Service Labs
Impacto de las enfermedades transmitidas por alimentos
• ~48 milliones de enfermedades,~128,000 hospitalizacione, ~3000muertes por año atribuidas aenfermedades transmitidas poralimentos (estimado CDC, 2011)
• El costo en EU por enfermedades• El costo en EU por enfermedadestrasnsmitidas por alimentos es de~$152 Billones / año (ProduceSafety Project 2010)
• Los costos por retiros de productoscon riesgo de causar unaenfermedad es de ~$7 Billones(Washington Post)
RETIROS DE PRODUCTO
Advierte la FDA sobre queso contaminado10 Marzo de 2009Fuente: NotimexLa Administración de Medicamentos y Alimentos (FDA) de Estados Unidos advirtió hoy sobre la posible contaminación por listeria en queso fresco y cotija producidos en Nueva York.cotija producidos en Nueva York.
La FDA recomendó a los estadunidenses no consumir y desechar los quesos frescos y cotija elaborados en Nueva York por la compañí …….., porque alertó que "podrían estar contaminados con listeria monocytogenes".
La listeria puede provocar aborto e infecciones como meningitis ……..
La compañía ya está retirando del mercado los productos que fueron distribuidos en los barrios del Brooklyn, Queens, Bronx y Manhattan en Nueva York y en el estado de Pensilvania.
Proceso de seguridad alimentaria
Plan HACCP Tecnología
DETECCION +
Cliente
Proveedores
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RegulacionesRecursos
Grupos de consumidores
+PROTECCION
Análisis
Demanda
Proceso típico de AnálisisSample
Collection
Enrich Yes
Send samples to 3rd. Party lab
In-house lab? No
Yes
ProductDisposition
HoldProduct Food safety
process in control? No
Possible consequences
YesContinue NormalProcess
•Release Product
Enrich samples
Analyze samples
Yes
NoTest
negative?
Culture confirmation
Increase testing
Conf. Positive?
No
Yes
Production shut down
Reassessment of Sanitation and
quality programs
Recall product
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¿Qué preocupa a los clientes en cuanto a métodos ?
Velocidad
Seguridad
� Tiempo Total de resultado (TTR)
Tiempo en el
instrumento
Timepo Total de Resultado
Horas hombre(preparación
de la muestra)
Horas hombre
(recolección muestra)
Tiempo de enriquecimiento
Fácil de usar
Costo
Aprobaciones
• La importancia del tiempo total de resultadosdepende de la acción que el cliente tomará en función del resultado.
• “Ambiguedad ” en los resultados es un problema
Timepo Total de Resultado (TTR)
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Velocidad
Seguridad
� Sensitibilidad (rango falsos negativos)
• Probabilidad de que una prueba, de como resultado positivo
cuando el microrganismo objetivo esta presente
• Termino que hace relación al nivel de deteccion.
• Especificidad (rango falsos positivos)• Probabilidad de que una prueba, de como resultado positivo
¿Qué preocupa a los clientes en cuanto a métodos ?
• Probabilidad de que una prueba, de como resultado positivocuando el microrganismo objetivo NO esta presente
� Inclusividad
• Capacidad para detetctar todas las vartiantes de una mismaespecie .
• Termino asociado con la reducción de falsos negativos
� Exclusividad
• Capacidad de rechazar todas las especies no deseadas• Termino asociado con la reducción de falsos positivos.
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Fácil de usar
Costo
Aprobaciones
Velocidad
Seguridad
� Error humano
¿Qué preocupa a los clientes en cuanto a métodos ?
Fácil de usar
Costo
Aprobaciones
� Horas hombre o tiempo del analista
� Capacitación / Experiencia requerida
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Velocidad
Seguridad
� Costo de Kit, Medios de cultivo, and
consumibles
¿Qué preocupa a los clientes en cuanto a métodos ?
Fácil de usar
Costo
Aprobaciones
� Costo de personal
� Producto detenido
� Retiro de producto
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Velocidad
Segueridad
� Certificación AOAC/ AFNOR/ COFEPRIS
� Adopción y/o aprobación por USDA/FDA* /
¿Qué preocupa a los clientes en cuanto a métodos ?
Fácil de usar
Costo
Aprobaciones
� Adopción y/o aprobación por USDA/FDA* / SENASICA / Health Canada
� Desarrollo en conjunto USDA/FDA
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Tecnologías para la determinación de microorganismo s
� Métodos de referencia o tradicionales (Técnicas
basadas en el vertido en placa o medios de cultivo)
• USDA MLG, FDA BAM, Health Canada,
ISO, etc. Lateral FlowELISA
� Fenotípico - Métodos Inmopnológico (Bsado en
tecnología de Anticuerpos)
� Genotípico - Métodos Moleculares (basados en el
material genético ADN o ARN)
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Métodos Moleculares
Ventajas
PCR (Polymerase Chain Reaction – Reacción de la Cadena de polimerasa )
� Basado en el material genetico – ADN o ARN
� Alta sensibilidad y especificidad� No depende de la expresión de un antigeno
� Mejor nivel de detección 10^4 ufc/ml
Desventajas� PCR Tradicional con geles, requiere de
intenso trabajo en laboratorio.� PCR tradicional requiere de especialista no
así en los métodos auotmatizados� Costo
*Automated BAX® System
• No gels required• No expert skills
required• Excellent
primers/probes
� Mejor nivel de detección 10^4 ufc/ml• Tecnología de inoovación - automatizado
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AAdenine CCytosine
Estructura del ADN
GGuanineTThymine
Dado que cadenas son complementarias, cada una puede servir como una plantilla para producir una copia exacta de la molécula original
Que es la Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)?
Etapas básicas PCR:
1. Desnaturalización de la cadena de ADN porcalentamiento
2. Unión de primers (iniciadores) que son complementarios con la secuencia de la cadenade AND
3. Extensión de la cadena de ADN por la reacción de la polimerasa
Propuesta de ValorP
rod
uct
os
Estás ahí? Que microorganismo es este?¿He visto este antes?, ¿ Cuando?, ¿Donde?
¿De donde viene?
Pro
pu
est
ad
e V
alo
r � Sistema automatizado, basado en
AND para la determianción de
patógenos en alimentos.
Certidifacado, validado y adoptado
alrededor del mundo
� Rápido, Fácil de usar, seguro y
confiable.
� Sistema automatizado, basado en AND
para monitorear procesos de producción y
rastreao de pountos de contaminación
Identificación y caracterización de cepas
simultaneamente
� Proporciona una huella digital genética
“fingerprints” en tan solo 8 horas
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Sistema DuPont BAX®Detección de patógenos
Sistema DuPont RiboPrinter® Identificacion y Caracetrización microbiana
Reactivos para PCR: TabletasContienen todos los reactivos necesarios para
PCR:Taq polimerasaNucleotidosIniciadores o primersReacción de ControlMarcador fluorescente – colorante
� Empacados en tubos para PCR� Empacados en tubos para PCR
� Contienen un control positivo de proceso interno
� Se eliminan las transferencias múltiples
� Se reducen los errores por operador: Mayor Reproducibilidad
� Incluyen ingredientes que previenen la inhibición d el PCR
� Los sistemas de tapas cerradas reducen la contaminación potencial por amplicones
Segundo
enriquecimiento
BHI
Lisis de las
muestras, todo
el proceso en un
mismo bloque
Hidratación de
tabletas PCR
Proceso de PCR
automatizado
Interpretacion
de resultados
Un solo protocolo ……… SENCILLO
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DuPont Nutrition & Health
CONFIDENCIAL
• Confiable
• Fácil de usar
• Reducción de manos hombre
• Menor espacio
• Listo para usar
• Confiable
• Fácil de usar
• Reducción de manos hombre
• Menor espacio
• Listo para usar
Kits Estandar
Detección con colorante fluorescente
• Cuando PCR finalizó, El colorante incluido en la tableta de PCR se intercala en la doble cadena durante la amplificación del ADN
• Mientras esta unida la cadena de al ADN, el colorante produce señal fluorescente cuando es excitado por la luz
• Cuando la muestras se calientan al punto de fusión, la doble cadena de ADN se desnaturaliza (separación de las cadenas), liberando el colorante.
Temperatura de fusión (Tm) es el punto en el cual el ADN se desnaturaliza Depende del largo de los fragmentos y del contenido de enlaces de G-CMayor numero de estos enlaces G-C--> Incrementa la temperatura de fusiónMayor contenido de enlaces G-C --> Incrementa la temperatura de fusión
Kits Estandard
Señal e Flourescencia (“raw data”) cae con calentamie nto generando la curva de fusión.
Fluorescencia
• Software analiza los datos crudos, por medio de algoritmos se genera los datos procesados.
No SeñalSeñalIncremento de temperatura
Fluorescencia
Kits Real Time
Señal de Flourescencia incrementa con el numero de ciclos sim el microroganismo objetivo esta presente.
Fluorescencia
No Señal SeñalIncrementos de Ciclos
Fluorescencia
Compañías requieren: Tecnología que le permita reaccionar en el menor ti empo posible ante crisis asociadas a bacterias.
�Inovador: Identificación y CaracterizaciónResultados basados en ADN
�Facilidad de uso: Automatizado, NO requiere personal especializadoPermite compartir información electrónica
�Seguridad: Interpretación objetiva
¿Qué microrganismo es? ¿Hemos visto esta cepa antes?¿Dónde? ¿Cuándo?¿De dónde proviene?
�Seguridad: Interpretación objetivaMayor precisiónResultados consistentes
� Velocidad: Resultados en 8 horas� Estandarizado: Menos horas hombre
Único protocolo �Soporte técnico: 365 días del año RiboPrinter® …TIENE
LAS RESPUESTAS!Capacidad de identificar bacterias descocnocidas utilizando una base de datos pre-instalada de > 8500 patrones conocidos , diferenciar a un nivel sub-especies y realizar la trazabilidad de los puntos como fuente de contaminación.
Como trabaja el Sistema Riboprinter ®
Proceso AutomatizadoPreparación ADNSeparación y Transferencia Procesamiento de la membrana Detección
Análisis automatizadoIdentificaciónDiferenciación de cepas
Analisis de datos - IdentificaciónLos patrones son compardos con la base de datos - conti nuamente se actualiza
Los patrones son actualizados (actualización con un CD)
Colaboración con las principales empresas farmaceúticas e instituciones encargadas de la colección de cepas y certificarlas, tales como: ATCC, DSMZ (Alemania) and Riken (Japón)
• Al comparar el patr ón, proporciona la identificaci ón de la muestra, con un umbral de similitud de 0.85
Análisis de Datos: La Diferenciación de cepas
Los patrones son compardos tambien con la base de d atos hist óricos del cliente, independientemente del an álisis de identificaci ón.
Mapeo microbiano, utilizando
Ambientes
Productos
Personal
Mapeo y Bases de Datos Microbianas
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utilizando sus propias bases de datos
Equipos
Riboprinter® permitiódeterminar la fuentede contaminación real.
S. epidermidis(Producto Terminado)
S. epidermidis(Materia Prima)
S. epidermidis(Manos del Personal)
Diferenciación - Es una Ventaja y Excelente herramie nta
1. Laboratorio tercería (+)
2. Sistema BAX®
3. Riboprinter 3. Riboprinter