1MicrobiologiA AliMENTElor

- volumul ii -

Patogeni alimentari

Ediie mbuntit i revizuit

Editura AsclepiusBucureti, 2011

coordonatori:

Simona Ivana

Autori:

Alexandru T. Bogdan Iulian ogoe Gheorghe Cmpeanu

Simona Ivana Traian Enache Stelian Britreanu Ipate Iudith Alexandru Popescu

ISBN electronic: 978-606-8236-25-4

2Toate drepturile sunt rezervate editurii. Tiprit n Romnia. Nici o parte din aceast lucrare nu poate fi reprodus sub nici o form, prin nici un mijloc, mecanic sau electronic sau stocat ntr-o baz de date, fr acordul prealabil, n scris, al editurii.

All rights reserved. Printed in Romania. No part of this publication may be reproduced or distributed in any form, by any means or stored in a data base or retrieval system without the prior, written, permission of the editor.

ISBN electronic: 978-606-8236-25-4

Editura Asclepius, BucuretiTel: 072.44.66.481, tel/fax: 021/242.11.01Website: www.asclepius.ro, e-mail: editura@aslcepius.ro

3cuprins

cAPiTolUl 1 BACTERII PATOGENE CE SE TRANSMIT PRIN ALIMENTE 91.1. Patogeni alimentari 91.1.1. Introducere 91.1.2. Modul de transmitere 101.1.3. Patogenitate 111.1.3.1. Descrierea Quorum sensing 131.1.3.2. Biofilmele 161.1.3.3. Factorii sigma alternativi 191.1.3.4. Rspunsul la tolerana acid (ATR) 191.2. Bacteriile Gram pozitive 211.2.1. Listeria monocytogenes 211.3. Bacteriile Gram negative 221.3.1. Genul Salmonella 221.3.2. Escherichia coli 241.3.3. Genul Yersinia 251.3.4. Genul Shigella 261.3.5. Genul Vibrio 261.4. Concluzii 27

CAPITOLUL 2 TOXIINFECII ALIMENTARE PRODUSE DE BACTERII DIN GENUL STAPHYLOCOCCUS 362.1. Staphylococcus aureus 362.1.1. Istoric 362.1.2. Taxonomie 372.1.3. Incidena speciilor de stafilococi n alimente 382.1.4. Condiii de cultivare i caractere culturale 402.1.4.1. Temperatura 412.1.4.2. Efectul substanelor chimice 412.1.5. Caractere morfologice 452.1.6. Proprieti biochimice 452.1.7. Tipurile de enterotoxine stafilococice i incidena lor 472.1.7.1. Proprieti chimice i fizice ale enterotoxinelor stafilococice 492.1.7.2. Modul de aciune al enterotoxinelor stafilococice 502.1.8. Ecologie 52

42.1.8.1. Habitat i distribuire 522.1.9. Patogenitatea 542.1.10. Structura antigenic 592.1.11. Infecia natural 602.1.12. Infecia experimental 622.1.13. Imunoprofilaxie 622.1.14. Sindromul gastroenteritelor stafilococice 632.1.15. Incidena toxiinfeciilor alimentare produse de stafilococi i alimentele vehicul 632.1.16. Prevenirea sindroamelor de intoxicaii stafilococice i de alte intoxicaii alimentare 642.1.17. Staphylococcus aureus meticilino-rezistent (MRSA) 652.1.18. Metode de izolare i identificare a lui Stp. aureus din alimente 66

CAPITOLUL 3 TOXIINFECII ALIMENTARE PRODUSE DE BACTERII DIN GENUL BACILLUS 783.1. Bacillus anthracis 783.1.1. Taxonomie 783.1.2. Istoric 793.1.3. Morfologie 803.1.4. Condiii de cultivare i caractere culturale 813.1.4.1. Aspecte culturale 813.1.5. Proprieti biochimice 823.1.6. Proprieti antigenice 823.1.7. Ecologie 833.1.8. Sensibilitatea fa de factorii de mediu 833.1.9. Patogenitatea 833.1.10. Infecia natural 843.1.11. Infecia experimental 863.1.12. Diagnosticul la om 863.1.12.1. Diagnosticul diferenial 863.2. Bacillus cereus 913.2.1. Introducere 913.2.2. Patogenitate 913.2.3. Sindromul diareic 923.2.4. Sindromul emetic 933.2.5. Determinarea numrului cel mai probabil de germeni (most probable number, MPN) 94

3.3. Bacillus subtilis 1003.3.1. Taxonomie 1003.3.2. Caractere generale 1003.3.3. Morfologie 1003.3.4. Proprieti biochimice 100

CAPITOLUL 4 TOXIINFECII ALIMENTARE PRODUSE DE BACTERIILE DIN GENUL CLOSTRIDIUM 1114.1. Clostridium botulinum 1114.1.1. Taxonomie 1114.1.2. Istoric 1124.1.3. Morfologie 1134.1.4. Condiii de cultivare i caractere culturale 1154.1.5. Proprieti biochimice 1164.1.6. Proprieti antigenice 1174.1.7. Ecologie 1174.1.8. Patogenitate 1184.1.9. Sensibilitatea fa de factorii de mediu 1194.1.10. Intoxicaia botulinic 1204.1.11. Situaia epidemiologic a botulismului 1204.1.12. Situaia botulismului n Romnia, ntre anii 2003 i 2009, 1224.1.13. Metode de izolare i identificare a speciei 133Clostridium botulinum din alimente 1334.1.14. Detectarea lui C. botulinum viabil 1354.2. Clostridium perfringens 1384.2.1. Introducere 1384.2.2. Istoric 1394.2.3. Morfologie 1394.2.4. Condiii de cultivare i caractere culturale 1404.2.5. Proprieti biochimice 1424.2.6. Proprieti antigenice 1434.2.7. Patogenitate 1434.2.8. Infecia experimental 1464.2.9. Infecia natural 1464.2.10. Prevenire i combatere 1474.2.11. Metode de izolare i identificare a lui C. perfringens din alimente 148

5

CAPITOLUL 5 IMPLICAIILE BACTERIILOR DIN GENUL LISTERIA N PRODUCEREA TOXIINFECIILOR ALIMENTARE 1605.1. Listeria monocytogenes 1605.1.1. Caractere generale 1605.1.2. Istoric 1615.1.3. Taxonomie 1625.1.4. Morfologie 1635.1.5. Condiii de cultivare i caractere culturale 1655.1.6. Proprieti biochimice 1665.1.7. Sensibilitatea fa de factorii de mediu 1675.1.8. Structura antigenic 1705.1.9. Patogenitatea 1705.1.10. Izolarea i identificarea 1735.1.11. Listerioza uman 1735.1.12. Epidemiologie 1745.1.13. Transmiterea prin alimente 1765.1.14. Transmiterea listeriozei la animale 1785.1.15. Toxiinfeciile alimentare produse de Listeria monocytogenes 1845.1.16. Profilaxie i combatere 1865.1.17. Metoda i schema de lucru utilizat pentru izolarea i identificarea lui Lis. monocytogenes 189

cAPiTolUl 6 IMPLICAIILE BACTERIILOR DIN GENUL MYCOBACTERIUM N PRODUCEREA TOXIINFECIILOR ALIMENTARE 2016.1. Mycobacterium avium subspecia paratuberculosis 2016.1.1. Istoric 2016.1.2. Morfologie 2016.1.3. Condiii de cultivare i caractere culturale 2016.1.4. Proprieti biochimice 2026.1.5. Proprieti antigenice 2026.1.6. Ecologie 2026.1.7. Patogenitate 202

cAPiTolUl 7 IMPLICAIILE BACTERIILOR DIN FAMILIA ENTEROBACTERIA-CEAE N PRODUCEREA TOXIINFECIILOR ALIMENTARE 208

6

cAPiTolUl 8 IMPLICAIILE BACTERIILOR DIN GENUL SALMONELLA N PRODUCEREA TOXIINFECIILOR ALIMENTARE 2148.1. Caractere generale 2148.2. Istoric 2158.3. Taxonomie 2168.4. Morfologie 2188.5. Condiii de cultivare i caractere culturale 2188.6. Proprieti biochimice 2218.7. Proprieti antigenice 2238.8. Nomenclatura salmonelelor 2278.9. Ecologie 2288.10. Patogenitate 2298.11. Sensibilitatea fa de factorii de mediu 2318.12. Infecia experimental 2318.13. Serotipuri de salmonele patogene 2328.14. Salmoneloza non-tifoidic la om 2358.15. Epidemiologie 2418.15.1. Distribuia cazurilor de salmoneloz uman 2438.15.2. Supravegherea salmonelozelor 2448.16. Rezervoare i ci de infecie 2458.17. Contaminarea alimentelor 246Contaminarea crnii 246Contaminarea oulor 247Contaminarea laptelui i produselor lactate 247Contaminarea n timpul manipulrii alimentelor 2488.18. Msuri de prevenire i combatere a salmonelozelor 2488.19. Diagnosticul de laborator al toxiinfeciilor alimentare produse de salmonele 253Recoltarea probelor 253

7

Cuvnt nainte,

Anul editorial 2010, n domeniul medicinii veterinare marcheaz apariia unei lucrri deosebite, a unui tratat remarcabil de Microbiologie a alimentelor, att de necesar ntr-o perioad, n care, sigurana i controlul alimentelor se impune, att ca pruden profilactic ct i ca necesitate de aliniere acceptat, la tot ceea ce reprezint reglementrile UE.

Lucrarea de fa este realizat pe baza unui material bibliografic extrem de bogat i recent, care poart amprenta experienei profesionale i tiinifice a autoarei, cadru didactic la disciplina de Microbiologie-Imunologie, din anul 1990.

O lucrare de asemenea dimensiuni (compus din cinci volume), acoperitoare a domeniului microbiologiei, a nsemnat un adevrat curaj contient, bazat pe competen i pe obligaia resimit de autor, de a pune la dispoziia celor vizai, nu puini la numr, medici veterinari, medici umani, oameni de sntate public, cercettori, specialiti microbiologi.

Nu n ultimul rnd, tratatul se adreseaz studenilor facultilor de medicin veterinar i medicin uman, chemai s-i neleag importana, din punctul de vedere al sntii animale i al scopului final, Sntatea Public.

O asemenea ntreprindere de lung respir pune la dispoziia generaiilor tinere, un volum de cunotine selecionate i reprezint rspunsul evident, la acumularea informaiilor microbiologice i la aplicaiile rezultatelor cercetrii, n domeniul biotehnologiei.

Modul de prezentare, fr repro, fluent, cu grija cadrului didactic i al omului de tiin, pentru limbaj, exprimarea tiinific ntr-un stil clar i corect mrturisete calitile autoarei. Nu-i uor s-i convingi pe cei vizai, s participe la o asemenea lucrare, chiar dac au motivaia necesar, nu-i uor s dai dovad de perseveren de a ncepe a urmri, redacta, volumele tratatului, ntr-un stil unitar.

Volumul prim al Microbiologiei Alimentelor, cuprinde Bacteriologia General, morfologia-structura celulei procariote, elemente de nutriie i metabolism bacterian, creterea i multiplicarea, utilizri n biotehnologie, influena factorilor fizici, chimici i biologici asupra bacteriilor, genuri bacteriene i ciuperci microscopice (mucegaiuri, levuri) izolate din alimente, sursele principale de microorganisme prezente n alimente, tipuri de fermentaii i produse alimentare.

Mai puin obinuit, ntr-un asemenea tratat este pledoaria pentru cercetare, pentru verificarea ideilor, prin observaii i experimente, care s susin ipoteza de lucru, alturi de deducie i inducie; sunt enumerate calitile cardinale ale celor chemai s lrgeasc orizontul cunotinelor noastre (curiozitate, lipsa prejudecilor, scepticismul, creativitatea i cooperarea, revizuirea opiniilor).

Lucrarea meritorie datorat faptului c pune la ndemn cititorilor avizai numeroase informaii tiinifice, deosebit de utile n domeniile microbiologiei alimentelor.

Prof. univ. Dr. Constantin CIUFECU,UMF Carol Davila,

Membru titular al Academiei de tiine Medicale

8

9cAPiTolUl 1

bAcTErii PATogENE cE SE TrANSMiT PriN AliMENTE

1.1. Patogeni alimentari

1.1.1. introducere

Cu toate ca multe boli infecioase se pot transmite prin alimente (de exemplu: listerioza, colita hemoragic), ne vom referi n acest capitol la cele care produc mbolnviri exclusiv sau predominant prin consumul de produse alimentare (botulism-intoxicaii stafilococice).

Antraxul i bruceloza sunt dou zoonoze temute ce se transmit, ns foarte rar prin consumul unor produse alimentare de la animalele bolnave.

n categoria patogenilor alimentari recunoscui se ncadreaz bacterii, virusuri, fungi, prioni, protozoare, precum i parazii animali multicelulari.

Tabelul 1.1.

Patogeni alimentariBacterii Gram pozitive

Staphylococcus sp.Bacillus cereusB. anthracisClostridium botulinum, C. argentinensisC. perfringens Listeria monocytogenes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis

Bacterii Gram negativeSalmonellaShigellaEscherichiaYersiniaVibrioCampylobacterAeromonas (?)BrucellaPlesiomonas (?)

VirusuriHepatita ANorovirusuri (Norwalk, etc.) Rotavirusuri

PrioniInfecia Creutzfeldt-Jakob (varianta nou)

1.1.2. Modul de transmitere

Este evident c pentru producerea unei toxiinfecii alimentare trebuie ingerat fie agentul patogen, fie toxinele preformate ale acestuia. Cu excepia toxinelor botulinice, aminotoxinelor i a toxinelor fitoplanctonului, aproape toi agenii patogeni menionai pot fi contactai pe cale fecal-oral. Vehicularea acestora se face fie prin intermediul operatorilor din industria alimentar, fie prin vectori (exemplu: insectele), fie prin elemente constituente ale alimentelor, cum ar fi ap contaminat (fig. 1.1.).

Figura 1.1.

Rute fecal-orale de transmitere a patogenilor intestinali de origine alimentar

Gur

Obiecte de joac ale copiilor

Hran, tacmuri

Alimente

Degete

Insecte

Ap

Fecale10

1.1.3. Patogenitate

Pentru ca gazda s fie invadat sunt necesare o suit de evenimente nedorite, pe care agentul patogen trebuie s le execute:

1. s supravieuiasc trecerii prin mediul acid conferit de pH-ul gastric. Unii ageni se protejeaz de acest mediu prin nglobarea n bolul alimentar, iar alii folosesc mecanisme adaptative proprii de rezistena la pH-ul acid;

2. s se ataeze sau s colonizeze pereii intestinali, n aa fel nct s-i poat mri populaia; Prima linie de aprare a organismului mpotriva invaziei patogenilor alimentari este reprezentat de mucoasa intestinal. De exemplu, Lis. monocytogenes strbate stratul de mucus prin intermediul listeriolizinei (LLO), iar C. perfringens nu are nevoie s nving aceast barier pentru c se pare c nu trebuie s se ataeze la esuturile intestinale.

3. s posede arme mpotriva mecanismelor de aprare ale gazdei (de exemplu: limfonodurile asociate intestinului);

4. s fie pregtit de lupta cu noua armat heterogen a microflorei intestinale. Acest lucru se realizeaz pe principiul excluderii competititve, prin faptul c microflora inofensiv odat ataat la toate situsurile disponibile ale pereilor intestinali vor exclude alte microorganisme. Deasemenea, tractul gastrointestinal reprezint un mediu srac n O2 i, de aceea, majoritatea microorganismelor de la acest nivel sunt anaerobe. Totui, s-a observat c, de exemplu, S. typhimurium poate crete n astfel de medii datorit capacitii sale de a ptrunde n celulele mamiferelor.

5. s fie capabili, odat ataai, s elaboreze produi toxici, ori s trea-c de peretele epitelial i s patrund n celulele somatice sau n fagocite (de exemplu: Lis. monocytogenes).

Capacitatea de a respecta aceste cerine nu este la dispoziia oricrui agent microbian, majoritatea lor neputnt nvinge mecanismele defensive ale organismului uman. Aceasta reprezint probabil motivul pentru care nu se pot ncadra n categoria agenilor patogeni care se transmit prin consumul de alimente.

Situsurile de ataare i mecanismele de virulen ale patogenilor alimentari sunt discutate mai jos:

n figura 1.2 este prezentat o diagram a aparatului digestiv al omului, iar n tabelul 1.2 este prezentat o list cu agenii patogeni capabili s colonizeze diferite organe i aparate. n tabelul 1.2 Helicobacter sp. este prezentat ca fiind singura bacterie capabil s colonizeze pereii stomacului. Se tie c Sarcina ventriculi (germen strict anaerob) se dezvolt n stomac, dar nu este un patogen alimentar. Acelai lucru trebuie demonstrat i despre H. peglosi. pH-ul stomacului n timpul ingestiei este ntre 3 i 5 putnd

11

ajunge chiar la 1,5 dac este privat de hran.Figura 1.2.

Diagrama sistemului digestiv uman. Courtesy of John W. Kimball, 1965, Andover Massachusetts

Dini

Limb

Glande salivare

FaringeEpiglot

Ficat

Vezic biliar

Duoden

Cecum

Apendice cecal

Esofag

Stomac

Sfincterul piloric

Pancreas

Intestinul gros

Intestinul subire

Rect

Anus

12

Tabelul 1.2.

Tipuri de toxiinfecii alimentare localizate la nivelul diferitelor organe la om

Musculatura scheleticTrichinella spiralis

StomacHelicobacter pylori

FicatClonorchis - viermele de glbeaz (fascioloz)Listeria monocytogenesHepatita A i E

Intestinul subireAstrovirusuriBacillus cereusCampylobacter jejuni (poriunea distal a ileonului)Clostridium perfringensCryptosporidium parvum Cyclospora cayetanensisEscherichia coli - tulpinile EPEC i ETECGiardia lambliaHepatita A

Listeria monocytogenesRotavirusuriSalmonella spp. (nontifoid) - poriunea terminal a ileonului)S. Typhi (poriunea distal a intestinului subire)Shigella spp. (poriunea terminal a ileonului i jejunului producnd diareea apoas)Toxoplasma gondiiCestodeVibrio choleraeVibrio parahaemolyticusYersinia spp.

intestinul gros/colonCampylobacter spp. (colon)E. coli - tulpinile EHEC (enterohemoragic) i EPEC (enteropatogen) (colonul ascendent i transvers)Entamoeba histolyticaPlesiomonas shigelloides (form aparent)Salmonella EnteritidisShigella sp., n special S. dysenteriae

1.1.3.1. Descrierea Quorum sensing

Aceast metod permite exprimarea anumitor funcii fiziologice i fenotipice bazate pe densitatea populaiei bacteriene. Este prezent aici datorit rolului jucat de densitate n virulena unor bacterii i implicrii acesteia n alte infecii.

Sistemul prototip pentru detectarea densitii este Lux1-LuxR (Lux=gena luminiscent) descris prima dat n 1970 la Vibrio fisheri.

n figura 1.3 este explicat metoda de detectare a densitii la bacteriile Gram negative.

n partea stng a figurii 1.3. o celul de V. fisheri secret moleculele de autoinductor (AI) prin sinteza autoinductorului Lux I.

Se continu (cu un numr mic de celule) producia de AI, far s apar vreun efect de comunicare ntre celule. AI se ataaz proteinei LuxR care este un activator transcripional ce declaneaz expunerea genelor. n tabelul 1.3 sunt prezentate cteva din expresiile fenotipice de la anumite

13

microorganisme.

Fig. 1.3.

Fr transcripia genei int

Densitate celular crescut

Densitate celular sczut

Cu transcripia genei int

Autoinductor (autoinducer)Proteina R

Quorum sensing la organismele Gram negative are dou componente: proteina activator transcripional (proteina R) i molecula AI care este produs prin sinteza autoinductor. AI se acumuleaz n celul pn la nivelul de umplere al acesteia. n acest moment se produce cuplarea moleculelor AI i activarea proteinei R inducnd expresia genei. Proteina R este format din 2 domenii: proteina N-terminal care interacioneaz cu AI i C-terminal implicat n legarea DNA-ului.

Moleculele AI ale bacteriilor Gram negative sunt N-acyl-HSL, (American Society of Microbiology).

Tabelul 1.3.

Cteva rspunsuri fenotipice ale bacteriilor Gram negative, ca o consecin a Quorum Sensing

Bacterii Gram negative Rspunsuri fenotipice

Vibrio fischeri Escherichia coli Escherichia coli mutanta LuxS Escherichia coli Escherichia coliE. coli EHEC i EPECSerratia liquefaciens Serratia marcescens Pantoea stewartii Pectobacterium carotovorum Pectobacterium chrysanthemi Burkholderia cepacia Aeromonas hydrophila Pseudomonas aeruginosa

BioluminiscenProducia toxinei Stxncetinirea vitezei de notFormarea de att/effRspuns SOSSistem secretor tipul IIIMobilitate foarte activProducie de prodigiozin; sinteza carbapenuluiCreterea produciei de polizaharideProducie de enzime care degradeaz peretele celular al plantelorProducerea liazelor pectateProteaze, producerea de sideroforiProducerea de exoproteazeStructur de biofilm

Dac celula din stnga figurii 1.3. se presupune a fi V. fisheri, este non-

14

luminiscent, cea din dreapta este bioluminiscent datorit dobndirii unui quorum de AI care se leag de LuxR.

Autoinductorul-2 (AI-2) reprezint un semnal alternativ al quorumului la V. harveyi unde regleaz bioluminiscena n asociere cu AI-1. Sistemul AI-2 a fost demonstrat la mai multe bacterii patogene Gram negative. Numrul minim de celule necesare pentru a crea un quorum a fost foarte rar raportat. ntr-un studiu al enterobacteriaceelor pshichotrofe de origine alimentar, pentru a da un rspuns pozitiv biosenzorilor folosii, a fost necesar un quorum de cel puin 106 ufc/g. Cele mai studiate i mai folosite substane AI pentru bacteriile Gram negative sunt lactonele M-acetil-homoserine (AHL

s). Aceti compui sunt formai din homoserine (cu un

inel de lacton) i un lan acil cu 3 pan la 10 atomi de carbon (fig. 1.4.). Nu toate bacteriile Gram negative folosesc sistemul Lux I-LuxR. De exemplu, V. harveyi, E.coli i S. typhimurium prezint un sistem de producere diferit al autoinductorilor. n plus, fa de AHLS, unele bacterii Gram negative produc dipeptide ciclice implicate n detectarea quorumului, fie singure, fie n combinaie cu AHLS.

Fig. 1.4.

Structura a 4 autoinductori quorum sensing (Degrassi et al.)

Legend: A = N-butanoil-L-lacton homoserin; B = N-hexanoil-L-lactoz

homoserin; C = ciclo(L-Tir-L-Pro); D = ciclo(L-Leu-L-Pro).

La patogenii alimentari a fost demonstrat creterea toxinelor Stx, iar genele pentru Stx au fost induse de detectarea quorumului.

Anumite bacterii Gram negative psichotrofe produc AHLS n alimente contaminate natural, cnd numrul de celule a ajuns la 105-107 ufc/g.

Detectarea quorumului este important n formarea biofilmelor, iar 15

acest lucru este prezentat mai jos. n cazul bacteriilor Gram pozitive, AI-urile sunt reprezentate de peptide, feromoni peptidici i nisin. Reglarea densitii celulelor din aceste sisteme descrise de ctre Kleerebezen et. al. se pare c urmeaz o tem comun, n care semnalul molecular este dat de un peptid procesat post translaional care este secretat de un ATP-bending-casette-exporter (exportator de casete ce leag ATP-ul).

Feromonul peptidic secretat funcioneaz ca un semnal input (input signal) pentru un senzor specific dintr-un sistem de transducie a semnalului (signal-transduction system) format din dou componente. Este interesant faptul c unele bacterii Gram pozitive cum ar fi Bacillus spp. produc lactonaze care degradeaz specific AHL-urile produse de ctre bacteriile Gram negative. Printre alte activiti fenotipice i fiziologice demonstrate la bacteriile Gram pozitive se numr rspunsul virulent produs de Stp. aureus, precum i producerea de peptide antimicrobiene, altele dect nisina. S-a demonstrat c aceasta din urm i induce propria sintez. Detectarea axonului a fost demonstrat la Stp. aureus i Stp. epidermidis. Cnd cele dou bacterii au fost cultivate mpreun, Stp. epidermidis s-a prut a fi favorit, ceea ce sugereaz c acest lucru ar putea fi motivul pentru care aceast specie predomin pe piele, unde feromonii autoinductori sunt mai eficieni dect n interiorul corpului. La Stp. aureus un feromon octopeptidic i manifest virulena prin activarea locusului agr.

Detectarea quorumului in vivo este problematic din cauza lipsei generale de oportuniti pentru ca substanele AI s ajung la aceasta.

1.1.3.2. Biofilmele

Un biofilm este reprezentat de bacterii, fungi sau protozoare singure sau n combinaii legate mpreun de o matrice extracelular ataat de o suprafa solid sau ferm. Exemplele obinuite includ suprafeele mucoide (slime surfaces) formate pe pietrele sau butenii din apele curgtoare, placa dentar i stratul mucos de pe carne, pete, psri care s-au stricat n frigider. Aceste biofilme ader la suprafeele respective, n special datorit concentraiei mari de nutrieni. n studiile de laborator aderena la suprafee, este mai mare n mediile mbogite. Ataarea este facilitat de o excreie microbian exopolizaharidic ce poart uneori denumirea de glicocalix.

n acest micromediu se formeaz colonii care comunic ntre ele prin canalele de ap formnd astfel un sistem circulator primitiv n care nutrienii sunt adui nuntru, iar subprodusele toxice sunt eliminate. Celulele microbiene din lichide care nu sunt cuprinse n biofilm se afl ntr-o stare de plancton (tree-floating).

16

n timp ce n condiii naturale biofilmele sunt compuse, de obicei, din culturi mixte, n studiile de laborator acestea sunt formate din culturi pure.

Ca exemple de suprafee solide folosite pentru studiul bacteriilor patogene din alimente se pot da: adezivul de podea, lamele de sticl, nylon, policarbonat, polipropilen, cauciuc, oel inoxidabil, teflon, sticl i oel inoxidabil sunt folosite pe scar larg.

Pe baza numeroaselor studii care au fost fcute pe alimente se pot trage urmatoarele concluzii:

1. Cu toate c biofilmele de culturi pure apar n mediile de mbogire (de exemplu: bulion triptic de soia), dup 24 de ore, la temperaturi adecvate creterii, dezvoltarea maxim apare n 3 zile la 24oC. De exemplu Lis. monocytogenes a crescut la 6-7log10/cm.

2. Nu toate tulpinile din aceeai specie sunt capabile n mod egal de iniierea formrii biofilmului, iar ataarea la suprafee i formarea biofilmului reprezint procese diferite.

3. Microorganismele din biofilme pot prezenta reacii fiziologice diferite faa de formele planctonice, iar biofilmele pot conine celule viabile, dar care nu se pot cultiva n condiii de laborator.

4. Microorganismele din biofilme sunt foarte rezistente fa de agenii de curire i sanitaie. Folosii n combinaie acetia sunt mult mai eficieni n eliminarea biofilmului.

5. Ataarea unui patogen la diferite suprafee, poate fi ajutat de formarea unui biofilm de cultur mixt, iar un astfel de exemplu este prezentat mai jos. ntr-un biofilm cu cultur mixt de Lis. monocytogenes i Flavobacterium sp. pe suprafaa de oel inoxidabil Lis. monocytogenes a aderat mai bine i a persistat mai mult dect n cultur pur.

Shewanella putrefaciens a format biofilme pe suprafeele inerte de procesare ale alimentelor, iar cnd s-au adaugat nutrieni au fost formate mai multe straturi de structuri. Tulpinile de Lis. monocytogenes izolate din diferite epidemii umane au produs biofilme unice pe oelul inoxidabil. Acestea erau n form de faguri de miere (honey comb)

Tulpina Scott a fost cea mai interesant prin faptul c nu a format biofilme n condiii de laborator.

ntr-un alt studiu, tulpinile de Lis. monocytogenes care produc cea mai mult substan extrapolimeric (EPS) au produs un biofilm tridimensional n contrast cu tulpinile de control.

Formarea biofilmelor nu a putut fi corelat cu serotipul. La Pseudomonas aeroginosa DNA-ul extracelular a fost esenial pentru formarea biofilmelor folosind un sistem flow-chamber. Cu toate c sursa de DNA nu a fost determinat, DNA-aza 1 a dizolvat biofilmul sugernd c

17

DNA-ul reprezint o parte integral din structura biofilmului.Celulele de Enterococcus faecalis au aderat la celulele cardiace Caco-2

i Girardi, dar mai slab dect cele de control.Inhibarea formrii biofilmelor de ctre Bacillus subtilis (izolat din

algele marine) a fost demonstrat prin folosirea furanonelor.Formarea biofilmelor pe echipamentele medicale de ctre bacterii

ca Ps. aeruginosa i Burkholderia cepacia, produc complicaii grave la pacienii cu fibroz chistic.

Factorii sigma ()Sigma reprezint una din cele 4 subuniti ale RNA polimerazei, iar

rolul su este acela de recunoatere a protomerului (unde RNA-polimeraza se leag de DNA i ncepe transcripia). Subunitatea sigma este implicat numai n formarea complexul iniial DNA-RNA polimeraz. Dup ce a fost format o cantitate mic de RNAm factorul sigma disociaz n sigma A (sau 70=numrul se refer la greutatea molecular n kilodaltoni) i sigma S. Sigma A recunoate majoritatea genelor care codific funciile eseniale ale celulei. Cei mai cunoscui factori sigma sunt reprezentai de 28 implicat n sinteza flagelilor la Salmonella i n sistemul de secreie tip III .

32 (RpoH) este implicat n sinteza proteinelor ocului caloric (heat-shock proteins=HSP

s).

54 regleaz genele harp (implicate n rspunsul hiperimun i n patogenicitate) la cteva patovaroruri de Ps. syringae.

Sigma B i confer rezisten lui Lis. monocytogenes la condiiile acide letale i lui B. subtilis n rspunsul la stres.

Sigma S este prezentat la proteobacteriile din subclasa gamma care includ vibrionii. l ajut pe V. vulnificus s reziste la condiiile de mediu adverse.

Expunerea bacteriilor n condiii acide face ca acestea s dea urmtoarele rspunsuri:

1. Scderea pH-ului intracelular prin folosirea unor pompe de protoni, atunci cnd acetia sunt extrdai din citoplasma de PMF (proton motive force = fora mobilizant de protoni);

2. Repararea unor macromolecule ca DNA i proteinele RecA;3. Schimbri n componentele membranei celulare (de exemplu acizii

grai);4. Reglarea exprimrii genelor de ctre factorii sigma alternativi;5. Densitatea celulelor i formarea biofilmului;6. Alterarea cilor metabolice.

18

1.1.3.3. Factorii sigma alternativi

Dac apare o schimbare stresant n mediul celular, acest lucru duce la producerea factorilor sigma alternativi care ajut celulele s reziste n condiii nefavorabile.

Factorul alternativ, sigma 38 este codificat de ctre gene rpoS i regleaz cel puin 30 de proteine. Expunerea la stress acid duce la sinteza de proteine care protejeaz bacteriile.

n faza logaritmic (log) a creterii celulelor la un pH de 4,5 sunt induse cel puin 43 de proteine.

n faza staionar la un pH de 4,5 sunt sintetizate 15 proteine.

1.1.3.4. Rspunsul la tolerana acid (ATR)

n cazul a dou tulpini de Lis. monocytogenes cultivate ntr-un mediu definit chimic prin folosirea de HCl, pH-ul minim de cretere a fost de 3,5-4.

Mutantele de Lis. monocytogenes care au prezentat ATR crescut au demonstrat letalitate mare pentru oareci, comparativ cu tulpinile slbatice, sugernd c n condiii acide acestea ar putea fi selective pentru tulpinile cu virulen crescut.

n mod similar celulele de Yer. enterocolitica adaptate la un pH 5 (de la un pH de 7,5) au fost mult mai enteropatogene dect celulele de control, cnd au fost testate pe oarecele sugar.

Factorul sigma B a fost identificat la Lis. monocytogenes, B. subtilis i Stp. aureus, iar funcia sa a fost comparat cu cea a lui 5/RpoS de la bacteriile Gram negative.

La B. subtilis, sigma B influeneaz reglarea a 100 gene, ca rspuns la stresul energetic. Mutantele de B. subtilis sunt mai sensibile la cldur, eta-nol, acid, nghe, uscciune. n mod paradoxal o tulpin de Lis. monocyto-genes rezistent la presiunea hidrostatic, a manifestat rezisten la cldur, acid i peroxid de hidrogen.

S-a descoperit c adaptarea lui Lis. monocytogenes la un pH acid ar putea depinde de ali parametrii de cretere.

Proteina sigma B asigur rezistena maxim a lui Lis. monocytogenes la doze letale de acid. Sigma B alturi de sigma S sunt asociate cu rspunsurile la condiiile de stres, att la bacteriile Gram pozitive, ct i la cele Gram negative.

Sigma B joac un rol important n rezistena acid a celulelor bacteriene din faza staionar, rezistena la stresul osmotic i oxidativ i la creterea la

19

temperatur joas a Lis. monocytogenes. Adaptarea la mediul acid confer protecia mpotriva HHP i ngheului.

Tulpinile adaptate la un pH acid de Shi. flexneri i Shi. sonnei au supravieuit pan la 14 zile n sucul de roii i mere la 70C. pH-ul minim necesar dezvoltrii n BHI acidifiat pentru Shi. flexneri i Shi. sonnei a fost de 4,75 i respectiv 4,5.

ntr-un studiu pe E. coli adaptat la pH acid s-a demonstrat c aceasta a rmas pe carcasele de vit, chiar i dup o splare a acestora cu acid acetic 2%.

Rezistena la pH acid a fost foarte bine studiat la Shigella. Gorden i Small au descoperit n culturile examinate c 9 din 12 bacterii din genul Shigella erau rezistente la pH acid; 11 din 15 tulpini de E. coli (incluznd tulpinile K12 ) au manifestat aceeai rezisten, iar din 12 salmonele studiate toate au prezentat rezisten la pH acid.

Aceiai cercettori au stabilit i motivul pentru care boala poate fi produs de un numr mic de germeni. Ei au ajuns la concluzia c dup ce aceste microorganisme prsesc colonul, ele intr n faza staionar, n afara gazdei. n urma ingestiei de ctre alt gazd, ele sunt deja rezistente la pH-ul acid al stomacului.

ntr-un alt studiu tulpinile de E. coli productoare de Stx, care nu puteau supravieui la un pH de 2,5 au devenit acidorezistente prin introducerea unei gene rpoS ntr-o plasmid. Cnd tulpinile de E. coli productoare de Stx s-au dezvoltat pe diferite alimente la un pH de 4,6-4,7 ele au devenit de 2 ori mai rezistente la radiaii dect culturile de control.

n timp ce doza infecioas de salmonele pentru om este de aproximativ 105, atunci cnd este administrat n condiii definite, boala poate fi provocat prin consumul de alimente ce conin 50-100 celule (ali cercettori susin c poate fi provocat doar de 10 celule).

O tulpin virulent pentru oareci de S. typhimurium este mult mai acidorezistent dect tulpina nevirulent.

ntr-un studiu asupra rezistenei relative a lui V. vulnificus i fagii si, ambii au fost sensibili la un pH

1.2. Bacteriile Gram pozitive

n general bacteriile patogene Gram pozitive produc substane extracelulare responsabile de majoritatea factorilor de virulena (de exemplu Staphylococus aureus).

Gastroenteritele sunt produse de ctre tulpinile enterotoxigene. Toxiinfeciile alimentare produse de C. botulinum, C. perfringens i B. cereus se datoreaz tot producerii de exotoxine.

Botulismul este produs de o neurotoxin puternic elaborat de bacteriile care se dezvolt n alimentele susceptibile.

Enterotoxina produs de C. perfringens (CPE) este o protein asociat endosporului produs n timpul sporulrii celulelor bacteriene n tractul gastrointestinal. Toxina produs de B. cereus este o exotoxin, dar componentele toxice care cauzeaz sindromul diareic nu sunt foarte bine cunoscute.

Stp. aureus a fost prima bacterie izolat din alimente creia i s-a stabilit modul de patogenitate. A fost studiat pentru prima dat de ctre Denys, n 1894 i apoi de ctre Barder, n 1914 prin reproducerea simptomelor infeciei alimentare produs de stafilococi pe el nsui. Deck, n 1930, a reprodus boala pe studenii absolveni voluntari, care au consumat alimente inoculate cu un filtrat de cultur de S. aureus.

1.2.1. Listeria monocytogenes

Cu toate c este o bacterie Gram pozitiv este foarte diferit de cele menionate mai sus. Diferena notabil const n faptul c este un patogen intracelular. Aceasta ptrunde n citosol, unde se replic i folosete acidul lipoic de la gazd pentru replicare. Pentru a invada celulele epiteliale, internalina interacioneaz cu E-caderina de pe celulele gazd umane (E-caderinele de la oarece sau obolan nu sunt receptori pentru internalin).

Cu toate c tulpinile virulente produc listeriolizin O (LLO), o substan extracelular, activat de ctre tiol, formatoare de pori, nu se produce sindromul de gastroenterit de origine alimentar, ca atare.

LLO este o hemolizin implicat n invadarea epiteliului intestinal ce contribuie la rspndirea de la o celul la alta a microorganismului.

Secvena PEST (P = prolin; E = acid glutamic; S = serin; T = treonin) a LLO este esenial pentru virulena lui Lis. monocytogenes. Dup ce iese din lizozomi, aceast secven induce macrofagele gazdei s degradeze LLO. Mutantele fr secvena PEST ptrund n citosol i omoar

21

celula gazd.Mecanismul de aciune (strbaterea barierei mucoasei intestinale i

ptrunderea n celulele epiteliale) nu este pe deplin cunoscut. De asemenea, numai 1/3 din oamenii contaminai manifest simptome.

Primul rspuns de aprare al organismului mpotriva listeriilor este reprezentat de macrofage, n special de celulele Kuppffer din ficat. Ele ptrund n aceste celule fiind internalizate n celule M, n mod nedistructiv. Acest lucru este urmat de inducerea imunitii mediate de celulele T.

Neutrofilele polimorfonucleare (PMN) lizeaz celulele parenchima-toase infectate de Listeria sp. i expun bacteria fagocitelor profesionale.

PMN conin anioni superoxizi, enzime proteolitice i ali factori.Cnd aceste neutrofile interacioneaz cu Lis. monocytogenes ele

prezint creteri ale citochinelor (interleukina-1beta, interleukina 6, factorul de necroz tumorala=TNF).

Odat ce listeriile sunt fagocitate, celulele ies prin liza membranei vacuolare cu LLO, se mic prin citosol prin filamentele de actin, iar apoi se rspndesc n celulele nvecintate unde procesul se repet. Tulpinile virulente se deosebesc de cele nevirulente prin capacitatea de aderare i de ptrundere prin bariera mucoas i epitelial i prin capacitatea de a se rspndi de la o celul la alta cu ajutorul LLO.

1.3. Bacteriile Gram negative

Mecanismele de virulen ale bacteriilor Gram negative sunt mult mai complexe i variate faa de cele ale bacteriilor Gram pozitive.

1.3.1. Genul Salmonella

Se presupune c genurile Salmonella i Escherichia s-au desprins dintr-un strmo comun n urm cu 120-160 milioane de ani. Toate serovarurile de S. enterica poart insulele de patogenitate 1 i 2 (SPI-1, SPI-2) care au fost obinute prin transfer orizontal, prin plasmide sau prin fagi.

La S. typhimurium sunt necesare cel puin 60 de gene pentru virulen. Prin comparaia dintre secvenele 16s i 23s ale RNAr s-a demonstrat c salmonelele sunt nrudite cu E. coli i cu shigelele. Serovarurile monofazice de salmonele sunt adaptate la mamifere, iar cele bifazice la reptile.

S. enterica i E. coli posed un numr mare de fenotipuri mutagene, ceea ce a dus la mrirea numrului de recombinri ntre diferite specii.

La S. typhimurium a fost demonstrat prezena unei enterotoxine 22

polipeptidice de 29 kDa, care posed urmtoarele trsturi: 1. reacioneaz cu toxina holeric; 2. activeaz adenilat-ciclaza; 3. receptorul celular preferat al celulei gazd este gangliozidul GM1; 4. testul ansei ileale este pozitiv.

Aceste concluzii sugereaz c toxina ar putea juca un rol n producerea diareei n sindromul salmonelic, ns rolul n invazia intracelular i n patogeneza subsecvenial este neclar. Producia altor proteine citotoxice a fost raportat la salmonelele non-tifoide.

Tulpinile virulente de S. enterica iniiaz infecia n celulele non-fagocitare, atandu-se la mucoasa intestinal cu ajutorul adezinelor fimbriale, codate de o gen de pe SPI-1. Aceasta, este urmat de penetrarea foliculilor limfoizi ai plcilor Peyer din mucoasa intestinal. Iniierea infeciei are loc n ileon. O dat intrate salmonelele invadeaz celulele M ale plcilor Peyer. Din veziculele acestor celule ele intr n lizozomi.

Tulpinile virulente de S. enterica secret n citoplasm o protein (SpiC) care previne fuzionarea veziculelor cu lizozomii.

S. typhimurium conine fimbrii care ader selectiv la celulele M. Pentru a ptrunde n celulele non-fagocitare sunt ajutate de un sistem de secreie de tip III.

Dup observaiile lui Galn, acest mecanism de ptrundere implic o interaciune intim ntre bacterie i celula gazd, care rezult din cross-talk. Consecina se traduce prin rearanjri ale citoscheletului membranei i ptrunderea bacteriilor prin macropinocitoz. Are loc producerea de citokine (interleukina 8) i apariia neutrofilelor de-a lungul celulelor epiteliale. Odat intrate n aceste celule ele rmn n vacuole ataate de membrane pe toat durata fazei intracelulare. Dup multiplicare, celulele se rup, avnd loc rspndirea salmonelelor. Ptrunderea acestora n macrofage este nsoit de schimbri la nivelul membranei i de macropinocitoz. Odat intrate n membrane, ptrund n interiorul fagozomilor care se mresc n volum. S. typhimurium induce apoptoz n macrofage.

Serovarurile de salmonele nontifoide au grade diferite de patogenitate pentru om. S. Pullorum i S. Gallinarum sunt slab patogene, iar S. Choleraesuis, S. Dublin i S. enteritidis sunt nalt patogene.

Salmonella Choleraesuis se izoleaza mai frecvent din snge, dect din scaunele bolnavilor. Acest serovar mpreun cu S. Dublin sunt asociate cu o mortalitate mai mare la om. S. Choleraesuis produce de obicei septicemie. ntr-un studiu pe 19 cazuri cu salmoneloz cauzat de acest serovar, toate victimele au fcut septicemie.

23

1.3.2. Escherichia coli

Tulpinile patogene se grupeaz n 5 grupe. Vom aborda n cele ce urmeaz tulpinile enteropatogene (EPEC) i pe cele enterohemoragice (EHEC).

Dup cum am mai menionat, Salmonella i Escherichia provin dintr-un strmo comun i din aceast cauz genele de virulen au fost schimbate ntre ele prin transfer orizontal. Insula de patogenitate de pe cromozomul EHEC i EPEC include LEE care conine gene eae care codific intimina, esenial pentru ataare-anulare (attachment-effacement, A-E). Gena eae i LEE sunt transferate orizontal la EHEC.

Tulpinile EPEC conin proteina espB, care le face similare cu EHEC. Se pare c tulpinile EHEC provin din EPEC prin achiziia toxinelor shiga codificate de fagi. n acest sens, exist dovezi care arat evoluia secvenial a lui EHEC din EPEC O55:H7, dobndind mai nti gene Stx2, separate apoi n dou ramuri. Tulpinile din prima ramur, sorbitol i -glucuronidaz negative (clona O157:H7), iar cele din cea de-a doua ramur produc glucuronidaz i sorbitol (clona O157:H7). Acest lucru a fost demonstrat prin electroforez enzimatic multilocular.

Tulpinile EHEC au nevoie pentru colonizare de intimin (dar nu este suficient pentru adeziune). Posibila folosire a vaccinurilor, bazate pe intimin a fost sugerat pentru protejarea vacilor mpotriva infeciilor cu EHEC. Patogenitatea acesteia se datoreaz toxinei Stx, endotoxinelor i citokinelor derivate de la gazd, cum ar fi factorul de necroz tumoral (TNF-) i interleukin 1. Toxinele Stx1 i Stx2 inhib sinteza proteinelor n celulele endoteliale, iar receptorul lor este globotriasilceramida (Gb3).

Stx2 este mai toxic dect Stx1 pentru celulele endoteliale microvas-culare ale intestinului uman, iar aceast descoperire ar putea fi relevant pentru preponderena produciei de Stx2 n colitele hemoragice infecioase.

Tulpinile EPEC au nevoie pentru aderen i autoaglutinare de bundle-forming pili (bfp) (pili formatori de grmezi), de tip IV formai de plasmide. ntr-un studiu pe voluntari umani s-a observat c mutantele care nu posed bfp au cauzat un sindrom diareic mai puin sever, fiind de 200 de ori mai puin virulente.

Citrobacter freundii i Hafnia alvei produc leziuni A/E, n special la unele specii de animale, dar nu s-a demonstrat nc, c ar putea fi patogeni alimentari.

24

1.3.3. Genul Yersinia

Yesinia enterocolitica (i alte specii) posed un determinant cromozomal implicat n prelucrarea fierului, care este privit ca o insul de patogenitate (PI). Aceast insul se gsete n special la tulpinile EAggEC i, mai rar la EPEC, EIEC i ETEC; este absent la EHEC, salmonele i shigele.

A fost probabil dobndit prin transfer orizontal ntre Yer. pestis i unele tulpini de E. coli. Cel mai important mecanism de patogenitate la Yer. enterocolitica, Yer. pestis i Yer. pseudotuberculosis este reprezentat de virulonul proteic extern (yersiniae outer protein virulon) (Yop).

Acest virulon permite yersiniilor s supravieuiasc i s se multiplice n esutul limfoid al gazdei fiind format din 4 componente. Yop este codificat de o plasmid de 70kb, pYV i posed insula de patogenitate nalt 1, care este necesar pentru exprimarea virulenei i determin dependena de Ca2+.

Yop este sintetizat la 370C i translocat n celulele mamiferelor n momentul contactului cu acestea. Bacteriile Gram pozitive pot secreta aceste proteine n afara celulei, fiind lipite de membrana extern.

n sistemul secretor de tip 1 al bacteriilor Gram negative, proteinele acestora sunt secretate direct din citoplasm n mediu prin dou proteine citoplasmatice i una din membrana extern.

Aportul de secreie al yersiniilor este n mod normal inut nchis n membrana extern de ctre YopN care acioneaz ca un dop.

YopN poate fi ndeprtat prin eliminarea Ca2+, moment n care proteinele Yop sunt secretate din citoplasm la exterior. Proteina YopP este responsabil de supresia secreiei de -TNF de ctre macrofagele infectate.

Cnd Yop vine n contact cu celula eucariot se formeaz un mecanism de microinjecie, ce permite proteinei s treac direct n celul prin sistemul secretor de tip III. Acest proces a fost descris de ctre Silhavy ca fiind moartea macrofagelor prin injecie letal. Falkow a descris plastic acest proces prin urmatoarele cuvinte: shigelele oblig macrofagele s comit suicid.

Sistemul secretor de tip III de la S. typhimurium a fost descris ca structur supramolecular, att a membranei interne, ct i a celei externe.

Bacteriile patogene pentru plante, ca de exemplu, cele din genurile Erwinia, Xanthomonas, Pseudomonas i Ralstonia posed sistem de tip III. Un sistem de tip IV l posed Agrobacterium tumefaciens (bacterie patogen pentru plante).

25

1.3.4. Genul Shigella

Celulele M din plcile Peyer (din ileonul terminal) sunt invadate de shigele, salmonele, EPEC sau virusuri. Tulpinile invazive de Shigella flexneri ptrund n celulele M ale colonului i rectului, iar macrofagele mor prin apoptoz. Rezultatul se traduce printr-un rspuns inflamator acut nsoit de dizenterie. Acest tip de distrugere produce pierderea de snge i mucus din lumenul intestinal. Datorit faptului c absorbia apei de ctre colon este inhibat, rezult scaunele dizenterice apoase. Acest lucru se datoreaz multiplicrii shigelelor n timpul trecerii lor n jejun. Dintre toate speciile de shigele, Shi sonnei produce cel mai des diaree apoas. n ceea ce privete doza minim infecioas s-a stabilit ntr-un studiu pe voluntari c doar 10 celule au reprodus boala la 10% dintre acetia, iar o doz de 500 de celule a produs infecia la 50% dintre subieci.

Toxina Shiga de tip 1de la Shi. disenteriae se combin cu galabioza i inhib sinteza proteinelor. Sindromul uremic hemolitic (HUS - Hemolytic Uremic Syndrome) produs de tulpinile EHEC ale lui E. coli, poate fi uneori generat i de Shi. dysenteriae.

1.3.5. Genul Vibrio

La V. parahaemolyticus patogenitatea este asociat cu producerea de TDH (thermostabile direct hemolysin) (hemolizin termostabil direct). Aceasta este responsabil de: hemoliza, ptc (pore-forming capacity), efectele citotoxice, letalitatea la animalele mici i enterotoxigenicitate.

Tulpinile 01 ale lui V. cholerae colonizeaz epiteliul intestinului subire (n special celulele M), ceea ce duce la diaree profuz. Factorii primari de virulen ai acestei tulpini sunt reprezentai de: TCP (toxin-coregulated pili), necesari pentru colonizarea intestinal i de toxina holeric (CT) (cholera toxin), care este o enterotoxin. Genele pentru CT (ctxAB) fac parte dintr-un element genetic mai mare, CTX care constituie genomul unui bacteriofag filamentos, denumit CTX nrudit cu colifagul M13.

Ultimele investigaii au artat c CTX izolat din 10 tulpini de V. cholerae a infectat tulpinile CT negative. Totui aceti cercettori au menionat c inducia fagic s-ar putea s nu aib loc n intestinele umane.

Acest locus de patogenitate reprezint un exemplu de transfer orizontal de gene care poate duce la apariia unor noi tulpini patogene.

O caracteristic neobinuit a lui V. cholerae o reprezint faptul c posed doi cromozomi circulari. Cel mare conine peste 2,96 milioane de baze i conine i gene implicate n virulen. Cromozomul mic conine

26

peste 1,07 milioane de baze i multe gene cu funcii necunoscute.Subunitatea toxinei holerice B (CTB) se ataeaz la gangliozidul GM1

al receptorilor de suprafa celulari.Rolul bacteriofagilor n transmiterea genelor de virulen este ilustrat

de elementul genetic CTX.n cazul patogenilor alimentari, genele sunt mediate fagic pentru

urmtoarele toxine: enterotoxina stafilococic A, Stx1 i Stx2 de la tulpinile EHEC de la E. coli i toxinele botulinice.

1.4. Concluzii

n tabelul 1.4 sunt prezentate 8 bacterii Gram negative care posed cel puin o proprietate ce poate fi asociat cu patogeneza bacteriilor din alimente. Ele nu reprezint ageni patogeni alimentari primari deoarece sunt incapabili s adere i s invadeze celulele epiteliale.

Aeromonas hydrophila i Plesiomonas shigeloides s-au aflat pe lista de supraveghere a microbiologilor timp de 2 decenii, dar nu s-a putut demonstra c pot produce gastroenterit n absena unui alt enteropatogen.

n tabelul 1.5 sunt prezentai ultimii 8 patogeni alimentari descoperii. nvCJD este cea mai nou toxiinfectie alimentar descoperit.

Tabelul 1.4.

Exemple de bacterii Gram negative care posed factori de virulen

bacterii gram negative Factor de virulenAeromonas caviae A. hydrophila Bacteroides fragilis Citrobacter freundii Enterobacter cloacae Hafnia alvei Klebsiella pneumoniae Plesiomonas shigelloides

EnterotoxinEnterotoxin citotoxicEnterotoxinEnterotoxin termo-stabil; Leziuni A/E (attaching and effacing)Enterotoxin termo-stabilProducere leziuni A/EEnterotoxin termo-stabilEnterotoxin termo-stabil

Tabelul 1.5.

Cei mai receni patogeni de origine alimentar

Patogen/Sindrom Anul n care a fost descoperit

Botulismul la copiiYersinia enterocoliticaCyclospora cayetanensisNorwalk i virusuri nruditeVibrio cholerae non-01Listeria monocytogenesE. coli enterohemoragicCreutzfeldt-Jakob (v CJD) varianta nou

19761976197719781979198119821996

27

Bacteroides sp.: Bacili gram negativi

Mediu Thiosulfate Citrate Bile Salt Su-crose agar (TCBS) utilizat pentru izolarea selectiv a Vibrio cholerae i Vibrio para-haemolyticus din probe clinice. n imagine colonii de 24 ore, incubate n aerobioz la 35C de Vibrio cholerae (galbene), Vibrio parahaemolyticus (colonii verzi), Staphy-lococcus aureus nu a crescut.

Mediu Agar Eosin-Albastru de Metilen (EMB): difereniaz bacteriile enterice Gram-negative pe baza fermentrii lactozei. Bacteriile lactozo-fermentative formeaz colonii netede verde metalizat sau albastru nchis pn la brun nchis. Bacteriile care nu fermenteaz lactoza formeaz colonii incolore sau transparente uor purpurii. n imagine cultur aerob de 24 ore, 35C: colonii E. coli bine crescute, cu luciu verde metalizat i colonii Klebsiella pneumoniae bine crescute, purpurii, rugoase.

Mediu Agar Salmonella-Shigella (SS): mediu selectiv i diferenial pentru bacilii enterici patogeni (n special salmonele). Bacteriile lactozo-fermentative (E. coli, Klebsiella pneumoniae) formeaz colo-nii mici roz sau roii. Bacteriile lactozo-nefermentative (Salmonella sp., Proteus sp., Shigella sp.) formeaz colonii incol-ore. Prin producia de H2S centrul coloni-ilor produse de salmonele se negrete. n imagine cultur aerob de 24 ore, 35C: colonii incolore, cu centrul netru de Salmo-nella typhi i colonii roz de E. coli.

28

Bibliografie selectiv

Archer, D.L. 1996. Preservation microbiology and safety: Evidence that stress 1. enhances virulence and triggers adaptive mutations. Trends Food Sci. Technol.

7:91-95.

Bagamboula, C.F., M. Uyttendaele, and J. Debevere. 2002. Acid tolerance of 2. Shigella sonnei and Shigella flexneri. J. Appl. Bacteriol. 93:479-486.

Bagge, D., M. Hjelm, C. Johansen, I. Huber, and L. Gram. 2001. 3. Shewanellaputrefaciens adhesion and biofilm formation on food processing

surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 67:2319-2325.

Baumler, A.J., R.M. Tsolis, T.A. Ficht, and L.G. Adams. 1998. Evolution of host 4. adaptation in Salmonella enterica. Infect Immun. 66:4579-4587.

Berry, E.D., and C.N. Cutter. 2000. Effects of acid adaptation of Escherichia coli 5. 0157:H7 on efficacy of acetic acid spray washes to decontaminate beef carcass

tissue. Appl. Environ. Microbiol. 66:1493-1498.

Bieber, D., S.W. Ramer, and C.-Y. Wu. 1998. IV pili, transient bacterial aggregates, 6. and virulence of enteropathogenic Escherichia coli. Science 280:2114-2118.

Blackman, I.C., and J.F. Frank. 1996. Growth of 7. Listeria monocytogenes as a biofilm on various food-processing surfaces. J. Food Protect. 59:827-831.

Boerlin, P., S. Chen, and J.K. Colbourne. 1998. Evolution of enterohemonhagic 8. Escherichia coli hemolysin plasmids and the locus for enterocyte effacement in

Shiga toxin-producing E. coli. Infect. Immun. 66:2553-2561.

Boland, A., andG.R. Cornells. 1998. Role of YopP in suppression of tumor necrosis 9. factor alpha release by macrophages during Yersinia infection. Infect. Immun.

66:1878-1884.

Borucki, M.K., J.D. Peppin, D. White, F. Loge, and D.R. Call. 2003. Variation 10. in biofilm formation among strains of Listeria monocytogenes. Appl. Environ.

Microbiol. 69:73367342.

Bremer, P.J., I. Mond, and CM. Osborne. 2001. Survival of 11. Listeria monocytogenes attached to stainless steel surfaces in the presence or absence of Flavobacterium

spp. J. Food Protect. 64:1369-1376.

Buchanan, R.L., S.G. Edelson, and G. Boyd. 1999. Effects of pH and acid resistance 12. on the radiation resistance of enterohemorrhagic Escherichia coli. J. Food Protect.

62:219-228.

Buswell, CM., YM. Herlihy, L.M. Lawrence, J.T. McGuiggan, P.D. Marsh, C.W. 13. Keevil, and S.A. Leach 1998. Extended survival and persistence of Campylobacter

spp. in water and aquatic biofilms and their detection by immunofluorescent-

antibody and -rRNA staining. Appl. Environ. Microbiol. 64:733-741.

Carpenter, B., and O. Cerf. 1993. Biofilms and their consequences, with particular 14.

29

reference to hygiene in the food industry. J. Appl. Bacteriol. 75:499-511.

Centers for Disease Control and Prevention. 2003. Preliminary FoodNet data on 15. the incidence of foodborne illnesses Selected sites, United States, 2002. Morb.

Mortal. Wkly. Rep. 52:340-343.

Cheetham, B.F., and M.E. Katz. 1995. A role for bacteriophages in the evolution 16. and transfer of bacterial virulence determinants. Mol. Microbiol. 18:201-208.

Christensen, H., S. Nordentoft, and J.E. Olsen. 1998. Phylogenetic relationships of 17. Salmonella based on rRNA sequences. Int. J. Syst. Bacteriol. 48:605-610.

Chumkhunthod, P., H. Schraft, and M.W. Griffiths. 1998. Rapid monitoring 18. method to assess efficacy of sanitizers against Pseudomonas putida biofilms. J.

Food Protect. 61.1043-1046.

Cloak, O.M., B.T. Solow, C.E. Briggs, C.-Y. Chen, and P.M. Fratamico. 2002. 19. Quorum sensing and production of autoinducer-2 in Campylobacter spp.,

Escherichia coli 0157:H7, and Salmonella enterica serovar Typhimurium in foods.

Appl. Environ. Microbiol. 68:4666-4671.

Coconnier, M.-H, E. Dlissi, and N. Robard. 1998. 20. Listeria monocytogenes stimulates mucus exocytosis in cultured human polarized mucosecreting intestinal

cells through action of listeriolysin O. Infect. Immun. 66:3673-3681.

Comelis, G.R., and H. Wolf-Watz. 1997. The Yersinia Yop virulon: A bacterial 21. system for subverting eukaryotic cells. Mol. Microbiol. 23:861-867.

Costerton, J.W. 1994. Biofilms, the customized microniche./. Bacteriol. 176:2137-22. 2142.Cotter, P.D., and C. Hill. 2003. Surviving the acid test: Responses of Gram-positive 23. bacteria to low pH. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67:429^153.

DAoust, J.Y. 1997. Salmonella species. In Food MicrobiologyFundamentals and 24. Frontiers, ed. M.P. Doyle, L.R. Beuchat, and T.J. Montville, 129-158. Washington,

DC: ASM Press.

Dack, G.M., WE. Cary, O. Woolpert, and H. Wiggers. 1930. An outbreak of food 25. poisoning proved to be due to a yellow hemolytic staphylococcus. J. Prev. Med.

4:167-175.

Davies, D.G., M.R. Parsek, J.P. Pearson, B.H. Iglewski, J.W. Costerton, and E.P. 26. Greenberg. 1998. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a

bacterial biofilm. Science 280:295-298.

Davis, M.J., P.J. Coote, and C.P. OByrne. 1996. Acid tolerance in 27. Listeria monocytogenes: The adaptive acid tolerance response (ATR) and growth-phase-

dependent acid resistance. Microbiology 142:2975-2982.

Dean-Nystrom, E.A., B.T. Bosworth, H.W. Moon, and A.D. OBrien. 1998. 28. Escherichia coli 0157.H7 requires intimin for enteropathogenicity in calves. Infect.

Immun. 66:4560-4563.

Decatur, A.L., and D.A. Portnoy. 2000. A PEST-like sequence in listeriolysin O 29.

30

essential for Listeria monocytogenes pathogenicity. Science 290:992-995.

Degrassi, G., A. Anguilar, M. Bosco, S. Zahariev, S. Pongor, and V. Venturi. 2002. 30. Plant growth-promoting Pseudomonas putida WCS358 produces and secretes

four cyclic dipeptides: Cross-talk with quorum sensing bacterial sensors. Curr.

Microbiol. 45:250-254.

De Kievit, T.R., and B.H. Iglewski. 2000. Bacterial quorum sensing in pathogenic 31. relationships. Infect. Immun. 68:4839-4849.

Dong, Y.-H., A.R. Gusti, Q. Zhang, J.-L. Xu, and L.-H. Zhang. 2002. Identification 32. of quorum-quenching N-acyl-homoserine lactonases from Bacillus species. Appl.

Environ. Microbiol. 68:1754-1759.

Donnenberg, M.S., J.B. Kaper, and B.B. Finlay. 1997. Interactions between 33. enteropathogenic Escherichia coli and host epithelial cells. Trends Microbiol.

5:109-114.

Dunny, G.M., and B.A.B. Leonard. 1997. Cell-cell communication in Gram-34. positive bacteria. Ann. Rev. microbiol. 51:527-564.

DuPont, H.L., M.M. Levine, and R.B. Hornick. 1989. Inoculum size in shigellosis 35. and implications for expected mode of transmission. /. Infect. Dis. 159:1126-

1128.Elhanafi, D., B. Leenanon, W. Bang, and M.A. Drake. 2004. Impact of cold 36. and cold-acid stress on poststress tolerance and virulence factor expression of

Escherichia coli 0157:H7. /. Food Protect. 67:19-26.

Falkow, S. 1996. The evolution of pathogenicity in Escherichia, Shigella, and 37. Salmonella. In Escherichia coli and SalmonellaCellular and Molecular Biology,

2nd ed., ed. F.C. Neidhardt, 2723-2729. Washington, DC: ASM Press.

Faruque, S.M., Asadulghani, A.R.M. Abdul Alim, M.J. Albert, K.M.N. Islam, and 38. J.J. Mekalanos. 1998. Induction of the lysogenic phage encoding cholera toxin

in naturally occurring strains of toxigenic Vibrio cholerae 01 and 0139. Infect.

Immun. 66:3752-3757

Feng, P.K., A. Lampel, and H. Karch. 1998. Genotypic and phenotypic changes in 39. the emergence of Escherichia coli 0157:H7. J. Infect. Dis. 177:1750-1753.

Ferreira, A., D. Sue, C.P. OByrne, and K.J. Boor. 2003. Role of 40. Listeria monocytogenes SB in survival of lethal acidic conditions and in the acquired acid

tolerance response. Appl. Environ. Microbiol. 69:2692-2698.

Frank, J.F., and R.A. Koffi. 1990. Surface-adherent growth of 41. Listeria monocytogenes is associated with increased resistance to surfactant sanitizers and

heat. J. Food Protect. 53:550-554.

Fratamico, P.M. 2003. Tolerance to stress and ability of acid-adapted and non-acid 42. adapted Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104 to invade and survive in

mammalian cells in vitro. J. Food Protect. 66:1115-1125.

Fuqua, W.C., S.C. Winans, and E.P. Greenberg. 1994. Quorum sensing in bacteria: 43.

31

The Lux-R-Luxl family of cell density-responsive transcriptional regulators. J.

Bacteriol. 16:269-275.

Galan, J.E. 1996. Molecular genetic bases of Salmonella entry into host cells. Mol. 44. Microbiol. 20:263-271.

Gellin, B.G., and C.V. Broome. 1989. Listeriosis. JAMA 261:1313-1320.45. Gorden, J., and P.L.C. Small. 1993. Acid resistance in enteric bacteria. Infect. 46. Immun. 61:364-367.

Gram, L., A.B. Christensen, L. Ravn, S. Molin, and M. Givskov. 1999. Production of 47. acylated homoserine lactones by psychrotrophic members of the Enterobacteriaceae

isolated from foods. Appl. Environ. Microbiol. 65:3458-3463.

Groisman, E.A., and H. Ochman. 1997. How Salmonella became a pathogen. 48. Trends Microbiol. 9:343-349.

Hacker, J., and J.B. Kaper. 2000. Pathogenicity islands and the evolution of 49. microbes. Ann. Rev. Microbiol. 54:641-679.

Holden, M.T.G., S.R. Chhabra, R. de Nys, P. Stead, N.J. Bainton, P.J. Hill, M. 50. Manefield, N. Kumar, M. Labatte, D. England, S. Rice, M. Givskov, G.P.C.

Salmond, G.S.A.B. Stewart, B.W. Bycroft, S. Kjelleberg, and P. Williams. 1999.

Quorum-sensing cross talk: Isolation and chemical characterization of cyclic

dipeptides from Pseudomonas aeruginosa and other Gram-negative bacteria. Mol.

Microbiol. 33:1254-1266.

Humphrey, T.J., N.P. Richardson, K.M. Statton, and R.J. Rowbury. 1993. Acid 51. habituation in Salmonella Enteritidis PT4: Impact of inhibition of protein synthesis.

Lett. Appl. Microbiol. 16:228-230.

Ikeda, J.S., J. Samelis, P.A. Kendall, G.C. Smith, and J.N. Sofos. 2003. Acid 52. adaptation does not promote survival or growth of Listeria monocytogenes on fresh beef following acid and nonacid decontamination treatments. J. Food Protect.

66:985-992.

Jacewicz, M.S., D.W.K. Acheson, D.G. Binion, G.A. West, L.L.Lincicome, C. 53. Fiocchi, and G.T. Keusch. 1999. Responses of human intestinal microvascular

endothelial cells to Shiga toxins 1 and 2 and pathogenesis of hemorrhagic colitis.

Infect. Immun. 67:1439-1444.

Jensen, V.B., J.T. Harty, and B.D. Jones. 1998. Interactions of the invasive 54. pathogens. Salmonella typhimurium,Lwferia monocytogenes, and Shigella flexneri

with M cells and murine Peyers patches. Infect. Immun. 66:3758-3766.

Ji, G. Y., R.C. Beavis, and R.P. Novick. 1995. Cell density control of staphylococcal 55. virulence mediated by an octapeptide pheromone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA

92:12055-12059.

Jones, B.D., and S. Falkow. 1994. Identification and characterization of a 56. Salmonella typhimurium oxygen-regulated gene required for bacterial internalization. Infect.

Immun. 62:3745-3752.

32

Karatzas, K.A.G., and M.H.J. Bennikk. 2002. Characterization of a 57. Listeria monocytogenes Scott A isolate with high tolerance towards high hydrostatic

pressure. Appl. Environ. Microbiol. 68:3183-3189.

Kleerebezem, M., L.E.N. Quadri, O.P. Kulpers, and W.M. de Vos. 1997. Quorum 58. sensing by peptide pheromones and two-component signal-transduction systems in

Gram-positive bacteria. Mol. Microbiol. 24:895-904.

Kim, K.Y., and J.F. Frank. 1995. Effect of nutrients on biofilm formation by 59. Listeria monocytogenes on stainless steel. /. Food Protect.

Koo, J., A. DePaola, and D.L. Marshall. 2000. Impact of acid on survival of Vibrio 60. vulnificus and Vibrio vulnificus phage. /. Food Protect. 63:1049-1052.

Koutsoumanis, K.P., P.A. Kendall, and J.N. Sofos. 2003. Effect of food processing-61. related stresses on acid tolerance of Listeria monocytogenes. Appl. Environ.

Microbiol. 69:7514-7516.

Kubori, T., Y. Matsushima, D. Nakamura, J. Uralil, M. Lara-Tejero, A. Sukhan, 62. J.E. Galan, and S.-I. Aizawa. 1998. Supramolecular structure of the Salmonella

typhimurium type III protein secretion system. Science 280:602-605.

Lecuit, M., S. Vandormael-Pournin, J. Lefort, M. Huerre, P. Gounon, C. Dupuy, C. 63. Babinet, and P. Cossart. 2001. A transgenic model for listeriosis: Role of internalin

in crossing the intestinal barrier. Science 292:1722-1725.

LcClerc, J.E., B. Li, W.L. Payne, and T.A. Cebula. 1996. High mutation frequencies 64. among Escherichia coli and Salmonella pathogens. Science 274:1208-1211.

Leuschner, R.G.K., and M.P. Boughtfiower. 2001. Standardized laboratory-scale 65. preparation of mayonnaise containing low levels of Salmonella enterica serovar

Enteritidis. J. Food Protect. 64:623-629.

LeClerc, J.E., B. Li, W.L. Payne, and T.A. Cebula 1996. High mutation frequencies 66. among Escherichia coli and Salmonella pathogens. Science 274:1208-1211.

7Marsh, E.J., H. Luo, and H. Wang. 2003. Characteristics of biofilm development 67. by Listeria monocytogenes strains. FEMS Microbiol. Lett. 228:203-210.

Mead, P.S., L. Slutsker, V. Dietz, 1. F. McCaig, J.S. Bresee, C. Shapiro, P.M. 68. Griffin, and R.V. Tauxe. 1999. Food-related illness and death in the United States.

Emerg. Infect. Dis. 5:607-625.

McLean, R.J.C., M. Whiteley, D.J. Stickler, and W.C. Fuqua. 1997. Evidence 69. of autoinducer activity in naturally occurring biofilms. FEMS Microbiol. Lett.

154:259-263.

Michiels, C.W, M. Schellekens, C.C.F. Soontjens, and KJ.A. Hauben. 1997. 70. Molecular and metabolis typing of resident and transient fluorescent pseudomonad

flora from a meat mincer. /. Food Protect. 60:1515-1519.

OBrien, A.D., and R.K. Holmes. 1996. Protein toxins of Escherichia coli and 71. Salmonella. In Escherichia coli and SalmonellaCellular and Molecular Biology,

2nd ed., ed. F.C. Neidhardt, 2788-2802. Washington, DC: ASM Press.

33

ODriscoll, B., C.G.M. Gahan, and C. Hill. 1996. Adaptive acid tolerance response 72. in Listeria monocytogenes: Isolation of an acid-tolerant mutant which demonstrates increased virulence. Appl. Environ. Microbiol. 62:1693-1698.

Oh, D.-H, and D.L. Marshall. 1996. Monolaurin and acetic acid inactivation of 73. Listeria monocytogenes attached to stainless steel. J. Food Protect. 59:249-252.

Otto, M., H. Echner, W. Voelter, and F. Gotz. 2001. Pheromone cross-inhibition 74. between Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Infect. Immun.

69:1957-1960.

ORiordan, M., M.A. Moors, and D.A. Portnoy. 2003. Listeria intracellular growth 75. and virulence require host-derived lipoic acid. Science 302:462-464.

erna, N.T., G.F. Mayhew, G. Posfai, S. Elliott, M.S. Donnenberg, J.B. Kaper, 76. and F.R. Blattner. 1998. Molecular evolution of a pathogenicity island from

enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7. Infect. Immun. 66:3810-3817.

Phan-Thanh, L., F. Mahouin, and S. Alige. 2000. Acid responses of 77. Listeria monocytogenes. Int. J. Food Microbiol. 55:121-126.

Pruzzo, C, R. Tarsi, M. del Mar Lleo, C. Signoretto, M. Zampini, R.R. Colwell, 78. and P. Canepari. 2002. In vitro adhesion to human cells by viable but nonculturable

Enterococcus faecalis. Curr. Microbiol. 45:105-110.

Ren, D., J.j. Sims, and T.K. Wood. 2002. Inhibition of biofilm formation and 79. swarming of Bacillus subtilis by (5Z)-4-brome-5-(bromomefhylene)-3-butyl-2-

(5//)-furanone. Lett. Appl. Microbiol. 34:293-299.

Richter-Dahlfors, A.A., and B.B. Finlay. 1997. Salmonella interactions with host 80. cells. In Host Response to Intracellular Pathogens, ed. S.H.E. Kaufmann, 251-270.

Austin, TX: R.G. Landes Co.

Samelis, J., J.N. Sofos, J.S. Ikedak, P.A. Kendall, and G.C. Smith. 2002. Exposure 81. to non-acid fresh meat decontamination washing fluids sensitizes Escherichia coli

0157:H7 to organic acids. Lett. Appl. Microbiol. 34:7-12.

Samelis, J., J.N. Sofos, P.A. Kendall, and G.C. Smith. 2001. Influence of the 82. natural microbial flora on the acid tolerance response of Listeria monocytogenes in a model system of fresh meat decontamination fluids. Appl. Environ. Microbiol.

67:2410-2420.

Saphra, I., and M. Wassermann. 1954. Salmonella choleraesuis: A clinical and 83. epidemiological evaluation of 329 infections identified 1940 and 1954 in the New

York Salmonella Center. Am. J. Med. Sci. 228:525-533.

Sasahara, K.C., and E.A. Zottola. 1993. Biofilm formation by 84. Listeria monocytogenes utilizes a primary colonizing microorganism in flowing systems. J.

Food Protect. 56:1022-1028.

Schauer, D.B., and S. Falkow. 1993. Attaching and effacing locus of a 85. Citrobacterfreundii biotype that causes transmissible murine colonic hyperplasia.

Infect. Immun. 61:2486-2492,

34

Schubert, S., A. Rakin, H. Karch, E. Carriel, and J. Heesemann. 1998. Prevalence 86. of the high-pathogenicity island of Yersinia species among Escherichia coli

strains that are pathogenic to humans. Infect. Immun. 66:480-485.

Sibelius, U., E.-C. Schulz, F. Rose, K. Hattar, T. Jacobs, S. Weiss, T. Chakraborty, 87. W. Seeger and F. Grimminger. 1999. Role of Listeria monocytogenes exotoxins

listeriolysin and phosphatidylinositol-specific phospholipase C in activation of

human neutrophils. Infect. Immun. 67:1125-1130.

Silhavy, T.J. 1997. Death by lethal injection. Science 278:1085-1086.88. Sperandio, V, A.G. Torres, J.A. Giron, and J.B. Kaper. 2001. Quorum sensing is 89. a global regulatory mechanism in enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7. /.

Bacteriol. 183:5187-5197.

Surette, M.G., M.B. Miller, and B.L. Bassler. 1999. Quorum sensing in Escherichia 90. coli, Salmonella typhimurium, and Vibrio harveyi: A new family of genes responsible

for autoinducer production. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1639-1644.

Trucksis, M., J. Michalski, Y.K. Deng, and J.B. Kaper. 1998. The Vibrio cholerae 91. genome contains two unique circular chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci.USA

95:14459-14464.

van der Velden, A.W.M., A.J. Baumler, R.M. Tsolis, and F. Heffron. 1998. Multiple 92. fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infect. Immun. 66:2803-2808.

Venturi, V. 2003. Control of rpoS transcription in Escherichia coli and Pseudomonas: 93. Why so different? Mol. Microbiol. 49:1-9.

Waldor, M.K., and J.J. Mekalanos. 1996. Lysogenic conversion by a filamentous 94. phage encoding cholera toxin. Science 272:1910-1914.

Wallis, T.S., and E.E. Galyov. 2000. Molecular basis of Salmonella induced 95. enteritis. Mol. Microbiol. 36:997-1005.

Waterman, S.R., and P.L.C. Small. 1996. Characterization of the acid resistance 96. phenotype and rpoS alleles of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli. Infect.

Immun. 64:2808-2811.

Waterman, S.R., and P.L.C. Small. 1998. Acid-sensitive enteric pathogens are 97. protected from killing under extremely acidic conditions of pH 2.5 when they are

inoculated onto certain solid food sources. Appl. Environ. Microbiol. 64:3882-

3886.Wemekamp-Kamphuis, H.H., J.A. Wouters, P.P.L.A. de Leeuw, T. Hain, T. 98. Chakraborty, and T. Abee. 2004. Identification of sigma factor (5B-controlled

genes and their impact on acid stress, high hydrostatic pressure, and freeze survival

in Listeria monocytogenes EGD-e. Appl. Environ. Microbiol. 70:3457-3466.Whitechurch, C.B., T. Tolker-Nielsen, P.C. Ragas, and J.S. Mattick. 2002. 99. Extracellular DNA required for bacterial biofilm formation. Science 295:1487

35

CAPITOLUL 2

TOXIINFECII ALIMENTARE PRODUSE DE bAcTErii DiN gENUl STAPHYlococcUS

2.1. Staphylococcus aureus

Gastroenterita stafilococic este provocat de ingestia unor alimente, care conin una sau mai multe enterotoxine, produse numai de unele specii i tulpini stafilococice.

Dei producia de enterotoxine este considerat n general ca fiind asociat cu tulpinile de Stp. aureus coagulaz i termonucleaz pozitive, multe dintre speciile de stafilococi, care nu produc nici una dintre aceste enzime produc enterotoxine.

Tabelul 2.1.

Grupa cocilor Gram pozitivi, aerobi

Familie gen Specii

Micrococcaceae MicrococcusMic. luteus, Mic. varians, Mic. lylae, Mic. roseus

Staphylococcaceae Staphylococcus

Stp. aureus aureus, Stp. aureus anaerobius, Stp. hyicus hyicus, Stp. hyicus chromogenes, Stp. intermedius

Streptococcaceae Streptococcus

Stc. agalactiae, Stc. dysgalactiae dysgalactiae, Stc. dysgalactiae equisimilis, Stc. equi equi, Stc. equi zooepidermicus, Stc. pneumoniae

2.1.1. Istoric

Pentru prima dat stafilococii au fost observai de ctre Billroth (1874) n colecii purulente umane i mai trziu izolai n culturi pure de Pasteur (1880) i Rosenbach (1884), acesta din urm folosind primul termenul de stafilococ. Studiul stafilococilor i a afeciunilor produse de acetia au

36

preocupat numeroi cercettori, cum ar fi: Pasteur, Rosenbach, Bang, Meyer, Hajek, Marsalek, Bayrd-Parker etc. n 1955, Evans, Bradford i Niven (citai de Brzoi i col.) au propus separarea taxonomic a stafilococilor de micrococi pe baza comportrii lor fa de oxigen.

n 1965, Silvestri i Hill (citai de Brzoi i col.) propun ca deosebirea ntre stafilococi i streptococi s fie fcut pe baza compoziiei acestora n DNA.

Studii mai recente au stabilit criterii i mai exacte de difereniere care se bazeaz pe compoziia chimic a peretelui celular, pe existena citocromilor, pe felul i proporia acizilor grai, pe hibridarea DNA, RNA. Marsalec i Hajek au efectuat studii amnunite asupra tulpinilor de stafilococi de origine animal. n ara noastr, contribuii importante n studiul stafilococilor au fost aduse de ctre Stamatin, Bica-Popii, Marica, Cernea, Volintir i alii.

2.1.2. Taxonomie

Cuprinde cinci genuri i anume: Staphylococcus, Gemella, Jeotgalicoccus, Macrococcus, Salinicoccus (dup J. P. Euzby, 2006)

Genul Staphylococcus a fost separat din familia Micrococcaceae datorit coninutului total diferit al bazelor DNA (un coninut G+C de 30-39 mol% la Staphylococcus fa de 63-73 mol% la Micrococcus) (Silvestri i Hill), compoziia peretelui celular, al spectrului diferit de sensibilitate la antibiotice (schema 1.1).

n cadrul genului exist specii patogene pentru om i animale, numai pentru animale i specii nepatogene. Specia tip a acestui gen este considerat Staphylococcus aureus.

Genul cuprinde un numr de 40 de specii (conform J.P. Euzby, 2006).

Pentru patologia animal, dup Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, 2nd edition, 2004 sunt mai importante urmtoarele specii de stafilococi:

- Staphylococcus aureus:subsp. anaerobius;subsp. aureus.

- Staphylococcus hyicus:subsp. hyicus;subsp. chromogenes.

- Staphylococcus intermedius.

37

Dintre speciile nepatogene sau cu patogenitate redus izolate de la animale, fac parte:

- Staphylococcus epidermidis;- Staphylococcus caprae;- Staphylococcus felis;- Staphylococcus gallinarum;- Staphylococcus delphini.

Schema 2.1

Proprieti biochimice pentru diferenierea cocilor Gram pozitivi aerobi(dup Rpuntean Gh., 2001)

Coci Gram pozitivi

Glucoz

Oxidativ Fermentativ

catalaza

Genul Micrococcus Genul Staphylococcus Genul Streptococcus

- +

2.1.3. Incidena speciilor de stafilococi n alimente

Genul Staphylococcus face parte din familia Staphylococcaceae care cuprinde cinci genuri. Cuprinde 40 de specii dintre care 16 sunt considerate ca fiind patogeni alimentari.

Dintre speciile coagulaz pozitive, Stp. intermedius este binecunoscut ca productoare de enterotoxine. Aceast specie se gsete n nrile i pe pielea carnivorelor i cailor, rareori la om. ntr-un studiu efectuat n Brazilia, din piodermitele cinilor au fost izolate 73 de tulpini de stafilococi dintre care 52 au fost Stp. intermedius. Toate cele 52 de tulpini au fost coagulaz pozitive pe plasma de iepure, dar negative pe plasma uman, iar 13 dintre acestea au fost enterotoxigene. Patru dintre ele au produs enterotoxina stafilococic D (SED), cinci au produs SEE i patru au produs SEB, SEC, SED/ E i SEA/ C. Toate 13 au fost termonucleaz (TN-aza), iar trei dintre ele au produs toxina sindromului ocului toxic (TSST)(30,40,41).

Un mare numr de tulpini de Stp. hyicus sunt coagulaz pozitive, iar unele produc enterotoxine. ntr-un studiu tulpinile de Stp. hyicus au fost

38

coagulaz pozitive, iar unele productoare de enterotoxine. Au fost raportate cazuri de tulpini de Stp. hyicus productoare de enterotoxine la maimuele Cynomologus, dar tipul de enterotoxin nu a fost identificat.

La capre, din ase tulpini coagulaz pozitive, dou au produs SEC.Nu a fost raportat producia de enterotoxine de ctre Stp. delphini,

Stp. simulans, Stp. schleiferi subsp. coagulans.Cel puin 10 dintre speciile de stafilococi coagulaz negativi, produc

enterotoxine: Stp. cohnii, Stp. epidermidis, Stp. haemolyticus si Stp. xylosus au fost izolai din laptele de oaie mpreun cu Stp. aureus. Un izolat de Stp. cohnii a produs SEC; trei izolate de Stp. epidermidis au produs SEC i SEB/C/D/ (dou tulpini); cinci izolate de Stp. haemolyticus au produs SEA, SED, SEB/C/D i SEC/D (dou tulpini); n timp ce cele patru izolate de Stp. xylosus au produs SED. Aceti cercettori au observat ca fermentarea manitolului a constituit cea mai bun reacie pentru diferenierea ntre tulpinile enterotoxigene pozitive i enterotoxigene negative. n alte studii, unul din 20 de izolate coagulaz negative, s-a dovedit a fi o tulpina enterotoxigen de Stp. haemolyticus care a produs att SEC ct i SED.

ntr-un studiu de izolate stafilococice de la capre sntoase 74,3% din 70 de izolate coagulaz pozitive au produs enterotoxine, iar 22% din 272 de izolate coagulaz negative au produs enterotoxine pozitive. SEC a fost enterotoxin cel mai frecvent izolat de la capre. 7 specii din izolate au produs mai multe enterotoxine (Stp. caprae, Stp. epidermidis, Stp. haemolyticus, Stp. saprophyticus, Stp. sciuri, Stp. warneri si Stp. xylosus), iar dou specii au produs numai o singur enterotoxin (SEC) de Stp. chromogenes i SEE de ctre Stp. Lentus.

Din carnea de crab fiart, gata de consum au fost identificate aproape 100 de izolate suspecte: Stp. lentus - 31, Stp. hominis - 21, Stp. epidermidis - 10, Stp. kloosi - 8, Stp. capitis - 5 i cte unul de Stp. aureus, Stp. saprophyticus i Stp. sciuri. Din celelalte specii s-au gsit mai puin de trei.

Din unca spaniol afumat uscat s-a izolat Stp. epidermidis, productor de SEC.

Din alimente s-au mai izolat i alte specii de stafilococi i anume: Stp. condimenti, Stp. piscifermentans i Stp. fleurettii, toate fiind coagulaz negative. De asemenea, nu produc TN-az i nici enterotoxine.

Stp. condimenti a fost izolat din sosul de soia, Stp. piscifermentans, din petele fermentat din Thailanda i Stp. fleurettii, din brnza de capr. Specia Stp. caseolyticus a fost transferat n genul Macrococcus, devenind M. caseolyticus.

n general stafilococii se gsesc n alimentele de origine animal, netratate termic, manipulate direct de ctre oameni. Exist multe studii n care

39

se arat c stafilococii se gsesc n numr mare n alimentele comerciale.

Tabelul 2.2. Specii i subspecii de stafilococi coagulaz, nucleaz i endotoxine pozitive

Specia Coagulaz Nucleaz Enterotoxin Hemoliz Manitol g+c S. aureus subsp.

anaerobius + TS - + - 31,7aureus + TS + + + 32-36

S. intermedius + TS + + (+) 32-36S. hyicus (+) TS + - - 33-34

S. delphini + - + + 39S. schleiferi

subsp.

coagulans + TS + (+) 35-37schleiferi - TS + - 37S. caprae - TL + (+) - 36,1

S. chromogens - -p + - v 33-34S. cohnii - - + - v 36-38

S. epidermidis - - + v - 30-37S. haemolyticus - TL + + v 34-36

S. lentus - + - + 30-36S. saprophytics - - + - + 31-36

S. sciuri - + - + 30-36S. simulans - V v + 34-38S. warneri - TL + -p + 34-35S. xylosus - - + + v 30-36

Legend: + = pozitiv; - = negativ; -p = negativ spre slab pozitiv; (+) = reacie slab; v = variabil; TS = termostabil; TL = termolabil.

2.1.4. Condiii de cultivare i caractere culturale

Cerinele stafilococilor n anumii compui organici sunt caracteristice celorlalte bacterii Gram pozitive. Aminoacizii sunt necesari ca surse de azot, iar tiamina i acidul nicotinic sunt recunoscute ca surse de vitamina B. n cazul creterii anaerobe au nevoie de uracil. ntr-un mediu minim pentru creterea anaerob i producia de enterotoxine, glutamatul monosodic servete ca surs de carbon, azot i energie. Acest mediu conine numai trei aminoacizi (arginin, cistin, fenil-alanin) i patru vitamine (pantotenat, biotin, niacin, tiamin) pe lng srurile anorganice. Arginina este esenial

40

pentru producerea de enterotoxin B.

2.1.4.1. Temperatura

Stp. aureus este un germen mezofil, ns unele tulpini se pot multiplica i la temperaturi de numai 6-7C. Cercettorii au descoperit n budinc (ou, lapte) trei tulpini de stafilococi, care au crescut la 45,6C, diminundu-i creterea n timpul incubrii la 46,7C-48,9C. Unele tulpini de stafilococi s-au multiplicat la temperatura de 44,4C n pui la king, dar nu au crescut n salata de unc, la aceeai temperatur.

n general multiplicarea are loc ntre 7 i 47,8C, iar producia de enterotoxine, ntre 10-46C, cu un optim ntre 40 i 45C.

2.1.4.2. Efectul substanelor chimice

Stp. aureus se dezvolt bine n mediul de cultur fr NaCl, dar poate crete la fel de bine la o concentraie de 7-10% NaCl, iar cteva tulpini sunt halofile, dezvoltndu-se n medii cu 20% NaCl. n afar de temperatur, pH, NaCl, creterea bacterian este influenat i de activitatea hidric (a

w) i de

potenialul REDOX (Eh). Stp. aureus prezint o toleran foarte mare fa de telurit, clorur de mercur, neomicin, polimixin, azidur de sodiu, compui folosii de obicei ca ageni selectivi n mediile de cultur.

Stp. aureus poate fi diferit de alte specii de stafilococi prin rezistena sa mai mare la acriflavin. Acest germen este sensibil la borat, n timp ce Stp. epidermidis este rezistent.

Stp. saprophyticus este rezistent la novobiocin, n timp ce Stp. aureus i Stp. epidermidis sunt sensibili.

Capacitatea de tolerare a unor niveluri ridicate de NaCl i de ali compui este aceeai i la speciile din genul Micrococcus i Kocuria, care sunt larg distribuite n natur i apar n alimente n numr mai mare dect stafilococii, ceea ce ngreuneaz detectarea acestora din urm.

Stp. aureus se poate dezvolta n limite de pH, cuprinse ntre 4 i 9, optimul situndu-se ntre 6 i 7.

n maioneza preparat n cas, producia de enterotoxine a avut loc atunci cnd pH-ul a fost mai mic de 5,15 i nu la un pH de sub 4,7.

SEB a fost produs la un nivel de 158 ng/100 g cu un inocul de aproximativ 105 per gram. n general producia de SEA a fost mai puin sensibil la pH dect SEB.

Tamponarea unui mediu de cultur la pH 7, duce la o producie mai mare de SEB, dect atunci cnd mediul este netamponat sau tamponat n

41

limite acide. Un rezultat similar s-a observat i n cazul unui pH controlat de 6,5 dect de 7,6.

n ceea ce privete aw, stafilococii sunt unici, prin faptul c au capacitatea

s se multiplice la valorile cele mai joase, fa de bacteriile nehalofile. Folosind un mediu de hidrolizat de protein, incubat la 37C, timp de

8 zile, creterea i producerea de enterotoxin C s-au produs n limite de pH 4,00-9,83 fr NaCl. n cazul unei concentraii de NaCl 4%, limitele pH-ului au fost ntre 4,00 i 9,43.

Toxina a fost produs la o concentraie de 10% NaCl, cu un pH de 5,45 sau mai mare, dar nu s-a produs deloc toxin la o concentraie de 12% NaCl.

Creterea lui Stp. aureus n bulion este inhibat de un pH de 4,8 i la o concentraie de 5% NaCl.

Creterea i producia de enterotoxin B, de ctre tulpina S-6 s-au produs la o concentraie de 10% NaCl i la un pH de 6,9, dar nu i la concentraia de 4% NaCl i un pH de 5,1.

Efectul general al creterii concentraiei de NaCl const n ridicarea pH-ului minim de cretere. La un pH de 7,00 i la temperatura de 37C, enterotoxina B a fost inhibat de concentraia de 6% NaCl sau mai mare.

n bulion BHI (Brain Heart Infusion), a fost nsmnat un amestec de tulpini de Stp. aureus. Mediul coninea NaCl i sucroz ca umectani, la un pH 4,3 a

w de 0,85 i la 8C. Creterea bacterian n acest mediu nu a fost

sesizat. De asemenea, nu a avut loc nici n cazul unei asocieri de pH 5,5, temperatur 12C i un a

w de 0,93 sau la pH sub 4,9, temperatur 12C i

aw

0,96.Tulpina S-6 de Stp. aureus a crescut i a produs enterotoxina B n

unca afumat, n condiii anaerobe, cu un coninut de 9,2% saramur, dar nu sub un pH de 5,3 i sub o temperatur de 30C, sau sub un pH de 5,58 la 10C.

n condiii aerobe producia de enterotoxine a avut loc mult mai rapid dect n condiii anaerobe. Pe msur ce concentraia de HNO2 a crescut, producia de enterotoxin s-a diminuat.

Cele mai multe specii sunt catalaz-pozitive i facultativ anaerobe, dar cresc mai bine aerob, cu unele excepii (Stp. aureus, subspecia anaerobius i Stp. sacharolyticus). Sunt germeni nepretenioi nutritiv, cultivndu-se bine pe medii uzuale. Tolereaz concentraii de peste 5% NaCl, iar unele specii sunt chiar halofile (tolereaz concentraii de 10-15% NaCl n mediile de cultur). Vitamina B1 i acidul nicotinic reprezint factori indispensabili pentru cretere.

Culturile bacteriene apar dup 16-24 de ore de incubare la 37 C. 42

Tolereaz variaii mari de pH, dar pH-ul optim este de 7,5.Pentru izolarea stafilococilor din materiale patologice sau din

alimente, se utilizeaz medii selective hiperclorurate, cum ar fi Chapman, Bayrd-Parker sau Vogel-Johnson. Totodat, aceste medii permit ca pe baza aspectelor culturale sau a reaciilor de culoare s se aprecieze unele proprieti metabolice sau de patogenitate ale tulpinilor izolate (mediul Chapman fermentarea manitolului, mediul Vogel-Johnson activitatea coagulazic). Examinarea caracterelor morfologice i culturale i izolarea pe medii selective hiperclorurate sunt edificatoare pentru ncadrarea bacteriilor n acest gen.

Tabelul 2.3.

Valorile D pentru distrugerea prin cldur a enterotoxinei stafilococice B i pentru nucleaza termostabil

Condiii D (C)

Tampon VeronalTampon VeronalTampon VeronalTampon VeronalTampon Veronal, pH 7,4Bulion de carne, pH 7,4Nucleaz

D110 = 29,7*D110 = 23,5D121 = 11,4*D121 = 9,9D110 = 18D110 = 60D110 = 16,5

Legend: * toxin n stare pur;

99+% purificatTabelul 2.4.

Valorile D i z pentru distrugerea termic a lui Stp. aureus 196EProduse D(F) z

Pui a la king 5,37 10,5

Custard (crem fcut din ou i lapte) 7,82 10,5

Sup de mazre verde 6,7-6,9 8,1

Lapte smntnit 3,1-3,4 9,2

NaCl 0,5% 2,2-2,5 10,3

Carne fiart 2,2-2,6 10,5

Lapte smntnit simplu 5,34 -

Lapte smntnit + 10% zahr 4,11 -

Lapte smntnit + 25% zahr 6,71 -

Lapte smntnit + 45% zahr 15,08 -

Lapte smntnit + 6% grsime 4,27 -

Lapte smntnit + 10% grsime 4,20 -

43

Produse D(F) zTampon Tris, pH 7,2 2,0 -

Tampon Tris, pH 7,2, NaCl 5,8% 7,0 -

Tampon Tris, pH 7,2 + NaCl 5,8% + MSG 5% 15,5 -

Tris (THAM) = tri(hidroximetil)aminometan - (CH2OH)3CNH2

Stp. aureus, specia tip a genului, produce n bulion o turbiditate intens, un depozit necaracteristic, uor omogenizabil n mediu, unele tulpini formnd un inel slab la suprafa. Pe suprafaa agarului nclinat formeaz (obinuit) nite colonii de tip S (netede i lucioase), rotunde, cremoase, cu diametrul de 2-3 milimetri, cu margini perfecte, uor bombate (Irina Codi). Tulpinile izolate din infecii stafilococice posed microcapsul i formeaz colonii de tip M (moi, mucoase).

Tulpinile care provin din probe tratate cu substane antimicrobiene sau care au fost supuse unor tratamente termice formeaz pe medii solide colonii de tip G (glossy = lucios) sau G-R (rough = rugos), care sunt pitice, cu margini imperfecte, granulate, nehemolitice. Aceste tipuri de microorganisme cultivate n mediu lichid, formeaz un depozit granular pe fundul eprubetei, mediul rmnnd limpede.

Pe agar cu 5-8% snge defibrinat de berbec sau de bou, Stp. aureus i Stp. haemolyticus produc o zon circular de hemoliz n jurul coloniilor (Irina Codi).

n tabelul 2.5. este prezentat aspectul coloniilor la Stp. aureus, S. haemolyticus i S. saprophyticus pe agar cu snge defibrinat de berbec 5-8% i pe mediul Chapman dup 5 zile de incubare la 37oC.

Tabelul 2.5.

Aspectul coloniilor unor specii de stafilococi pe agar-snge i pe mediul solid hiperclorurat (Chapman)

SpeciaAspectul

coloniilor pe agar-snge

Diametrul coloniei Pigment

Aspectul coloniilor pe mediu solid hiperclorurat

Stp. aureus neted cremos 5-10 mmauriu/citrin

fr pigmentcolonii galbene, manitol

pozitive, nglbenesc mediul Stp. haemolyticus

neted cremos 3-5 mm fr pigmentcolonii nepigmentate,

mediul rmne roz

Stp. saprophyticus

lucios, cremos,

foarte convex5-9 mm

pot fi pigmentate

colonii galbene, manitol pozitive

44

Pigmenii produi de stafilococi sunt de natur carotenoid, nedifuzibili n mediu, putnd avea diferite culori: alb-cretacee, alb-gri, galben-aurie, galben-citrin; exist corelaii aproximative ntre felul pigmentului, originea i patogenitatea tulpinii (Rducnescu, 1973).

Stp. aureus formeaz colonii pigmentate n auriu, iar pigmentarea se poate observa mult mai bine dac culturile respective, dup incubare, sunt inute 24 de ore la temperatura camerei. Pigmentogeneza, nu apare n condiii de anaerobioz i nu se observ n medii lichide, fiind un caracter variabil, att genetic, ct i n raport cu sursele de sintez prezente n mediu. Unele tulpini pot s produc pigment n cantitate mai redus sau acesta poate aprea modificat, coloniile fiind pigmentate palid sau alb-murdare; altele i pot pierde total capacitatea de a sintetiza pigment. Longevitatea germenilor n culturile bacteriene este de 2-3 luni.

2.1.5. Caractere morfologice

Bacteriile din genul Staphylococcus sunt coci sferici sau ovali, cu diametrul de 0,8-1 care se divid n planuri perpendiculare succesive. Datorit separrii incomplete a celulelor fiice de cele parentale, celulele bacteriene formeaz grmezi neregulate cu aspect caracteristic de ciorchine de strugure (grec. staphylos = strugure) foarte evidente n culturile pe medii solide.

Se coloreaz Gram pozitiv, dar n condiii de stress metabolic (temperatur, pH, presiune osmotic, factori antimicrobieni, etc.) pot deveni Gram variabili, aprnd n aceeai grmad coci Gram pozitivi i Gram negativi. O dat cu modificrile tinctoriale, de regul, apar i anomalii morfologice, cocii devenind uor alungii sau imperfect conturai.

Sunt bacterii necilogene, nesporogene i necapsulogene. Unele tulpini de Stp.