mi cie e - ensressources.agreg.phys.ens.fr/media/ressources/ressourcef... · 2019. 4. 6. · çs...
TRANSCRIPT
La microscopie optique
Nicolas Sandeau Maître de Conférences
A quoi ça sert?
Observer un objet, un phénomène…avec une bonne résolution spatiale (voire temporelle) sans trop de perturbations (innocuité).L’instrument doit être sensibleet la mesure (l’image) contrastée.
Le plan• Les contrastes• Les microscopies de fluorescence• La microscopie confocale• Augmenter la résolution• Les microscopies non linéaires
Les 1er microscopes
Vers 1880, des détails aussipetits que 0.2 µm sont déjàaccessibles.
Microscope Carl Zeiss 1891
Principe du microscope
Source enEpi-illumination
Vers l’oeil
Vers caméra
Imageur
Source en transmission
Détection en forward
Principe du microscope
Image intermédiaire
Oculaire
160 mm
Plan image
Oculaire
Spécimen
Objectif
160 mm
Spécimen
Lentille de Telan
Objectif
Les contrastes en
microscopiemicroscopie
Contraste en microscopie
D’où vient le contraste?
⇒Absorption, diffusion,réfraction, réflexion.
Variations d’intensité, de couleurs, de netteté
Contraste en microscopie
Cam
éra
Lampe (incohérent)
Condenseur
Filtre occultant ⇒ Fond noirFiltre déphasant ⇒ Contraste de phase
Contraste en microscopie
Cam
éra
Lampe (incohérent)
Condenseur
Filtre occultant ⇒ Fond noirFiltre déphasant ⇒ Contraste de phase
Contraste en microscopie
Cam
éra
Lampe (incohérent)
Condenseur
Filtre occultant ⇒ Fond noirFiltre déphasant ⇒ Contraste de phase
ei'
Microscopie sur fond noir
Objectif
Rayons diffractés
Rayons non-diffractés
Spécimen
Condenseur
Filtre annulaire
Lumièreblanche
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/darkfieldgallery
http://prn1.univ-lemans.fr/prn1/siteheberge/PublisCours-OPI/OPI_fr_M03_C04/co/Contenu_K22.html
Contraste de phase
Plan Image
Source
Lame de PhaseDiaphragme annulaire
(Zernike prix Nobel 1953)
Source
Plan focal arrière de l’objectif
Ouverture du condenseur
Contraste de phase(Zernike prix Nobel 1953)
Image de la phase
http://www.microscopyu.com/articles/phasecontrast/phasemicroscopy.html
Microscope polarisant
P A
E sin (2µ) (ei'¡ 1)
0
¡ sin µ1
Mesure de la biréfringence
0
cos µ1
0
cos µ1
E0 sin (2µ) (ei'¡ 1)
2
0
@
¡ sin µcos µ
0
1
AE0
0
@
cos µsin µ
0
1
A E0
0
@
cos µsin µei'
0
1
A
I0 I0I0 sin2(2µ) sin2('=2)
Microscope polarisant
PMesure du pléochroïsme
0
cos µ1
0
cos µ1
E0
0
@
cos µsin µ
0
1
A
E0
0
@
cos µsin µe¡®
0
1
A
I0I0
¡
cos2 µ + sin2 µe¡2®¢
http://les.mineraux.free.fr/dossier-mineralo/lamemince/fiches/biotite.htm
Contraste par interférométrie
Image du relief
http://prn1.univ-lemans.fr/prn1/siteheberge/PublisCours-OPI/OPI_fr_M03_C04/co/Contenu42.html
Microscope DIC
± < r¶esolution
Image du gradient de la phase
“Differential Interference Contrast”
I / 1 + cos(¢' + '0)
gradient de phase
DIC ou Contraste de phase?
Objets Images de la phaseImages DIC
http://www.microscopyu.com/galleries/dicphasecontrast/index.html
Contraste de phase insensible aux pbs de polarisation ⇒ boite de PetriDIC utilisable avec des objectifs à forte NA ⇒ meilleur résolution
Contraste de fluorescence
Excitation Émission
Diagramme énergétique de Jablonski
Décalage de Stokes
Jablonski
https://www.omegafilters.com/curvo2/index.php?dyes=16&xmin=400Intérêts de ce contraste
• Possibilité de filtrer simplement le faisceau d’excitation et ne détecter que l’émission• Découplage de l’excitation et de l’émission• Rendement de fluorescence• Marquage spécifique
Défauts
• Photobleaching• Toxicité
Particularités
• Temps de désexcitation• Transfert d’énergie
Les luminophores
• Fluorophores exogènes intercalables, greffables (spécifique)…• Protéines chimériques (GFP…);• Billes fluorescentes (plus lumineux mais plus gros);• Fluorophores endogènes (moins lumineux);
• Nanocristaux de semi-conducteur (plus lumineux, moins de photobleaching mais blinking! et pb de greffache et de phototoxicité.
• Nano-diamants (plus stables, plus lumineux…)
Contraste de fluorescence (spectral)
Cellules de foie www.zeiss.de
2 (fausses)couleursDichroïque
Filtre DAPIFiltre rouge
Excitation à 360nm Émission
Miroir dichroïque
Excitation
détection
dét
ecti
on
filtres Noyau (DAPI) Cytosquelette
Contraste de fluorescence (temps de vie)
FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy)
Deux méthodes (Cf F. Sureau):• Time domain• Frequency domain
Permet de différencier 2 fluorophores qui ont même spectre d’émission
Images Sandrine Lévêque-Fort - Lab.de Photophysique Moléculaire
Contraste en microscopies cohérentes
• Génération de Second Harmonique (SHG)⇒ uniquement sur des matériaux non-centrosymétriques!
~P 2! = Â(2) ~E! : ~E!
ωωωω2ω2ω2ω2ω
SHG
ωωωω ωωωωf
2PF
Artère de rein fibrotiqueRouge:2PEFVert: SHG=>collagènehttp://www.lob.polytechnique.fr
30000
Intensity (counts)
THG
Image d’embryon de drosophileW. Supatto et al., PNAS (2005)
• Génération de Troisième Harmonique (THG)⇒ efficace sur les interfaces!
SHG 2PF
ωωωω 3ω3ω3ω3ω
THG
~P 3! = Â(3) ~E! : ~E! : ~E!
350 400 450 550 600 650
0
200
400
600
800
20000
30000
wavelength (nm)
Intensity (counts)
SHG
THG
TPF
Les microscopies de
fluorescencefluorescence
Microscopies de fluorescence
Échantillons spatialement incohérents!
Deux modes d’imagerie :
Cam
éra
Lampe
Condenseur
Imagerie en champ large
Lampe (incohérent)
Miroir dichroïque
Faisceau pompe (cohérent)
Photodiode
Trou confocalx
zy
Imagerie en mode confocal
Microscopies de fluorescence
Échantillons spatialement incohérents!
Deux modes d’imagerie : dz =n¸
NA2La profondeur de champ
Microscopies de fluorescence
Résolution vs Localisation
La localisation latérale est limitée par le bruit⇒ de l’ordre du nm avec 1 émetteur!⇒ Single Particule Tracking (SPT)
New directions in single-molecule imaging and analysis, W. E. Moerner, PNAS 104, 12596–12602, 2007
La résolution latérale est limitée par la diffraction⇒ de l’ordre de .¸=2
µ
J1 (k NA M r)
k NA M r
¶2
Microscopies de fluorescence
Résolution vs Grandissement
Image grandie 4 fois
Le grandissement M =ft
fo
M =ft
fo
La résolution 1:22¸
2NA
1:22¸
2NA
Image à faible grandissement
Image grandie 4 fois et 2 fois plus résolue
Le grandissement est important mais l’ouverture numérique de l’objectif l’est beaucoup plus!
2NA2NA
Microscopies de fluorescence
Résolution vs Grandissement
résolution de l’objectifrésolution de l’objectif
Attention à la taille du pixel!
M1; 22¸
2NA
Il faut adapter le grandissement à la taille du détecteur!
emission
excitation
camera
x
z
Microscopies de fluorescence
Mesure de l’orientation 3D
λ=525 nmNA=1,3 n=1.518 m=40
emission
excitation
camera
Conservation de l’information sur l’orientation de l’émetteur à travers le microscope
emission
excitation
camera
dipole
Image du dipole
focal plane
Conservation de l’information sur l’orientation de l’émetteur à travers le microscope
x
z
Imagerie défocalisée
-40
-20
0
20
40
Y (
µ m)
-40 -20 0 20 40
X ( µm)
60
40
20
0
(A.U
.)
Image du dipolesur l’orientation de l’émetteur à travers le microscope
emission
excitation
camera
-40
-20
0
20
40
Y (
µ m)
-40 -20 0 20 40
X ( µm)
30
20
10
0
(U.A
.)
dipole
Image du dipole
focal plane
Mais information difficile à lire!
x
z
150
100
50
0
-50
-100
-150
Y (
µ m)
1000-100
X ( µm)
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.20.0
(A.U
.)
Imagerie défocalisée
emission
excitation
camera
L’imagerie défocalisée pour lire cette information!
emission
excitation
camera
focal plane
« image défocalisée» du dipole
10 mm
x
z
M. Böhmer & J. Enderlein, JOSA B 20 (2003)
150
100
50
0
-50
-100
-150
Y (
µ m)
1000-100X (µm)
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
(A.U
.)
A
Imagerie défocalisée
A D. Patra, I. Gregor, J. Enderlein, J. Phys. Chem. A 108 (33) p. 6836-6841 (2004)
B E. Toprak et al., PNAS 103 (17) p. 6495-6499 (2006)
Les microscopies de
fluorescence à balayagefluorescence à balayage
Microscopie confocale de fluorescence
Dichroic mirror
Laser beam
Photodetector
NA
n
φfl
fobj
Main parametersMain parameters
• of the microscope : NA and the ratio φφφφ/M…
• of the excitation : mode, wavelength, polarization, shape of the beam…
• of the emission : wavelength…
3D-Resolution is defined by a volumetric function depending on the excitation, emission and collection parameters.
Volumes d’excitation (EEF)Excitation Efficiency Function (EEF)
LASER beamEEF = Carte 3D de l’intensité focalisée (1PF)
= Carte 3D de I2 (2PF)
NA=1,4 n=1,518λ1=400nm
E. Guiot, PhD Orsay Univ. (2001)
meilleure confocalité
Volumes de collection (CEF)Collection Efficiency Function (CEF)
600
400
200
0
-200
z (n
m)
100
80
60
40
CEF = Image 3D du trou confocal
=
-400
-600
-400 -200 0 200 400
r (nm)
20
Fluorescence
objective Tube lens pinhole
Carte 3D de l’intensité détectée enfonction de la position 3D de l’émetteurindividuel uniformément éclairé
Volumes de collection (CEF)Collection Efficiency Function (CEF)
600
400
200
0
-200
z (n
m)
100
80
60
40
CEF = Image 3D du trou confocal
=
-400
-600
-400 -200 0 200 400
r (nm)
20
Fluorescence
objective Tube lens pinhole
Carte 3D de l’intensité détectée enfonction de la position 3D de l’émetteurindividuel uniformément éclairé
Volumes de collection (CEF)Collection Efficiency Function (CEF)
600
400
200
0
-200
z (n
m)
100
80
60
40
CEF = Image 3D du trou confocal
=
-400
-600
-400 -200 0 200 400
r (nm)
20
Fluorescence
objective Tube lens pinhole
Carte 3D de l’intensité détectée enfonction de la position 3D de l’émetteurindividuel uniformément éclairé
Volumes de collection (CEF)Collection Efficiency Function (CEF)
600
400
200
0
-200
z (n
m)
100
80
60
40
CEF = Image 3D du trou confocal
=
-400
-600
-400 -200 0 200 400
r (nm)
20
Fluorescence
objective Tube lens pinhole
Carte 3D de l’intensité détectée enfonction de la position 3D de l’émetteurindividuel uniformément éclairé
Volumes de détection (DEF)Detection Efficiency Function (DEF)
600
400
200
0
-200
z (n
m)
100
80
60
40
Focusing
Excitation
Emission
Collection
Fluorescent sample
LASER beam
Fluorescence
DEF=EEF X CEF
Focused beamImage of the
pinhole
-400
-600
-400 -200 0 200 400
r (nm)
20
Detection
ResolutionEEF CEF
Augmenter la résolution?
100
80
60
40
20
0
-2 -1 0 1 2
EEFCEFDEF
100
80
60
40
20
0
-2 -1 0 1 2
EEFCEFDEF
NA=0,6 φφφφ/M=1µµµµmλp=488nm λf=525nm
-2 -1 0 1 2
Axe X ( µm)
-2 -1 0 1 2
Axe X ( µm)
NA=0,6 φφφφ/M=0,3µµµµmλp=488nm λf=525nm
Le trou confocal doit être adapter à la fonction d’Airy
R = M1; 22¸
2NA
Augmenter la résolution?
100
80
60
40
20
0
-2 -1 0 1 2
EEFCEFDEF
100
80
60
40
20
0
-2 -1 0 1 2
EEFCEFDEF
NA=0,6 φφφφ/M=1µµµµmλp=488nm λf=525nm
-2 -1 0 1 2
Axe X ( µm)
NA=0,6 φφφφ/M=0,3µµµµmλp=488nm λf=525nm
-2 -1 0 1 2
Axe X ( µm)
Le trou confocal doit être adapter à la fonction d’Airy
R = M1; 22¸
2NA
Augmenter la résolution des
microscopes confocauxmicroscopes confocaux
Résolution axiale
TIRF microscopy(Total Internal Reflection Fluorescence)
I(z) = I0e¡z=d
d =¸
4¼p
n 2 sin2 µ ¡ n 24¼p
n12 sin2 µ ¡ n2
2
d ↘ quand λ↘ ou θ ↗
Résolution axiale
TIRF microscopy(Total Internal Reflection Fluorescence)
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/tirf/tirfconfiguration.html
Résolution axiale
Le θθθθ-microscopeEEF CEF DEF
X =z zz
Résolution axiale: le θθθθ-microscope
EEF DEF
CEF
Photodetector
Laser beam
Pb d’encombrement et de support d’échantillons!
Résolution axiale: 4ππππ-microscopie
Filtre Notch
Sténopé
Photodetecteur
FluorescenceLame semi-
réfléchissante
L
M
LASER
ObjectifsL
L Sténopé
Miroir dichroïque
Fluorescence
LASER
(a) S. W. Hell, EP0491289 (24-06-1992)
(b) C. J. R. Sheppard et al. Optik 87(3) (1991)
MM
Objectifs
(a)
Ldichroïque
(b)
Résolution axiale: 4ππππ-microscopie
Filtre Notch
Sténopé
Photodetecteur
FluorescenceLame semi-
réfléchissante
L
M
LASER
ObjectifsL
L Sténopé
Miroir dichroïque
Fluorescence
LASER
(a) S. W. Hell, EP0491289 (24-06-1992)
(b) C. J. R. Sheppard et al. Optik 87(3) (1991)
MM
Objectifs
(a)
Ldichroïque
(b)
Résolution axiale : 4ππππ-microscopie
Filtre Notch
Sténopé
Photodetecteur
FluorescenceLame semi-
réfléchissante
L
(a) S. W. Hell, EP0491289 (24-06-1992)
(b) C. J. R. Sheppard et al. Optik 87(3) (1991)
(c) A. Egner et al. Trends in Cell Biology 15(4) 2005
MM
Objectifs
(a)
(c) Fibres d’actines
CEF d’un 4ππππ-microscope
Axe optique (z)
Fluorophore dipolaire
Foyers
λ=525 nm
NA=1,3 n=1.518 m=40
φ=20 µm
CEF d’un 4ππππ-microscope
Axe optique (z)
Fluorophore dipolaire
Dipôle fictif cohérent
Foyers
λ=525 nm
NA=1,3 n=1.518 m=40
φ=20 µm
Résolution axiale: le 4ππππ-microscope
Lobes secondaires trop intenses
Pas de gain sur la résolution latérale
Images of a pair of actin fibers
A. Egner et al. Trends in Cell Biology 15(4) 2005
EEF= Carte 3D du carré de l’intensité du faisceau pompe focalisé Excitation Émission
Régime d’absorption à 2 photons
λ =488 nm
4ππππ-microscopie et excitation 2PE
λpompe1=488 nm
λpompe2=2x488 nm
λfluo=525 nm
β=0.1
Polarisation selon X
NA=1,3 n=1.518
Φ=20 µm m=40
EEF= Carte 3D du carré de l’intensité du faisceau pompe focalisé Excitation Émission
Régime d’absorption à 2 photons
λ =488 nm
4ππππ-microscopie et excitation 2PE
λpompe1=488 nm
λpompe2=2x488 nm
λfluo=525 nm
β=0.1
Polarisation selon X
NA=1,3 n=1.518
Φ=20 µm m=40
Excitation Émission
Régime d’absorption à 2 photons
λ =488 nm
Lobes secondaires
moins intenses
4ππππ-microscopie et excitation 2PE
λpompe1=488 nm
λpompe2=2x488 nm
λfluo=525 nm
β=0.1
Polarisation selon X
NA=1,3 n=1.518
Φ=20 µm m=40
Perte sur la résolution latérale
optical axis(z)
Fluorophore
Focus
Résolution latérale: le 4ππππ’
λ=525 nm φ=20 µm
NA=1,3 n=1.518 m=40
S. Hell, “Double-confocal scanning microscope,” European Patent EP0491289 (1992, filed dec. 18 1990).
optical axis(z)
FluorophoreCoherent dipole
Focus
Résolution latérale: le 4ππππ’
λ=525 nm φ=20 µm
NA=1,3 n=1.518 m=40
S. Hell, “Double-confocal scanning microscope,” European Patent EP0491289 (1992, filed dec. 18 1990).
optical axis(z)
Fluorophore
Focus
Coherent dipole
Résolution latérale: le 4ππππ’
λ=525 nm φ=20 µm
NA=1,3 n=1.518 m=40 N. Sandeau, H. Giovannini, J. Opt. Soc. Am. A 23, 1089-1095 (2006).
Résolution 3D: le STED
Stimulation
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(15): 8206-8210 (2000).
Excitation
Principe des microscopies
non linéaires et/ou non linéaires et/ou
cohérentes
ωωωω1111ωωωωf
Fluorescence excitée à 1 ph.
1PF
ωωωω2222
ωωωωf
Fluorescence excitée à 2 ph.
2PF
ωωωω2222
ωωωω3333
ωωωωf
Fluorescence excitée à 3 ph.
3PF
ωωωω3333
ωωωω3333
ωωωω2ω2ω2ω2ω
Génération 2nd
Harmonique.
ωωωω3ω3ω3ω3ω
Fluorescence Signaux cohérents
ωωωω
ωωωω
ωωωω
Signaux non linéaires
1PF 2PF 3PF
350 400 450 550 600 650
0
200
400
600
800
20000
30000
Longueur d’onde(nm)
Intensité (U.A.)
SHG
THG
Fluo
Harmonique.SHG Génération 3ème
Harmonique.THG
Uniquement sur les objets non centro-
symétriques (Collagène)
Efficace sur les interfaces (membranes)
ωωωω1111ωωωωf
1PF
ωωωω2222
ωωωωf
2PF
ωωωω2222
Avantages:• confocalité• pénétration dans les tissus (- de diffusion)
Signaux non linéaires
400nm
continu
800nm
impul-
sionneldiffusion)• + grand écart entre excitation et émission
Inconvénients:• sources à impulsions courtes (Prix, spectre…)
1 photon 2 photons
sionnel
W. R. Zipfel et al. Nature Biotech. 21 (2003)
ωωωω1111ωωωωf
1PF
ωωωω2222
ωωωωf
2PF
ωωωω2222
Avantages:• confocalité• pénétration dans les tissus (- de diffusion)
Signaux non linéaires
diffusion)• + grand écart entre excitation et émission
Inconvénients:• sources à impulsions courtes (Prix, spectre…)
Rein de singe profondeur 60 µmexc 750nm, NA 1.2
V. E. Centonze et al. Biophys. J. 75 (1998)
ωωωω1111ωωωωf
1PF
ωωωω2222
ωωωωf
2PF
ωωωω2222
Avantages:• confocalité• pénétration dans les tissus (- de diffusion)
Signaux non linéaires
2PE1PE
95 nm 305 nmdiffusion)• + grand écart entre excitation et émission
Inconvénients:• sources à impulsions courtes (Prix, spectre…)
95 nm
Spectre 2PE sur tissu pulmonaire non marquéExcitation à 800 nm
ωωωω1111ωωωωf
1PF
ωωωω2222
ωωωωf
2PF
ωωωω2222
Avantages:• confocalité• pénétration dans les tissus (- de diffusion)
Signaux non linéaires
diffusion)• + grand écart entre excitation et émission
Inconvénients:• sources à impulsions courtes (Prix, spectre…)
ωωωω2ω2ω2ω2ω
SHG
ωωωω
(signal cohérent)
Sur objet non centro-symétrique
Signaux Cohérents
Sensible à l’ordre et à l’orientation des molécules
Spectre 2PE sur tissu pulmonaire non marquéExcitation à 830 nm
SHG image of fibroblast cell labeled by Di8LPQM Collaboration with The Ben-Gurion University (L. Amire, R. Marx)
Microscopies cohérentes : ex la SHG
Coherent induced dipoles
Local excitation field ( )zyxE ,,ω
�
( )zyxP NL ,,2ω
�
( ) ( ) ( )zyxEzyxEzyxPNL ,,:,,:,, )2(22 ωωωω χ
���
=
( ) ( ) ( )zyxEzyxEzyxPNL ,,:,,:,, )2(22 ωωωω χ
���
=
Vpm
Vpm
Vpm
Vpm
Vpm
/9.16
/4.4
/5.2
/6.3
/9.1
)2(33
)2(32
)2(31
)2(24
)2(15
≈
≈
≈
≈
≈
χχχχχ
Potassium Titanyl Phosphase -KTiOPO4
Microscopies cohérentes : ex la SHG
Vpm /9.1633 ≈χ
We define the KTP orientation by the Euler
angles (θ, ϕ, ψ)(θ, ϕ, ψ)(θ, ϕ, ψ)(θ, ϕ, ψ)
ψθ
ϕ
1111
2222
X
Y
Z
x y
z
3333χχχχ(2) of massive KTP
Le signal de SHG dépend du champd’excitation et de l’objet (orientation,taille…)!
-40
-20
0
20
40
x n
m
-40 -20 0 20 40
z nm
250200150100500
-20
0
20
40
y n
m
250200150100500
200
100
0
-100
-200
x n
m
2000-200
z nm
600
400
200
0
x10
3
200
100
0
-100
y n
m
6005004003002001000
x10
3
-200
-100
0
100
200
x n
m
-200 0 200
z nm
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
x10
6
200
100
0
-100
y n
m
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
x10
6
Microscopies cohérentes : ex la SHG
10 nm long side 70 nm long side100 nm long side
-40
-40 -20 0 20 40
z nm
0 -200
2000-200
z nm
1000
-200
2000-200
z nm
0.0
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Inte
nsi
ty (
A.U
.)
400300200100
sides length (nm)
ForwardEpi x 100Epi/ForwardKTP along X axis
Euler angles:
θθθθ=90°°°°, ϕ, ϕ, ϕ, ϕ=0°, ψψψψ=0°