microarray de expresiÓn para el estudio de las alteraciones del metabolismo lipÍdico

MICROARRAY DE MICROARRAY DE EXPRESIÓN PARA EL EXPRESIÓN PARA EL

ESTUDIO DE LAS ESTUDIO DE LAS ALTERACIONES DEL ALTERACIONES DEL

METABOLISMO LIPÍDICOMETABOLISMO LIPÍDICO

Se han seleccionado 319 clones del cDNA humanos (IMAGE):• Controles• Síntesis de colesterol• Ciclo celular• Beta-oxidación• Metabolismo lipídico• Transducción de señales• Obesidad• Respuesta a estrés• Factores de transcripción• Receptores nucleares• Etc.

23 controles comerciales (genes artificiales) Lucideas Universal ScoreCard• 10 controles de calibración• 8 controles de relación Cy3/Cy5• 3 controles de purificación• 2 controles negativos

Se han seleccionado 319 clones del cDNA humanos (IMAGE):• Controles• Síntesis de colesterol• Ciclo celular• Beta-oxidación• Metabolismo lipídico• Transducción de señales• Obesidad• Respuesta a estrés• Factores de transcripción• Receptores nucleares• Etc.

23 controles comerciales (genes artificiales) Lucideas Universal ScoreCard• 10 controles de calibración• 8 controles de relación Cy3/Cy5• 3 controles de purificación• 2 controles negativos

Cada sonda se imprime por triplicado, en dos localizaciones diferentes.

Diseño del microarray v2.2Diseño del microarray v2.2

EN TOTAL 2592 PUNTOS

6 m

m

8,4 mm

10 µ

m

Los 23 controles se imprimenpor triplicado dos localizaciones diferentes de cada subarray.

Media de las 6 replicas

Células HepG2 tratadas con Células HepG2 tratadas con lovastatinalovastatina

Grafico realizado con PathwayEditor( © Elmar Trost & Bernhard Mecnik)

basandose en KEGG PATHWAY Database(http://www.genome.ad.jp/kegg/

pathway.html)

HMG CoA Red

0

2

4

6

8

10

12

14

Control Lovastatina

Fo

ld c

ha

ng

e (

No

rma

lize

d)

HMG CoA Red

0

2

4

6

8

10

12

14

Control Lovastatina

Fo

ld c

ha

ng

e (

No

rma

lize

d)

DHCR24

0

1

2

3

4

Control Lovastatina

Fo

ld c

ha

ng

e (

No

rma

lize

d)

DHCR24

0

1

2

3

4

Control Lovastatina

Fo

ld c

ha

ng

e (

No

rma

lize

d)



pathway.html)

60h0 48h

SKF

Celulas HL60

Células HL60 tratadas con SKF Células HL60 tratadas con SKF 104976104976



pathway.html)

HMGCR

0

0.5

1

1.5

2

48h 48+2 h 48+4 h 48+6 hExp

resi

ón

rel

ativ

a d

e m

RN

A

DHCR24

0

0.5

1

1.5

2

2.5

48h 48+2 h 48+4 h 48+6 hExp

resi

ón

rel

ativ

a d

e m

RN

A

6h2h 4h0 48h

SKF LDL

Células HL60 tratadas con SKF Células HL60 tratadas con SKF 104976 + LDL104976 + LDL

Adaptado de: http://www4.utsouthwestern.edu/moleculargenetics/pages/rawson/lab.html

Regulación transcripcinal por Regulación transcripcinal por esteroles: SREBPesteroles: SREBP

Búsqueda de nuevos genes que Búsqueda de nuevos genes que responden a colesterolresponden a colesterol

DHCR24

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Lov 0 Lov 10 µM LDL 30 µg/ml Lov 10 µM+LDL 30µg/ml

Rat

io N

orm

aliz

ed(D

HC

R24

/RP

LP

0)

DHCR24

0

0,5

1

1,5

2

2,5


Rat

io N

orm

aliz

ed(D

HC

R24

/RP

LP

0)

HMG CoA Reductase

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3


Ra

tio

No

rma

lize

d(H

MG

Co

A R

ed

/RP

LP

0)

HMG CoA Reductase

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3


Ra

tio

No

rma

lize

d(H

MG

Co

A R

ed

/RP

LP

0)

Regulación de la expresión de la Regulación de la expresión de la DHCR24 por colesterolDHCR24 por colesterol

Localización del promotor de la Localización del promotor de la DHCR24 mediante RACE-PCRDHCR24 mediante RACE-PCR

Actividad del promotor de la Actividad del promotor de la DHCR24DHCR24

HepG2

0 2 4 6 8 10 12

13

16B

14A

15

10

14B

14B

7

pH DHCR24

luciferasa/renila

LDL 0

LDL 30

-868

Luc

-643

Luc

-520

Luc

-348

Luc

-258

Luc

-198

Luc

-178

Luc

-164

Luc

-149

Luc

-868

Luc

-643

Luc

-520

Luc

-348

Luc

-258

Luc

-198

Luc

-178

Luc

-164

Luc

-149

Luc

-1051 TATGTCATGTTTAGCTTCTAAACTAAAACATCTCGAAAACTTCCTAAAAT

-1001 TCCATATGAAATGCAAATGGCGCTGGATTTCAGCTTTTGCTGGTAACCGT

-951 GGCAGCTCCCCTACACTGGTTGCTGAGTGAGGGCAGGGCCATCTGCTTTG

-901 CTCACCACCCTACCCGAGGCTTGCAACACTGCCTGGCACAGAGCGGGCCT

-851 GGGGAGTTTACTCGGGCTGAAATGCCTTCCTTCATTCTTTCTCCTCCGGG

-801 CCTCCCATCTGCCTCAGTGAACTGGAAAAAGAGGAAGAGTGCCAGCCATA

-751 GCCTTCCATGCTTCCAATGGCCTCTGGAGTTCACGAACAGGTCTTCACCT

-701 TTCTGGGCTGCTTCCAAGTGTACACAATGGAGCTCACCACTCCCCACTGC

-651 CCAGGACTGCTGTGTAGCTCAAATGAATTCGTGGAAAGTGCCCCCTAAAA

-601 ATGAAAAGATGCCTCTGGAGACCTTGCGCACACCGAGTGGCACGACCTGC

-451 AGAGGTTACCGCCAGGTTTCCATCCTCCGCGCCCGGGAACCGCCTGTCCG

-401 GCCAAAGGGTGACTGACTCAGGGCCGGGGCGCCTCCCAGCCCTCCGGCGG

-351 AAAGCCACTGCAAAACCGCTTAAGGCGCGTTTGGAAGAGGCGGCCCCGCA

-301 GCCCCGAGGGCCTGGGGCCCTGAGTCCCAACTGCCCACCCCCAGTATTCG

CACCC binding factor

-251 CAGCGGACCCCACCGGCACCCAGTCCCTGGCACCCCCGCCTCGCGCGGCG

SP1

-201 GCGGGGAGAAAAGGGTGGAGCGGTCCGACTCCCGCAGCCAATGAAAGCTG

-151 CGGGTTCCTGGTCCGATCCCCGGCGCGGCTCGCCATTGGTCGCCGCCCGG

NFY NFY

-101 GTCTCGGCCCACCGAACCTCGGCGACCCGAGCCAATCGCGAGGCGGCGGG

SP1 SRE SP1

-51 CGATCCCGGGCTCCCCGGGCTGTGGGCTACAGGCGCAGAGCGGGCCAGGC

+1 GCGGAGCTGGCGGCAGTGACAGGAGGCGCGAACCCGCAGCGCTTACCGCG

* * * * * * *

+1

*

-1051 TATGTCATGTTTAGCTTCTAAACTAAAACATCTCGAAAACTTCCTAAAAT

-1001 TCCATATGAAATGCAAATGGCGCTGGATTTCAGCTTTTGCTGGTAACCGT

-951 GGCAGCTCCCCTACACTGGTTGCTGAGTGAGGGCAGGGCCATCTGCTTTG

-901 CTCACCACCCTACCCGAGGCTTGCAACACTGCCTGGCACAGAGCGGGCCT

-851 GGGGAGTTTACTCGGGCTGAAATGCCTTCCTTCATTCTTTCTCCTCCGGG

-801 CCTCCCATCTGCCTCAGTGAACTGGAAAAAGAGGAAGAGTGCCAGCCATA

-751 GCCTTCCATGCTTCCAATGGCCTCTGGAGTTCACGAACAGGTCTTCACCT

-701 TTCTGGGCTGCTTCCAAGTGTACACAATGGAGCTCACCACTCCCCACTGC

-651 CCAGGACTGCTGTGTAGCTCAAATGAATTCGTGGAAAGTGCCCCCTAAAA

-601 ATGAAAAGATGCCTCTGGAGACCTTGCGCACACCGAGTGGCACGACCTGC

-451 AGAGGTTACCGCCAGGTTTCCATCCTCCGCGCCCGGGAACCGCCTGTCCG

-401 GCCAAAGGGTGACTGACTCAGGGCCGGGGCGCCTCCCAGCCCTCCGGCGG

-351 AAAGCCACTGCAAAACCGCTTAAGGCGCGTTTGGAAGAGGCGGCCCCGCA

-301 GCCCCGAGGGCCTGGGGCCCTGAGTCCCAACTGCCCACCCCCAGTATTCG

CACCC binding factor

-251 CAGCGGACCCCACCGGCACCCAGTCCCTGGCACCCCCGCCTCGCGCGGCG

SP1

-201 GCGGGGAGAAAAGGGTGGAGCGGTCCGACTCCCGCAGCCAATGAAAGCTG

-151 CGGGTTCCTGGTCCGATCCCCGGCGCGGCTCGCCATTGGTCGCCGCCCGG

NFY NFY

-101 GTCTCGGCCCACCGAACCTCGGCGACCCGAGCCAATCGCGAGGCGGCGGG

SP1 SRE SP1

-51 CGATCCCGGGCTCCCCGGGCTGTGGGCTACAGGCGCAGAGCGGGCCAGGC

+1 GCGGAGCTGGCGGCAGTGACAGGAGGCGCGAACCCGCAGCGCTTACCGCG

* * * * * * *

+1

*

Posibles factores de Posibles factores de transcripción en el promotor de transcripción en el promotor de

la DHCR24la DHCR24

SRE

Sonda consenso SRE

SondaDHCR24

Extracto nuclear- + + + + - + + + +Sonda DHCR24 no marcada -++ + + -++ + +

Electrophoretic Mobility Shift Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)Assay (EMSA)

Retardo

Sonda-Cy5 libre

Retardo

Sonda-Cy5 libre

Papel del colesterol en la Papel del colesterol en la regulación del ciclo celularregulación del ciclo celular

00 10210233DNADNA

00400

400

Célu

las

Célu

las

GG11

GG22/M/MSS

ControlControl0 h0 h

00 10210233DNADNA

00400

400

Célu

las

Célu

las

GG11 GG22/M/M

SS

00 10210233DNADNA

00400

400

Célu

las

Célu

las

GG11

GG22/M/M

SS

SKF 1, 5 µM SKF 1, 5 µM 48 h48 h

SKF 1, 5 µMSKF 1, 5 µM60 h60 h

La parada del ciclo en G2 es debida a la inhibición de la

actividad cdc2

Martinez-Botas, J., Suarez, Y., Ferruelo, A. J., Gomez-Coronado, D., and Lasuncion, M. A. (1999). Cholesterol starvation decreases p34(cdc2) kinase activity and arrests the cell cycle at G2. Faseb J 13, 1359-1370.


basandose en KEGG PATHWAY Database

(http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html)

Resultados: ParadaResultados: Parada

MODIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA Y

LOS FACTORES DE RIESGO

CARDIOVASCULAR EN LA OBESIDAD MÓRBIDA

Nº PACIENTE 36 10 75 65 18 55 Media

Edad (años) 25 46 61 57 52 51 48.67

Edad inicio obesidad (años) 10 41 25 25 Infancia 15 23.20

Factor desencadenante ---Abandono

tabacoAbandonod

eporteReposo por

enf. ---- ----

Peso máximo (Kg) 165 125 136 130 191 164 151.83

Talla (cm) 170 160 166 167 170 182 169.17

IMC máximo 57.1 48.8 49.3 46.6 66.1 49.5 52.90

Edad cirugía (años) 23 43 60 56 50 50 47.00

Técnica quirúrgica ScopinaroBy-pass gástrico Scopinaro Scopinaro Scopinaro Scopinaro

Peso precirugía (Kg) 162 120 136 116 --- 152.9 137.38

HTA Sí No Sí Sí Sí Sí

Diabetes No No No Sí --- No

Glucemia basal (mg/dl) 112 90 120 113 ---- 105 108.00

Hiperuricemia Sí Sí --- Sí Sí No

A. úrico (mg/dl) 10 11.5 --- --- ---- 6.6 9.37

Triglicéridos (mg/dl) 283 149 107 130 --- 110 155.80

Colesterol total (mg/dl) 205 200 177 160 --- 292 206.80

HDL-colesterol (mg/dl) 27 --- 52 47 --- 62 47.00

LDL-colesterol (mg/dl) 121 --- 103 87 --- 208 129.75

Transaminasas altas Sí Sí No No --- No

Familiares obesos – – +/– + + +++

Peso 6 m postcirugía (Kg) 114 90 108 89.9 --- 120 104.38

Peso 12 m postcirugía (Kg) 91.5 82 100.9 --- --- 118.7 98.28

Δ peso 6 m postcirugía (%) 29.6 25 20.5 22.5 --- 21.5 23.82


Edad (años) 25 46 61 57 52 51 48.67



tabacoAbandonod

eporteReposo por

enf. ---- ----

Peso máximo (Kg) 165 125 136 130 191 164 151.83

Talla (cm) 170 160 166 167 170 182 169.17

IMC máximo 57.1 48.8 49.3 46.6 66.1 49.5 52.90








A. úrico (mg/dl) 10 11.5 --- --- ---- 6.6 9.37










Tejido adiposo subcutáneo Agrupamiento

jerárquico

Cluster 10

Cluster 4

Cluster 3

Cluster 8

Incluir algun gen mas y

comprobarlo en el array


Edad (años) 25 46 61 57 52 51 48.67



tabacoAbandonod

eporteReposo por

enf. ---- ----

Peso máximo (Kg) 165 125 136 130 191 164 151.83

Talla (cm) 170 160 166 167 170 182 169.17

IMC máximo 57.1 48.8 49.3 46.6 66.1 49.5 52.90








A. úrico (mg/dl) 10 11.5 --- --- ---- 6.6 9.37











Edad (años) 25 46 61 57 52 51 48.67



tabacoAbandonod

eporteReposo por

enf. ---- ----

Peso máximo (Kg) 165 125 136 130 191 164 151.83

Talla (cm) 170 160 166 167 170 182 169.17

IMC máximo 57.1 48.8 49.3 46.6 66.1 49.5 52.90








A. úrico (mg/dl) 10 11.5 --- --- ---- 6.6 9.37










Relación de los patrones de expresión con las características

fenotípicas

Hipertensión8 ♀

Controles no obesos

9 ♀

Hipertensión y

diabetes6 ♀

Sin factores de

riesgo cardiovasc

ular8 ♀

Banco de muestras de > 70 pacientes:• Tejido adiposo subcutáneo• Tejido adiposo visceral• Músculo• Sangre• Plasma

Bioquímica-Bioquímica-InvestigaciónInvestigación

Miguel Ángel LasunciónMiguel Ángel LasunciónDiego Gómez-CoronadoDiego Gómez-CoronadoJavier Martínez-BotasJavier Martínez-Botas

Oscar PastorOscar PastorJonatan SánchezJonatan Sánchez

Nuria OleaNuria OleaMiguel MartínMiguel Martín

Sección Endocrinología Sección Endocrinología y Nutrición:y Nutrición:

Clotilde VázquezClotilde VázquezNuria PalaciosNuria Palacios

Servicio de Cirugía Servicio de Cirugía General y Digestivo:General y Digestivo:

Virgilio Fresneda Virgilio Fresneda MorenoMoreno

Roberto PeromingoRoberto Peromingo

microarray de expresiÓn para el estudio de las alteraciones del metabolismo lipÍdico

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