microRNA製品カタログhaving a big impact on biology

microRNA製品カタログ

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MicroRNA： 生物学の新しいフロンティア

マイクロRNA（miRNA）は、タンパク質をコードしない

小さなRNA分子で、遺伝子発現の翻訳後抑制を行い

ます。この分子は、当初“生物学における暗黒物質のよ

うなもの”[1*]として言及されましたが、その後、発生や

細胞増殖、分化、数多くの基本的な生物内プロセスに

おいて重要な調節因子であるということが明らかにさ

れました。最近の報告では、miRNAが癌や代謝疾患、

神経疾患、感染症、その他のヒトの疾病にmiRNAが関

与していることが示唆されています [2*]。

通常、miRNAは比較的長いRNAからなる前駆体とし

て転写され、17～24ヌクレオチドからなる活性型の成

熟miRNAにプロセシングされます。非常に低分子で

あるため、成熟miRNAやその他の small RNAの研究

には特別なテクニックが必要とされます。単離から新

規miRNAの同定、プロファイリング、定量、あるいはバ

リデーションや機能解析まで、ライフテクノロジーズは

miRNA研究のために特別に開発した革新的なツールを

提供しています。これらのツールは、多くの研究者による

miRNAの基本的な研究をサポートするだけでなく、解明

された多くの結果から、このエキサイティングな生物科

学の新分野の全貌を明らかにすることを可能にします。

*Reference情報は裏表紙をご参照ください。

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Contents

4 small-RNAのゲノムワイド探索

8 microRNA発現の網羅的プロファイリング

13 ターゲットmiRNAの定量

18 microRNA機能解析

23 microRNA抽出

26 エキソソームの分離・回収

4

シーケンス データ解析

ライブラリ作製

6時間 5時間 2時間 1時間

テンプレート調製1 2 3 4

• Ion PGM™ シーケンサ• Ion Proton™ シーケンサ

• Torrent Server• Torrent Suite Software

• Ion OneTouch™ システム• Ion Total RNA-Seq Kit v2

図1．small-RNA シーケンスワークフロー

small-RNAのゲノムワイド探索

サンプル中の全ての small RNAの配列情報を取得し発現レベルを把握する

ここ 2年の間に 10,000種類近くの新規 small RNAの配列がmiRBase レジストリに登録されており [3]、新規 smallRNAの探索が進んでいます。ライフテクノロジーズの Ion PGM™システムのためのRNAシーケンシング手法なら、これまで報告されていないsmall RNAを迅速に発見し、その発現レベルを高感度に検出するための数多くの製品が提供されています。 原理

サンプルから small RNAを単離した後、逆転写を行ってsmall RNA集団の cDNAライブラリを作製します。このライブラリのcDNAを増幅し、シーケンシングを行い、通常“タグ”と呼ばれるそれぞれのsmall RNAのcDNAに対応する塩基配列情報を取得します。これらのタグを参照するリファレンス配列のデータベースにマッピングすることで、新規のあるいは既知の small RNAが同定されます。相対的な発現レベルは、それぞれの small RNAから得られたタグの数から計算可能です。また、結果をフォローアップするバリデーションはTaqMan® 5'nucleaseケミストリを用いて行うことができます（図1）。

Ion 半導体シーケンシング：シンプルなワークフローのソリューションです

Ion PGM™システムでは、ライブラリ調製に始まり、シンプルで迅速なシーケンシングのワークフローや直観的に操作できるデータ解析ツールまで、small RNA研究を行うための完全なワークフローを提供します。

Ion Total RNA-Seqキット v2は、ヒトおよびヒト以外のサンプルを使用し、シンプルな操作でたった1 ngの small RNAからsmall RNAのライブラリ調製を可能にします。二本鎖 cDNAにアダプタをライゲーションする他の方法とは異なり、Ion Total RNA-Seqキット v2は独自のAmbion®テクノロジーを利用して方向性を維持したままアダプタを付加するので、作製したライブラリでは元の鎖の情報が保存されています（US Patent:8192941）。さらに、3'および 5'のアダプタを同時に付加するのでライゲーションとクリーンナップのステップを減らすことができます。

Ion OneTouch™システムはテンプレートの調製を約 3時間で完了することを可能にします。実際に操作を行う時間は数分です。また、引き続いて行われる Ion PGM™シーケンサによるシーケンスは1時間未満で完了します。シーケンスの読み取りはTorrent Suiteソフトウェアで行い、これも通常1時間以内で完了し、次世代データ解析ソフトウェアで解析を行うためのファイルがエクスポートされます。

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プローブデザインに依存しない、マイクロアレイよりも優れたデジタルデータの産出

Ion small RNA-Seqはマイクロアレイと異なりプローブデザインに依存せずにsmall RNAの探索やプロファイリング、定量を実施するための方法です。Ion RNA-Seq kit v2と Ion 314™ および Ion 316™チップを使用し、ヒトの肺や胎盤のサンプルから得られたmiRNAのシーケンシングを行いました（肺については両方のチップで3反復、胎盤については Ion 314™ チップ が3反復、Ion 316™チップが2反復）。シーケンスデータをGeneChip® miRNA マイクロアレイ（3反復）、および TaqMan® Array MicroRNA（それぞれの組織について2反復）で行った発現プロファイリング実験の結果と比較しました。検出された異なるmiRNA分子の数は、Ion PGM™シーケンサの検出結果がマイクロアレイの結果を上回り（表1）、miRNA種の検出感度では Ion半導体シーケンシングがマイクロアレイを凌ぐことがわかります。

さらに、Ion RNA-Seqのデジタル検出手法のおかげで、検出装置のシグナル強度のしきい値に制限されるLogRatio値のダイナミックレンジもマイクロアレイと比較して拡大されます（図2）。

　 検出手法 Total assays

Intersection assays

Intersection detected

TaqMan® 法 748 708 308

GeneChip® Array 847 708 216

Ion 314™ チップ 904 708 230

Ion 316™ チップ 904 708 358

表1. Ion small RNA-Seqデータに見られる高い感度最初のカラムには、それぞれのプラットフォームが含むコンテントにもとづいた検出可能なmiRNAの総数を示します。Ion PGM™シーケンサによる検出のしきい値は、各コンテントに依存せず、この数は最新のmiRBaseに含まれるmiRNAの総数を示します。TaqMan®ケミストリによる検出ではCt < 40として計算しています。理論上 3つ全てのプラットフォームで検出可能なmiRNAの数を2番目のカラムに、また、各プラットフォームで実際に検出されたmiRNAの数を最後のカラムに示します。

log 2(胎

盤/肺

)

PGM 316 PGM 314 Array

log2倍数変化の分布

図2. Ion small RNA-Seqはアレイよりも広いダイナミックレンジを示します Ion 316™チップと Ion 314™チップで得られた ChipsLogRatio値のダイナミックレンジをGeneChip® miRNAと比較しました。ダイナミックレンジは箱ヒゲプロットで表示しています。

検出手法 hsa-miR-126 hsa-miR-126*

TaqMan® 法 21.4 26.5

マイクロアレイ 15.1 Not detected

Ion PGM™シーケンサ 13.2 10.9

Ion PGM™シーケンサを用いた全miRNAアイソフォームの検出

Ion PGM™シーケンサはまた、アノテーション済みのmiRNAの -3pフォームあるいは -5pフォーム（これらは以前はそれぞれ leadingフォーム、star（*）フォームと呼ばれていたものです）を識別することができます（表 2）。ステムループ hsa-mir-126に由来する成熟miRNAフォームの Ion PGM™シーケンスデータ解析の代表例を示します。胎盤のライブラリから得られたこれらのリードでは、5'もしくは 3'isomirがどちらも検出されました（データ未掲載）。マイクロアレイによる解析では、正確に isomirを検出することは非常に困難です。

表 2. Ion PGM™シーケンサによる成熟miRNAの -3pフォームおよび -5pフォームの識別能力　ここにはTaqMan® MicroRNA アッセイのCt値、マイクロアレイのハイブリダイゼーションシグナルの log2値、mapped Ion PGM™シーケンサリードのノーマライズ済の log2値です。

Ordering information製品名 サイズ 製品番号 価格Ion PGM™ システム　テンプレート調製自動化システム付Ion PGM™ シーケンサ1台、Torrentサーバー 1台、Ion OneTouch™ 2.0 Duoシステム1式、卓上遠心機1台、無停電安定化電源装置1台、 インスタレーション用試薬1式、設置・基本取扱説明

一式 PGM11-020S2（2年保証） ¥9,600,000

Ion PGM™ システム　チップ作製自動化システム付Ion PGM™ シーケンサ1台、Torrentサーバー 1台、Ion Chef™ システム1台、 卓上遠心機1台、無停電安定化電源装置1台、 インスタレーション用試薬1式、設置・基本取扱説明

一式 PGM11-C01S2（2年保証） ¥13,400,000

Ion PGM™ システム

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Ion Total RNA-Seqキットv2

Ion Total RNA-Seqキット v2は、既知の、あるいは予測したsmall RNA配列を解析するだけの他の検出手法とは異なり、予め得られる配列情報に依存することなく、サンプル中に含まれるすべてのsmall RNA分子をデジタルな配列情報として得ることができます。この能力が、新規の small RNA分子の発見だけでなく、選択的プロセシングにより生じる異なるアイソフォームの検出も可能にします。100ngのトータルRNA中の5ngのmiRNAもしくは濃縮済の1ngのmiRNAからスタートすることができます。

特長• 新規のsmall RNA分子やアイソフォームを検出

• 細胞あたり1コピー以下のsmall RNAを検出可能な感度

• ストランド情報を保持した発現解析が可能

• ゲル精製不要のビーズ精製方式により、プライマーダイマーを除去

• 最新の逆転写酸素の採用により精度向上

• 16サンプルまでのマルチプレックス可能

Ordering information製品名 サイズ 製品番号 価格Ion Total RNA-Seq kit v2、12Rxn 12 ライブラリ 4475936 ¥144,000Ion Total RNA-Seq kit v2、48Rxn 48 ライブラリ 4479789 ¥480,000Ion Xpress™ RNA-Seq Bc 01-16kit 10×16 ライブラリ 4475485 ¥192,000RiboMinus™ Eukaryote System v2 12 反応 A15026 ¥85,700Low Input RiboMinus™ Eukaryote System v2 12 反応 A15027 ¥85,700

RiboMinus™ Eukaryote システムキット v2

RiboMinus™ Eukaryoteシステムキット v2は、トータルRNA試料中の大きなリボソームRNA分画を激減させることによって、RNA転写物の全スペクトルを濃縮する新しい精製システムです。このキットは、ヒトあるいはマウスのTotal RNAから18S、28S、5S、5.8S rRNAを 95％以上取り除くことができるように、rRNAに特異的な5’ビオチン標識プローブを使用してます。rRNA/プローブ複合体は、ストレプトアビジン標識のマグネットビーズによって、試料から取り除かれます。これによって、末端にPolyA+を持たない断片化されたmRNA、あるいはPolyA+選択法では精製することができないほかの調節RNAなどのRNA転写産物種の回収量が増加します。精製されたRNAは、次世代シーケンス、マイクロアレイ、RT-PCRなどのサンプル調製にお使いいただけます。

特長• 細胞質およびミトコンドリア由来の rRNAを95％以上除去

• 磁気ビーズ精製方式によりスムーズな約1時間のワークフロー

• RiboMinus™ Eukaryote System v2は1～5μgのRNAインプットに対応

• Low Input RiboMinus™ Eukaryote System v2は100ng-1μgのRNAインプットに対応

ワークフロー

磁気ビーズ クリーンナップを備えた v2システムでは、1時間でリボゾームRNAを除去

Step 1 Step 2 Step 3 Step 4

Ion Total RNA-Seqキットホールトランスクリプトーム ライブラリ調製

15分

30分

30分

1時間

1時間

1時間

合計：4時間15分

RNAサンプル

アダプターのハイブリダイゼーション

ライゲーション

逆転写

精製

ライブラリの増幅

精製

5’アダプター3’アダプター

逆転写開始位置ブロック

5’ライゲーション部位

目的の RNAサンプル

3’ライゲーション部位

NonrRNAS

Biotin

HybridizedRiboMinus™ probe

NonrRNAS

BiotinStreptavidin

BeadMagnet

rRNA-depleted RNA

リボソームRNAとプローブをハイブリダイゼーション10分 - 変性20分 - キャプチャー

ストレプトアビジン-磁気ビーズを用いて、リボソームRNA / プローブ複合体を捕捉

マグネットで複合体を吸着

クリーンナップ30分

Ion Total RNA-Seqキット v2

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ERCC RNA Spike-In コントロールミックス

ERCC RNA Spike-In コントロールミックスは、NIST（National Institute of Standards & Technology）によってERCC（External RNA Control Consortium）で定められたRNAコントロールの内、92種類を含む発現解析のためのコントロールRNAです。コントロールRNAはpolyAを有し、真核生物に対応しています。SOLiD® システムを用いた遺伝子発現解析において、サンプル調整時のTotal RNAから rRNA 除去時の品質確認、ライブラリ調製時の品質確認、シーケンス後のデータ品質確認に利用できます。

特長• 23種×4サブグループ：計 92種類のpolyA RNA

• 約106 のダイナミックレンジ

• 次世代シーケンサ、マイクロアレイ、リアルタイムPCR などを用いた遺伝子発現解析に対応（small RNA解析には適用不可）

• total RNAにSpike-In ミックスを添加後、rRNA 除去または、polyA RNA 精製する事で、RNAサンプル調製過程の品質確認が可能

• Spike-In ミックスが添加されたRNAサンプルを用いる事で、ライブラリ調製時の品質確認が可能

• データの品質確認（再現性、検出限界、ダイナミックレンジなど）が可能

• サブグループの濃度が異なるSpike-In ミックス 1とSpike-In ミックス 2 を併用する事で、発現変動の評価が可能

• 個々のコントロールR N Aを検出するリアルタイムP CR用TaqMan® Assayを別途提供しており、サンプル調製過程で確認実験が可能

Ordering information製品名 サイズ 製品番号 価格ERCC ExFold RNA Spike-In ミックス 10 µl × 2 4456739 ¥240,000ERCC RNA Spike-In ミックス 10 µl 4456740 ¥120,000

図3. ERCC ExFold RNA Spike-In ミックスに含まれるExFold RNA Spike-In ミックス1とミックス 2を2種のサンプルに加え比較した場合の模式図 23種×4サブグループ ：計 92種類のpolyA RNA からなるERCC RNA Spike-In ミックス1を用いる事で、サンプル調製、データの品質確認が可能。さらに、ExFold Spike-In ミックス 1 とミックス 2を用いた場合、それぞれのミックスの4種のサブグループの濃度が異なる為、発現変動の評価も可能。

1e+2

1e+3

1e+4

1e+5

1e+6

1e+7

1e+8

1e+9

1e+9

1e+8

1e+7

1e+6

1e+5

1e+4

1e+3

1e+2

ERCC Mix 2（molecules/100ng mRNA）

ERCC

Mix

1（

mol

ecul

es/1

00ng

mR

NA）

8

ゴールドスタンダードとしてのTaqMan®テクノロジー： 1日以内に microRNAのプロファイリングを完了

サンプル間の全miRNA発現の違いをプロファイリングすることは、生物学的プロセスに影響を与える特定のmiRNAを同定する際の最初のステップとなります。まず、miRNA発現が異なると予想されるサンプル間の比較を行います。例えば疾患組織と正常組織、薬剤処理サンプルと未処理サンプル、異なる組織間などでmiRNAの発現プロファイルの比較を行います。

miRNAは非常に低濃度でも細胞の機能に影響を与え、また、その発現レベルの範囲が非常に広いので、その定量には高感度で広いダイナミックレンジを持つツールが必要となります。TaqMan® OpenArray® MicroRNA Panelおよび TaqMan® Array Micro RNA Cardは、Megaplex™ Primer Poolsとの組み合わせで、このような実験に最適です。

これらのツールは、ヒト、マウス、ラット由来のmiRNA解析に対応しており、48サンプル分のmiRNA発現プロファイルを同日中に得ることができます。しかも、必要なのはたった100 ngのトータルRNAだけです。ゴールドスタンダードとなっているTaqMan®アッセイケミストリの感度や特異性、ダイナミックレンジのメリットを最大限に生かし、また少量ターゲットのPCRにライフテクノロジーズの革新的なステムループRTプライマーデザインを採り入れたことにより、TaqMan® OpenArray® MicroRNAパネルおよび TaqMan® Array MicroRNAカードは、データを得るために数日を有し、1回の解析に数100 ngのRNAが必要なマイクロアレイ解析に対して明らかな優位性を示します（図4）。

ワークフローの特徴

•5時間以内に数百種類のmiRNAのプロファイリング実験が完了します

•ヒト、マウス、ラットのプロファイリングに最適です

•miRBaseに含まれる既知のmiRNAを広く網羅します

原理

中規模のスループットを持つTaqMan® Array MicroRNA Cardの場合には、377種のmiRNAに対する逆転写反応を1本のチューブで行います。（A・Bアレイを両方とも解析する場合は、それぞれ 377種のmiRNAに対する逆転写反応を、2本のチューブに分けて行います。また、ハイスループットのTaqMan® OpenArray® MicroRNA Panelの場合には、754種のmiRNAを2本のチューブに分けて逆転写します。逆転写に使用するMegaplex™ RT Primersは 377種のmiRNA特異的なステムループプライマーがミックスされたものでApplied Biosystems®リアルタイムPCR装置を用いた解析フォーマットに合わせてデザインされています。次に、Megaplex™ PreAmp Primer Poolsを用いてプレ増幅のステップを行います。バイアスのない増幅を可能とするこのステップによりサンプル中のmiRNAの濃度が増加し、最大の感度でリアルタイムPCRの検出ができるようになります。最後の定量ステップでは、TaqMan® Universal PCR Master Mix IIを各サンプルに添加します。サンプルのロードはご利用になるシステムによって異なります。TaqMan® OpenArray® MicroRNA Panelの場合、AccuFill™システムを用いてサンプルをロードします（このパネルは予め調製されたナノ流路プレートで 3セット754種のTaqMan® MicroRNA Assaysがプリントされています）。TaqMan® Array MicroRNA Cardの場合、ピペットを用いてCardのサンプル注入用ポートからサンプルをロードします。TaqMan® MicroRNA CardはA・Bの2枚のカードから成り、それぞれ 377種のmiRNA Assayがマイクロ流路カードに予めプリントされています。

microRNA発現の網羅的プロファイリング

60 min10 min90 min150 min30 min

・mir VanaTM 　miRNA Isolation Kit・TaqMan® ABC Purification Kit

・MegaplexTM RT Primers・TaqMan® MicroRNA 　Reverse Transcription Kit

・MegaplexTM PreAmp Primers

&

・TaqMan® PreAmp Master Mix

・RealTime StatMiner® Software

・DataAssist™ Software

サンプル調製 逆転写反応(RT) cDNA増刷(オプション) データ解析cDNAの希釈

＆ロード

リアルタイムPCR装置によるラン実行

1 2 3 4 5 6

Total RNA

miRNA

xxxxxxxxxxxxxxxxxx

xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

xxxxxxxxxxxxxxxxxx

xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

xxxxxxxxxxxxxxxxxx

xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

xxxxxxxxxxxxxxxxxx

xxxxxxxxxxxxxxxxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

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xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xx

・QuantStudio™ 12K Flex,・ViiA™ 7・7900HT Fast リアルタイム 　PCR システム

ライブラリ作製

・TaqMan® Array Card　 or

・OpenArray® Plate

図4. TaqMan® OpenArray® MicroRNA Panelおよび TaqMan® Array® MicroRNA Cardsのワークフローヒト、げっ歯類のmiRNA発現プロファイリングを行う際、TaqMan®OpenArray®MicroRNA Panelsを用いた解析では、オプションのMegaplexTMPreAmp Primer Poolsによるpre-amplificationを行った場合でも、同時に12サンプルを5.5時間で処理することが可能です（pre-amplificationなしでは 4.25時間）。TaqMan®Array MicroRNA Cardsを用いた解析では、MegaplexTMPreAmp Primer Poolsによるpre-amplificationを行った場合、1サンプルあたり5.75時間で処理します。

9

Megaplex™ プライマープール： カードとパネル

プロファイリング実験に究極の感度や広いカバー率を求める場合には、Megaplex™ Primer Poolsがその目的を達成するためのフレキシビリティを提供します。TaqMan® OpenArray® MicroRNA PanelまたはTaqMan® Array MicroRNA Cardは、Megaplex™ Primer Poolsと組み合わせて使用します。これらはmiRBaseに登録されているmiRNAの多くをカバーしており、ヒトやげっ歯類に対する理想的なmiRNAプロファイリングソリューションを提供します。

•Megaplex™ RT Primer Pools̶miRNAプロファイリングをシンプルにするためにデザインされたMegaplex™ RT Primer PoolsはグローバルなmiRNA発現プロファイリング用のRTプライマーのプールです。この製品はcDNA調製や個別のTaqMan® MicroRNA Assaysにも使用することができます。

•Megaplex™ PreAmp Pr imer Pools̶TaqMan® Array MicroRNA Cardsとともに使用する場合やサンプル量が限られる場合、アッセイの感度を最も重視する場合には、Megaplex™ PreAmp Pr imer Poolsが大いに役立ち、低発現レベルのmiRNAや限られたサンプル量の場合の検出感度を向上させることができます。Megaplex™ PreAmp Primer Poolsは、わずか1 ngのトータルRNAから効果的にmiRNA発現プロファイルを得ることができます（図5）。

TaqMan® MicroRNAアレイとパネル

ヒトおよびげっ歯類のプロファイリングに最適な TaqMan ® MicroRNA Arraysは、microRNAアッセイが予めプリントされているマイクロ流路カードのセットでTaqMan® MicroRNA Assayの優れた定量性で解析を行うことが可能です。アッセイの組み合わせはMegaplex™ Primer Poolsと一致しており、セットアップの時間や実験手技によるバイアスを減らせます。より高いスループットを求める場合にはTaqMan® OpenArray® MicroRNA Panelsをおすすめします。TaqMan® OpenArray® MicroRNA Panelsは1枚のプレートで3つのサンプルを同時に処理することが可能です。どちらの場合でも、miRNAターゲットの逆転写にはMegaplex™ RT Primer Poolsを使用し、Megaplex™ PreAmp Primer Poolsによるプレ増幅を行った後に各反応液にTaqMan® Universal PCR Master Mix IIを加えるだけのシンプルな試薬調製で、ハイスループット解析に適しています。

miRNAマイクロアレイ TaqMan®Arrays MicroRNA Cardsおよび TaqMan® OpenArray® Panel

結果を得るまでの時間 少なくとも2日： サンプルのラベリングとハイブリダイゼーションのセットアップに丸1日かかり、2日目に洗浄とアレイのスキャニングを行います。

トータル RNAからリアルタイム PCRのデータまで2ステップ（プレ増幅を行う場合は3ステップ）のみで1日で完了します。

ダイナミックレンジ 典型的には2–3 log （プラットフォームとプローブの種類によっては、4 logの報告があります）。

最大7 logのレンジを持つので、高発現および低発現のmiRNAの検出を1回の実験で行う事が可能となります。

特異性 マイクロアレイの測定が単一のハイブリダイゼーションイベントに依存することを考慮すると、クロスハイブリダイゼーションの懸念があります。また、キャプチャープローブのハイブリダイゼーションでは、miRNA前駆体と生物学的に活性を持つ成熟型miRNAを区別できません。

TaqMan®ケミストリによる高い特異性が得られます̶増幅シグナルを得るためには、4つのユニークなオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが必要です。革新的なステムループ RTプライマーにより、成熟型 miRNAに対する特異性が得られます。

使用 RNA量 典型的には1 µgもしくはそれ以上（いくつかのプラットフォームでは100 ng以下がサポートされています）。

1–1,000 ngの範囲のいずれも使用可能です。

既知miRNAのカバー率 マイクロアレイのデザインは、典型的には in silicoでの選抜に依存しており、キャプチャープローブのデザインにはウェット実験によるバリデーションは通常行われません。このことは無反応プローブが生じることによるカバー率の低下につながります。さらに、ハイブリダイゼーションをベースとした技術であるため、感度が限定され、低発現のmiRNAが検出されることは困難です。

全てのアッセイは、実績がありバリデートされた in silicoのデザインパイプラインを使ってデザインされ、Megaplex™ Primer PoolsやTaqMan®Array Cardsに追加される前にはウェット実験によるバリデーションが実施されています。Megaplex™ Primer Poolsによるアッセイのパフォーマンスは実際の実験で再検証できます。その結果、全てのアッセイで必ず何らかの情報を得ることができます。

検出

%

テンプレート濃度RT PreAmp テンプレート濃度RT PreAmp

Megaplex™ Human A Pool の検出効率 Megaplex™ Human B Pool の検出効率

0ntc 0.1 fM 1 fM 10 fM 100 fM 1 pM 10 pM 100 pM

20

40

60

80

100

検出

%

0ntc 0.1 fM 1 fM 10 fM 100 fM 1 pM 10 pM 100 pM

20

40

60

80

100

図5. Megaplex™ Primer PoolsとTaqMan® Array MicroRNA CardsによるmiRNAの検出TaqMan®MicroRNA ArrayのA Card、B Cardに対して、それぞれのCardにプリントされているmiRNAアッセイの全ターゲットを人工的に化学合成し（10 pM）、total RNA （10ng/µL）にスパイクとして添加しました。人工ターゲットが 6 logもしくは 4 logになるように段階希釈した混合物を用いてMegaplex™ワークフローによるテストを行いました。プレ増幅を行った場合と行わなかった場合で測定を行っています。さらに、アッセイの特異性を確認するため、テンプレート無しのコントロール（NTC）の反応を実施しました。

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Ordering information ： microRNA 発現プロファイリング

■ サンプル調製（23～25ページ参照）mirVana™ miRNA Isolation KitTaqMan® miRNA ABC Purification Kit

■ microRNA用RT試薬TaqMan® MicroRNA RT KitTaqMan® MicroRNA RT Kitは、TaqMan® MicroRNA Assaysの逆転写反応試薬です。Megaplex™ Primer PoolsまたはTaqMan® MicroRNA Assaysに添付のRTプライマーと組み合わせて使用します。

製品名 サイズ 製品番号 価格TaqMan® MicroRNA RT Kit 200 反応 4366596 ¥25,500TaqMan® MicroRNA RT Kit 1000 反応 4366597 ¥76,400

Megaplex™ Primer PoolsMegaplex™ RT Primersはstem-looped構造の逆転写用プライマーをプールしたものです。TaqMan® MicroRNA Arraysと組み合わせることで効率的なプロファイリングワークフローを構築できます。数百のmiRNAのプロファイリングを一回の反応に集約し、網羅的miRNA発現解析に必要な逆転写反応とトータル RNAの量を低減します。

Megaplex™ RT Primers Pool （for Human）製品名 サイズ 製品番号 価格Megaplex™ RT Primers, Human Pool A 逆転写用プライマーのみ

50 反応 4399966 ¥91,200

Megaplex™ RT Primers, Human Pool B v3.0 逆転写用プライマーのみ

50 反応 4444281 ¥91,200

Megaplex™ RT Primers, Human Pool Set v3.0 RT Primers Pools A&B (4399966 & 4444281)

50 反応 4444745 ¥105,000

Megaplex™ RT Primers Pool（for Rodent）製品名 サイズ 製品番号 価格Megaplex™ RT Primers, Rodent Pool A 逆転写用プライマーのみ

50 反応 4399970 ¥91,200

Megaplex™ RT Primers, Rodent Pool B v3.0逆転写用プライマーのみ

50 反応 4444292 ¥91,200

Megaplex™ RT Primers, Rodent Pool Set v3.0RT Primers Pools A&B(4399970 & 4444292)

50 反応 4444746 ¥105,000

・ Megaplex Primer PoolsのPool AおよびPool Bは、TaqMan® MicroRNA ArraysのA、およびBアレイに搭載されている遺伝子にそれぞれ対応しています。

PreAmp製品によるcDNA増幅を行う場合（オプション）Megaplex™ PreAmp Primersでは、1ngの微量のトータルRNAからでも網羅的な発現解析が可能になります。微量サンプルを用いたプロファイリングに有効です。

Megaplex™ PreAmp Primers Pool （for Human）製品名 サイズ 製品番号 価格Megaplex™ PreAmp Primers, Human Pool A PreAmp用プライマーのみ

50 反応 4399233 ¥91,200

Megaplex™ PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 PreAmp用プライマーのみ

50 反応 4444303 ¥91,200

Megaplex™ PreAmp Primers, Human Pool Set v3.0 PreAmp Primers Pools A&B (4399233 & 4444303)

50 反応 4444748 ¥105,000

Megaplex™ RT and PreAmp Primers Package （for Human）製品名 サイズ 製品番号 価格Megaplex™ Primer Pools, Human Pools A RT Primers(4399966) + PreAmp Primers(4399233)

50 反応 4401009 ¥127,300

Megaplex™ Primer Pools, Human Pools B v3.0 RT Primers(4444281) + PreAmp Primers(4444303)

50 反応 4444749 ¥127,300

Megaplex™ Primer Pools, Human Pools Set v3.0 RT Primers Pools A&B (4444745(= 4399966 & 4444281)) PreAmp Primers Pools A&B (4444748(= 4399233 & 4444303))

50 反応 4444750 ¥144,300

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Megaplex™ PreAmp Primers Pool （for Rodent）製品名 サイズ 製品番号 価格Megaplex™ PreAmp Primers, Rodent Pool A

PreAmp用プライマーのみ50 反応 4399203 ¥91,200

Megaplex™ PreAmp Primers, Rodent Pool B v3.0PreAmp用プライマーのみ

50 反応 4444308 ¥91,200

Megaplex™ PreAmp Primers, Rodent Pool Set v3.0PreAmp Primers Pools A&B(4399203 & 4444308)

50 反応 4444747 ¥105,000

Megaplex™ RT and PreAmp Primers Package（for Rodent）製品名 サイズ 製品番号 価格Megaplex™ Primer Pools, Rodent Pools ART Primers (4399970) + PreAmp Primers (4399203)

50 反応 4401090 ¥127,300

Megaplex™ Primer Pools, Rodent Pools B v3.0RT Primers(4444292) + PreAmp Primers(4444308)

50 反応 4444752 ¥127,300

Megaplex™ Primer Pools, Rodent Pools Set v3.0RT Primers Pools A&B(4444746(=4399970 & 4444292))PreAmp Primers Pools A&B(4444747(=4399203 & 4444308))

50 反応 4444766 ¥144,300

TaqMan® PreAmp Master Mix製品名 サイズ 製品番号 価格TaqMan® PreAmp Master Mix 40 反応 4391128 ¥130,200

12

TaqMan® MicroRNA Panelsおよび関連試薬製品名 アッセイ数/Plate サンプル数/Plate サイズ 製品番号 価格TaqMan® OpenArray® Human MicroRNA Panel QuantStudio TM 12K Flex 757 3 1 プレート 4470187* ¥105,000

TaqMan® OpenArray® Rodent MicroRNA Panel QuantStudio TM 12K Flex 757 3 1 プレート 4470188* ¥105,000

TaqMan® OpenArray® Real-Time Master Mix, 1.5mL 1.5 ml 4462159 ¥14,900TaqMan® OpenArray® Real-Time Master Mix, 5mL 5 ml 4462164 ¥44,600QuantStudio™ 12K Flex OpenArray® Accessories Kit 1キット 4469576 ¥40,800

* QuantStudio™ 12K Flex リアルタイムPCRシステムで、4470187と4470188をご使用になるためには、4469576が必要です。

リアルタイムPCR解析システム

QuantStudio™ 12K FlexリアルタイムPCRシステム

Applied Biosystems®ViiaTM7

リアルタイムPCRシステム

■ miRNA定量用リアルタイムPCRHumanTaqMan® Array Human MicroRNA Cards

製品名 サイズ 製品番号 価格TaqMan® Array Human MicroRNA A Card v2.0 4 枚 4398965 ¥212,100TaqMan® Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 A array (4398965) + B Array (4444910)

8 枚（各4枚）

4444913 ¥273,600

TaqMan® Array Human MicroRNA B Card v3.0 4 枚 4444910 ¥212,100

RodentTaqMan® Array Rodent MicroRNA Cards

製品名 サイズ 製品番号 価格TaqMan® Array Rodent MicroRNA A Card v2.0 4 枚 4398967 ¥212,100TaqMan® Array Rodent MicroRNA A+B Cards Set v3.0

A array (4398967) + B Array (4444899)8 枚

（各4枚）4444909 ¥273,600

TaqMan® Array Rodent MicroRNA B Card v3.0 4 枚 4444899 ¥212,100

13

特定のmiRNAを検出、定量

特定のmiRNAを検出する実験は、以前に得られた結果の検証や特定のmiRNAについての情報を得たい場合によく実施されます。ライフテクノロジーズは、アッセイデザインの最適化により、TaqMan®

アッセイおよび定量リアルタイムPCRのメリットである「高い感度と特異性、ダイナミックレンジ」をmiRNAの検出および定量に利用することに成功しました。

TaqMan® MicroRNA Assaysには、ターゲット特異的なステムループ逆転写プライマーが含まれています。この革新的なデザインにより、低分子の成熟miRNA（~22 nt）の検出というmiRNAの定量における根本的な問題点に取り組んでいます。このステムループ構造は、成熟miRNAターゲットのみに特異性を持ち、miRNAの3’末端にRTプライマー/成熟miRNAのキメラを形成します。

この少し長いRT産物は、標準的な TaqMan®リアルタイムPCRのテンプレートとなります。

ライフテクノロジーズは、ヒトやマウス、ラット、アラビドプシス、C. elegans、ショウジョウバエなど、Sangerデータベースに登録されている全生物種のTaqMan® MicroRNA Assaysの豊富なコレクションを提供しています。また、miRBaseデータベースが更新されるのに伴って、迅速に新規のアッセイを追加しています。

ワークフローの特徴

•ヒトやマウス、ラット、ショウジョウバエ、アラビドプシス、C. elegansなど、miRBaseに登録されている生物種の個別のmiRNAの定量に最適です。

•各キットには、ターゲットの成熟miRN Aに対して特異的なTaqMan® Assaysおよび逆転写プライマーがセットで含まれています。

•miRBaseに登録されている全miRNAへのカバー率を上げるため、新たなアッセイが継続的に追加されています。

原理

TaqMan® MicroRNA Assaysでは、革新的なターゲット特異的なステムループ逆転写プライマーを採用しており、低分子の成熟miRNAの検出が困難という問題を解決しています。このプライマーによってターゲットの 3'末端に配列が付加されたcDNAが合成され、標準的な TaqMan®リアルタイムPCRのテンプレートを形成します。また、プライマー末端のステムループ構造は、生物学的な活性を持つ成熟miRNAを特異的に検出するというこれらのアッセイの重要なメリットとなります（図5）。

ターゲットmiRNAの定量

• mirVana™ miRNA Isolation Kit• TaqMan® miRNA ABC Purification Kit• RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE• TaqMan® MicroRNA Cells-to-CT™ Kit

• TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit• TaqMan® MicroRNA Assays

• TaqMan® Universal Master Mix II• TaqMan® MicroRNA Assays

• Applied Biosystems® リアルタイム PCR システム

• Instrument software (included)• RQ Manager enterprise software (optional)• RealTime StatMiner® Software (optional)

30 min 65 min 25 min 90 min

Stem-loop primer

microRNAmicroRNA

1 2 3 4 5サンプル調製 逆転写反応(RT) データ解析TaqMan®MicroRNAAssayの反応準備

リアルタイムPCR装置によるラン実行

14

Q F

Reverse Transcription

Real-Time PCR

Stem-loop RT primer

Target Sequence

Forward Primer

TaqMan® probeReverse primer

TaqMan®テクノロジーがmiRNA研究の世界に大きなメリットをもたらします

•高い特異性̶前駆体ではなく生物活性を持つ成熟 miRNAのみを定量します̶よく似たファミリーに属するホモログの間の1塩基の差異も識別可能です（図6）

•高感度̶わずか1-10 ngのトータルRNAから検出可能。サンプルの節約もできます

•広いダイナミックレンジ̶最大 7 logのダイナミックレンジ̶ 1回の実験で高発現と低発現の miRNAを同時に検出可能です（図7）

•カスタムアッセイが利用可能̶シーケンスを特定して頂ければライフテクノロジーズがデザインとアッセイを行います

•迅速、シンプル、スケーラブル̶2ステップのリアルタイムPCRアッセイが、迅速に高品質な結果をもたらします

図6. TaqMan® MicroRNA Assay アプローチ　シンプルな2ステップからなる反応で、ターゲットmiRNAをリアルタイムPCRで高感度かつ特異的な検出・定量が可能です。

TaqMan® MicroRNA Assays

2ステップのTaqMan® MicroRNA Assays（TaqMan®アッセイとターゲットに特異的な逆転写プライマーを含みます）は Sanger miRBaseデータベースに含まれるほぼ全てのmiRNAに対してデザインされています。ライフテクノロジーズは、Sanger miRBaseデータベースの更新に合わせてアッセイコレクションの数を継続して増やしています。

TaqMan® MicroRNA Assays 内在性アッセイ

ヒト、マウス、ラット、アラビドプシス、C. elegans、ショウジョウバエの内在性コントロールの候補となるアッセイを提供しています。これらのコントロールは、綿密に選択された低分子ノンコーディングRNAに対してデザインされています。これらは、さまざまなタイプの細胞や組織、実験条件下で一定レベルの発現を示すことを確認しています。詳細はアプリケーションノート“Endogenous controls for real-time quantitation of miRNA using TaqMan® MicroRNA Assays”をご覧ください。

Custom TaqMan® Small RNA Assays

miRNA研究のために開発された、TaqMan®miRNA Assayのデザインのノウハウは、200ベース以下のさまざまなタイプの低分子核酸の解析にも利用することが可能です。Custom TaqMan® Small RNA Assayを使用すれば、これらのアッセイのメリットを、さまざまな生物種の低分子RNAに対しても利用できます。例えば、データベースにまだ登録されていない新規のmiRNAやpiRNA（piwi-interacting RNA）やsnRNA、snoRNAのようなさまざまな small RNAに有効です。

15

miRNA Assays

Mature miRNAs Precursors

Perfectly matched Ct

Mismatched Ct ∆Ct (mismatch vs. match)

Ct ∆Ct (Precursor vs. mature)

let-7aLooped 16.5 33.1 16.6 29.5 13.0

Linear 23.6 38.3 14.7 30.4 6.8

miRNA

Stem-loopRT primer

miRNA

LinearRT primer

図7. TaqMan® MicroRNA Assaysの逆転写反応におけるステムループプライマーが生物活性をもつ成熟miRNAに対する特異性をもたらしますlet-7aに対するステムループRTプライマーを含むデザイン済みTaqMan® MicroRNA Assayを、同等の配列を持つリニアなRTプライマー/PCRプライマー/TaqMan®プローブのセットと比較しました。次に、成熟 let-7aおよび成熟 let-7e（let-7aと2塩基だけが異なる近縁のmiRNA）を模した1.5 x 108コピーの合成miRNA、ステムループ let-7a前駆体を逆転写反応液に添加し、TaqMan® MicroRNA AssayのRTステムループプライマーあるいはリニアRTプライマーによるプライミングを行い、リアルタイムPCRで検出を行いました。その結果、ステムループRTプライマーでは、成熟miRNAを前駆体miRNAや近縁のmiRNAターゲットからより明確に識別できることを示しました。

Panel A. Ampli�cation Plot

Cycle Quantity

Panel B. Standard Curve

1.0

39

37

35

33

31

29

27

25

23

21

19

17

15

13

11

0.1∆ Rn C

T

0.01

0 5 10 15 20 25 30 35 40 10 100 1,000 10 4 10 5 10 6 10 7 10 8 10 9

Slope = –3.36R2 = 0.999

7copies

70Mcopies

図8. TaqMan® MicroRNA Assaysは最大7 logのダイナミックレンジを示しますこのような広いダイナミックレンジによって、1回の実験で数コピーから数百万コピーまで発現の異なるmiRNAターゲットを正確に定量することが可能になります̶細胞と組織、または疾患のレベルなどにより、miRNAの発現レベルが大幅に変動することがあります。このようなケースには非常に有効です。TaqMan® MicroRNA Assaysのダイナミックレンジと感度を示すために、合成 lin-4 miRNAを段階希釈し、lin-4 TaqMan® MicroRNAアッセイを用いて増幅しました。（A） 合成 lin-4 miRNAの増幅プロットは7桁のダイナミックレンジを示しました。PCRにおける合成RNAの投入量は1.3 x 10-3 fM（反応当たり7コピーに相当します）から1.3 x 104 fM（反応当たり7 x 107コピーに相当します）まで変化することになります。（B）lin-4 miRNA増幅の標準曲線

16

Ordering information ： ターゲット microRNA の定量

■ サンプル調製（23～25ページ参照）mirVana™ miRNA Isolation KitTaqMan® miRNA ABC Purification Kit

■ microRNA用RT試薬TaqMan® MicroRNA RT Kit

TaqMan® MicroRNA RT Kitは、TaqManR MicroRNA Assaysの逆転写反応試薬です。TaqMan® MicroRNA Assaysに付属しているRTプライマーと組み合わせて逆転写反応を行ないます。

製品名 サイズ 製品番号 価格TaqMan® MicroRNA RT Kit 200 反応 4366596 ¥25,500TaqMan® MicroRNA RT Kit 1,000 反応 4366597 ¥76,400

■ miRNA定量用リアルタイムPCRTaqMan® MicroRNA Assays

TaqMan® MicroRNA Assaysは、リアルタイムPCRでmicroRNA（miRNA）を定量するためのアッセイです。生物学的に活性のある成熟型miRNAを検出します。

製品名 サイズ 製品番号 価格TaqMan® MicroRNA Assays, Inventoried各miRNA特異的RT primer： 5X reaction mix(50サンプル分 / 15 µL反応系 )各miRNA特異的TaqMan® Assay： 20X reaction mix (150反応分 / 20 µL反応系 )販売中の生物種：ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis thaliana、Caenorhabditis elegans、Drosophila melanogaster

50 サンプル・150 反応分 4427975 ¥31,300

TaqMan® MicroRNA Assays, Made-to-Order, Extra Small各miRNA特異的RT primer： 5X reaction mix(25サンプル分 / 15 µL反応系 )各miRNA特異的TaqMan® Assay： 20X reaction mix (75反応分 / 20 µL反応系 )

25 サンプル・75 反応分 4440885 ¥31,100

TaqMan® MicroRNA Assays, Made-to-Order, Small各miRNA特異的RT primer： 5X reaction mix(50サンプル分 / 15 µL反応系 )各miRNA特異的TaqMan® Assay： 20X reaction mix (150反応分 / 20 µL反応系 )

50 サンプル・150 反応分 4440886 ¥41,000

TaqMan® MicroRNA Assays, Made-to-Order, Medium 750 サンプル・750 反応分 4440887 ¥82,700TaqMan® MicroRNA Assays, Made-to-Order, Large 2,900 サンプル・2,900 反応分 4440888 ¥153,800

Custom TaqMan® Small RNA Assays製品名 サイズ* 製品番号 価格Custom TaqMan® Small RNA Assays, XＳ 25 サンプル・75 反応 4440418 ¥41,800Custom TaqMan® Small RNA Assays, Ｓ 50 サンプル・150 反応 4398987 ¥52,500Custom TaqMan® Small RNA Assays,Ｍ 750 サンプル・2,250 反応 4398988 ¥127,300Custom TaqMan® Small RNA Assays,Ｌ 2,900 サンプル・8,700 反応 4398989 ¥269,400

*20µLの反応系として計算

17

QuantStudio™ 3DデジタルPCRシステム

QuantStudio™ 6 Flex リアルタイムPCRシステム

QuantStudio™ 7K Flex リアルタイムPCRシステム

QuantStudio™ 12K Flex リアルタイムPCRシステム

リアルタイムPCR解析システムデジタルPCR解析システム

TaqMan® Universal Master Mix II

TaqMan® Universal Master Mix IIは、TaqMan技術を利用したさまざまなアプリケーションに使用できるマスターミックス試薬です。TaqMan® MicroRNA Assays によるリアルタイムPCR反応の際に使用します。

TaqMan® Universal Master Mix II, with UNG製品名 サイズ* 製品番号 価格TaqMan® Universal Master Mix II, with UNG 1mL 40反応 4440042 ¥14,700TaqMan® Universal Master Mix II, with UNG 5mL 200反応 4440038 ¥66,200TaqMan® Universal Master Mix II, with UNG 2 x 5mL 400反応 4440044 ¥128,100TaqMan® Universal Master Mix II, with UNG 5 x 5mL 1,000反応 4440045 ¥309,800TaqMan® Universal Master Mix II, with UNG 10 x 5mL 2,000反応 4440046 ¥598,500TaqMan® Universal Master Mix II, with UNG 50mL 2,000反応 4440039 ¥585,900

TaqMan® Universal Master Mix II, no UNG製品名 サイズ* 製品番号 価格TaqMan® Universal Master Mix II, no UNG 1mL 40反応 4440043 ¥14,700TaqMan® Universal Master Mix II, no UNG 5mL 200反応 4440040 ¥60,900TaqMan® Universal Master Mix II, no UNG 2 x 5mL 400反応 4440047 ¥117,600TaqMan® Universal Master Mix II, no UNG 5 x 5mL 1,000反応 4440048 ¥283,500TaqMan® Universal Master Mix II, no UNG 10 x 5mL 2,000反応 4440049 ¥535,500TaqMan® Universal Master Mix II, no UNG 50mL 2,000反応 4440041 ¥525,000

*50µLの反応系として計算

18

ターゲット遺伝子のmRNAレベルの評価

ターゲットのタンパク質レベルまたはその他の生物学的作用の評価

細胞へのトランスフェクション

• mirVana™ miRNA mimics• mirVana™ miRNA inhibitors

• Lipofectamine™ RNAiMAX Transfection Agent• Neon Transfection System

• TaqMan® Gene Expression Cells-to-CT™ Kit• TaqMan® Gene Expression Assays• Applied Biosystems® リアルタイム PCR システム

• NuPAGE® プレキャストゲルシステム• iBlot® ゲルトランファーシステム • MagicMark™ XPウエスタンブロッティング　スタンダード

miRNA mimicまたはinhibitorを選択

mirVana™ miRNA mimic mirVana™ miRNA Inhibitor

3' 5'3' 5'

1 2 3 4

原理

•mirVana™ miRNA mimicおよびmirVana™ miRNA inhibitorは、特定のmiRNAを特異的に模倣もしくは阻害するようにデザインされており、ターゲットmRNAの翻訳を人工的に増加もしくは減少させるために使用できます。

•miRNAターゲットは、miRNAの増加や減少に伴う、ターゲットタンパク質および /もしくはmRNAレベルの定量でバリデートされています。

•タンパク質発現への影響を調べる場合にはウェスタン解析が用いられます。

•miRNAとそのターゲット部位との相互作用の研究には、レポーター遺伝子のアッセイが用いられます。

miRNAの機能を解析する

miRNAの機能解析では、タンパク質をコードする遺伝子とよく似た戦略が取られます。培養細胞に人工的なmiRNA mimicをトランスフェクションすると、gain-of-functionの形質を特定することに役立ちます。また、loss-of-functionの形質を特定するためには、miRNA inhibitorを使ったdown-regulation実験あるいは阻害実験を実施します。

また、miRNA発現のup-regulation実験とdown-regulation実験の組み合わせは、特定のmiRNAによる制御を受けている遺伝子や細胞内プロセスを同定するのに利用することができます。

Ambion®（現在はライフテクノロジーズの1ブランド）は、最初にmiRNAモジュレーターを提供した会社です。Ambion® microRNA mimicおよび inhibitorは、細胞内のmiRNAの機能解析を行うツールで、Ambion® によって初めて製品化されました。

最新のmir Vana™ miRNA mimic およびmir Vana™ miRNA inhibitorは、特定のmiRNAを模倣あるいは阻害するようにデザインされており、それぞれ gain-of-functionもしくは loss-of-functionの研究に使用します。 どちらもsiRNAの導入に使用されるソリューションを使ってのトランスフェクションもしくはエレクトロポレーションによって細胞内に導入することができます。

ワークフローの特徴

•gain-of-functionおよび loss-of-function形質により、miRNAで調節される遺伝子やプロセスを同定します。

•miRNAターゲットのバリデーションには、ウェスタンブロッティングまたはリアルタイムPCR、もしくはその両方を使用します。

•ターゲットサイトの相互作用とタンパク質発現に対する評価は、レポーター遺伝子アッセイおよびイムノディテクションシステムで行うことができます。

microRNA機能解析

miRNAオリゴ： mirVana™ miRNA mimics & inhibitorsトランスフェクション： Lipofectamine® RNAiMAX

miRNAオリゴ： mirVana™ miRNA mimics & inhibitors, in vivo readyトランスフェクション： Invivofectamine® 2.0

miRNA機能解析

In vitro

In vivo

19

microRNA合成分子

mirVana™ miRNA mimics & inhibitors:

•細胞毒性はありません

•最新のmiRBase に対応しています

• in vitroレベルでは低濃度の導入でも最大の安定した効果を示します

• in vitroおよびin vivoの両方で使用可能です

mirVana™ miRNA mimics

mirVana™ miRNA mimicsは化学的に修飾された二本鎖の短いRNA分子で（siRNAとよく似てはいますが、同じものではありません）、内在性の成熟miRNAを模して働くようデザインされています。化学修飾により、目的の成熟miRNAの正しい鎖がRISC（RNA-induced silencing complex）に取り込まれます（図8）。低分子であるため、これらの分子はベクターよりも容易にトランスフェクションが可能です。また、導入にあたってはsiRNAのトランスフェクションやエレクトロポレーションで使用される条件と同等の条件が使用できます。miRNA発現ベクターと比較するとこれらの合成分子は、Dose responseの研究に使用することが可能です。

mirVana™ miRNA Inhibitors

mirVana™ miRNA Inhibitorは化学修飾された一本鎖の核酸で、内在性のmiRNAに特異的に結合して阻害するようにデザインされています。 適当なmiRNA結合サイトを含むレポーターベクターを用いてテストを行った場合に、これらの inhibitorは、ネガティブコントロールmirVana™ miRNA Inhibitorを用いた場合と比較して、平均で約 4倍のレポーター遺伝子の発現誘導を引き起こします。このことからターゲットmiRNAへの強力な阻害活性が示唆されます。

in vivo 研究にも利用可能（in vivo Ready 製品）

miRNA解析の in vivo研究は近年急成長している分野です。多くの研究者がより正確な定量データを得るために TaqMan®ケミストリを利用するようになっており、それがmir Vana™ mRNA inhibitorが TaqMan®アッセイに完全に対応している理由です（図10）。

mimicや inhibitor のようなオリゴヌクレオチドをin vivoで使用する場合の重要な必要条件の1つは、毒性や免疫刺激性を持たないことです。開発の過程で、mimicも inhibitor もまったく毒性を示さないことを確認しています。

miRNAライブラリー製品（ヒト用、マウス用）

網羅的なmiRNA機能解析を行うためのmiRNAライブラリー製品もご用意しています。ライブラリーに含まれるmirVana™ miRNA mimicまたは inhibitorは 96ウェルの各ウェルに 0.25 nmolが凍結乾燥された状態で提供されます。これは 50 nMでトランスフェクションを行う場合に50回分に十分な量に相当します。mirVana™ miRNA mimicまたは inhibi torと使用するための Posit i ve ControlおよびNegative Controlも別途販売しています。

mRNA5'Cap AAAAAAAAAAAAA3'

5'Cap AAAAAAAAAAAAA3' No translation

Translation

3' 5'

Sequence-specific loading into RISC-like complex

miRNA mimic

Complementary binding of specific miRNAs—no RISC-like complex association

miRNA inhibitor

mirVana™ miRNA mimics

mirVana™ miRNA inhibitors

3' 5'

3' 5'

3' 5'

3' 5'

3' 5'

図9. mirVana™ miRNA mimics およびmirVana™ miRNA inhibitors の働き

図 11. mir Vana™ miRNA mimicでは、ターゲットmiRNAの配列からなるmature鎖が特異的に活性を持ち、逆鎖側（star鎖）は不活性化されますレポーターベクターを用いて、ターゲット鎖（mature鎖）と逆鎖（star鎖）の活性の比較を行いました。6種類のmiRNAの認識配列に対して、mirVana miRNA mimicを導入したところ、すべてのケースでmature鎖が高い活性を示しました。（Negative Controlと比較するとシグナルが 5倍から10倍減少しました）一方でstar鎖の活性は低い（Negative Controlと同じ）ものでした。

0.00 0miR122

NT

AldoA

mR

NA

upre

gula

tion

%

Hfe2 Slc35a4 Lass6

NEG1 miR122

NT NEG1 miR122

NT NEG1 miR122

NT NEG1

50

100

150

200

250

300

350

400

450miRNA122 = miR122 miRNA inhibitorNT =Not transfectedNeg1 = Negative Control #1

Fold

cha

nge

reporter 1

miRNAmimic

Neg miRNAmimic

Neg miRNAmimic

Neg miRNAmimic

Neg miRNAmimic

Neg miRNAmimic

Neg

reporter 2 reporter 3 reporter 4 reporter 5 reporter 6

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40FWRV

図10. mirVana™ miRNA inhibitorはin vivoで効果的にmiRNAを抑制しますmiR122またはNegative Control #1 mir Vana™ miRNA inhibitorをInvivofectamine® 2.0試薬と複合体を形成させ、Balb-Cマウスの尾の静脈に 3日間連続で 7 mg/kgで尾静脈投与しました。最後の投与から24時間後にマウスの肝臓のmiR122の 4つの細胞内ターゲットの発現レベルを TaqMan® MicroRNA Assayを使って測定しました。無処理のマウスおよびNegative Controlマウスとの比較で、miR122で処理したマウスの肝臓において、4種すべてのmRNAの有意な発現増加が検出されました。

0.00 0miR122

NT

AldoA

mR

NA

upre

gula

tion

%

Hfe2 Slc35a4 Lass6

NEG1 miR122

NT NEG1 miR122

NT NEG1 miR122

NT NEG1

50

100

150

200

250

300

350

400

450miRNA122 = miR122 miRNA inhibitorNT =Not transfectedNeg1 = Negative Control #1

Fold

cha

nge

reporter 1

miRNAmimic

Neg miRNAmimic

Neg miRNAmimic

Neg miRNAmimic

Neg miRNAmimic

Neg miRNAmimic

Neg

reporter 2 reporter 3 reporter 4 reporter 5 reporter 6

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40FWRV

20

Ordering information ： microRNA 機能解析

■ microRNA合成分子

mirVana™ miRNA mimic製品名 サイズ 製品番号 価格

mirVana™ miRNA mimic 5 nmol 4464066 ¥60,900mirVana™ miRNA mimic 20 nmol 4464067 ¥186,900mirVana™ miRNA mimic, in vivo Ready 250 nmol 4464070 ¥535,500Customer-defined mirVana™ miRNA Mimic 5 nmol 4464068 ¥102,900Customer-defined mirVana™ miRNA Mimic 20 nmol 4464069 ¥189,000Customer-defined mirVana™ miRNA Mimic, in vivo Ready 250 nmol 4464071 ¥535,500mirVana™ miRNA Mimic Negative Control #1 5 nmol 4464058 ¥59,900mirVana™ miRNA Mimic Negative Control #1 20 nmol 4464059 ¥182,700mirVana™ miRNA Mimic Negative Control #1, in vivo Ready 50 nmol 4464060 ¥262,500mirVana™ miRNA Mimic Negative Control #1, in vivo Ready 250 nmol 4464061 ¥525,000mirVana™ miRNA Mimic miR-1 Positive Control 5 nmol 4464062 ¥59,900mirVana™ miRNA Mimic miR-1 Positive Control 20 nmol 4464063 ¥182,700mirVana™ miRNA Mimic miR-1 Positive Control, in vivo Ready 50 nmol 4464064 ¥262,500mirVana™ miRNA Mimic miR-1 Positive Control, in vivo Ready 250 nmol 4464065 ¥525,000mirVana™ miRNA mimic ライブラリ（miRBase v 20*） 0.25 nmol each 4464074 お問い合わせmirVana™ miRNA mimic ライブラリ（miRBase v 20*） 1 nmol each 4464075 お問い合わせ

* 2014年4月現在

mirVana™ miRNA inhibitor製品名 サイズ 製品番号 価格

mirVana™ miRNA inhibitor 5 nmol 4464084 ¥60,900mirVana™ miRNA inhibitor 20 nmol 4464085 ¥186,900mirVana™ miRNA inhibitor, in vivo ready 250 nmol 4464088 ¥535,500Customer-defined mirVana™ miRNA Inhibitor 5 nmol 4464086 ¥102,900Customer-defined mirVana™ miRNA Inhibitor 20 nmol 4464087 ¥189,000Customer-defined mirVana™ miRNA Inhibitor, in vivo ready 250 nmol 4464089 ¥535,500mirVana™ miRNA Inhibitor Negative Control #1 5 nmol 4464076 ¥59,900mirVana™ miRNA Inhibitor Negative Control #1 20 nmol 4464077 ¥182,700mirVana™ miRNA Inhibitor Negative Control #1 , in vivo Ready 50 nmol 4464078 ¥262,500mirVana™ miRNA Inhibitor Negative Control #1 , in vivo Ready 250 nmol 4464079 ¥525,000mirVana™ miRNA Inhibitor let-7 Positive Control 5 nmol 4464080 ¥59,900mirVana™ miRNA Inhibitor let-7 Positive Control 20 nmol 4464081 ¥182,700mirVana™ miRNA inhibitor ライブラリ（miRBase v 20*） 0.25 nmol each 4464092 お問い合わせmirVana™ miRNA inhibitor ライブラリ（miRBase v 20*） 1 nmol each 4464093 お問い合わせ

* 2014年4月現在

21

miRNA導入用トランスフェクション試薬&機器

Lipofectamine® RNAiMAX reagent

細胞への siRNA導入用に開発されたトランスフェクション試薬で、多くのRNAi研究者の方にご利用いただいています。miRNA mimicおよびmiRNA inhibitorの導入にも最適なトランスフェクション試薬です。

特長• siRNA/miRNAの導入に最適な試薬• 少ないsiRNA量でも高効率にノックダウン• 幅広い試薬レンジにおいて高い細胞生存率を維持• 様々な細胞株で使用可能

Invivofectamine® 2.0

マウス全身投与による肝臓への siRNA導入用に開発されたトランスフェクション試薬です。 mir Vana™ miRNA mimics and inhibitors, in vivo ready製品と組み合わせることで in vivoでのmiRNA解析を行うことができます。

■ miRNA導入用トランスフェクション試薬&機器Lipofectamine® RNAiMAX細胞への導入

製品名 サイズ 製品番号 価格Lipofectamine® RNAiMAX 0.1 mL 13778-100 ¥9,400Lipofectamine® RNAiMAX 0.3 mL 13778-030 ¥27,300Lipofectamine® RNAiMAX 0.75 mL 13778-075 ¥66,200Lipofectamine® RNAiMAX 1.5 mL 13778-150 ¥94,000Lipofectamine® RNAiMAX 15 mL 13778-500 ¥771,800

Invivofectamine® 2.0In vivo 用 肝臓への導入

製品名 サイズ 製品番号 価格Invivofectamine® 2.0 Reagent Starter Kit 1mL 1377501 ¥147,000Invivofectamine® 2.0 Reagent 5mL 1377505 ¥546,000

※ Starter kitには、siRNA ポジティブコントロールとしてAmbion® In Vivo FVll siRNA（マウス） 50nmolが添付されています。

Neon® Transfection System

製品名 サイズ 製品番号 価格Neon® Transfection System*1 1 ユニット MPK5000 ¥945,000Neon® Transfection System Starter Pack*2 1 セット MPK5000S ¥1,100,000

＊1　Neon® Transfection System(MPK5000) は、Neon® システム本体、Neon® Pipette（MPP100）、Neon® Pipette Station（ MPS100）で構成されています。＊2　Starter Pack（MPK5000S）には、 Neon® Transfection System(MPK5000) に、Transfection Kit(MPK10096、MPK1096（各1 キット）が添付されています。

Neon® Transfection System 消耗品

製品名 サイズ 製品番号 価格Neon® Transfection System Kit (100μL) 1 キット（Neon チップ：96 本） MPK10096 ¥173,300

1 キット（Neon チップ：25 本） MPK10025 ¥57,800Neon® Transfection System Kit (10μL) 1 キット（Neon チップ：96 本） MPK1096 ¥173,300

1 キット（Neon チップ：25 本） MPK1025 ¥57,800Neon® Transfection Tubes 1 パック (100 本 ) MPT100 ¥51,500Neon® Pipette １ユニット MPP100 ¥78,800Neon® Pipette Station １ユニット MPS100 ¥105,000

図12. Neon® Transfection システムとNeon® 消耗品キット

Neon® Transfection System

Neonシステムは、ピペットチップ型電極（特許）を採用したエレクトロポレーション装置です。このピペット型電極は、細長いチップ内で均一な電界を形成することで導入効率を高め、電極に金メッキを施すことで細胞へのダメージを軽減しています。

特長• 初代細胞、幹細胞、神経細胞などのトランスフェクションが難しい細胞に最適なツール

• ピペットチップ型電極（特許）により、高効率・低毒性な エレクトロポレーションが実現

• 細胞タイプによって試薬を使い分ける必要なし

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miRNA機能解析のバリデーション

miRNA機能解析の gain-of-functionおよび loss-of-function実験では、ターゲットmRNA発現に対する効果・影響を、遺伝子発現レベルやタンパク質発現レベルでバリデーションを行ないます。

• 遺伝子発現解析 ： microRNAのターゲットと予想されるmRNAの発現量を測定

• タンパク質解析 ： microRNAのターゲットと予想されるタンパク質をウェスタンブロットで検出

ライフテクノロジーズでは、これらダウンストリーム解析にご利用いただける製品を取り揃えております。製品の詳細については右記のカタログをご覧ください。

遺伝子発現解析

リアルタイムPCR 試薬・消耗品カタログ• TaqMan® リアルタイムPCR用試薬

• SYBR® リアルタイムPCR用試薬

• 逆転写酵素

• RNA抽出キット＆試薬

タンパク質解析

タンパク質解析カタログ• タンパク質電気泳動ゲル

• タンパク質スタンダード

• タンパク質染色試薬

• ウェスタンブロット用機器＆試薬

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ライフテクノロジーズでは、miRNA、あるいはその他のsmall RNAの単離と分析のためのさまざまなキットを提供しています。それぞれのキットはsmall RNA（<200 nt）が定量的に回収できるため、miRNAの解析に最適です：

New! TaqMan® miRNA ABC Purification Kit

TaqMan® miRNA ABC (anti-miRNA Bead Capture)Purification Kitは、ヒトのTaqMan® miRNA Assayおよび TaqMan® Array Card専用に特別にデザインされた精製キットです。anti-miRNAオリゴがコンジュゲートされた磁気ビーズを用いており、全血、血清、血漿あるいはFFPE組織切片といった調製が難しいサンプルを対象とし、非常に少ないスタート量からmiRNAを回収することが可能です。スタートサンプル量は全血では10 µLから、血清や血漿では 50 µLまでとサンプルによって異なります。miRNAは磁気ビーズでキャプチャーされ、血液などに含まれるリアルタイムPCR阻害物質が容易に除去されます。このプロセスにはフェノールやクロロホルム、TRIzol®試薬、あるいはグアニジンイソチアシアネートなどの有害化学物質は使用しておらず、すべての操作は75分以内で完了します。さらに、さまざまなRNAが混在した状態で精製される他のサンプル調製法とは異なり、TaqMan® miRNA ABC Purification Kitでは特定のmiRNAのみが回収されます。

このキットは 2種類が提供されており、1つはHuman Panel A、もう１つはHuman Panel Bとなります。それぞれのキットは、TaqMan® Array Human MicroRNA A CardおよびB Card（全部で754種のヒトmiRNAに対応します）に含まれるmiRNAアッセイに応じた特定のmiRNAが回収されるようにデザインされています。

mirVana™ miRNA Isolation Kit

サンプルはタンパク変性作用のあるLysis Solution中で溶解されるとRNaseが不活性化され、RNAが安定化されます。次に、得られたライセートを酸性フェノール：クロロホルムで抽出し、RNAを含む抽出液の上清を回収します。このRNAはさらにグラスファイバーフィルターにより精製し、トータルRNAを得るか、サイズ分画によってmiRNAを濃縮することも可能です。このキットに含まれる試薬はmiRNAの回収率を上げ、small RNAのロス（標準的なグラスファイバー法ではよく見られます）を減らすために特別に調製されたものです。この迅速で簡単な操作は実質的にほぼ全てのタイプの細胞や組織に適しており、効率的にsmall RNAを含むトータルRNAを単離したり、small RNA分画（<200 nt）を濃縮し、解析での感度を向上するために使用できます。

microRNA抽出

RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit（FFPEサンプル用）

RecoverAll™Kitでは、インキュベーション時間を除いた実際のハンドリング時間は約45分で、1.5時間以内にFFPEサンプルからRNAの単離を完了することができます。FFPEサンプルを、キシレンとエタノールによる洗浄で脱パラフィンし、次に効果的なプロテアーゼによる組織分解を行います。この時のインキュベーション時間は回収するのがRNAかDNAかにより決定します。続いて迅速なグラスフィルター法により、フィルター上でのヌクレアーゼ処理を行いつつ核酸を精製し、最後に水もしくはキット付属の低塩濃度バッファーで溶出します。得られたRNAはそのままリアルタイムPCRによる分析を行い、新鮮な組織や凍結サンプルを用いた場合と同等のプロファイルを作成することができます。

TaqMan® MicroRNA Cells-to-CT™ Kit

マルチウェルプレート、シングルチューブの両方のフォーマットで使用でき、10分以内にリアルタイムPCRに使用可能なRNAを10–105個の培養細胞から調製します。細胞をPBSで洗浄し、室温で8分間溶解します。この際にDNase処理を行うこともできます。Stop Solutionを添加して溶解を停止し、さらに2分間室温でインキュベーションを行います。サンプルを直接培養プレート上（96ウェルもしくは 384ウェル）で処理することができるので、サンプルのハンドリング回数を減らせ、サンプルロスや操作ミスの危険を最小限に抑えられます。加熱や洗浄もしくは遠心の操作が不要で、TaqMan® MicroRNA Cells-to-CT™ Kitは従来の時間と手間のかかるプロセスをたった10分にまで大幅に減少することができました。また、キットに含まれるTaqMan® MicroRNA逆転写試薬および TaqMan® Universal PCR Master Mix IIを使って、ゴールドスタンダードとも言えるTaqMan® miRNAプロファイリングのワークフローを完了することができます。

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microRNA 抽出用試薬セレクションガイドmirVana™ miRNA Isolation Kit

mirVana™ PARIS™ Kit

MagMAX™-96 for Microarrays Total RNA Isolation Kit

TaqMan® MicroRNA Cells-to-CT™ Kit

TaqMan® miRNA ABC Purification Kit

RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE Tissues

テクノロジー 酸性フェノールと改良グラスファイバーフィルターによる迅速な精製法です

細胞溶解バッファーと酸性フェノール：クロロホルム抽出およびグラスファイバーフィルターによる精製法を組み合わせています

TRI Reagent®による細胞溶解と磁気ビーズによる精製法です

Cells-to-CT™テクノロジーとオプションのDNase処理を用いることで、RNA精製ステップを省略して、簡単にリアルタイムPCRに使用可能な細胞ライセートが得られます

Anti-miRNAオリゴを付加した磁気ビーズを用いて、少量サンプルから得られたヒト miRNAのキャプチャーと精製を行います

脱パラフィン、プロテアーゼによる分解、グラスファイバーフィルターによる精製法です

サンプル使用量

培養細胞103–107個 もしくは組織0.5–250 mg

培養細胞102–107個 もしくは組織最大100 mg

培養細胞最大5x106個もしくは 組織最大100 mg

培養細胞10-105個 血液関連サンプル10–50 µL、培養細胞10-106個、組織1–10 mg、FFPE切片5–10 µm、唾液50 µL

FFPE切片最大 20 µm

特長 • 培養細胞および多くの組織（高レベルのRNaseを持つ組織を含みます）から迅速かつ容易にsmall RNAを精製します

• miRNAプロファイリング実験やその他の遺伝子発現アプリケーションに最適です

• 30分で完了するシンプルなプロトコール

•トータル R N A、small RNAと同時に、タンパク質も回収できます

• オプションでsmall-RNA 濃縮操作も可能です

• mRNAやmiRNA、siRNAとタンパク質の相関を調べる実験に最適です

• 実験間での高い再現性が得られます

• 競合他社のキットと比較してより短い操作時間

• small RNA精製のための改良プロトコルを採用しています

• ロボットを使った自動化プラットフォームに組み込むことが可能です

• 10分以内に室温で培養細胞からリアルタイム PCR用のライセートが得られます

• サンプルの移しかえや遠心、バキュームマニホルドなどの操作は不要です

• Ta q M a n ®M i c ro RNA Array CardおよびPanelと使用することで良好な結果が得られます

• フェノール、クロロホルム TRIzol®試薬、グアニジンイソチアシアネートなどの有害化学物質を使用しません

• 難しいサンプルから磁気ビーズを用いてシンプルに精製を行います

• 75分以内に、感度、特異性、再現性の面からも良好な RT-qPCR結果が得られます

• TaqMan® Human MicroRNAアッセイおよびアレイカードのために特別に開発されました

• FFPEサンプルからDNA、miRNAなどの核酸をトータルで精製します

• Proteinase Kの処理が不要です̶午前中に脱パラフィンを始めても午後にはリアルタイムPCRが可能です

• 同一サンプル由来の未固定組織と比較して>50%の収率です

• リアルタイムPCRおよびPCR、変異スクリーニング、マイクロアレイ解析に使用できます

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Ordering information ：microRNA 抽出

microRNAを含むTotal RNAの抽出

mirVana™miRNA Isolation Kit

製品名 サイズ 製品番号 価格mirVana™ miRNA Isolation Kit ＜40回 AM1560 ¥52,800mirVana™ miRNA Isolation Kit（without Phenol） ＜40回 AM1561 ¥46,200

血清、血漿からのmiRNA抽出

mirVana™ PARIS™ Kit

製品名 サイズ 製品番号 価格mirVana™ PARIS™ Kit 40反応 AM1556 ¥60,700

MagMax™ シリーズ製品名 サイズ 製品番号 価格MagMAX™ Total Nucleic Acid Isolation Kit 100回 AM1840 ¥115,800MagMAX™-96 Blood RNA Isolation Kit 96回 AM1837 ¥69,100MagMAX™-96 Total RNA Isolation Kit 96回 AM1830 ¥62,500MagMAX™ Viral RNA Isolation Kit 50回 AM1939 ¥42,700MagMAX™-96 Viral RNA Isolation Kit 96回 AM1836 ¥64,800

キットを使用する際にはマグネティックスタンドが必要です。

磁気ビーズを用いるRNA抽出キット用のマグネティックスタンド製品名 サイズ 製品番号 価格Single Place Magnetic Stand 1個 AM10026 ¥13,000Magnetic Stand-96 1個 AM10027 ¥62,80096 well Magnetic-Ring Stand 1個 AM10050 ¥130,200

TaqMan® MicroRNA Cells-to-CT™ Kit

RNA抽出無しで、培養細胞から直接microRNA（miRNA）の発現プロファイリングを可能にします。

製品名 サイズ* 製品番号 価格 TaqMan® MicroRNA Cells-to-CT™ Kit 100反応 4391848 ¥199,500

* スタートサンプル数（細胞溶解反応数）として表示

微量サンプルからのmicroRNA抽出

TaqMan® miRNA ABC（Anti-miRNA Bead Capture）Purification Kiｔ製品名 サイズ 製品番号 価格TaqMan® miRNA ABC Purification Kit-Human Panel A 40回 4473087 ¥63,000TaqMan® miRNA ABC Purification Kit-Human Panel B 40回 4473088 ¥63,000

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Total Exosome Isolation シリーズ超遠心法と同等のインタクトなエキソソームを短時間で回収！RNAとタンパク質の精製、特定の抗原をもつエキソソームの単離、エキソソームの蛍光標識、ウエスタン解析用の抗体等、エキソソーム解析に必要な試薬を幅広く揃えております。

エキソソームの分離・回収

Total Exosome Isolation シリーズ製品名 サイズ 製品番号 価格

エキソソームの単離Total Exosome Isolation（細胞培養上清） 50 mL 4478359 ¥43,100Total Exosome Isolation（血清） 6 mL 4478360 ¥39,900Total Exosome Isolation（血漿） 6 mL 4484450 ¥42,000Total Exosome Isolation（尿） 50 mL 4484452 ¥28,400Total Exosome Isolation（その他体液） 6 mL 4484453 ¥42,000Exosome-Human CD63 Isolation/Detection（細胞培養上清） 3ｍL（約 30 prep/150 rxn） 10606D ¥42,000Exosome-Human CD9 Isolation （細胞培養上清） 　2mL（約 50 prep） 10614D ¥60,900Exosome-Human CD81 Isolation （細胞培養上清） 　2mL（約 50 prep） 10616D ¥60,900Exosome-Human Ep-CAM Isolation （細胞培養上清） 　2mL（約 50 prep） 10618D ¥60,900Exosome-Human CD9 Flow Detection （細胞培養上清） 　2mL（約 100 rxn） 10620D ¥27,300Exosome-Human CD81 Flow Detection （細胞培養上清） 　2mL（約 100 rxn） 10622D ¥27,300Exosome-Human Ep-CAM Flow Detection （細胞培養上清） 2mL（約 100 rxn） 10624D ¥27,300Exosome-Streptavidin for Isolation/Detection* 3mL（約 30 prep/150 rxn） 10608D ¥42,000

エキソソームRNAやタンパク質の精製Total Exosome RNA & Protein Isolation Kit 40 rxn 4478545 ¥39,900Exosome Immunoprecipitation （Protein A）* 1 mL 10610D ¥23,100Exosome Immunoprecipitation （Protein G）* 1 mL 10612D ¥23,100

エキソソームの蛍光標識Exosome Spin Columns （MW 3000） 30 カラム 4484449 ¥21,000SYTO® RNASelect™ Green Fluorescent Cell Stain 100 µL S32703 ¥45,100BODIPY® TR Ceramide 250 µg D7540 ¥45,100

ウェスタン解析用抗体Exosome Anti-CD9 （ウェスタン解析） 　0.2 mL 10626D ¥30,500Exosome Anti-CD63 （ウェスタン解析） 　0.2 mL 10628D ¥30,500Exosome Anti-CD81 （ウェスタン解析） 　0.2 mL 10630D ¥30,500

*別途、目的に応じた抗体が必要になります。

エキソソーム単離から解析へのワークフロー

エキソソーム回収

細胞培養上清 脳脊髄液 腹水 羊水 母乳 唾液血清 血漿 尿

Total Exosome Isolation・ 各サンプルに対応した 5種類の専用試薬・ 超遠心を使わずに短時間でエキソソームを回収・ 対応サンプルタイプ

エキソソームの蛍光標識

SYTO® RNASelect™ Green Fluorescent Cell StainBODIPY® TR ceramideエキソソーム中の RNAもしくはエキソソームの膜を蛍光標識

Exosome Spin Columns （MW 3000）蛍光標識したエキソソームの精製

特定の抗原を持つエキソソームの単離・フロー解析

Exosome-Human Isolation/Detection （CD9, CD63, CD81, Ep-CAM）高純度の CD9, CD63, CD81, Ep-CAM,陽性エキソソームを単離

Exosome-Streptavidin for Isolation/Detection前濃縮したエキソソームから作業時間 1時間以内に特定の抗原を持つエキソソームを単離可能

RNA とタンパク質の精製・解析

Total Exosome RNA & Protein Isolation Kit同一サンプルからタンパク質と RNAを回収可能

Exosome Immunoprecipitation磁気ビーズを利用した、わずか 30分のシンプルなプロトコール

ウェスタン解析用抗体エキソソームマーカータンパク質のウェスタン解析用抗体

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オンラインオーダーシステムのご案内TaqMan® Assaysなどの製品については、オンラインオーダーシステムを採用しています。このシステムのご利用には、事前登録が必要となります。一度ご登録いただければ、次回以降ユーザーIDとパスワードだけで簡単にご注文いただけます。

オンラインオーダー製品• TaqMan® MicroRNA Assays• mirVana™ miRNA mimics• mirVana™ miRNA inhibitors

〈ご登録方法〉ユーザー登録は、ウェブサイトの登録画面をご利用ください。ウェブの登録画面は必要事項を直接タイプ入力できるようになっております。

ご登録に関してご不明な点がありましたら弊社ヘルプデスクまでお問い合わせください。

メール：JP.Admin@lifetech.com電　話：03-6832-6980（音声ガイダンス　①のあと　アプライドバイオシステムズ　オリゴ・ウェブ受注品の④を選んでください。）

新規ユーザーアカウントのご登録に関する詳細は、以下のウェブサイトをご参照ください。www.lifetechnologies.com/taqman-order

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References1. Bartel DP (2004) MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116(2): 281–297.2. Soifer HS, Rossi JJ, Saetrom P (2007) MicroRNAs in disease and potential therapeutic applications. Mol Ther 15(12): 2070–2079.3. Griffi ths-Jones S, Saini HK, van Dongen S, Enright AJ (2008) miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res 36: D154–D158.

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