microbiologia de los alimentos
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NUMERACIÓN DE MARCADORES DE INOCUIDAD MICROBIOLOGICA BACTERIAS COLIFORMES TOTALES Y COLIFORMES TERMOTOLERANTES POR EL MÉTODO DEL NMPTRANSCRIPT
FARMACIA Y BIQUIMICA
CURSO : MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS
DOCENTE : DRA. TERESA GALLARDO
TEMA : NUMERACIÓN DE MARCADORES DE INOCUIDADMICROBIOLOGICA BACTERIAS COLIFORMES
TOTALES Y COLIFORMES TERMOTOLERANTESPOR EL MÉTODO DEL NMP
ALUMNA :
CICLO : VIII
TURNO : NOCHE
2011
PRÁCTICA Nº 5
NUMERACIÓN DE MARCADORES DE INOCUIDAD MICROBIOLOGICA BACTERIAS COLIFORMES TOTALES Y COLIFORMES
TERMOTOLERANTES POR EL MÉTODO DEL NMP
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
MUESTRA: Queso
MÉTODO: Número más probable (NMP)
DILUYENTE: Agua peptonada al 0.1%
NUMERACIÓN DE COLIFORMES TOTALES.MÉTODO I : (AMERICANO)
DETERMINACIÓN DE LA POSIBLE PRESENCIA DE COLIFORMES TOTALES
MÉTODO: Número más probable (NMP)
MEDIO DE CULTIVO: Caldo LST
TEMPERATURA Y TIEMPO INCUBACIÓN: 35 – 37ºC durante 24 - 48 horas
DILUCIONES REALIZADAS: Dil. 10 –1, Dil. 10-2, Dil. 10-3
FACTOR DE DILUCIÓN CON POSIBLE PRESENCIA DE COLIFORMES:
- 10-1 (1 tubo)
- 10-2 (2 tubos)
PRUEBA CONFIRMATORIA DE PRESENCIA DE COLIFORMES TOTALES
MEDIO DE CULTIVO: Caldo brila y agar EMB
TEMPERATURA Y TIEMPO INCUBACIÓN: 35 – 37ºC durante 24 - 48 horas
COLIFORMES FECALES (TERMOTOLERANTES)
MEDIO DE CULTIVO: Caldo E. Coli
TEMPERATURA Y TIEMPO INCUBACIÓN: 44.5ºC durante 24 - 48 horas
NUMERACIÓN DE COLIFORMES TOTALES. MÉTODO II:(EUROPEO)
DETERMINACIÓN DE LA POSIBLE PRESENCIA DE COLIFORMES TOTALES
MÉTODO: Número más probable (NMP)
MEDIO DE CULTIVO: Caldo Brila
TEMPERATURA Y TIEMPO DE INCUBACIÓN: 35 – 37ºC durante 24 - 48 hora.
DILUCIONES REALIZADAS: Dil. 10 –1, Dil. 10-2, Dil. 10-3
FACTOR DE DILUCIÓN CON POSIBLE PRESENCIA DE COLIFORMES:
10-1 (2 tubos)
PRUEBA CONFIRMATORIA DE PRESENCIA DE COLIFORMES TOTALES
MEDIO DE CULTIVO: agar ENDO
TEMPERATURA Y TIEMPO INCUBACIÓN: 35 – 37ºC durante 24 - 48 horas
COLIFORMES FECALES (TERMOTOLERANTES)
MEDIO DE CULTIVO: Caldo Brila y caldo triptonado.
TEMPERATURA Y TIEMPO INCUBACIÓN: 44.5ºC durante 24 - 48 horas
RESULTADOS:
NUMERACIÓN DE COLIFORMES TOTALES. MÉTODO I
LECTURAS EN CALDO LST
Dil 10 –1: Hubo formación de gas (1 tubo)
Dil. 10-2: Hubo formación de gas (2 tubos)
Dil. 10-3: No hubo formación de gas.
Se obtuvo 11 números más probables por gramo de la muestra.
PRUEBA CONFIRMATORIA DE PRESENCIA DE COLIFORMES TOTALES
En agar EMB: Hubo presencia de colonias típicas de color rosadas con brillo metálico.
En caldo E. Coli: Hubo formación de gas.
Al fermentar la lactosa a una temperatura de 44,5o , confirma la presencia de coliformes termotolerantes.
NUMERACIÓN DE COLIFORMES TOTALES. MÉTODO II
LECTURAS EN CALDO BRILA
Dil 10 –1: Hubo formación de gas en 2 tubos de la siembra por triplicado.
Dil 10 –2: No Hubo formación de gas en ningún tubo de la siembra por triplicado.
Dil. 10-3: No Hubo formación de gas en ningún tubo de la siembra por triplicado.
PRUEBA CONFIRMATORIA DE PRESENCIA DE COLIFORMES TOTALES
En agar ENDO: Se observo colonias rojas con brillo metálico.
Caldo Brila: Hubo producción de gas
Caldo Triptonado: Con el reactivo de Kovacs se observo la presencia de un anillo rojo por producción de indol en la parte superior del tubo.
Se confirma la presencia de coliformes termotolerantes
PRUEBAS BIOQUÍMICAS E.Coli:
Medio: TSA
INDOL: se le agrega Gtas de Kovacs se observa Anillo rojo (Positivo)
RM VP: Se le agrega Gtas de Rvo Rojo de Metilo: Se observa coloración
roja
INDOL
RM VP
RM VP
CITRATO
RM VP: Se le agrega Gtas de Rvo Alfa Naftol + Gtas KOH: Se observó
color amarillo anaranjado.
CITRATO: Se observó coloración verde.
CUESTIONARIO
1.- Describa los métodos de los medios de cultivo empleados en la práctica.
Fundamento de los medios de cultivo
Caldo Lauril Sulfato triptosa
Fundamento
Medio rico en nutrientes, que permite un rápido desarrollo de los
microorganismos fermentadores de la lactosa, aún de los fermentadores lentos.
La triptosa es la fuente de nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos, la
lactosa es el hidrato de carbono fermentable, las sales de fosfato proveen un
sistema buffer, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico
Es un medio selectivo, ya que el lauril sulfato de sodio inhibe el desarrollo de la
flora acompañante. Por la fermentación de la lactosa, se produce ácido y gas,
éste último se evidencia al utilizar las campanas Durham.
E. C. Agar
Fundamento
El contenido de lactosa en este medio, favorece el crecimiento de bacterias
lactosa positivas, mientras que las sales biliares inhiben el crecimiento de gran
parte de la flora acompañante. Este caldo es recomendado por el Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater (1975), y por Hajna y
Perry (1943), para el recuento de coliformes en alimentos.
E.M.B. Agar
Fundamento
Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine,
para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de
enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación
entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que
son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de
metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram
positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. Presentan un
característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro
oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son
incoloras. Este medio permite el crecimiento de Cándida spp. Como colonias
rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de
clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. Crece en este medio como
colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. Y otras
bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede
ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al
0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas.
En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de
Salmonella y Shigella.
Verde Brillante Bilis 2% Caldo
Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el
adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes
selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram
negativas a excepción de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono
fermentable.
Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentación de la lactosa con
producción de ácido y gas.
Agar Endo .
Fundamento
En el medio de cultivo, la pluripeptona junto con la peptona, la tripteína y el
extracto de levadura, aportan los nutrientes necesarios para el adecuado
desarrollo bacteriano. La lactosa es el hidrato de carbono fermentable. El
fosfato dipotásico y el fosfato monopotásico otorgan la capacidad buffer, y el
cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
Es un medio selectivo debido al lauril sulfato de sodio y al desoxicolato de
sodio que inhiben el desarrollo de la flora acompañante, y es diferencial debido
a la fermentación de la lactosa.
Las bacterias fermentadoras de lactosa producen durante la fermentación
aldehídos, que en combinación con la fucsina y el sulfito presentes en el medio
le confieren a la colonia un brillo metálico, mientras que las colonias de las no
fermentadoras son rosadas.
2.- Describa los métodos modernos para el recuento de coliformes totales
y termotolerantes
Sistemas de Identificación Microbiana Existen muchos métodos, algunos de ellos son:
1.- Sistema ColiTrak da un resultado presuntivo de cuentas de coliformes, reemplazando al NMP y especialmente aplicado a ensayos de aguas.
2.- Sistema Vitek automático que iidentifica en 2 a 24 h y realiza también confirmación de Patógenos. Los equipos son expandibles con 32, 60, 120, 240 ó 480 exámenes y además realiza el antibiograma y CMI.
3.- El sistema PASCO es semejante al sistema Vitek.