micrornas como biomarcadores do ritmo circadiano
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Mestrado em Medicina Legal
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano.
Joana Rodrigues Pinto
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M
2019
JOANA RODRIGUES PINTO
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano.
Dissertação de Candidatura ao Grau de Mestre em Medicina Legal submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto Orientadora - Doutora Ana Luísa Teixeira, Investigadora Júnior, Grupo de Oncologia Molecular e Patologia Viral do Centro de Investigação do Instituto Português de Oncologia do Porto; Colaboradora externa, Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto Co-orientadora – Mestre Francisca Dias, Doutoranda em Ciências Biomédicas, Grupo de Oncologia Molecular e Patologia Viral do Centro de Investigação Português de Oncologia do Porto
INFORMAÇÃO TÉCNICA TÍTULO: microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano.
Dissertação de Candidatura ao Grau de Mestre em Medicina Legal, apresentada ao
Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto
AUTOR: Joana Rodrigues Pinto DATA: setembro de 2019 EDITOR: Joana Rodrigues Pinto CORREIO ELETRÓNICO: [email protected]
1º EDIÇÃO: setembro de 2019
“Time is what we want most, but what we use worst.”
By William Penn
7
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
ÍNDICE
AGRADECIMENTOS ............................................................................................................ 9
RESUMO ............................................................................................................................. 13
ABSTRACT .......................................................................................................................... 17
ÍNDICE DE FIGURAS ......................................................................................................... 19
ÍNDICE DE TABELAS ......................................................................................................... 20
ABREVIATURAS ................................................................................................................. 21
1. Introdução..................................................................................................................... 27
1.1. Contextualização histórica .................................................................................... 27
1.2. Relógio biológico e mecanismos moleculares do ritmo circadiano ..................... 30
1.3. Regulação do ritmo circadiano pela luz ............................................................... 33
1.4. Importância do cortisol no ritmo circadiano .......................................................... 34
1.5. microRNAs ............................................................................................................ 38
1.6. microRNAs envolvidos na via do cortisol e sua importância para as ciências
forenses ........................................................................................................................... 40
2. Objetivos ....................................................................................................................... 45
2.1. Objetivo principal .................................................................................................. 45
2.2. Objetivos específicos ............................................................................................ 45
3. Materiais e métodos ..................................................................................................... 49
3.1. Seleção do perfil de microRNAs........................................................................... 49
3.2. População em estudo ........................................................................................... 49
3.3. Processamento de amostras ................................................................................ 50
3.4. Extração de microRNAs ....................................................................................... 51
3.5. Síntese de cDNA .................................................................................................. 51
3.6. Quantificação por PCR tempo real ....................................................................... 52
3.7. Quantificação dos níveis de cortisol sérico e salivar ……………………………….52
3.8. Análise estatística ................................................................................................. 53
4. Resultados.................................................................................................................... 57
8
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
4.1. Frequências de deteção dos microRNAs estudados em amostras de sangue e saliva
.......................................................................................................................................... 57
4.2. Níveis de cortisol e quantificação relativa dos microRNAs nas amostras de sangue
e saliva ............................................................................................................................. 59
5. Discussão ..................................................................................................................... 65
6. Conclusão e perspetivas futuras ................................................................................. 71
7. Referências bibliográficas ............................................................................................ 75
AGRADECIMENTOS
9
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
AGRADECIMENTOS
Ao concluir esta etapa do meu percurso académico, não poderia deixar de agradecer
a todas as pessoas que contribuíram, de forma direta e indireta, para a execução deste
projeto.
Agradeço à Professora Doutora Maria José Pinto da Costa, Diretora do Mestrado em
Medicina Legal, a oportunidade de ingressar neste mestrado, assim como todos os
conhecimentos transmitidos e disponibilidade.
À Doutora Ana Luísa Teixeira, minha orientadora um muito obrigada por ter aceite a
orientação científica deste trabalho e por me ter proposto este projeto tão desafiante.
Obrigada por todas as sugestões, saber partilhado, críticas construtivas e principalmente
por me ter ajudado a crescer a nível científico, laboratorial mas também pessoal.
À minha coorientadora, Mestre Francisca Dias, um muito obrigada pela paciência que
teve comigo, pelo conhecimento partilhado e por todas as vezes que me “salvou” e arranjou
soluções para os obstáculos que foram surgindo ao longo deste caminho. A tua boa
disposição contagia qualquer um e faz toda a diferença.
A todo o Grupo de Oncologia Molecular e Patologia Viral do Instituto Português de
Oncologia do Porto, em especial à Mariana Morais e Inês Nogueira pela ajuda
esclarecimento de dúvidas.
Agradeço a colaboração do Serviço de Química Clínica do Departamento de
Diagnóstico Laboratorial do IPO-Porto pela quantificação dos níveis de cortisol e a todos
os voluntários, sem os quais, a realização deste projeto não teria sido possível.
Um muito obrigada, às minhas amigas e colegas de Mestrado Bruna Cavalcante e
Bela Barros. Foi muito importante para mim todo o vosso apoio e amizade. Crescemos
juntas nesta etapa e espero continuar a compartilhar muito bons momentos ao vosso lado.
À minha melhor amiga Rafaela Maia, por sempre acreditar em mim, estar sempre do
meu lado a ouvir as minhas lamentações. O teu apoio foi e será sempre fundamental.
Aos meus amigos(as), em especial João Miranda e André Almeida, por me fazerem rir
mesmo quando as coisas não correram bem e estarem sempre do meu lado. Obrigado por
todos os momentos de descontração.
AGRADECIMENTOS
10
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
À minha irmã Sara Pinto, não há pessoa que me conhece melhor do que tu. Muito
obrigada pelo teu esforço e disponibilidade em ajudar, mesmo não sendo a tua área de
formação. És sempre a primeira a estender a mão quando mais preciso.
A toda a minha família, mas em especial aos meus pais, os melhores do mundo. O
vosso apoio é incondicional e sem vocês nada disto seria possível. Obrigada por todos os
valores que me transmitiram ao longo deste caminho, que é a minha vida. Por todos os
momentos que me fizeram ver o lado positivo da situação, por todos os obstáculos que me
ajudaram a ultrapassar e por toda a compreensão.
A todos, muito obrigado.
RESUMO
RESUMO
13
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
RESUMO
A vida na Terra adaptou-se ao ciclo de dia e de noite, através da evolução dos
relógios biológicos. Os relógios biológicos são ritmos biológicos endógenos que ajustam o
equilíbrio entre o comportamento e as necessidades do organismo, face às mudanças
constantes do ambiente, sendo um processo transversal aos organismos unicelulares e
multicelulares. O estudo do funcionamento e regulação dos relógios biológicos é designado
de Cronobiologia, nesta área os ritmos biológicos são classificados em ritmos ultradianos,
infradianos e circadianos. O ritmo circadiano, é o período de aproximadamente 24 horas,
de acordo com o tempo de rotação da Terra em torno do seu eixo. O controlo deste permite
a regulação de uma ampla variedade de processos fisiológicos, nomeadamente a
regulação da via do cortisol sérico.
O cortisol é uma hormona corticosteróide produzida pela glândula suprarrenal,
estando diretamente envolvida na regulação dos níveis de stress e do ritmo circadiano. Na
regulação da via do cortisol, estão envolvidos mecanismos de regulação epigenéticos
como é o caso dos microRNAs (miRNAs). Os miRNAs pertencem a uma família de
pequenas moléculas de RNA não codificante, com uma grande importância em estudos
forenses, uma vez que apresentam uma elevada estabilidade, podendo permanecer
estáveis ao longo do intervalo post-mortem (IPM). O IPM fornece uma estimativa do
intervalo que ocorre entre a morte e a descoberta do respetivo cadáver. Deste modo, a
elevada estabilidade dos miRNAs neste intervalo, poderá permitir a análise da dinâmica
dos miRNAs associada à via de produção do cortisol possibilitando que seja fornecida uma
estimativa do momento da morte de um indivíduo, e assim auxiliar na inclusão ou exclusão
de possíveis suspeitos a um local de crime ou fornecer informações temporais de amostras
biológicas depositadas num suporte físico.
O objetivo deste estudo foi analisar o potencial dos miRNAs envolvidos nas vias de
produção do cortisol como biomarcadores de ritmo circadiano em amostras de sangue e
saliva. Inicialmente, foi realizada a revisão da literatura com o objetivo de selecionar o perfil
de miRNAs com maior potencial para ser analisado, tendo sido selecionados os seguintes
miRNAs: hsa-miR-10a, hsa-miR-10b, hsa-miR-16, hsa-miR-20, hsa-miR-21, hsa-miR-24 e
hsa-miR-144-5p. Realizaram-se colheitas de sangue a 20 indivíduos voluntários saudáveis,
nos períodos da manhã e da tarde e colheitas de saliva no período da noite. As amostras
foram processadas e os miRNAs extraídos. Posteriormente foi realizada a síntese de DNA
complementar e, de seguida os miRNAs foram analisados por qPCR em tempo real.
RESUMO
14
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
Observamos que os miRNAs foram detetados em ambos os fluídos biológicos,
contudo apresentaram frequências de deteção muito variáveis, com exceção do hsa-miR-
144-5p que não foi detetado na saliva. De acordo com os resultados, observamos que os
hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 apresentam um aumento de expressão ao longo
do dia, contrariamente aos níveis de cortisol, que foram diminuindo ao longo deste. Por
outro lado, o hsa-miR-144-5p também demonstrou um aumento de expressão entre os
períodos da manhã e da tarde mas não foi detetado à noite. O presente estudo concluiu
que os hsa-miR-10a, hsa-miR-16, hsa-miR-24 e hsa-miR-144-5p poderão ser
biomarcadores úteis no que respeita à determinação do espaço temporal em que uma
amostra de sangue foi colhida, podendo ser fortes candidatos a serem incluídos num perfil
de miRNAs a estudar a quando de uma determinação do IPM.
Futuramente, o presente estudo deveria ser replicado num maior número de
indivíduos, de modo a validar as associações encontradas. Adicionalmente também seria
interessante o estudo da expressão destes miRNAs em amostras de sangue periférico
durante o período da noite e em amostras de saliva durante o período da manhã e tarde,
de modo a complementar os resultados obtidos.
ABSTRACT
ABSTRACT
17
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
ABSTRACT
Life on Earth has adapted to the day and night cycle through the evolution of
biological clocks. Biological clocks are endogenous biological rhythms that adjust the
balance between the behavior and the needs of the organism, in response to the constant
changes of the environment. This process is transversal to the unicellular and multicellular
organisms and the study area of the regulation of biological clocks is called chronobiology.
Biological rhythms are classified into ultradian, infradian and circadian. The circadian
rhythm is the period of approximately 24 hours, according to the time of rotation of the earth
around its axis. Its control allows regulation of a wide variety of physiological processes,
including regulation of the serum cortisol pathway.
Cortisol is a corticosteroid hormone produced by the adrenal gland and is directly
involved in the regulation of the stress levels and the circadian rhythm. The regulation of
the cortisol pathway is made by several mechanisms, including epigenetic mechanisms like
microRNAs (miRNAs). MiRNAs are small non-coding RNAs that present a high stability in
several body fluids, including over the postmortem interval (PMI). The PMI provides an
estimate of the interval that occurs between the death and discovery of the respective body.
The high stability of miRNAs during this period may be usefull in the analysis of the miRNA
dynamics associated with the cortisol pathway, therefore allowing the estimation of an
individual's time of death. Consequently, miRNAs are potential biomarkers capable of
determine the timeline of biological samples found on a crime scene and also assist in the
inclusion or exclusion of possible suspects.
The aim of this study was to analyse the miRNAs involved in the cortisol pathway
as potential circadian rhythm biomarkers in blood and saliva samples. Initially, a literature
review was performed in order to select the miRNAs profile with the highest potential to be
analyzed, and the following miRNAs were selected: hsa-miR-10a, hsa-miR-10b, hsa-miR-
16, hsa-miR-20, hsa-miR-21, hsa-miR-24 and hsa-miR-144-5p. Blood samples were taken
from 20 healthy volunteers in the morning and afternoon and saliva samples were collected
in the evening. The samples were processed and the miRNAs were extracted.
Subsequently, complementary DNA synthesis was performed and then miRNAs were
analyzed by real time quantitative PCR. We observed that, with the exception of has-miR-
144-5p that was not detected in the saliva, all the miRNAs were detected in both biological
fluids, but had very variable detection frequencies. According to the results, we observed
that hsa-miR-10a, hsa-miR-16 and hsa-miR-24 showed an increased expression
throughout the day, as opposed to cortisol levels, which decreased over the course of the
ABSTRACT
18
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
day. Hsa-miR-144-5p also showed increased expression between morning and afternoon
but was not detected at night. The present study concluded that hsa-miR-10a, hsa-miR-16,
hsa-miR-24, and hsa-miR-144-5p may be useful biomarkers for determine the time frame
in which sample was taken. Additionally, these miRNAs may be strong candidates to be
included in a miRNA profile to be studied at the time of an PMI determination.
In order to validate the associations found, future studies should replicate this study
in a larger number of volunteers. Moreover, it would be interesting to study these miRNAs
expression in peripheral blood samples at night and in saliva samples in the morning and
afternoon to complement the results obtained.
.
ÍNDICE DE FIGURAS
19
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Localização do núcleo supraquiasmático (Adaptado de Netter FH (21)). ......... 30
Figura 2. Transcription-translation feedback loop – Formação do dímero CLOCK:BMAL1 e
consequente ativação da transcrição dos genes que codificam reguladores CRY e PER no
núcleo. Ligação do dímero PER:CRY no citoplasma que é transportado para o núcleo para
inibir ativadores de transcrição dos genes CLOCK e BMAL1. ........................................... 32
Figura 3. Auxiliar transcription-translation feedback loop responsável pela regulação do
gene BMAL1. Ativação de Reverb α e Ror α que consequentemente inibem ou ativam
(respetivamente) da produção de BMAL1. ......................................................................... 32
Figura 4. Regulação da transcrição dos clock controlled genes (ccgs), responsáveis por
codificar substâncias que regulam os neurónios do NSQ. ................................................. 33
Figura 5. Regulação dos relógios circadianos. A informação da entrada do estímulo
luminoso na retina transportado para o SNC, é coordenado pelo NSQ onde está localizado
o relógio central responsável por regular ciclos sono-vigília, performances cognitivas e
transmitir as informações para os relógios dos órgãos periféricos, permitindo assim a
homeostasia corporal. ......................................................................................................... 34
Figura 6. Mecanismo de ação eixo hipotálamo-hipófise-adrenal. ...................................... 35
Figura 7. Síntese de glicocorticóides e posterior formação de proteína quinase. ............. 36
Figura 8. Via da síntese do cortisol. Transporte do colesterol da membrana mitocondrial
externa para a membrana mitocondrial interna pela proteína StAR. Na mitocôndria e
reticulo endoplasmático, o colesterol passa por ações sequenciais até ser transformado em
cortisol. ................................................................................................................................. 36
Figura 9. Variações dos níveis de cortisol ao longo de um dia (Adaptado de Fleming B.
(51)). .................................................................................................................................... 37
Figura 10. Representação esquemática da biogénese de microRNAs ............................. 39
Figura 11. Mecanismo de ação dos miRNAs (Adaptado de Teixeira AL e colaboradores
(52)). .................................................................................................................................... 39
Figura 12. Frequência de deteção (%), dos miRNAs em estudo ao longo do dia. ............ 58
Figura 13.Níveis do cortisol e miRNAs ao longo do dia. .................................................... 60
Figura 14. Relação dos hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 com a regulação da via da
síntese do cortisol. ............................................................................................................... 68
ÍNDICE DE TABELAS
20
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Colheita das amostras biológicas ....................................................................... 50
Tabela 2. Valores de fold-change e pvalue para os hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-
24. ........................................................................................................................................ 61
ABREVIATURAS
21
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
ABREVIATURAS
A
AC Adenilciclase
ACTH Hormona adrenocorticotrófica
ACTHr Recetor da hormona adrenocorticotrófica
AGO Argonauta
AVP Arginina vasopressina ou Hormona antidiurética
AKE Cloreto de amónio fosfato de hidrogénio e EDTA
B
BMAL1 Brain and muscle arnt-like-protein-1
C
cAMP Adenosina 3’ 5’ monofosfato cíclico
CCGs Clock controlled genes
cDNA DNA complementar
CLOCK Circadian locomotor output cycles kaput
CRE cAMP response element
CREB cAMP response element binding
CREm Modulador de CRE
CRH Hormona libertadora de corticotrofina
CRY Crypthochrome gene
Ct Cycle threshold
D
DGCR8 DiGeorge Syndrome Critical Region 8
dL Decilitro
ABREVIATURAS
22
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
dsRNA Double-stranded ribonucleic RNA
E
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
G
CG Glucocorticóides
H
HSF1 Heat shock factor 1
I
IFN γ Interferão gama
L
LSS Lanosterol sintase
M
MCR2 Recetor melanocortina-2
MiRNA MicroRNA
mRNA RNA mensageiro
N
NFR2 Nuclear factor erythroid 2-related factor 2
NSQ Núcleo supraquiasmático
ABREVIATURAS
23
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
P
PCR Polymerase Chain Reaction
PER Period gene
PKA Proteína quiinase A
IPM Intervalo post-mortem
pre-miRNA microRNA precursor
pri-miRNA microRNA primário
PVN Núcleo paraventricular
R
RER Reticulo endoplasmático rugoso
RISC RNA-induced silencing complex
RNA Ácido ribonucleico
RNase Ribonuclease
RNA Pol II RNA Polimerase II
RT Reverse Transcriptase
S
SNC Sistema nervoso central
StAR Proteína reguladora aguda esteroideogénica
STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3
T
TNF α Fator de necrose tumoral
TRBP Transactivation-responsive RNA-binding protein
ABREVIATURAS
24
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
X
XPO5 Proteina Exportina 5
INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO
27
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
1. Introdução
1.1. Contextualização histórica
O relógio tornou-se imprescindível para controlar a passagem do tempo na vida
agitada da nossa sociedade, visto que horários e prazos são critérios continuamente
presentes no dia-a-dia do Homem. Porém, os relógios biológicos já são parte integrante e
indispensável na Terra desde a evolução dos organismos unicelulares mais primitivos até
ao ser humano. À medida que a trajetória do Sol e da Lua se concretiza, juntamente com
a inclinação natural do eixo da Terra, resultam a ocorrência de ciclos associados ao dia e
à noite, estações do ano, fases da Lua e oscilação de marés (1). Deste modo, as espécies
desenvolveram determinados comportamentos de forma a se adaptarem e viverem com
estas mudanças ciclícas. Exemplos destas oscilações, são o facto de algumas espécies
de plantas germinarem numa determinada época, de outras perderem as folhas, de alguns
animais migrarem para regiões mais propícias à sua sobrevivência e outros hibernarem
durante épocas adversas para a sua sobrevivência. Tal como outras espécies, o organismo
do ser humano apresenta ritmos biológicos endógenos denominados de relógios
biológicos, que lhe permite adaptar antecipadamente as suas respostas, face a estímulos
externos como a luz e a temperatura (1).
O estudo do funcionamento e regulação dos relógios biológicos é designado de
Cronobiologia. A Cronobiologia é a ciência que se dedica a estudar a relação entre o tempo
cronológico (resultante da rotação do planeta Terra no seu próprio eixo) e o ritmo biológico
dos organismos, bem como os efeitos que resultam da desregulação entre ambos, como
por exemplo, desregulações no sono, no desenvolvimento, metabolismo e funções
comportamentais (2). O primeiro cientista a suspeitar da existência de relógios biológicos
foi o astrónomo Jean Jaques de Mairan, que em 1729 observou que uma planta no seu
escritório, de espécie Mimosa pudica, abria conforme a luminosidade. Para comprovar
essa observação, decidiu colocar a planta dentro de um baú e verificou que mesmo nas
condições de escuridão, a planta continuou a movimentar-se como se acompanhasse os
ciclos de dia e noite durante alguns dias (3). Um século após, em 1835, Augustin Pyrame
de Candolle, observou que a planta de espécie Mimosa pudica, mantida no escuro num
período mais prolongado, apresentava um movimento variável entre as 22 horas e 23
horas, mas em condições normais de iluminação, o movimento da planta era ajustado para
as 24 horas. Isto, permitiu-lhe concluir que o ciclo era uma expressão do ritmo endógeno
da planta e que dependia da variável claro/escuro do ambiente (4). Apesar das
INTRODUÇÃO
28
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
descobertas, a Cronobiologia não foi considerada um campo legítimo de estudos
científicos e, apenas no século XX é que começou a ganhar relevo quando novas técnicas
começaram a comprovar a importância do funcionamento dos relógios biológicos ao nível
neurológico e molecular (5).
O termo relógio biológico foi introduzido só no final da década de 40 do século
passado, pelo alemão Gustav Kramer. Este investigador estudou a migração das aves,
argumentando que as aves migravam para Norte na primavera tendo como ponto de
referência o sol (6). Para Gustav Kramer, as aves necessitavam de uma entidade fisiológica
que fosse precisa para a contagem do tempo, ou seja, um relógio (7). A luz, tal como a
temperatura por exemplo, são definidos como “inputs” ambientais, também designados por
zeitgebergs, capazes de sincronizar o tempo cronológico com o tempo biológico e assim,
conferir vantagem seletiva na espécie (6). Mais tarde, Franz Halberg não só definiu os
ritmos biológicos como atividades endógenas do organismo sincronizadas com o ambiente
e que se repetiam ciclicamente, como também os classificou em ritmos ultradianos,
infradianos ou circadianos (8). Halberg definiu os ritmos ultradianos como ritmos
caracterizados por pequenas variações em curtos espaços de tempo, ou seja, ritmos que
ocorrem várias vezes num período de 24 horas. Exemplo destes ritmos são os batimentos
cardíacos e respiratórios (9). Relativamente aos ritmos infradianos, caracterizou-os como
variações ocorridas num período superior a 28 horas. Exemplos destes ritmos são os ciclos
estrais em roedores (que ocorrem a cada 3 ou 4 dias em ratos) e o ciclo menstrual (que
ocorre aproximadamente a cada 28 dias nas mulheres) (9). Por último, Halberg definiu os
ritmos circadianos (do latim Circa diem que significa “sobre o dia”) como ritmos
caracterizados pela ocorrência num período de 24 horas, de acordo com o tempo de
rotação da terra em torno do seu próprio eixo. Exemplos destes ritmos são o ciclo
claro/escuro, a produção hormonal (cortisol, melatonina), regulação da temperatura
corporal e pressão arterial (10).
Tal como Gustav Kramer, também Curt Richter afirmou que os relógios biológicos
seriam “instrumentos do corpo para manter a contagem do tempo”. Sugeriu também, que
os relógios biológicos poderiam estar presentes em diferentes órgãos (7). O
reconhecimento da presença de estruturas envolvidas na medição do tempo, através de
experiências que consistiram na observação de lesões progressivas no sistema nervoso
central (SNC) em ratinhos, com a permanência ou supressão de ritmos diários, levou-o à
conclusão que o centro responsável pela regulação da ritmicidade era o hipotálamo (7).
Com esta descoberta, em 1972, Martin Moore Ede, juntamente com a sua equipa, partiu
do princípio que o zeitgeberg com maior influência sobre o relógio biológico seria o ciclo
INTRODUÇÃO
29
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
claro/escuro e por isso decidiu estudar o papel da visão neste ciclo, conseguindo descrever
a via retino-hipotalâmica que terminava em dois núcleos na base do cérebro, os núcleos
supraquiasmáticos (NSQ) (11). No mesmo ano, um estudo em ratinhos demonstrou que os
ritmos circadianos envolvidos na ingestão de água ficavam suprimidos na existência de
lesões nos NSQ (12). Passados 7 anos, Kawamura e Inouye cortaram todas as ligações
das restantes estruturas do cérebro dos ratinhos com os NSQ. Antes do “knockout” das
restantes estruturas, observaram que a atividade elétrica do hipotálamo apresentava
ritmicidade circadiana, porém após o procedimento, a ritmicidade circadiana apenas
persistiu na região dos núcleos, confirmando que eram as estruturas responsáveis pela
oscilação endógena do sistema nervoso central (SNC) (13). Estabeleceram então dois
critérios para que uma estrutura fosse considerada um oscilador endógeno: 1) atividade
autónoma mesmo quando isolado de outras estruturas e mantido in vivo e, 2) a capacidade
do tecido restaurar a sua atividade se implantado em hospedeiros sem atividade (13). Na
década de 90, o segundo critério foi confirmado através de uma experiência com ratinhos
com um período de atividade de 21 horas versus ratinhos com um período de atividade de
24 horas. Ao ser provocada uma lesão nos NSQ dos modelos animais com período de
atividade de 24 horas, estes ficaram sem atividade, porém, após serem transplantados os
NSQ com um período de atividade de 21 horas, os ratinhos que anteriormente tinham um
período de atividade de 24 horas passaram a ter ritmos de atividade e repouso com
períodos iguais aos dos dadores (14).
INTRODUÇÃO
30
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
1.2. Relógio biológico e mecanismos moleculares do ritmo circadiano
Os relógios biológicos são um mecanismo intrínseco às células, organizados, e que
preparam o organismo para os estímulos externos com o objetivo de manter a homeostasia
corporal (15). O nosso organismo possui um relógio principal no cérebro que funciona
como um temporizador, coordenando todos os relógios biológicos do organismo e
mantendo-os sincronizados. Nos seres vertebrados, o relógio principal constitui cerca de
20 000 neurónios com capacidade rítmica autossustentável que formam uma estrutura
denominada NSQ (16). O NSQ localiza-se mais precisamente no hipotálamo anterior, na
região ventral do cérebro, na junção do cérebro médio com os tálamos óticos (2). Este
núcleo, está estrategicamente posicionado para receber informações visuais e para
percecionar a presença e ausência de luz, tanto direta como indiretamente através da via
da retina (Figura 1) (17). Outro temporizador presente no cérebro é a glândula pineal,
responsável pela secreção de melatonina (18). Embora o SNC regule a maioria dos ritmos
circadianos nos mamíferos, muitos órgãos e tecidos do corpo podem gerar ritmos
circadianos independentemente, sendo denominados osciladores circadianos periféricos
(19). Os osciladores periféricos estão presentes no sangue, coração, fígado, tecido adiposo
e outras regiões (20).
Figura 1. Localização do núcleo supraquiasmático (Adaptado de Netter FH (21)).
Os relógios biológicos têm a capacidade de estabelecer os horários das refeições,
do sono, os níveis das hormonas como é o caso do cortisol sérico, regular a resposta do
INTRODUÇÃO
31
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
corpo ao açúcar, entre outros processos biológicos. Permitem também que as mudanças
nos processos celulares ocorram em tempos ideais (22). A realização destes processos
biológicos é realizada uma vez que, o relógio do SNC é composto por múltiplos osciladores
unicelulares que quando sincronizados, geram respostas circadianas coordenadas (23).
Embora os componentes moleculares individuais do relógio circadiano não sejam
totalmente homólogos entre o ser humano e a mosca Drosophila melanogaster, o
conhecimento atual sobre o ritmo circadiano e a sua interação com fatores externos foi
aprofundado pelos estudos realizados neste modelo animal (24). Foi a partir deste modelo
que o primeiro gene do relógio foi identificado, nomeadamente o gene period (PER) (7). Os
restantes genes foram identificados nos anos 90: cryptochrome (CRY), brain and muscle
arnt-like protein-1 (BMAL1) e circadian locomotor output cycles kaput (CLOCK) (25).
Ao nível celular, os ritmos circadianos são consequência dos genes relógio que
conjuntamente se autorregulam para gerar ritmos que regulam e preparam o organismo
para estímulos externos, mantendo a homeostasia corporal (26-28). Por sua vez, ao nível
molecular os ritmos circadianos são sustentados por interações de loops de feedback
negativo que produzem ritmos cíclicos ao nível das proteínas e do ácido ribonucleico (RNA)
dos principais componentes do relógio (2).
Tal como já foi referido, os principais genes envolvidos nos mecanismos do relógio
são: os genes CLOCK, BMAL1, PER e CRY (2). Estes genes podem ser divididos em duas
categorias antagónicas: os reguladores positivos e os reguladores negativos. Nos
reguladores positivos estão incluídos os principais fatores responsáveis pela transcrição
no primeiro feedback loop, nomeadamente os genes CLOCK e BMAL1. Estas proteínas
ligam-se, formando um dímero e têm como principal função a ativação da transcrição. No
núcleo ligam-se a promotores E-box que, por sua vez, vão aumentar e controlar a
transcrição dos genes que codificam os reguladores negativos: CRY e PER. As proteínas
CRY e PER quando são produzidas no citoplasma ligam-se, formam um dímero, e são
transportadas novamente para o núcleo onde vão ter a função de inibir ativadores de
transcrição dos genes CLOCK e BMAL1 (29). Antes do próximo ciclo iniciar, o dímero
CLOCK:BMAL1 deve ser reativado e por isso, os níveis de produção das proteínas CRY
e PER vão diminuir até se tornarem insuficientes para reprimir a atividade de
CLOCK:BMAL1, o qual volta a ativar a transcrição dos genes que codificam os reguladores
negativos, reiniciando um novo ciclo (Figura 2).
INTRODUÇÃO
32
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
Figura 2. Transcription-translation feedback loop – Formação do dímero CLOCK:BMAL1 e consequente ativação da transcrição dos genes que codificam reguladores CRY e PER no núcleo. Ligação do dímero PER:CRY no citoplasma que é transportado para o núcleo para inibir ativadores de transcrição dos genes CLOCK e BMAL1.
Ao mesmo tempo, um segundo feedback loop (Figura 3) é responsável pela
regulação do gene BMAL1. No núcleo, os dímeros CLOCK:BMAL1 ativam a transcrição do
gene Reverb α e β (conhecido como NR1D1 e NR1D2 ou subfamília do recetor nuclear 1)
cuja respetiva proteína compete com a proteína Ror α, β e γ, para se ligarem a CORE que
está localizado em E-box de promotores do BMAL1. No entanto, quando se ligam ao
promotor, as proteínas possuem ações contrárias. A Ror α vai ativar a expressão de
BMAL1, enquanto que Reverb α vai inibir a expressão (30). Como consequência ocorrem
oscilações das concentrações de Reverb α, Ror α e produção de BMAL1. Contudo, se
ocorrer uma maior expressão de Ror α, ou seja, mais ativação, a proteína BMAL1 vai ser
produzida para formar novamente dímeros com a proteína CLOCK.
Figura 3. Auxiliar transcription-translation feedback loop responsável pela regulação do gene BMAL1. Ativação de Reverb α e Ror α que consequentemente inibem ou ativam (respetivamente) da produção de BMAL1.
INTRODUÇÃO
33
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
É importante referir que as proteínas envolvidas na regulação da transcrição dos
próprios genes do relógio também regulam a transcrição de genes alvo, denominados clock
controlled genes (CCGs) (Figura 4). Os CCGs são responsáveis por codificar substâncias
como vasopressina, recetores de hormonas (glucocorticoides, estrogénios)
neurotransmissores, fatores de transcrição (HSF1, STAT3), neuropéptidos, que regulam
os neurónios do NSQ e posteriormente, todo o organismo através de enervações diretas
sobre o tecido alvo (31).
Figura 4. Regulação da transcrição dos clock controlled genes (ccgs), responsáveis por codificar substâncias que regulam os neurónios do NSQ.
1.3. Regulação do ritmo circadiano pela luz
O estímulo externo, que vai permitir regular o ritmo circadiano, é a luz. A entrada da
luz é permitida através da retina, apresentando o seguinte trajeto: retina, NSQ, órgãos
periféricos.
A retina é uma estrutura localizada na parte mais interna do globo ocular. Esta
estrutura, constituída por células especializadas, nomeadamente fotorrecetores, tem como
principal função converter o estímulo luminoso em impulsos nervosos, através da
transdução e transmissão de sinal pelo nervo ótico para o cérebro (32). Alguns estudos
demonstram que muitos aspetos da função e da fisiologia da retina são controlados por um
relógio circadiano, tais como a libertação da melatonina pela glândula pineal, o aumento
do cortisol nas primeiras horas do dia e posterior diminuição, a síntese de dopamina, entre
outros (33-35). A informação da entrada de luz é transportada para o SNC diretamente
pela via trato retina-hipotálamo para o NSQ (28). Após receber a informação, o NSQ
coordena-a para todos os órgãos periféricos como o fígado, o coração, os pulmões e outros
sistemas, de forma a regular e organizar os processos fisiológicos (36) (Figura 5).
INTRODUÇÃO
34
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
Figura 5. Regulação dos relógios circadianos. A informação da entrada do estímulo luminoso na retina transportado para o SNC, é coordenado pelo NSQ onde está localizado o relógio central responsável por regular ciclos sono-vigília, performances cognitivas e transmitir as informações para os relógios dos órgãos periféricos, permitindo assim a homeostasia corporal.
1.4. Importância do cortisol no ritmo circadiano
O eixo hipotálamo-hipófise-adrenal é considerado um importante circuito
neuroendócrino responsável pelo controlo de respostas ao stress, sendo a sua atividade
efetuada em resposta a hormonas excretadas pela glândula suprarrenal. No hipotálamo
são libertados sinais neuroquímicos provocados por uma resposta ao stress que estimulam
os neurónios do núcleo paraventricular (PVN) a libertar hormona libertadora de
corticotrofina (CRH) e arginina vasopressina (AVP). As hormonas libertadas possuem
como objetivo induzir a síntese da hormona adrenocorticotrófica (ACTH) e secreção na
hipófise, visto que a sua produção aumenta em períodos de stress. Por sua vez, a ACTH
induz a síntese e secreção na glândula SR de glucocorticóides (GC), nomeadamente o
cortisol (37), que interagem com recetores específicos do SNC e em vários tecidos-alvo
periféricos (38) (Figura 6). Assim, os GC em circulação desativam a atividade
neuroendócrina do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, através de um feedback negativo, de
maneira que preparam o corpo para lidar com estímulos e manter assim a homeostasia
(39).
INTRODUÇÃO
35
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
Figura 6. Mecanismo de ação eixo hipotálamo-hipófise-adrenal.
A glândula suprarrenal, é um relógio periférico que pode influenciar os ritmos dos
tecidos periféricos através da libertação de hormonas com propriedades moduladoras.
Enquanto que a medúla é responsável por libertar catecolaminas (nomeadamente
epinefrina e norepinefrina), o córtex da suprarrenal secreta mineralocorticóides,
glucocorticóides (CG) e esteróides sexuais (40).
Os GC são libertados com a ligação da hormona ACTH que é secretada pela
hipófise, ao recetor da melanocortina 2 (MCR2) na glândula suprarrenal. Após a ativação
do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, a ACTH liga-se ao recetor da hormona
adrenocorticotrofica (ACTHr), ativando a proteína G e posteriormente estimulando a
adenilciclase (AC) que catalisa a formação da adenosina 3',5'-monofosfato cíclico (cAMP).
Com a estimulação da atividade da cAMP, os fatores de transcrição nuclear da proteína
quinase (PKA), as proteínas de ligação ao elemento de resposta cAMP (cAMP response
element binding (CREB) e cAMP response element (CRE)) e o modulador da CRE (CREm)
também são ativados (Figura 7). Estes fatores são responsáveis pela modulação da
expressão dos genes envolvidos na síntese de GC (41).
INTRODUÇÃO
36
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
Figura 7. Síntese de gluocorticóides e posterior formação de proteína quinase.
Após a ativação dos vários fatores, a proteína reguladora aguda esteroideogénica
(StAR) atua como um transportador que regula a passagem do colesterol da membrana
mitocondrial externa para a membrana mitocondrial interna. É importante salientar que o
gene codificante da StAR é controlado pelo relógio específico da suprarrenal bem como
pelo heterodímero CLOCK: BMAL1 (42, 43). Na mitocôndria, o colesterol passa por várias
ações sequenciais mediadas por hidroxiesteróides desidrogenases e citocromos P450.
Este, começa por ser clivado pela enzima cyp11a1 e é convertido em pregnenolona. De
seguida, no retículo endoplasmático rugoso (RER), a pregnenolona é metabolizada pelas
enzimas 17-α-hidroxilase (cyp17) (presente apenas em espécies produtoras de cortisol) e
3-β-hidroxiesteróide desidrogenase (3β-HSD ou HSD3B) e é convertida em 17-α-
hidroxipregnenolona e 17-α-hidroxiprogesterona, respetivamente (44). Posteriormente, a
21-β-hidroxilase (cyp21) converte 17-α-progesterona em 11-desoxicortisol. Finalmente, na
mitocôndria e por ação de 11-β-hidroxilase (cyp11b1), o 11-desoxicortisol é transformado
em cortisol (41) (Figura 8).
Figura 8. Via da síntese do cortisol. Transporte do colesterol da membrana mitocondrial externa para a membrana mitocondrial interna pela proteína StAR. Na mitocôndria e reticulo endoplasmático, o colesterol passa por ações sequenciais até ser transformado em cortisol.
INTRODUÇÃO
37
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
O cortisol é uma hormona glucocorticóide diretamente envolvida com a adaptação
a respostas de stress e controlo da via do eixo neuro endócrino do hipotálamo-hipófise-
adrenal (ritmo circadiano). Possui também outras funções, nomeadamente, a regulação da
resposta imune, da função cerebral, da atividade cardiovascular e do metabolismo. É o
principal glucocorticóide presente em humanos e possui uma oscilação circadiana muito
característica. A hormona corticosteroide é considerada um índice útil para a atividade do
eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, pois a sua atividade aumenta no organismo
imediatamente após uma pessoa despertar (45, 46).
Num indivíduo saudável, os níveis de cortisol apresentam variações específicas ao
longo do dia. A sua concentração mais elevada observa-se aproximadamente 20-45
minutos após o indivíduo despertar e vai diminuindo ao longo do dia até atingir um valor
mínimo durante a noite (47). Por norma, o cortisol atinge o seu pico mais elevado por volta
das 9 horas da manhã, a partir das 14:30 e as 15:30 verificam-se uma diminuição dos
valores de cortisol, atingindo um valor mais baixo por volta da meia-noite,
independentemente do género. No entanto, é importante salientar que na presença de
determinadas patologias como o síndrome de Cushing (hipercortisolismo) ou na presença
de um tumor adrenal a produção de cortisol fica descontrolada e os seus níveis
anormalmente elevados, não sendo possível observar uma variação circadiana (Figura 9)
(48). É ainda de referir que indivíduos que façam trabalhos noturnos ou trabalhem por
sistema de turnos também podem apresentar um padrão de níveis de cortisol alterado (49,
50).
Figura 9. Variações dos níveis de cortisol ao longo de um dia (Adaptado de Fleming B. (51)).
Atualmente, sabe-se que na regulação da via do cortisol, estão envolvidos
mecanismos de regulação epigenéticos como é o caso dos microRNAs (miRNAs). Os
miRNAs apresentam um papel importante na modulação da produção do cortisol,
modulando a expressão dos genes envolvidos.
INTRODUÇÃO
38
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
1.5. microRNAs
Os miRNAs são pequenas moléculas de cadeia simples de RNA não codificante,
com aproximadamente 19-25 nucleotídeos de comprimento, que regulam a expressão de
genes através da degradação ou repressão da tradução de moléculas-alvo de RNA
mensageiro (mRNA) (52). Desta forma, poderão influenciar a regulação de processos
celulares fisiológicos de reação ao stress (53). Estes pequenos RNAs endógenos estão
envolvidos em várias funções no organismo tais como proliferação celular e apoptose,
metabolismo de gordura, diferenciação celular, regulação do sistema imunitário,
envelhecimento e também homeostasia da glicose. Adicionalmente, cada miRNA tem a
capacidade de regular até 100 mRNAs diferentes, o que torna a sua expressão dinâmica
(52).
O processo de síntese dos miRNAs inicia-se no núcleo, onde os genes dos miRNAs
são transcritos pela RNA polimerase II (RNA Pol II), resultando precursores de miRNAs de
grandes dimensões designados miRNAs primários (pri-miRNAs). Os pri-miRNAs sobre
ação da enzima Drosha, uma ribonuclease III associada à proteína do domínio dsRNA
(double-stranded ribonucleic RNA), conhecida como DGCR8 (DiGeorge syndrome critical
region), dão origem a miRNAs precursores (pré-miRNAs). Os pré-miRNAs são
transportados para o citoplasma com o auxílio da proteína exportina-5 (XPO5). No
citoplasma, os pré-miRNAs são processados pela RNAse III dicer (enzima que cliva
moléculas de cadeia dupla de RNA) resultando numa cadeia de miRNA madura e a sua
cadeia complementar. De seguida, a dicer associa-se à transactivation-responsive RNA-
binding protein (TRBP) juntamente com proteínas argonautas (AGO). Ao mesmo tempo,
que acontece esta associação, as cadeias vão desenrolando e o miRNA maduro é
incorporado no RNA-induced silencing complex (RISC). O miRNA guia assim, o RISC
(complexo multiproteico) para o RNA mensageiro complementar (mRNA alvo) (54). (Figura
10).
INTRODUÇÃO
39
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
Figura 10. Representação esquemática da biogénese de microRNAs
Dependendo do grau de complementaridade entre os miRNAs e a sequência do
mRNA alvo, o silenciamento pode ocorrer de duas formas: degradação do mRNA alvo
(quando a complementaridade é total) ou por repressão da tradução (quando a
complementaridade é parcial) (55, 56) (Figura 11).
Figura 11. Mecanismo de ação dos miRNAs (Adaptado de Teixeira AL e colaboradores (52)).
INTRODUÇÃO
40
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
1.6. microRNAs envolvidos na via do cortisol e sua importância para as ciências
forenses
Na prática forense, um dos maiores dogmas para o perito legista é a determinação
da hora da morte de um indivíduo. Determinar a hora da morte, é um grande desafio,
principalmente no caso de cadáveres pouco conservados, no entanto é possível
estabelecer a sequência de acontecimentos (através do estudo de processos físicos como
o livor mortis, tanatoquímicos como as alterações oftalmológicas , microbiológicos como a
decomposição, físico-químicos como a rigidez cadavérica, entre outros) que ocorreram
após a morte através do intervalo post-mortem (IPM) (57). O IPM corresponde ao intervalo
de tempo que decorre entre a morte de um indivíduo e a descoberta do respetivo cadáver
(58). A determinação do IPM permite auxiliar na resolução de muitos crimes, identificar
vítimas e suspeitos, aceitar ou rejeitar álibis, fornecer uma estimativa da altura da morte e
é essencial para o preenchimento do atestado de óbito (59). Contudo, a estimativa muitas
vezes não é precisa e fiável uma vez que os cadáveres são suscetíveis à ação de fatores
extrínsecos como a temperatura, humidade, pH e fatores intrínsecos como a idade do
indivíduo, género ou patologias associadas (60).
Atualmente, realizam-se estudos que se centram no potencial dos miRNAs para
obter uma estimativa exata do IPM (59, 61). O pequeno tamanho destes, permite que não
sejam tão suscetíveis à degradação mantendo-se estáveis ao longo do IPM,
simultaneamente estas moléculas são colhidas em quantidade e qualidade suficiente para
a análise, mesmo que tenham sido expostas a condições adversas como é o caso de
variações de pH e múltiplos ciclos de congelação/descongelação (59, 60). Os miRNAs
também são moléculas capazes de regular vários constituintes de uma única via (como por
exemplo a via do cortisol), de modo que, a soma de todos esses efeitos podem resultar em
alterações pronunciadas no geral (62). Deste modo, a sua estabilidade ao longo do IPM
permite que a quantificação de miRNAs sensíveis ao ritmo circadiano (um importante
regulador da via do cortisol e consequentemente do ciclo sono-vigília) diferencie de uma
maneira exata o período do dia (manhã, tarde ou noite) em que ocorreu uma morte e assim
pode auxiliar na inclusão ou exclusão de possíveis suspeitos a um local de crime (63).
Segundo a literatura, no decorrer da produção de cortisol, a modificação pós-
transcrição por miRNAs desempenha um papel bastante significativo pois, verifica-se uma
inibição da expressão de miRNAs por knockdown da enzima Dicer (62). Esta inibição leva
ao aumento da produção do cortisol, implicando que a esteroidogénese é regulada
INTRODUÇÃO
41
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
negativamente por miRNAs. Outro estudo refere que entre os miRNAs cuja expressão
aumentou significativamente após knockdown da enzima Dicer, são assinalados os hsa-
miR-24 e hsa-miR-10b que regulam negativamente cyp11b1, e o hsa-miR-320a-3p que
regula negativamente cyp11a1 e cyp17a1 (64).
Por isso, mostra-se interessante estudar o potencial de miRNAs envolvidos nas vias
de produção do cortisol como biomarcadores de ritmo circadiano e assim associá-los com
os níveis de cortisol, nas 3 fases do ciclo circadiano (manhã, tarde e noite).
OBJETIVOS
OBJETIVOS
45
miRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
2. Objetivos
2.1. Objetivo principal
Estudo do potencial de miRNAs envolvidos nas vias de produção do cortisol como
biomarcadores de ritmo circadiano em amostras de sangue e saliva.
2.2. Objetivos específicos
• Revisão da literatura de modo a selecionar os miRNAs envolvidos na via de
produção do cortisol com potencial para serem usados como biomarcadores do
ritmo circadiano em amostras de sangue e saliva.
• Estudo do perfil de miRNAs selecionados em amostras de sangue periférico e saliva
e estabelecimento da sua associação com os níveis de cortisol, nas 3 fases do ciclo
circadiano (manhã, tarde e noite) numa população de 20 indivíduos saudáveis
provenientes do Norte de Portugal.
MATERIAIS E MÉTODOS
MATERIAIS E MÉTODOS
49
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
3. Materiais e métodos
3.1. Seleção do perfil de microRNAs
Inicialmente realizou-se uma revisão da literatura com recurso à Pubmed
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/). Numa primeira fase, pesquisaram-se as seguintes
palavra-chave “microRNA biomarker in cortisol”; “microRNA in glucocorticoid action”;
“MicroRNA cortisol regulator”; “microRNAs in circadian rhythm” e “microRNAs as a stress
biomarker”, obtendo-se um total de 794 artigos. Destes, foram selecionados aqueles que
incluíssem pelo menos um dos seguintes critérios: estudos realizados em amostras de
sangue periférico ou saliva em indivíduos, estudos com informações relativas à influência
de miRNAs na via de cortisol, estudos que associam níveis de stress com expressão de
miRNAs e artigos publicados a partir de 2010. Foram exluídos todos os artigos que
envolviam o estudo de diferentes patologias, tendo resultado desta seleção 7 artigos
científicos.
3.2. População em estudo
Foram realizadas colheitas de sangue e saliva em 20 indivíduos voluntários,
caucasianos e saudáveis (6 homens e 14 mulheres) provenientes do Norte de Portugal. As
amostras de sangue periférico foram obtidas por punção venosa ante cubital em tubos com
EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) e em tubos com ativador de coágulo (para
análise bioquímica do cortisol) ao início da manhã (aproximadamente 8 horas) e à tarde
(aproximadamente 15 horas). As amostras de saliva foram recolhidas através de um kit
salivette à noite (aproximadamente 24 horas) (Tabela 1). Todas as colheitas foram
realizadas após consentimento esclarecido e informado escrito, de acordo com os
princípios da Declaração de Helsínquia. Após a colheita as amostras, foram submetidas a
um processamento segundo um protocolo padronizado e estabelecido pelo laboratório. O
primeiro passo foi registar as amostras. Para cada amostra foi também atribuído um código
de forma a que as amostras fossem aleatorizadas.
MATERIAIS E MÉTODOS
50
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
Tabela 1. Colheita das amostras biológicas
N Média idade Amostra Modo colheita Período dia
14 Mulheres 25,5 anos
Sangue periférico
Tubo EDTA Manhã
Tarde
Tubo com ativador de
coágulo
Manhã
Tarde
Saliva Kit Salivette Noite
6 Homens 39,7 anos
Sangue periférico
Tubo EDTA Manhã
Tarde
Tubo com ativador de
coágulo
Manhã
Tarde
Saliva Kit Salivette Noite
3.3. Processamento de amostras
Após realizadas as colheitas das amostras, processaram-se os dois tipos de
amostra da seguinte forma: os kits salivette com as amostras de saliva foram centrifugados
durante 2 minutos a 1000 g, transferindo-se o sobrenadante para um eppendorf. Os tubos
com amostras de sangue periférico foram centrifugados a 2500 rpm durante 5 minutos.
Após a centrifugação, foi recolhido 1 mL de plasma para um eppendorf, 1 mL de sangue
total para outro eppendorf e 200 µL de sangue para extração de miRNAs para outro
eppendorf devidamente identificados e armazenados a -20 ºC. O restante sangue foi
transferido para um tubo cónico à qual foi adicionado cloreto de amónio, fosfato de
hidrogénio e EDTA (AKE 1X) para a lise de eritrócitos, até perfazer 50 mL. As amostras
foram refrigeradas durante 20 minutos e centrifugadas durante 10 minutos a 2500 rpm. O
sobrenadante foi descartado, o pellet de leucócitos ressuspendido em AKE 1X e foi
centrifugado durante 10 minutos a 2500 rpm. De seguida, o sobrenadante foi novamente
descartado e o pellet de leucócitos ressuspendido em PBS 1X (solução salina tamponada
com fosfato) para lavagem celular. Foi centrifugado mais uma vez nas mesmas condições,
o sobrenadante foi descartado e o pellet de leucócitos ressuspendido em TripleExtractor
(Grisp-Research Solutions®) e armazenado a -80ºC.
MATERIAIS E MÉTODOS
51
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
3.4. Extração de microRNAs
A extração de miRNAs das amostras de saliva e sangue periférico foi realizada com
o GRS microRNA Purification kit, após adaptação das especificações do procedimento
laboratorial (Grisp Research Solutions®). Este método de extração é eficiente e rápido para
a purificação de miRNAs, com baixa contaminação de grandes moléculas de RNA e DNA
genómico. Nas amostras extraídas de sangue periférico começou-se por adicionar 600 µL
de tampão de lise de eritrócitos e incubou-se durante 5 minutos à temperatura ambiente.
De seguida foi adicionado 200 µL de tampão de lise e ressuspendeu-se. Incubou-se
novamente durante 10 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente foi adicionado 20
µL de tampão de miRNAs, 220 µL de fenol-clorofórimo e centrifugou-se a 15.000g por 3
minutos permitindo assim a separação de 3 fases: fase transparente correspondente aos
miRNAs, anel branco correspondente ao DNA e deposição no fundo do eppendorf
correspondente às proteínas. Colheu-se a fase transparente e procedeu-se para a
purificação dos miRNAs seguindo o protocolo do kit. Relativamente às amostras de saliva,
também foram adicionados 200 µL de tampão de lise e ressuspendeu-se. Incubou-se
novamente durante 10 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente foi adicionado 35
µL de tampão de miRNAs, 385 µL de fenol-clorofórmio e centrifugou-se a 13.000g por 10
minutos permitindo assim a separação das 3 fases. Os restantes passos foram seguidos
tendo em conta as instruções do fabricante, sendo que o principal objetivo deste kit é utilizar
sais caotrópicos e várias concentrações de etanol para permitir a ligação seletiva de RNA
de tamanhos específicos à matriz da coluna. Os materiais contaminados são removidos
com um tampão de lavagem e de seguida a coluna é centrifugada. De seguida, o RNA
purificado é eluído com tampão de eluição livre de ribonucleases (RNAses).
Após a extração, para avaliar a integridade e qualidade do miRNA presente em
cada amostra, estas foram quantificadas pelo Qubit™ 4 Fluorometer. Este equipamento
para além de fazer uma deteção rápida e muito precisa, é suficiente 1 µL de amostra para
ser realizada a sua quantificação.
3.5. Síntese de cDNA
Depois de devidamente quantificadas, procedeu-se à síntese de DNA
complementar (cDNA). A síntese de cDNA do RNU-48 e dos miR-21 e miR-144-5p foi
realizada através da utilização do kit TaqMan™ microRNA reverse Transcription (Applied
Biosystems®). A síntese de cDNA para os restantes miRNAs selecionados foi realizada
MATERIAIS E MÉTODOS
52
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
através do kit TaqMan™ Advanced miRNA cDNA synthesis (Applied Biosystems®). O uso
do kit TaqMan™ Advanced miRNA cDNA synthesis (Applied Biosystems®) assegura: uma
elevada sensibilidade, permitindo assim também uma quantificação de miRNAs de baixa
expressão (especialmente em amostras biológicas como soro, plasma e tecidos);
flexibilidade, uma vez que, possui uma etapa de RT universal que cria modelos universais
de cDNA para todos os miRNAs presentes na amostra de forma a simplificar o processo
de síntese de cDNA e necessita apenas de uma pequena quantidade de amostra.
3.6. Quantificação por PCR tempo real
Para avaliar os níveis de expressão dos miRNAs foram realizadas quantificações
relativas por PCR quantitativo em tempo real por ser um método capaz de gerar dados
quantitativos precisos, ser rápido devido à diminuição dos tempos dos ciclos de
amplificação e ao uso de equipamento com alta sensibilidade para a deteção da
fluorescência. O PCR em tempo real associa a metodologia de PCR convencional com um
sistema de deteção e quantificação de fluorescência produzida nos ciclos de amplificação
no decorrer da reação, ou seja, determina para cada amostra utilizada o número de ciclos
no qual a fluorescência acumulada ultrapassa a sua baseline: o Ct (cycle threshold).
Durante a amplificação, as amostras foram sujeitas a temperaturas de 95ºC durante 10
minutos e depois a 40 ciclos de 95ºC durante 15 segundos, seguida de 60ºC durante 1
minuto.
As reações foram realizadas no aparelho StepOne™ qPCR Real-Time. A mistura
de reação foi feita com os seguintes componentes: H2O, 1X TaqMan® Fast Advanced
Master Mix (Applied Biosystems®), 1X sondas específicas para amplificar os miRNA alvo
(Taqman® microRNA Expression Assays®, miR-21, miR-144-5p e Taqman® Advanced
microRNA Assays®, miR-10a, miR-10b, miR-16, miR-20, miR-24) e o controlo endógeno
RNU48 (Applied Biosystems®) juntamente com as amostras de cDNA (5µL por amostra).
Todas as quantificações foram realizadas em duplicado e foi incluído um controlo negativo
de maneira a controlar possíveis contaminações.
3.7. Quantificação dos níveis de cortisol sérico e salivar
A quantificação dos níveis de cortisol foi efetuada com a colaboração do Serviço de
Química Clínica do Departamento de Diagnóstico Laboratorial do IPO-Porto, de acordo
MATERIAIS E MÉTODOS
53
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
com os procedimentos de rotina do mesmo. A quantificação dos níveis de cortisol foi
realizada com recurso ao teste ElecsysCortisol II® (Cobas®).
3.8. Análise estatística
De seguida foram feitas as análises das curvas de amplificação utilizando o
StepOne™ (Applied Biosystems®) com a mesma linha de base e limite definido para cada
placa, de forma a gerar valores de cycle threshold (Ct) para todos os miRNAs presentes
em cada amostra.
No final, a análise estatística foi realizada com recurso ao software estatístico
IBM®SPSS®Statistics for Windows (Versão 25.0), de maneira a avaliar potenciais
diferenças na expressão dos miRNAs estudados. Para avaliar a diferença dos níveis de
expressão dos vários miRNAs analisados, calculou-se o fold-change ou método de Livak
através da fórmula (65):
𝟐−∆∆𝑪𝒕 ⟷ ∆∆Ct = ∆Ct (tarde) - ∆Ct (manhã)
∆Ct = Ct (miRNA target) - Ct (endógeno)
RESULTADOS
RESULTADOS
57
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
4. Resultados
4.1. Frequências de deteção dos microRNAs estudados em amostras de sangue e
saliva
Na população em estudo, observou-se que todos os miRNAs analisados foram
detetados em ambos os fluídos biológicos (sangue e saliva) apresentando frequências de
deteção muito variáveis, com exceção do hsa-miR-144-5p que não foi detetado na saliva.
No período da manhã, podemos verificar que todos os miRNAs foram detetados no
sangue total. Na figura 12 verifica-se que o hsa-miR-20 (figura 12d), o hsa-miR-21 (figura
12e) e hsa-miR-24 (figura 12f) foram os miRNAs com maior frequência de deteção, a variar
entre os 80 e 90%, neste período do dia. Contrariamente, o hsa-miR-10b (figura 12b) foi o
miRNA com menor frequência de deteção (15%), nesse mesmo período do dia.
Ao analisarmos, as frequências correspondentes ao período da tarde, podemos
também concluir que todos os miRNAs também foram detetados no sangue total.
Verificando-se que o hsa-miR-16 (figura 12c), hsa-miR-20 (figura 12d) e o hsa-miR-24
(figura 12f) foram os mais frequentes, com uma taxa de deteção de 80%). Por outro lado,
verificámos que o hsa-miR-10b (figura 12b) e o hsa-miR-21 (figura 12e) apresentam a
menor frequência de deteção (30%).
Relativamente à colheita realizada no período da noite, podemos observar que três
miRNAs apresentam uma frequência máxima de deteção (100%) nas amostras de saliva,
nomeadamente o hsa-miR-16 (figura 12c), o hsa-miR-21 (figura 12e) e o hsa-miR-24 (figura
12f). No entanto, o hsa-miR-10a (figura 12a), o hsa-miR-10b (figura 12b) apresentam
baixas frequências (20%, 10%) e o hsa-miR-144-5p (figura 12g) não apresentou frequência
de deteção.
Deste modo, verificámos que o miRNA mais frequente quando considerado os três
períodos do dia foi o hsa-miR-24, sendo o hsa-miR-10b o miRNA menos frequente nas
amostras de sangue e saliva.
RESULTADOS
58
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
Figura 12. Frequência de deteção (%), dos miRNAs em estudo ao longo do dia.
RESULTADOS
59
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
4.2. Níveis de cortisol e quantificação relativa dos microRNAs nas amostras de
sangue e saliva
De forma a estudar a dinâmica de expressão dos miRNAs em estudo ao longo do
dia, foi determinado em simultâneo os níveis de cortisol de modo a estabelecer inferências
relacionadas com o ritmo circadiano humano. Na população em estudo, verificamos uma
variação dos níveis de cortisol ao longo do dia, sendo os valores mais elevados verificados
no período da manhá (média de cortisol da população 26,12 µg/dL), diminuindo ao longo
do dia (média de cortisol da população no períoda da tarde 14,03 µg/dL) e atingindo os
valores mais baixos à noite (0,17 µg/dL).
Podemos visualizar na figura 13, que à medida que os níveis de cortisol vão
diminuindo ao longo do dia, os níveis dos miRNAs vão aumentando, com exceção do hsa-
miR-21 que se verifica uma lenta e pequena diminuição entre o período da manhã e da
tarde e um acentuado aumento entre o período da tarde e da noite.
O hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 (figura 13a, 13c, 13f, respetivamente)
apresentam um aumento gradual e constante ao longo do dia. No entanto, não se verifica
o mesmo comportamento nos outros miRNAs.
O hsa-miR-10b (figura 13b) apresenta um aumento lento entre os períodos da
manhã e tarde mas um aumento mais acentuado do período da tarde para a noite. Pelo
contrário, tal como referido anteriormente, o hsa-miR-21 (figura 13e) apresenta uma
pequena e lenta diminuição entre os períodos da manhã e tarde mas à semelhança com o
hsa-miR-10b verifica-se um aumento mais acentuado entre os períodos da tarde e noite.
Os restantes miRNAs, nomeadamente o hsa-miR-20 (fig 13d) e hsa-miR-144-5p (fig
13g), apresentam inicialmente uma dinâmica semelhante (um aumento acentuado) entre a
manhã e a tarde. Porém, verifica-se um aumento mais lento no hsa-miR-20 entre a tarde e
a noite enquanto que não há deteção de hsa-miR-144-5p no mesmo período.
RESULTADOS
60
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
Figura 13.Níveis do cortisol e miRNAs ao longo do dia.
RESULTADOS
61
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
De acordo com os resultados, podemos verificar um aumento dos níveis de
expressão do hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 nas amostras de sangue colhidas
no período da tarde, comparativamente aos níveis de expressão detetados nas amostras
de sangue colhidas no período da manhã. Sendo este aumento de 75,6 (P=0,013), 26,7
(P=0,018) e de 135,6 (P=0,002), respetivamente (Tabela 2).
Tabela 2. Valores de fold-change e pvalue para os hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24.
hsa-miR Fold-change P
hsa-miR-10a 75,6 0,013
hsa-miR-16 26,7 0,018
hsa-miR-24 135,3 0,002
DISCUSSÃO
DISCUSSÃO
65
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
5. Discussão
Com o presente estudo pretende-se avaliar o potencial dos miRNAs associados à
via de produção do cortisol como biomarcadores do ritmo circadiano. Atualmente, os
miRNAs têm-se tornado alvo de estudo na área das ciências forenses pois a sua análise
fornece informações úteis, principalmente em amostras que já se encontram degradadas
(66). Na Medicina Legal, continua a ser um grande desafio a determinação da hora exata
de morte de um cadáver. Como tal, é utilizado o intervalo post-mortem (IPM) que fornece
uma estimativa do intervalo que ocorre entre a morte e a descoberta do respetivo cadáver
para auxiliar o perito forense (58). Estudos que se centram no estudo do potencial dos
miRNAs para obter uma estimativa do IPM demonstram que, o seu pequeno tamanho
torna-se uma vantagem na sua utilização em relação ao mesmo tipo de estudos que
analisam amostras de DNA, uma vez que estes não são tão suscetíveis à degradação por
fatores físicos e químicos, mantendo-se estáveis durante longo períodos de tempo (59-61).
Simultaneamente a esta característica, a quantidade e qualidade destas moléculas
continua a ser suficiente para análise molecular mesmo que estas tenham sido expostas a
condições adversas, como é o caso de variações de pH e temperatura (60). Deste modo,
a elevada estabilidade dos miRNAs poderá permitir a análise da sua dinâmica associada
à via de produção do cortisol possibilitando que seja fornecida uma estimativa da altura do
dia (manhã, tarde ou noite) da morte de um indivíduo, uma vez que os níveis de cortisol
apresentam uma ritmicidade diária. O conhecimento sobre o período do dia em que ocorreu
a morte, poderá auxiliar a investigação criminal, permintindo inclusive restringir possíveis
suspeitos ou encontrar possíveis testemunhas oculares, o que facilitará o conhecimento do
evento.
Da análise dos níveis de expressão dos hsa-miR-10a, hsa-miR-10b, hsa-miR-16,
hsa-miR-20, hsa-miR-21, hsa-miR-24 e hsa-miR-144-5p em amostras de sangue periférico
e saliva, observou-se que estes apresentaram oscilação mediante o período do dia em que
foram colhidas. Verificou-se que os hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 apresentaram
um aumento de expressão ao longo do dia, contrariamente aos níveis de cortisol, que foram
diminuindo ao longo do mesmo, tal como o esperado.
Um estudo realizado por Beech e colaboradores relacionou o aumento dos níveis
de stress agudo com o aumento de expressão de hsa-miR-10a utilizando amostras de
sangue, tendo sido colocada a hipótese deste miRNA ser influenciado por condições de
stress agudo (67). Contudo, este autores não conseguiram estabelecer qualquer relação
DISCUSSÃO
66
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
entre o o stress agudo e os níveis de cortisol (67). Esta evidência sugere que poderão
existir outros mecanismos moleculares responsáveis pelo variação dos níveis deste
miRNA. Por outro lado, um estudo realizado por Zhang e colaboradores admite que o uso
de Acarbose, um fármaco inibidor de α-glucosidade, regula o metabolismo da glicose ao
diminuir a glicose pós-pandrial e que esta diminuição resulta no aumento de expressão do
hsa-miR-10a (68). Numa situação normal, o aumento dos níveis de cortisol traduz-se num
aumento da glicose no sangue. Os autores sugerem que a Acarbose diminui os níveis de
glicose no sangue devido ao aumento da expressão de hsa-miR-10a (68). Adicionalmente,
Kim e colaboradores reportaram que o hsa-miR-10a regula a expressão da Lanosterol
sintase (LSS). Na última etapa de síntese de colesterol, a LSS é responsável por converter
o Esqualeno em Lanosterol, permitindo ativar a síntese do colesterol (69). Deste modo, o
aumento do hsa-miR-10a irá resultar numa diminuição de LSS e, consequentemente numa
inibição da síntese de colesterol (70). Logo, colocamos a hipótese que o aumento do hsa-
miR-10a, ao diminuir os níveis de LSS, inibe a síntese de colesterol, o que irá resultar na
diminuição dos níveis de cortisol. Deste modo, esta relação inversa entre os níveis de hsa-
miR-10a e os níveis de cortisol estão de acordo com os nossos resultados, sugerindo que
o hsa-miR-10a será um potencial biomarcador do período do dia em que a amostra foi
colhida e/ou recolhida.
Honda e colaboradores, propuseram que outros dos miRNAs que poderão ser
afectados pelo stress são o hsa-miR-16 e hsa-miR-144-5p. Este estudo, realizado na
população estudantil Japonesa, observou um aumento dos níveis de hsa-miR-16 e hsa-
miR-144-5p no sangue e na saliva, como resposta ao stress após a realização de um
exame (71). Contudo, tal como o verificado no estudo de Beech e colaboradores, também
neste estudo não foi observada qualquer alteração nos níveis de cortisol (71). Por outro
lado, estes autores admitem que o aumento do hsa-miR-16 poderá resultar na diminuição
da expressão do gene Wnt family member 4 (wnt4) (71). O wnt4 atua na via de produção
do cortisol, aumentando a sua produção após atuar como regulador positivo da cyp17 e
cyp21 (72). A cyp17 e cyp21 têm como principal função na via do cortisol, converter a
pregnenolona em 17-α-hidroxipregnenolona e a 17-α-hidroxiprogesterona em 11-
desoxicortisol, respetivamente (72). Logo, colocamos a hipótese que o aumento do hsa-
miR-16 consequentemente irá diminuir os níveis de expressão de wnt4, o que se traduzirá
numa diminuição da produção de cortisol. Deste modo, esta relação inversa entre hsa-miR-
16 e os níveis de cortisol estão de acordo com os nossos resultados, sugerindo que o hsa-
miR-16 também será um potencial biomarcador do período do dia em que a amostra foi
colhida e/ou recolhida.
DISCUSSÃO
67
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
Relativamente ao hsa-miR-144-5p, os resultados demonstraram em simultâneo
uma diminuição dos níveis do cortisol e um aumento da sua expressão entre os períodos
da manhã e da tarde no sangue, contudo este não foi detetado no período da noite na
saliva. Hill e colaboradores sugerem que uma função importante do sono é a defesa contra
o stress oxidativo (73). É no período do sono, à noite, que os níveis de cortisol diminuem.
Um estudo realizado por Sangokoya e colaboradores, afirma que o hsa-miR-144 regula
diretamente o Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NFR2), um importante regulador
que modula a resposta ao stress oxidativo (74). Por outro lado, os autores admitem que o
aumento do hsa-miR-144-5p está associado a níveis reduzidos de NRF2, o que leva a uma
redução da tolerância ao stress oxidativo (74). Logo, colocamos a hipótese que é durante
o período de sono que existe uma resposta ao stress oxidativo, e consequentemente
haverá um aumento de NFR2. Visto que o hsa-miR-144-5p regula negativamente a ação
do NFR2, isso irá implicar que não haja expressão do hsa-miR-144-5p durante a noite.
Sendo esta a razão pela qual não conseguimos detetar este miRNA à noite. Deste modo,
esta relação inversa entre os níveis de cortisol e hsa-miR-144-5p e, a não deteção deste
miRNA no período da noite, estão de acordo com os nossos resultados, sugerindo que o
hsa-miR-144-5p também será um potencial biomarcador do período do dia em que a
amostra foi colhida e/ou recolhida.
Relativamente ao hsa-miR-24, vários estudos reportam que está implicado na
regulação negativa da cyp11b1 (62, 64, 75). Alguns artigos observaram que o aumento da
expressão de hsa-miR-24 se traduz na inibição da atividade da enzima cyp11b1 (62, 64,
75). A cyp11b1 tem como principal função na via do cortisol, converter o 11-desoxicortisol
em cortisol Sendo o hsa-miR-24 um regulador negativo de cyp11b1, e estando esta enzima
diretamente envolvida com a produção de cortisol, como consequência do aumento da
expressão deste miRNA, também haverá uma diminuição dos níveis de cortisol. Esta
associação também foi observada no presente estudo, uma vez que o aumento do hsa-
miR-24 foi acompanhado pela diminuição dos níveis de cortisol. Deste modo, admitimos
que o hsa-miR-24 também poderá ser um útil indicador do período do dia em que a amostra
foi colhida e/ou recolhida.
Na figura 14, é possível verificar de uma forma mais elucidativa a relação dos hsa-
miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 com a via do cortisol De acordo com os resultados
obtidos, podemos admitir que os hsa-miR-10a, hsa-miR-16, hsa-miR-24 e hsa-miR-144-5p
poderão ser biomarcadores úteis no que respeita à determinação do espaço temporal em
que uma amostra de sangue foi colhida/ recolhida, podendo ser fortes candidatos a serem
incluídos num perfil de miRNAs a estudar a quando de uma determinação do IPM.
DISCUSSÃO
68
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
Figura 14. Relação dos hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 com a regulação da via da síntese do cortisol.
.
CONCLUSÃO E
PERSPETIVAS FUTURAS
CONCLUSÃO E PERSPETIVAS FUTURAS
71
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
6. Conclusão e perspetivas futuras
Na Medicina Legal, continua a ser um grande desafio a determinação da hora exata
de morte de um cadáver. Como tal, é utilizado o IPM que permite auxiliar na resolução de
muitos crimes, identificar vítimas e suspeitos, aceitar ou rejeitar álibis, fornecer uma
estimativa da altura da morte e é essencial para o preenchimento do atestado de óbito (59).
No entanto, a determinação do IPM muitas vezes não é precisa e fiável uma vez que o
cadáver muitas vezes é exposto a condições adversas, como é o caso de variações de pH
e temperatura (60). A análise de miRNAs tornou-se um campo crescente para estudo nas
ciências forenses, uma vez que é descrito que o seu pequeno tamanho torna-se uma
vantagem na sua utilização pois estas moléculas não são tão suscetíveis à degradação por
fatores físicos e químicos, mantendo-se estáveis durante longo períodos de tempo (59-61).
Deste modo, a elevada estabilidade dos miRNAs poderá permitir a análise da sua dinâmica
associada à via de produção do cortisol possibilitando que seja fornecida uma estimativa
da altura do dia (manhã, tarde ou noite) em que ocorreu uma morte e assim restringir
possíveis suspeitos ou encontrar possíveis testemunhas oculares num local de crime.
O presente estudo analisou o potencial dos hsa-miR-10a, hsa-miR-10b, hsa-miR-
16, hsa-miR-20, hsa-miR-21, hsa-miR-24 e hsa-miR-144-5p com associação à via de
produção do cortisol como biomarcadores do ritmo circadiano em amostras de sangue e
saliva, assim como estabeleceu a sua dinâmica em diferentes fases do ciclo diário (manhã,
tarde ou noite).
Os resultados do presente estudo mostraram que o método utilizado (qPCR)
apresenta inúmeras vantagens para a análise de amostras em contextos forenses, pois
requer pouca quantidade e qualidade de amostra inicial e a técnica laboratorial é simples
e rápida, comparativamente aos outros métodos disponíveis, reduzindo assim a
possibilidade de contaminações e erros. É possível concluir que tanto o sangue como a
saliva são bons fluídos biológicos que permitem a quantificação relativa de miRNAs alvo,
uma vez que todos os miRNAs em estudo foram detetados (com exceção do hsa-miR144-
5p na saliva). É de salientar que, em comparação ao sangue, a colheita da saliva é
realizada por um método não invasivo tornando-se mais vantajoso. Da análise dos níveis
de expressão, verificam-se alterações entre os três períodos do dia para todos os miRNAs.
No entanto, o hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 demonstraram um aumento de
expressão ao longo do dia, contrariamente aos níveis de cortisol, que foram diminuindo ao
longo do dia, tal como o esperado. Relativamente ao hsa-miR-144-5p, este também
demonstrou um aumento de expressão entre o período da manhã e da tarde mas não foi
detetado nas amostras de saliva à noite. Conclui-se que o hsa-miR-10a, hsa-miR-16, hsa-
CONCLUSÃO E PERSPETIVAS FUTURAS
72
microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano
miR-24 e o hsa-miR-144-5p poderão ser biomarcadores úteis no que respeita à
determinação do espaço temporal em que uma amostra foi colhida, podendo ser fortes
candidatos a serem incluídos num perfil de miRNAs a estudar a quando de uma
determinação do IPM.
Em estudos futuros, o presente estudo deveria ser replicado num maior número de
indivíduos, de modo a validar as associações encontradas. Adicionalmente também seria
interessante o estudo da expressão destes miRNAs em amostras de sangue periférico
durante o período da noite e em amostras de saliva durante o período da manhã e tarde,
de modo a complementar os resultados obtidos.
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